2027届高考生物人教版一轮复习课件 第42讲 基因工程的基本工具和基本操作程序

该高中生物学高考复习课件聚焦基因工程专题，覆盖重组DNA技术基本工具、操作程序、PCR技术及DNA粗提取鉴定等核心考点，依据高考评价体系分析2023-2025年17道真题，明确“基因表达载体构建”“目的基因检测”等高频考点权重，归纳工具比较、程序分析等常考题型，体现备考针对性。 课件亮点在于“真题溯源+实验探究+思维建模”，如以2025安徽T15为实例，解析双酶切防环化、PCR数量计算等技巧，培养科学思维与探究实践素养。设“易错警示”专栏，助力学生掌握答题规范，教师可据此精准复习，提升备考效率。

基因工程的基本工具和基本操作程序 高中生物·一轮复习·第42讲 SW生老师 考情 分析 重组DNA技 术的基本工具 ①2025江苏T19　　②2024江西T12　　③2024山东T5　　④2023新课标T6 基因工程的基本操作程序 ①2025安徽T15、20②2025河北T22③2025云南T21④2025陕晋宁青T21⑤2024重庆T19⑥2024湖南T21⑦2024甘肃T24⑧2024安徽T20⑨2024河北T22⑩2024全国甲T38⑪2024山东T25⑫2024新课标T35⑬2024黑吉辽T25⑭2023全国乙T38⑮2023全国甲T38⑯2023湖北T4 ⑰2023广东T20 重组DNA技术的基本工具 PART 01 （1）来源：主要从原核生物中分离出来。 （2）种类：数千种。 （3）作用： 磷酸二酯键 限制酶识别序列的长度一般为4-8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。 识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” EcoR Ⅰ + 常见的限制酶剪切示意图 （5）结果： 产生黏性末端或平末端 提醒　 (1)作用：将 “缝合”起来，恢复被 切开的两个核苷酸之间的______________。 双链DNA片段 限制酶 磷酸二酯键 DNA连接酶 + 二、DNA连接酶——“分子缝合针” 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 ____________ ____________ 功能 缝合____________和____________，但E.coli DNA连接酶缝合平末端的 效率远低于T4 DNA连接酶 结果 恢复被限制酶切开的_________________ 大肠杆菌 T4噬菌体 黏性末端 平末端 磷酸二酯键 载体的作用 最常用载体：质粒 将外源基因送入受体细胞。 裸露、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA外，具有自我复制能力的环状双链DNA。 在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 大肠杆菌及质粒结构模式图 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 目的基因是一个DNA片段，不含有复制原点、不含有启动子和终止子。 为什么需要载体 思考：形成一个重组质粒会形成几个磷酸二酯键？ 四 种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。 载体必须具备的条件 ①具一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。 ②能够在宿主细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 ③具有某些标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 标记基因通常有 抗生素的抗性基因，如：抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)。 荧光蛋白基因，如：绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。 实验目的 1、DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。 2、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。 3、在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 1. 了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。 2. 学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。 目的要求 四、DNA的粗提取与鉴定 DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 （注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。） 材料用具 1.选材： 2.试剂： ①研磨液 ②体积分数为95%的酒精 ③2mol/L 的NaCl溶液 ④二苯胺试剂 ⑤蒸馏水 ——溶解并提取DNA ——析出DNA ——溶解DNA ——鉴定DNA，要现配现用 称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。 在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。 在上清液中加入体积相等的、 溶液, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。 2.去除杂质—— 3.DNA的析出—— 1.破碎细胞—— 洋葱 研磨液 上清液 上清液 预冷的酒精 白色丝状物 方法步骤 思考：如何评价结果？ ——看提取物颜色 ——看与二苯胺反应颜色的深浅 DNA纯度 DNA的量 用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。 将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min 4.DNA的鉴定—— 对照组：如何设置？ 二苯胺 阴性对照： 在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min 2mol/L的NaCl （1）选什么样的材料实验更易成功？用洋葱做材料，为什么要充分研磨？ （2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？ （3）如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？ 猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合； 鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。 含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。 充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。 加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。 思考与讨论： 如果是猪肝呢？ 鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。 基因工程的基本操作程序 PART 02 基因工程的基本操作程序 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 构建表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 表现出新性状的植株 导入植物 细胞 植物细胞 将目的基因插入染色体DNA中 目的基因 Ti 质粒 T-DNA 含重组Ti质粒的农杆菌 转入农杆菌 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。 目的基因 目的基因 一、目的基因的筛选与获取 基因通常是有遗传效应的DNA片段 但一段DNA片段不一定是基因 --ATGCATGCATCCATGCTAGCCATCCCTAAGGACAG--- --TACGTACGTAGGTACGATCGGTAGGGATTCCTGTC--- 基因1 基因2 非基因片段 请从DNA水平上给基因下一个定义，要求既能反映基因与DNA的关系，又能体现基因的作用。 筛选Bt基因作为转基因抗虫棉的目的基因的原因： ⑴用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。 ⑵苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关。 ①掌握了Bt基因的序列信息。 ②对Bt基因的表达产物—Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。 筛选合适的目的基因 序列数据库（如GenBank） 序列比对工具（如BLAST） 公共生物医学数据库、分析分子及基因组数据的软件工具NCBI 利用PCR获取和扩增目的基因 聚合酶链式反应PCR PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 PCR扩增仪 解旋酶 高温和解旋酶都可以使双链螺旋的DNA打开氢键，解开成为两条单链。 DNA聚合酶 母链(模板链) 子链(新合成的链) 四种脱 氧核苷酸 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 体外用高温代替 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶（体外用高温代替） 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 DNA 聚合酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 真核细胞和细菌的DNA 聚合酶都需要Mg²+激活。因此，PCR 反应缓冲溶液中一般要添加Mg²+。 3’ 在DNA复制时，DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始合成子链，必须由引物提供3’端之后才能开始连接脱氧核苷酸。 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 引物：是能与DNA母链互补配对的一小段短单链核酸序列。 RNA单链、DNA单链 由于DNA双链是反向平行的，所以需要两种引物。 5’ 5’ 3’ 3’ DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA有羟基（-OH）的一端称为3’端，而没有羟基的一端称为5’端。DNA的合成方向总是从5’端到3’端延伸。 注意： 5’ 3’ 5’ 3’ 扩增的过程： 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 加热至90℃使双链分开 冷却至50℃左右使引物与DNA结合 ①变性 ②复性 ③延伸 90℃以上 50℃左右，引物与模板结合 72℃左右，DNA 从5’到3’延伸 冷却 加热 3’ 5’ 3’ 5’ DNA合成 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ ①变性 ②复性 ③延伸 第一轮产物 循环 1、复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？ 思考 复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，原因是： ①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。 ②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 2、用PCR可以扩增mRNA吗？ 不能！由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。 3、获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？ 至少要三次循环。 4、如何对产物进行鉴定？ 琼脂糖凝胶电泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。 5、获得目的基因后直接转入受体吗？ 不是，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。 拓展 1.比较体内DNA复制和PCR技术的异同 项目 体内DNA复制 PCR技术 不 同 点 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温作用下变性解旋 场所 细胞内(主要 在细胞核内) PCR扩增仪(PCR仪)内 酶 解旋酶、DNA 聚合酶 耐高温的DNA聚合酶 温度条件 细胞内的温度条件 需控制温度,在较高温度下进行 结果 形成完整的 DNA分子 短时间内可形成大量的DNA片段(目的基因) 相同点 (1)模板:均需要DNA的两条链作为模板; (2)原料:均为4种脱氧核苷酸; (3)酶:均需DNA聚合酶; (4)原则:均遵循碱基互补配对原则 2.PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA 分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物 的DNA分子数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 同时含两种引物 的DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2 共消耗引 物的对数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 含脱氧核苷酸链等 长的DNA分子数 0=21-2 0=22-4 2=23-6 2n-2n 基因表达载体的构建 PART 02 基因表达载体的作用： ①让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代； ②使目的基因能够表达和发挥作用。 基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。 启动子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，启动转录过程。 终止子：一段特殊DNA序列，位于基因的下游，终止转录。 