3.1重组DNA技术的基本工具课件——2026-2027学年高考一轮复习生物学选择性必修3生物技术与工程（人教版）

重组DNA技术的基本工具 高中生物学选择性必修3生物技术与工程（人教版） 第三章●基因工程●第1节 学习目标 结合基因工程的诞生和发展历程,认同相关技术的发展催生了基因工程。 01 通过对有关示意图和资料的分析,掌握重组DNA技术所需工具酶的作用、特点以及载体需要具备的条件。 02 通过探究实践,学习DNA粗提取与鉴定的方法。 03 基因工程的概念 基因工程的概念 按照人们的愿望,通过转基因等技术,赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看,由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫作重组DNA技术。 【重点点拨】 重组DNA技术的“分子工具” 1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀” (1)来源:主要来自　　　　　　　　。  (2)作用特点:具有专一性。 一种酶只催化一种或一类反应 ①识别双链DNA分子的　　　　　　　　　　　。  ②使每一条链中特定部位的　　　　　　　　　　　　断开。  (3)结果:切割DNA片段,并在末端产生　　　　　　　　　　　　　　。  原核生物 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端或平末端 回文序列 限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列,即一条链正向读(5'→3')的碱基顺序,与另一条链正向读(5'→3')的顺序完全一致。例如:EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为 ,为回文序列。 知识拓展 2.DNA连接酶——“分子缝合针” (1)种类 种类 来源 特点 　　　　  DNA连接酶 　　    只能“缝合”具有　　　　　　 　的双链DNA片段  T4 DNA 连接酶 T4噬菌体 既可以“缝合”双链DNA片段互补的_________,又可以“缝合”双链DNA片段的　　　　　　  (2)作用:在两个DNA 片段之间形成　　　　　　　　　　键。  (3)结果:　 。  大肠杆菌 E.coli　 互补黏性末端 黏性末端　 平末端　 磷酸二酯　 将DNA片段拼接成新的DNA分子 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” (1)作用:将外源基因送入细胞。 (2)种类:质粒、噬菌体、动植物病毒等。 (3)质粒作为载体的条件或特点 ①能在受体细胞中进行　　　　　　　。  ②有一个至多个　　　　　切割位点,供外源DNA片段(基因)插入其中。  ③带有特殊的　　　　　　　,便于重组DNA分子的筛选。  ④对受体细胞无害。 自我复制 限制酶 标记基因 被用作载体的质粒通常是在天然质粒的基础上进行过人工改造的,因为天然质粒往往不能满足所需的全部条件;质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 重点点拨 DNA的粗提取与鉴定 1.实验原理 (1)DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,可以初步分离 　　　　 　。  (2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于　　　　　的NaCl溶液。  (3)在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 2 mol/L DNA与蛋白质 2.方法步骤 研磨释放DNA 称取约30 g洋葱,切碎,放入研钵中,倒入10 mL研磨液,充分研磨。 ↓ 获取上清液 方案一 在漏斗中垫上纱布,将洋葱研磨液过滤到烧杯中,在4 ℃冰箱中放置几分钟后,再取上清液 方案二 直接将研磨液倒入塑料离心管中,在1 500 r/min的转速下离心5 min,再取上清液 ↓ 粗提取DNA 方案一 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为　 　), 静置2~3 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA;用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸去上面的水分  方案二 将溶液倒入塑料离心管中,在10 000 r/min的转速下离心5 min,弃上清液,将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干 95%　 ↓ 鉴定DNA 取两支20 mL的试管,各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后,向两支试管中各加入4 mL的 　　　　试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热5 min。待试管冷却后,比较两支试管中溶液颜色的变化。  3.实验结果 加入白色絮状物的试管中颜色变为　　　　　,另一对照试管中没有颜色变化。  二苯胺 蓝色 1.想一想,为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子? 2.粗提取的DNA中可能含有哪些杂质? 提示 含有某种限制酶的细胞中的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列,或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上,使限制酶不能将其切开。 提示 本实验提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。 想一想 议一议 3.不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端,这在基因工程操作中有什么意义? 提示 构建载体时,切割位点的选择范围扩大。例如,选择某种限制酶切割载体,如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列,那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时,目的基因就很可能被切断;这时用另外一种限制酶来获取目的基因,目的基因的核苷酸序列中没有它的识别序列,但可以获得相同的黏性末端。 