2026届高三一轮复习生物：基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取)课件

基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取) 生物 大 一 轮 复 习 第54课时 基因工程的基本工具 < 考点一 > 考点一 重组DNA技术的基本工具 一、基因工程的概念 　　指按照人们的愿望, 通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 别名： 操作环境： 操作对象： 操作水平： 工程原理： 最终目的： 生物体外 基因 DNA分子水平 基因重组 【归纳定义】 重组DNA技术 定向改造生物性状 基因工程的理论基础 提醒 考点一 重组DNA技术的基本工具 二、重组DNA技术的基本工具 “分子手术刀” “分子缝合针” “分子运输车” 限制性内切核酸酶 载体 DNA连接酶 考点一 重组DNA技术的基本工具 二、重组DNA技术的基本工具 1、限制性内切核酸酶（也称“限制酶”——”分子手术刀“） 主要从原核生物中分离纯化而来 ①来源： 选择性必修3 P71“旁栏思考”：原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 提示　切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。 教材隐性知识 考点一 重组DNA技术的基本工具 二、重组DNA技术的基本工具 1、限制性核酸内切酶（也称“限制酶”——”分子手术刀“） 主要从原核生物中分离纯化而来 ①来源： 数千种 ②种类： ③特点： 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 专一性 选择性必修3 P71“旁栏思考”：限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 提示　原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰 教材隐性知识 考点一 重组DNA技术的基本工具 EcoRⅠ ……G-A-A-T-T-C…… ……C-T-T-A-A-G…… HindⅢ ……A-A-G-C-T-T…… ……T-T-C-G-A-A…… BamHⅠ ……G-G-A-T-C-C…… ……C-C-T-A-G-G…… 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。 考点一 重组DNA技术的基本工具 二、重组DNA技术的基本工具 1、限制性核酸内切酶（也称“限制酶”——”分子手术刀“） ④作用： 断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键 磷酸二酯键 EcoRⅠ (识别GAATTC序列,在G与A之间切割) 考点一 重组DNA技术的基本工具 二、重组DNA技术的基本工具 1、限制性核酸内切酶（也称“限制酶”——”分子手术刀“） ⑤作用结果： SmaⅠ (识别GGGCCC序列,在G与C之间切割) 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 黏性末端 平末端 中心轴线两侧 中心轴线处 切割一次，形成一个切口，两个黏性末端 5' 5' 3' 3' 考点一 重组DNA技术的基本工具 二、重组DNA技术的基本工具 G A A T T C C T T A A G G A A T T C C T T A A G G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G 用同种限制酶切割(EcoRⅠ) 把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？ 思考： 考点一 重组DNA技术的基本工具 二、重组DNA技术的基本工具 G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G 考点一 重组DNA技术的基本工具 A G A T C T T C T A G A G G A T C C C C T A G G A T C T A G G A T C T A G C C T A G G A T C C G 用两种不同限制酶切割 同种限制酶产生的黏性末端相同，不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端，黏性末端相同的片段可以进行连接 考点一 重组DNA技术的基本工具 二、重组DNA技术的基本工具 缺口怎么办？ A T C T A G G A T C T A G C C T A G G A T C C G 考点一 重组DNA技术的基本工具 二、重组DNA技术的基本工具 2、DNA连接酶（——”分子缝合针“ ） ① 作用： 将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。 ②类型： a、E·coli DNA连接酶： b、 T4 DNA连接酶： 来源于大肠杆菌，只能“缝合”黏性末端 来源于T4噬菌体，“缝合”黏性末端和平末端 效率较低 比较DNA连接酶和DNA聚合酶 种类 DNA聚合酶 DNA连接酶 不 同 点 作用 实质 催化 加到已有脱氧核苷酸片段上，形成 . 催化两个 之间形成 . 作用 结果 催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子 催化具有 黏性末端或平末端的 连接起来，形成 . 模板 . . 相同点 ①化学本质都是蛋白质； ②都是催化形成 . 两个DNA片段 磷酸二酯键 不需要 互补 DNA片段 重组DNA分子 单个脱氧核苷酸 磷酸二酯键 磷酸二酯键 需要 DNA连接酶、限制酶、 DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较 项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA酶 作用部位 作用对象 作用结果 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 DNA片段 DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA DNA 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割双链DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 考点一 重组DNA技术的基本工具 二、重组DNA技术的基本工具 3、载体（——”分子运输车“） 作为运载工具，携带外源DNA片段进入受体细胞。 ①作用： 质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒 ②种类： 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 a、来源：真核或原核细胞 b、结构：环状双链DNA C、特点：能自我复制 考点一 重组DNA技术的基本工具 二、重组DNA技术的基本工具 3、载体（——”分子运输车“） ③载体应具备的条件（特点）： c、有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选 a、有一或多个限制酶切割位点 b、能在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制 通常是抗性基因，也可以是荧光蛋白基因） 考点一 重组DNA技术的基本工具 标记基因的筛选原理 考点一 重组DNA技术的基本工具 模拟重组DNA过程 目的基因 质粒 重组DNA 考点一 重组DNA技术的基本工具 …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG 模拟重组DNA过程 通常用两种不同限制酶同时切割目的基因和载体（双酶切法）： 防止载体自身连接、目的基因自身环化和确保目的基因插入的方向 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 一、DNA的粗提取与鉴定 1、基本原理： 不溶于 2 mol/L 二苯 胺 沸水浴 0 0.14 NaCI浓度（mol/L） DNA溶解度 考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定 2、实验材料： 新鲜洋葱（香菜、菠菜、菜花或猪肝等） 不能用哺乳动物成熟的红细胞（如猪血细胞），因为无细胞核和各种细胞器 可以用鸡血细胞，需加入柠檬酸钠，防止血液凝固 一、DNA的粗提取与鉴定 DNA含量高、材料易得、便于提取 1.取材、研磨 2.过滤或离心取上清液 3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA 4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定 三、方法步骤 提取DNA 步骤一：研磨破碎细胞，获取DNA 研磨液成分 作用 SDS 使蛋白质变性 EDTA 抑制DNA酶 Tris-HCl缓冲液 稳定DNA ①研磨时间不宜太长，也不宜太用力 ②可以加入适量的纤维素酶、果胶酶 ③若用植物叶片当实验材料，为了除去细胞中的糖，可事先黑暗处理 注意事项： 三、方法步骤 ①研磨的目的？ 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 称取约 洋葱， ，然后放入研钵中，倒入 ，充分研磨。 30g 切碎 10 mL研磨液 如果实验材料是鸡血细胞，获取DNA滤液的方法一样吗？ 用蒸馏水破碎细胞，因为血细胞在蒸馏水中大量吸水涨破。 26 步骤二： 提取DNA 过滤 3、实验收集的是上清液还是沉淀呢？ 上清液 1、实验用滤纸还是纱布过滤？ 纱布，为了减少DNA的损失 2、低温放置几分钟的作用？ 抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； 4、粗提取的DNA中可能会含有哪些杂质？ 蛋白质、多糖、RNA等杂质 三、方法步骤 27 向上清液中加入等体积的（95%）预冷酒精溶液，静置2-3min，用玻璃棒沿着同一方向缓慢搅拌，卷起白色丝状物。 步骤三：析出DNA 提取DNA 问题2：若提取物不是白色丝状物，可能原因是什么？ 问题1：为什么沿着同一方向缓慢搅拌？ 防止DNA断裂。 含较多杂质 三、方法步骤 实验中出现的丝状物的主要成分是 DNA ，实际上每一根“丝”都是由许多 DNA 分子聚集在一起形成的。 28 1号试管 2号试管 丝状物(DNA) 用玻璃棒搅拌 加入二苯胺试剂 沸水浴 冷却后，观察现象 不变蓝 变蓝 DNA的鉴定 不加入 加入 加入2mol/L NaCl溶液 2mL 2mL 2mL 5min 丝状物溶解 5min 2mL 无 若实验组颜色不变蓝，可能原因是？ ①实验材料的选取失误 ②材料中的核DNA没有充分释放，如研磨不充分或收集的滤液的量过少 ③加入酒精后摇动或搅拌过猛，DNA被破坏 三、方法步骤 0.14 NaCI浓度（mol/L） DNA溶解度 29 (1)使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端(2024·贵州，13D)(　　) (2)羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料(2020·海南，10A)(　　) √ × 判断正误 (3)向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻璃棒上有白色丝状物(　　) × (4)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行 (2022·湖北，4A)(　　) × 分析限制酶的作用和选择 将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶 关键能力 提升 EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请思考以下问题： (1)限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割产生的黏性末端分别是________________ __________和_____________________。 (2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。 提示　用限制酶MunⅠ和Spe Ⅰ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同， 实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。 考向一　辨析基因工程的基本工具 1.(2023·新课标，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 迁移应用 评价 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 √ 2.质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是 项目 细菌在含氨苄青霉素 的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 项目 细菌在含氨苄青霉素 的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 √ 考向二　DNA的粗提取与鉴定 3.(2024·安徽，14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是 A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白 质杂质 √ 4.(2024·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是 A.整个提取过程中可以不使用离心机 B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 √ 基因工程的基本操作程序 < 考点二 > 考点二 基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建（核心） 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 加 工 mRNA前体 成熟mRNA 不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列 编码序列=外显子 1 2 3 4 5 一.目的基因的筛选与获取---基因的结构 （2）真核生物基因 转 录 剪切、拼接 同一个体不同体细胞中基因转录的起点是否相同？ 考点二 基因工程的基本操作程序 一、目的基因的筛选与获取 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状的或获得预期表达产物的基因。 