二、基因表达载体的构建 “启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子” 启动子与终止子位于DNA分子中，作用：起始和终止转录过程。 起始密码子与终止密码子位于mRNA分子中，作用：起始和终止翻译过程。 基因表达载体构建的流程： ①用限制酶切割载体，使它出现一个缺口； ②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因； ③用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子。 目的基因 构建载体时，需要用同种限制酶切割载体和目的基因，以获得相同的黏性末端，便于两者顺利连接。但是由于被切割后的质粒本身也具备相同的黏性末端，所以会有一定概率的自身环化，你有办法解决这个问题吗？ 目的基因——载体连接物、 载体——载体连接物、 目的基因——目的基因连接物。 如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？ 双酶切（用两种不同末端的限制酶进行切割） -G -CTTAA -A -TCTAG 注意： 1、目的基因应插到启动子与终止子之间的部位。 2、目的基因的插入不能破坏标记基因。 3、切割质粒和获取目的基因的限制酶必须产生相同的末端。（碱基互补，便于连接） 拓展 1.限制酶的选择方法 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶,但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点,如图乙。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保产生相同的黏性末端。 ②质粒作为载体必须具备标记基因等,因此所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如(1)图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因;若所选酶的切割位点不是一个,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制原点区,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。 ③所选择的限制酶的切割位点应位于启动子和终止子之间,以确保目的基因可以转录。 2、双标记基因法筛选含目的基因的受体细胞 (1)原理:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果插入某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图,目的基因插入四环素抗性基因内部,则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种:含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 (3)筛选方法:将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌,如图1、2、3、4、5菌落,再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落,如图1、5菌落。最后,可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 将目的基因导入受体细胞 PART 03 方 法 1、植物细胞 常用方法： 受体细胞： 转化过程： 农杆菌转化法、花粉管通道法、基因枪法 体细胞 以农杆菌转化法为例： 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达 三、将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法 转化： 是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 农杆菌 农杆菌是生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞、并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的 转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。 根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别。 根据受体细胞不同，转化方法不同 ①可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株； ②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 花粉管通道法 ①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。 ②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 2、动物细胞 常用方法： 受体细胞： 转化过程： 显微注射法 受精卵 将含有目的基因的表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 显微注射法 利用显微注射将目的基因注入动物受精卵中，这个受精卵将发育成具有新性状的动物。是将目的基因导入动物受精卵最有效的方法。 3、微生物细胞 常用方法： 受体细胞： 转化过程： Ca2＋处理法 原核细胞（以大肠杆菌应用最广泛） Ca2+处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→重组表达载体与处理后的受体细胞混合→受体细胞吸收DNA分子 Ca2＋处理法 利用转基因大肠杆菌生产药物 目的基因的检测与鉴定 PART 04 目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道，这也是检查转基因抗虫棉是否培育成功的 一 步 四、目的基因的检测与鉴定 分子水平上的检测 检测是否插入目的基因 检测目的基因是否转录 检测mRNA是否翻译 DNA分子杂交 分子杂交 抗原-抗体杂交 DNA分子杂交法： 其基本原理是具有一定同源性的两条DNA单链，在一定条件下（适宜的温度等）可以按照碱基互补配对原则形成双链。杂交过程中，杂交的双方是待测的DNA和用放射性同位素标记的已知DNA片段（又称为基因探针）。 若待测DNA中有能与探针互补的特异性DNA片段，用于示踪的放射性同位素标记会指示出其所在的位置，表明目的基因已插入转基因生物染色体的DNA中。 个体水平上的检测 抗虫鉴定 棉铃虫 棉铃虫（死亡） (1)在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。 (2)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,作为新子链的合成起点,只能结合在母链的3'端,使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 (3)复性温度过高,则引物难以与模板链结合,温度过低则易使两条母链配对结合,均无法获得PCR产物。 (4)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。 (5)转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同,实质都是基因重组。 (6)导入的目的基因,可能存在于细胞质中,也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。 (7)农杆菌特点。 ①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 ②农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T⁃DNA转移到被侵染的细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 (4)农杆菌转化法中的两次拼接:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T⁃DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T⁃DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;两次导入:第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T⁃DNA导入受体细胞。 PCR技术和DNA复制的比较 如何筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果插入某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。如图所示,目的基因插入四环素抗性基因内部,则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种:含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 (3)筛选方法:将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培 养,能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌,如图中1、2、3、4、5菌落,再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图中能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落,如图中1、5菌落。最后,可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 PART 05 1、实验原理 利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 （1）利用PCR扩增DNA片段的原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 （2）DNA片段电泳鉴定的原理 五、DNA片段的扩增及电泳鉴定 2、目的要求 了解PCR和电泳鉴定的基本原理。 尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。 3、材料用具 PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）、4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。 微量移液枪 PCR仪 电泳装置 PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 总体积 50μL 4、方法步骤 （1）DNA片段的扩增 ①移液：用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 ②离心：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在管的底部。 ③反应：参照书中P85表格的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 （2）DNA片段的电泳鉴定 ①配制琼脂糖溶液：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 ②制备凝胶： a.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 b.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 c.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 ③加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 ④电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 ⑤观察记录：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 注意 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 结果 5、结果分析与评价 （1）你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ （2）你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分；各反应成分的用量不当；PCR程序设置不当等。 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 核心突破 1．RT­-PCR(逆转录PCR) 常规的PCR过程是由DNA依赖的DNA聚合酶以DNA作为模板进行扩增的，而逆转录PCR则由依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。首先，由逆转录酶将RNA单链转录为与其互补的DNA(cDNA)，再通过常规PCR和相应引物进行另一DNA链的合成以及DNA双链的扩增。逆转录PCR是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA，广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。 2．不对称PCR   不对称PCR是利用不等量的一对引物经PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA)的过程，这对引物分别称为非限制性引物和限制性引物，两条引物的比例通常为100∶1，这样随着PCR反应的进行，浓度低的引物很快被消耗光，高浓度引物随即产生大量的目的ssDNA。低浓度引物的加入保证了扩增过程具有足够多的模板，而高浓度引物则保证了ssDNA的大量合成。 3．反向PCR   反向PCR是克隆基因组已知序列旁侧序列的一种方法。其原理是选取已知序列中不存在的内切酶对基因组进行酶切，使已知序列和待检测的旁侧序列位于同一片段被切下，然后对该片段进行自身环化。以该环化DNA作为模板，根据已知序列设计一对反向引物进行扩增，从而获得所需的未知序列信息。利用该技术也可以实现对现有的环状DNA(如质粒)的线性化。 4．巢式PCR 巢式PCR先用待扩增DNA外侧的一对引物完成一次PCR，再将其作为模板，根据原来引物内侧的序列设置新的引物，再次完成第二次PCR。由于第二次PCR的模板DNA片段更短，引物更小因此可以减少第一次扩增中出现的非特异性扩增片段，提升扩增的精确性。