情境探究 主题一　重组DNA技术的工具酶 1.切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶,这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的,它能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 (1)推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键?产生多少游离的磷酸基团?产生几个黏性末端? 提示 断开2个磷酸二酯键;产生2个游离的磷酸基团;产生2个黏性末端。 (2)黏性末端和平末端是如何形成的?限制酶的识别序列有什么特点? 提示 限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA两条单链分别切开,形成黏性末端,而从识别序列的中心轴线切开就产生平末端。识别序列的特点是呈现碱基互补对称,无论是几个核苷酸组成,都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。 (3)请写出下列限制酶切割形成的黏性末端,并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同?不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同? 提示 如图 同种限制酶切割产生的黏性末端相同,不同的限制酶切割形成的黏性末端可能相同。 (4)推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么? 提示 限制酶是原核生物的一种防御工具,用来切割侵入细胞的外源DNA,以保证自身安全。 2.将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子,是靠DNA连接酶完成的,因此DNA连接酶是基因工程的“分子缝合针”。 (1)DNA连接酶和限制酶的作用部位是否相同? (2)DNA连接酶和DNA聚合酶有什么不同? 提示 相同,DNA连接酶就是用来恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 提示 DNA聚合酶是在DNA复制过程中,催化单个脱氧核苷酸添加到已有脱氧核苷酸片段上,形成磷酸二酯键,催化形成与模板链互补的DNA链,形成新的双链DNA分子;DNA连接酶是将具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来,形成重组DNA分子。 与DNA分子相关的四种酶的比较 比较项目 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用底物 DNA分子 DNA分子 脱氧核苷酸 DNA 分子 作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 作用 特点 识别特定核苷酸序列,使特定部位的磷酸二酯键断开 将双链DNA片段“缝合”起来,恢复磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上 将DNA两条链之间的氢键打开　 方法突破 比较项目 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用 结果 形成黏性末端或平末端 形成重组DNA分子 形成新的DNA分子 形成单链DNA分子 应用 基因工程 DNA复制 主题二　基因进入受体细胞的载体 重组好的DNA分子需要利用“分子运输车”导入受体细胞,基因工程中的“分子运输车”通常是质粒。 1.载体要与外源DNA片段连接,需要具备什么条件? 2.要使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在,载体需要具备什么条件? 提示 具有一个或多个限制酶切割位点,供外源DNA片段插入其中。 提示 能在受体细胞中自我复制,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制,这样它携带的外源DNA片段才能在受体细胞中复制。 3.我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞,为了便于筛选重组DNA分子,载体需要具备什么条件? 提示 具有标记基因,便于重组DNA分子的筛选。 4.下图表示四种质粒,其中箭头所指部位为限制酶的识别位点,质粒的阴影部分表示标记基因。适合作为载体的质粒是哪一种?说明理由。 提示 适合作为载体的质粒是①。由图可知,质粒②上无标记基因,不适合作为载体;质粒③和④的标记基因上都有限制酶的识别位点,使用该酶后将会破坏标记基因,故均不宜选作载体。 5.质粒上通常含有特殊的标记基因,便于重组DNA分子的筛选。请举例说明标记基因的筛选原理。 提示 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因,而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞,抗性基因在受体细胞内表达,受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上,能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示: 主题三　DNA的粗提取与鉴定 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异,可以利用这些差异,选用适当方法对DNA进行提取;在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色,因此可利用二苯胺试剂鉴定DNA。请结合下列DNA的粗提取与鉴定的基本流程,探讨分析下列问题。 1.研磨洋葱时加入的研磨液有什么作用?为什么要求充分研磨? 提示 加入研磨液有利于DNA的释放。研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全,提取的DNA量变少,影响实验结果,导致看不到白色丝状物或沉淀物、用二苯胺试剂鉴定不显示蓝色等。 2.上清液中加入预冷的酒精溶液有何作用?为什么要求玻璃棒沿着一个方向搅拌? 3.现有猪血和鸡血适量,能否用来提取DNA?用血细胞作材料可采用何种方法使细胞中的DNA释放? 