1.目的基因： 编码蛋白质的基因，或具有调控作用的因子 2、筛选合适的目的基因 ①从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用 和序列比对工具进行筛选。 结构和功能清晰 序列数据库 2.目的基因获取方法 从基因文库中获取 通过人工合成 利用PCR获取和扩增目的基因 基因组文库 部分基因文库（主要是cDNA文库） 基因文库： 从基因文库中直接获取： 基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。 部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。 44 与载体连接 导入受体菌群 用适当 限制酶切割 （1）基因组文库的构建 提取某生物 全部DNA 许 多 DNA片段 该生物 基因组文库 （每个受体菌含有一段不同的DNA片段） （2）cDNA文库的构建——mRNA逆转录形成 mRNA （某一发育时期） 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA DNA聚合酶 双链cDNA (cDNA) 与载体连接 导入受体菌群 该生物 cDNA文库 基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子。cDNA文库中的基因不含以上结构 人工合成： DNA合成仪 （1）前提： （2）方法： 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因 46 考点二 基因工程的基本操作程序 一、目的基因的筛选与获取 ②PCR 和扩增目的基因 获取 b、PCR反应的条件： 一定的缓冲溶液（一般添加Mg2+激活DNA聚合酶） DNA模板（需含有目的基因） 四种脱氧核苷酸(或dNTP） 耐高温的DNA聚合酶 （不需要解旋酶，DNA在高温下解旋） 2种引物 能严格调控温度的温控设备 PCR——聚合酶链式反应 PCR根据DNA半保留复制的原理 PCR根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。在该过程中，引物非常关键，回答下列有关引物的问题： 考点二 基因工程的基本操作程序 (1)什么是引物？ (2)PCR技术为什么需要引物？ A T C G A A T C G G T T T A G C T T A G C C A A DNA 聚合酶 母链 DNA 子链 DNA 引物 3′ 5′ 5′ DNA聚合酶不能从头合成子链，只能从3’端延伸DNA链 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 3′ 引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3’端连接脱氧核苷酸 考点二 基因工程的基本操作程序 (3)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？ 提示　目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 (5)在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是什么？ 提示　两种引物之间不能互补配对。 考点二 基因工程的基本操作程序 (4)为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么？ 提示　引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)。 考点二 基因工程的基本操作程序 一、目的基因的筛选与获取 ②PCR 和扩增目的基因 获取 c、PCR反应的过程： 90 单链 50 引物 72 d、PCR产物的鉴定： 常采用琼脂糖凝胶电泳法来鉴定。 第 一 次 循 环 90℃以上，DNA双链解开 50℃左右，引物与DNA结合 72℃左右，新DNA合成 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ 第 二次 循 环 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 第 三次 循 环 3’ 5’ 要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。 如果循环n次， 则共需消耗 个引物。 则共需消耗 对引物。 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 2n－1 2n+1－2 PCR扩增过程中产生等长的目的基因片段的分析 含目的基因的DNA分子在PCR仪中经过n次循环后产生等长的目的基因片段有 个。 2n – 2n 呈指数形式扩增（n次扩增后，DNA数量约为2n） PCR结果： ①n代后，DNA分子有_____个 ②n代后，DNA链有_____条 ③第____代出现完整的目的基因 ④n代后，含引物的DNA分子有__ ___个 ⑤n代后，共消耗__ ___个引物 ⑥第n代复制，消耗了______个引物 ⑦n代后，完整的目的基因有__ __个 2n 2n+1 3 2n 2n+1-2 2n 2n-2n PCR技术与细胞内DNA复制的比较 比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术 区别 解旋方式 场所 引物 酶 温度 结果 联系 解旋酶催化，边解旋边复制 高温变性解旋，全部解旋后再复制 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR仪内) RNA 通常是DNA 解旋酶、DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） 细胞内温和条件 在不同温度(较高)下进行 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ③原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ②酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3’端合成子链 1.目的基因的筛选和获取 考点二 基因工程的基本操作程序 二、基因表达载体的构建——基因工程的核心 1、目的：使目的基因 ，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代 启动子 标记基因 2、基因表达载体的组成及作用： 【说明】有时为了满足应用需要，会在载体上人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 考点二 基因工程的基本操作程序 提醒　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 基因表达载体的构建（基因工程的核心） ①单酶切 单酶切缺点: 质粒重新环化 目的基因自身环化 质粒与目的基因反向连接 基因表达载体的构建（基因工程的核心） ②双酶切的优点: 防止质粒重新环化 防止质粒与目的基因反向连接 防止目的基因自身环化 种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化过程 目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞（感受态）→基因表达载体导入细胞中 考点二 基因工程的基本操作程序 三、将目的基因导入受体细胞 能发育成完整个体 繁殖快、单细胞、遗传物质少 考点二 基因工程的基本操作程序 Ti质粒 目的基因 构建基因表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 转入 农杆菌 含重组Ti质粒的农杆菌 植物细胞 导入植物细胞 表现出新性状的植物 将目的基因插入染色体DNA中 T-DNA 植物组织培养 注意：1、农杆菌转化法过程 可转移的DNA 特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力 【说明】随着转化方法的突破，利用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 考点二 基因工程的基本操作程序 辨析：①农杆菌转化法小结： Ti质粒 目的基因 构建 基因表达载体 转入 农杆菌 导入 植物细胞 T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中 表达 新性状 该过程经过____次拼接、____次导入？ (1)第一次拼接___________________________ (2)第二次拼接___________________________ (3)第一次导入___________________________ (4)第二次导入___________________________ 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作） 两 两 将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌 含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作） 优先选择受伤的叶片与重组质粒的农杆菌培养，叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌 考点二 基因工程的基本操作程序 辨析：②转化： 转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 考点二 基因工程的基本操作程序 四、目的基因的检测与鉴定 (如分子杂交技术) 原理：抗原抗体特异性结合 考点二 基因工程的基本操作程序 △DNA分子杂交技术——检测目的基因是否插入 15N 15N 变性 变性 探针（PCR扩增） 转基因生物的DNA 杂交DNA分子 （PCR扩增） 出现杂交带 考点二 基因工程的基本操作程序 △分子杂交技术——检测目的基因是否转录 探针（PCR扩增） 出现杂交带 转基因生物的mRNA 15N 15N 变性 DNA-RNA 杂交分子 分析基因工程的基本操作程序 接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙型肝炎病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙型肝炎病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题： (1)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。为确保目的基因可以正常表达，其上下游序列需具有 。 关键能力 提升 用于筛选含有重组表达载体的细胞 启动子和终止子 (2)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 并用 扩增，电泳后观察是否扩增出目的基因。 (3)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。_______________________________________________ _________________________________。 染色体DNA(基因组DNA) PCR 从酵母细胞中提取蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测是否出现杂交带 考向三　辨析基因工程的基本操作程序 5.(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是 迁移应用 评价 A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的 培养基中能形成菌落 √ 6.(2024·永州三模)HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。如图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如图，下列叙述正确的是 A.①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4种游离的核糖核苷酸等组分 B.目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼 接前应先在目的基因两端分别引入 EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列，拼接前 载体用MfeⅠ和HindⅢ切割 C.利用PCR扩增目的基因时，反应缓冲 溶液中一般要加入Mg2＋的目的是维 持渗透压稳定 D.利用鸡输卵管生物反应器生产HA蛋 白可以大规模用于禽流感疫苗制备 √ 1.下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是 A.与洋葱相比，猪血更适合作为DNA的粗提取与鉴定实验的材料 B.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 C.因DNA溶于酒精但蛋白质不溶于酒精可分离DNA与蛋白质 D.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，取沉淀进一步实验 E.预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解 F.加入预冷酒精析出白色丝状物的过程中用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌 G.两次离心，第一次DNA主要存在于上清液中，第二次主要存在于沉淀物中 H.将提取的丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，将二苯胺试剂加入就能出现蓝色 √ √ √ √ 查落实固基础 2.下列关于基因工程中工具酶的叙述，正确的是 A.限制性内切核酸酶可以从某些原核生物中提取 B.限制性内切核酸酶也可以识别和剪切RNA C.不同限制性内切核酸酶可能切割出相同的黏性末端 D.DNA连接酶连接的是两条链碱基对之间的氢键 E.E.coli DNA 连接酶只能将有互补黏性末端的两个DNA 片段连接起来 √ √ 3.下列关于基因工程中载体的叙述，错误的是 A.基因工程中所用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等 B.基因工程中用的载体大多数为天然质粒 C.质粒是常用的载体，有2个游离的磷酸基团 D.必须具有自我复制能力 E.具有一个至多个限制酶切割位点，以便目的基因的插入 F.载体质粒中必须有抗生素抗性基因，便于重组DNA分子的筛选 √ √ √ 4.下列关于基因表达载体及其构建过程的说法，正确的是 A.基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建 B.