但由于操作过程中的开盖处理，会增加产物污染的概率。图示如下： 5．重叠延伸PCR 重叠延伸PCR是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术，可通过定点诱变在体外改造DNA分子，并将改造后的目的基因导入质粒构建目的基因表达载体。 (1)上图所示的重叠延伸PCR中，PCR1的引物是引物A、引物C。PCR4可获得大量的定点诱变目的基因，此时的引物为引物C、引物D。PCR3时模板DNA不能选择DNA分子③的原因是子链的延伸方向只能从5′→3′，以DNA分子③作模板时子链不能延伸。 (2)为使重叠延伸PCR改造后的目的基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)能与载体正确连接，PCR4时，应在基因上、下游引物的5′端分别添加限制酶KpnⅠ、EcoRⅠ的酶切位点。 6．荧光定量PCR (1)荧光染料 荧光染料与DNA双链结合时发出荧光信号，不掺入链中的(游离的)染料不会发出任何荧光信号。 (2)荧光探针，以TaqMan荧光探针为代表。 ①荧光探针的组成 ②荧光探针(TaqMan)工作原理 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光猝灭基团。探针完整时，荧光报告基团发射的荧光信号被荧光猝灭基团吸收；PCR扩增时，TaqDNA聚合酶的5′→3′外切酶活性将探针酶切降解，使荧光报告基团和荧光猝灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。图示如下： 能力提升 PART 03 一、教材知识链接 1．限制酶主要从原核生物中分离得到的原因： 。 2．质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件： 。 3．目前，在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶，而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因： 。 4．启动子的位置和生物作用： 。 片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，它能驱动基因转录出mRNA 启动子是位于基因上游一段有特殊结构的DNA 存在并大量复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点 能在宿主细胞内稳定 Taq DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下 会失活 具有限制酶的原核细胞可选择性地破坏不同于自身DNA的外来DNA，从而适应环境 原核细胞易受外源DNA的侵袭， 5．终止子的位置和生物作用： 。 6．农杆菌转化法中农杆菌的作用： 。 7．转移的基因能在受体细胞内表达的原因： 。 8．原核生物作为转基因受体细胞的优点： 。 9．用两种不同限制酶同时处理质粒和含目的基因的片段的主要优点： 。 的DNA片段，使转录在所需要的地方停下来 终止子是位于基因下游的一段有特殊序列结构 裸子植物，其所含的Ti质粒上的T－DNA可转移并整合到受体细胞染色体的DNA上 农杆菌可在自然条件下感染双子叶植物和 生物界共用同一套遗传密码 遗传物质相对较少等特点 原核生物具有繁殖快、多为单细胞、 止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化和反向连接 可以防 10．现要通过基因工程的方法获得某蛋白，若在启动子的下游直接接上编码该蛋白的DNA序列(TTCGCTTCT…CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出该蛋白，原因是 。 11．不同生物的DNA能拼接的原因： 。 12．基因工程检测目的基因是否导入、转录、翻译的方法依次为： 。 录出的mRNA无起始 编码该蛋白的DNA序列起始端无ATG，转 苷酸组成 DNA都是双螺旋结构，都由四种脱氧核 和转录通过PCR技术检测、是否翻译用相应的抗体进行抗原—抗体杂交 是否导入 1．若PCR扩增过程加入模板DNA片段a个，经过n次循环后，产生的DNA片段中含有模板DNA片段的DNA个数为_       个，试分析原因：                                   。 2．某同学认为PCR过程中不同的DNA片段变性时温度是不同的，你认为他的说法正确吗？          。说明你的理由：                                                 。 3．培育转基因生物的核心工作是                                  。构建基因表达载体的 目的：                                                                                                         二、教材深挖拓展 2a DNA是半保留复制， 一开始的模板链最终分布在子代DNA分子中 正确 变性的目的是通过升高温度破坏氢键，将 DNA分子双链解聚为单链，不同片段的DNA分子中氢键的数量不同导致稳定性不同 基因表达载体的构建 ①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；②使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 4.通过PCR技术获取足够量的目的基因后，能够直接导入受体细胞吗？     。原因是  。 5.农杆菌转化法要将目的基因插入农杆菌质粒的T-DNA 片段的原因是 。 6.如果改用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞，与农杆菌转化法相比，其具有的优点是 。 细胞分裂进行复制，不能稳定遗传和表达 若将目的基因直接导入受体细胞，目的基因可能被受体细胞分解或无法随 不能 Ti质粒 上的T-DNA片段可以整合到受体细胞的染色体DNA上 操作简便；无需组织培养即可获得植株(答出一点即可，其他答案 合理也可) 真题练习 PART 04 1．(2025·广东选择考)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的(　　) A．1′－碱基 B．2′－氢 C．3′－羟基 D．5′－磷酸基团 C 2．(2025·安徽选择考)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是(　　)  A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素， 生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因， 筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多， 原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 C 3．(2023·重庆选择考)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　)   A．其中一个引物序列为5′—TGCGCAGT—3′ B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶 B $