提示 DNA不溶于酒精,加入预冷的酒精溶液有利于DNA的析出。预冷的酒精溶液具有以下优点:一是抑制核酸水解酶活性,防止DNA降解;二是降低分子运动,易于形成沉淀析出;三是低温有利于增加DNA分子柔韧性,减少断裂。玻璃棒沿着一个方向搅拌可防止丝状DNA破碎,能够完整地缠在玻璃棒上。 提示 不能选用猪血,因为猪属于哺乳动物,其成熟的红细胞中没有细胞核,不含DNA;可选用鸡血作为提取DNA的材料。可向鸡血中加入蒸馏水,使血细胞吸水涨破,从而使其DNA释放。 DNA的粗提取与鉴定实验关键步骤分析 方法步骤 加入物质 目的 研磨洋葱 研磨液 释放DNA 粗提取DNA 预冷的酒精溶液(体积分数为95%) 有利于DNA析出 鉴定 DNA 2 mol/L的NaCl溶液 溶解DNA 二苯胺试剂 DNA遇二苯胺(沸水浴)变蓝色 方法突破 网络构建 限制酶作用示意图 经典图示 在线练习 1.有关下图所示的黏性末端的说法,错误的是(　　) A.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的 B.甲、乙具有相同的黏性末端,可形成重组DNA分子,但甲与丙的黏性末端不互补 C.a处是磷酸二酯键 D.切割产生甲的限制酶识别的核苷酸序列是“5'-CAATTG-3'3'-GTTAAC-5'” D 解析 切割产生甲的限制酶的识别序列为 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5', 切割产生乙的限制酶的识别序列为 5'-CAATTG-3' 3'-GTTAAC-5', 切割产生丙的限制酶的识别序列为 5'-CTTAAG-3' 3'-GAATTC-5'。 三者的切割位点不同,由此可见,甲、乙、丙的黏性末端是由三种不同的限制酶切割产生的,A项正确,D项错误。甲、乙的黏性末端相同,因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子;但甲、丙的黏性末端不同,它们之间不能形成重组DNA分子,B项正确。DNA连接酶催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键,a处是磷酸二酯键,C项正确。 2.某线性DNA分子含有3 000个碱基对(bp),先用限制酶a切割,再把得到的产物用限制酶b切割,得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法错误的是(　　) a酶切割产物(bp) b酶再次切割产物(bp) 1 600;1 100;300 800;300 A.在该DNA分子中,a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个 B.a酶与b酶切出的黏性末端可相互连接 C.a酶与b酶切断的化学键均为磷酸二酯键 D.a酶与b酶识别切割的序列不同体现了酶的专一性 A 解析 分析题表可知,a酶可以把原有DNA切成3段,说明a酶的识别序列有2个,b酶把大小是1 600的DNA切成大小分别为800和800两个片段、把大小是1 100的DNA片段切成大小分别为800和300两个片段,且a酶和b酶的识别位点不同,说明b酶的识别序列有2个,A项错误;a酶与b酶切出的黏性末端相同,用DNA连接酶可以将它们连接起来,B项正确;a酶和b酶属于限制酶,限制酶切割的化学键都是磷酸二酯键,C项正确;a酶与b酶切割后产生的黏性末端相同,但是两者识别切割的脱氧核苷酸序列不同,说明两种酶的底物不同,体现了酶的专一性,D项正确。 【题后归纳】a酶和b酶识别的脱氧核苷酸序列不同,但切割后产生的黏性末端相同。分析表格:a酶可以把原有DNA切成3段,说明该DNA分子上有2个切口,即a酶的识别序列有2个;b酶把大小是1 600的DNA切成大小分别为800和800两个片段、把大小是1 100的DNA切成大小分别为800和300两个片段,且a酶和b酶的识别位点不同,说明b酶的识别序列有2个。 3.下列关于DNA连接酶的叙述,正确的是(　　) A.DNA连接酶不需要识别特定的脱氧核苷酸序列 B.一种DNA连接酶只能连接一种黏性末端 C.将单个脱氧核苷酸加到某DNA片段末端,形成磷酸二酯键 D.连接两条DNA链上碱基之间的氢键 A 解析 DNA连接酶连接的是两条DNA链上的磷酸和脱氧核糖,形成磷酸二酯键,不需要识别特定的脱氧核苷酸序列,A项正确,D项错误;DNA连接酶可以连接互补的黏性末端两条链主链上的磷酸和脱氧核糖,所以一种DNA连接酶可以连接多种黏性末端,B项错误;DNA连接酶连接的是两个DNA片段,DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸加到某个DNA片段末端,形成磷酸二酯键,C项错误。 4.质粒是基因工程最常用的载体。下列有关质粒的说法,正确的是(　　) A.质粒不仅存在于细菌中,也存在于某些病毒中 B.细菌的基因只存在于质粒上 C.质粒为小型环状DNA分子 D.质粒是基因工程中的重要工具酶之一 C 解析 质粒主要存在于细菌、酵母菌等生物中,病毒中没有质粒,A项错误;细菌基因主要存在于拟核DNA上,也有少数存在于质粒上,B项错误;质粒为小型环状DNA分子,存在于细胞核外或拟核外的细胞质基质中,C项正确;质粒是基因工程中的重要工具之一,但不是工具酶,基因工程中的工具酶是限制酶和DNA连接酶,D项错误。 5.某实验小组进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验,如下为实验流程。下列相关叙述正确的是(　　) 取材→破碎细胞→静置或离心→去除杂质→进一步提纯→DNA鉴定 A.取材时可选用猪血、洋葱、香蕉、菜花等富含DNA的材料进行实验 B.经研磨后,将研磨液静置几分钟或离心后取上清液进行下一步操作 C.提纯时在滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液后会出现白色丝状物DNA D.DNA鉴定时可通过是否加入二苯胺试剂设置对照实验来观察实验现象 B 解析 哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核,不能用猪血做DNA提取的实验,A项错误;研磨液过滤到烧杯,在4 ℃冰箱中静置几分钟,或者离心后获取上清液,B项正确;提纯时在滤液中加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液后会出现白色丝状物DNA,C项错误;DNA鉴定时可通过加入二苯胺试剂,比较两支试管溶液颜色的变化,看看溶解有DNA的溶液是否变蓝,D项错误。 本 课 结 束 取材研磨过滤取上清液析出DNA鉴定DNA $