构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗 传给下一代 C.一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终止 密码子等结构 D.基因表达载体的构建至少需要两种工具酶 E.基因表达载体的构建过程中会发生碱基互补配对 F.诱导物与诱导型启动子结合可激活或抑制目的基因表达 G.基因表达载体中启动子具有DNA聚合酶的结合部位，启动复制过程 √ √ √ √ √ 5.下列关于将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的 A.农杆菌转化法是利用土壤农杆菌侵染植物细胞，然后将重组Ti质粒整合到受 体植物细胞的染色体DNA上 B.将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时，可以用钙离子处理细菌 C.应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T－DNA片段内 D.将目的基因导入动物细胞常用体细胞作受体细胞，采用显微注射技术进行操作 E.可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译 F.某抗虫基因转基因是否成功，最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状 √ √ √ 课时精练 对一对 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 题号 1 2 3 4 5 6 答案 B B D B D ABC (1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸) (2)EcoR Ⅰ　酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接(反向链接) (3)酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段　PCR (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 7. (1)蔗糖　参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解成葡萄糖　单位时间内葡萄糖的生成量(或蔗糖的减少量等) (2)NV基因　＞　突变体NV基因中插入了T－DNA序列，使基因中碱基对增加而发生突变 (3)突变体　便于筛选出成功导入NV基因的细胞 8. 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 1 (1)BglⅡ、BstE Ⅱ　—CATTG (2)3　核酸染料 (3)N　2、3 (4)A菌　B菌分解纤维素能力比A菌更强 9. 一、选择题：每小题给出的四个选项中只有一个符合题目要求。 1.(2024·湖南，5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是 A.限制酶失活，更换新的限制酶 B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 √ 2.(2022·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是 A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 3.(2023·广东，11)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是 A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 √ 4.(2024·衡阳调研)当苹果削好皮或切开后放置一会儿，切口面的颜色就会由浅变深，最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物。酚类化合物易被氧化成醌类化合物，即发生变色反应变成黄色，随着反应的量的增加颜色就逐渐加深，最后变成深褐色。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。如图是培育抗褐变的转基因苹果的过程，下列叙述不正确的是 C.步骤④阶段使用的MS培养基中要加入植物激素和卡那霉素等物质 D.为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入含pBI 121质粒的植 株作对照 A.要想获得抗褐变的转基因 苹果，目的基因可选择抑 制酚氧化酶表达的基因 B.实施步骤①是需要限制性 内切核酸酶和DNA聚合 酶的参与 1 2 3 4 5 6 7 8 9 √ 答案 二、选择题：每小题给出的四个选项中有一个或多个符合题目要求。 5.(2024·衡阳三模)CRISPR－Cas系统包含CRISPR基因和Cas基因(CRISPR关联基因)两部分，其中CRISPR是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列，当病毒入侵后，某些细菌能够把病毒基因的一小段存储到CRISPR，Cas基因则位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用，CRISPR－Cas系统的组成如图所示，现在CRISPR－Cas9(由一条单链向导RNA和内切核酸酶Cas9组成)已发展成为对靶向基因进行特定修饰的第三代基因编辑技术。下列相关叙述错误的是 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 A.CRISPR－Cas系统在基因编辑过程中起到限制酶的作用 B.该实例说明寄生物与寄主之间存在协同进化 C.内切核酸酶Cas9具有专一性 D.CRISPR基因经过转录翻译之后可以与内切核酸酶Cas9对目的基因进行 切割 √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 6.(2024·湖南师大附中二模)乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量；酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌内催化乳酸生成的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产生 乳酸的酵母工程菌株。如图为通过双酶切构建重组质粒的过程。GTG为原核生物偏好的起始密码子编码序列，ATG为真核生物偏好的起始密码子编码序列。下列说法不正确的是 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 A.引物2的3′端序列应包含XbaⅠ 的识别序列 B.重组质粒以能合成尿嘧啶的酵母 菌株为受体 C.PCR反应时，缓冲液中一般要添 加Ca2＋来激活相关酶 D.引物1的5′端序列应考虑将GTG 改为ATG √ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 √ √ 三、非选择题 7.(2024·重庆，19)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 (1)基因S启动子的基本组成单位是___________________________。 脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸) (2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是_________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是_____________________________________________________ ______________________________。 EcoR Ⅰ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接(反向链接) (3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有_________________________________________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是_____。 酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 PCR (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_______________________________________________________ ______________。 品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 高，种子更大 8.(2024·贵州，21)研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型(含NV基因)、突变体(NV基因突变)和转基因菌株(转入NV基因)，检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示(表中“＋”表示有，“－”表示无)。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中) 野生型 ＋ ＋ ＋ 野生型 － － － 突变体 ＋ － － 转基因菌株 ＋ ＋ ＋ 回答下列问题： (1)据表可推测______诱导了NV基因表达。NV酶的作用是_____________ _________________________。检测NV酶活性时，需测定的指标是_____ ______________________________________(答出1点即可)。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 蔗糖 代谢，将蔗糖分解成葡萄糖 参与蔗糖分解 时间内葡萄糖的生成量(或蔗糖的减少量等) 单位 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中) 野生型 ＋ ＋ ＋ 野生型 － － － 突变体 ＋ － － 转基因菌株 ＋ ＋ ＋ (2)表中突变体由T－DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与________(填“T－DNA”或“NV基因”)配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度_____(填“>”“＝”或“<”)野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是_______________________________ _________________________________。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 NV基因 突变体NV基因中插入了T－DNA序 ＞ 列，使基因中碱基对增加而发生突变 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中) 野生型 ＋ ＋ ＋ 野生型 － － － 突变体 ＋ － － 转基因菌株 ＋ ＋ ＋ (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入________细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是________________________________。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 突变体 便于筛选出成功导入NV基因的细胞 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中) 野生型 ＋ ＋ ＋ 野生型 － － － 突变体 ＋ － － 转基因菌株 ＋ ＋ ＋ 9.(2024·衡水模拟)研究人员从分解纤维素的细菌(A菌)中提取出一种纤维素酶基因(CBHⅡ)并进行PCR扩增，然后与高效表达载体pUT质粒(图1)连接构建成重组质粒并导入A菌，从而获得分解纤维素能力更强的工程菌(B菌)。请回答下列问题： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 几种限制酶识别序列及酶切位点 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 限制酶 识别序列及酶切位点 BglⅡ 5′－A↓GATCT－3′ BstE Ⅱ 5′－G↓GTNACC－3′ (N为任意碱基) Sac Ⅰ 5′－GAGCT↓C－3′ Msp Ⅰ 5′－C↓CGG－3′ BamH Ⅰ 5′－G↓GATCC－3′ (1)构建成重组质粒时，应选择限制酶______________对pUT质粒进行酶切，经酶切后形成了两个DNA片段(X和Y)，X两端的黏性末端分别为 －CTAG和－CAATG，则Y两端的黏性末端分别为－CTAG和_________。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 BglⅡ、BstEⅡ —CATTG (2)CBHⅡ基因中无上述限制酶的酶切位点，两端需添加相关酶切位点才能在酶切后与pUT质粒连接，PCR扩增过程中，最早经过____轮循环后，便可获得两端均携带限制酶识别序列的所需双链目的基因。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。为了能在波长为300 nm紫外灯下检测出DNA分子，需要在琼脂糖溶液中加入适量的__________。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 3 核酸染料 (3)为鉴定重组质粒是否构建成功以及是否成功导入A菌，将其接种在含抗生素_____(填“M”或“N”)的培养基上培养，将3个不同菌落扩大培养后提取质粒分别进行双酶切并进行电泳，结果如图3所示(片段过小时检测不到条带)。据图分析，菌落______中成功导入了重组质粒。 N 2、3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 (4)为检测B菌的纤维素分解能力，将含有20%纤维素的培养基均分为三组，进行不同处理后，在相同条件下培养一段时间，测定培养基中纤维素含量，结果如图4所示，对照组2的处理为接种_____，说明__________ ___________________。 A菌 维素能力比A菌更强 1 2 3 4 5 6 7 8 9 答案 B菌分解纤 $