2027届高三生物人教版二轮复习课件增分微专题❶　PCR的原理与应用

增分微专题❶　PCR的原理与应用 1 01.真题示例 02.专题强化练43 内容 索引 2 01.真题示例 返回导航 3 例1 (2025·河北卷)X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为，某患病男孩(其母亲没有患病)X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。 注：引物组合S1和S2，R1和R2可分别用于对正常基因D和H序列的扩增检测 返回导航 4 不考虑其他变异，下列分析错误的是 (　　) A．该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为 B．用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同 C．与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变 D．利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病 答案：AB 返回导航 5 解析：某患病男孩其母亲没有患病，可知该病为伴X染色体隐性遗传病，该病患者中男性显著多于女性，在男性中发病率为，则该致病基因d频率为，正常基因D基因频率为，女性中携带者的占比为2×，A错误；该男孩的母亲为携带者，基因型为XDXd，该男孩基因型为XdY，该男孩的染色体倒位，故用R1和R2不能扩增出产物来，母亲有正常的H基因，有产物，故对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果不同，B错误； 返回导航 6 该男孩的染色体倒位，故与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变，C正确；利用S1和S2进行PCR检测，有产物则含有正常D基因，若无产物，则含有致病基因，故可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病，D正确。 返回导航 7 例2 (2025·陕晋青宁卷)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 返回导航 8 (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、________________、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的________步骤中起作用。 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的________(填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5′-________-3′，切割载体时应选用的两种限制酶是________________，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 4种脱氧核苷酸 延伸 5′端 AGATCT BamHⅠ、EcoRⅠ 返回导航 9 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到 __________________________________，抗性基因____可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体DNA上 2 再分化 返回导航 10 解析：(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。 返回导航 11 (2)为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需要在引物的5′端添加相应的限制酶识别序列。为保证目的基因的正确插入，应使用双酶切；载体中含有BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ的酶切位点，S基因上含有Xba Ⅰ、Nde Ⅰ、BamH Ⅰ的酶切位点，为保证S基因结构的完整性，不能在S基因两端添加Xba Ⅰ、Nde Ⅰ、BamH Ⅰ的识别序列；分析表格数据， Bgl Ⅱ切割产生的黏性末端和BamH Ⅰ切割产生的黏性末端相同，结合S基因的转录方向和载体上启动子的转录方向可知，应在S基因上游添加BglⅡ的识别序列，即 5′-AGATCT-3′，下游添加EcoR Ⅰ的识别序列。因此，切割载体应选用的两种限制酶为BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ。 返回导航 12 (3)T-DNA属于可转移DNA，用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体DNA上，抗性基因1位于T-DNA外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2位于T-DNA内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 返回导航 13 [题后拓展] 1．常规PCR的原理流程及应用 返回导航 14 返回导航 15 返回导航 16 2．PCR中设计引物的意义及一般原则 意义 (1)DNA分子体外扩增时必须设计两种引物。 (2)设计引物的首要目标是其特异性，只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定结构时才能达到这个目标(如图)。 返回导航 17 一般原则 (1)引物的长度一般在20～30 bp(碱基)，太短则特异性不够强，太长则复性温度会比较高。 (2)引物G＋C含量以40%～60%为宜，太少扩增效果不佳，过多则易出现非特异性条带。4种碱基最好随机分布。 (3)两条引物之间不能有连续4个碱基的互补配对，否则加入的引物自身形成双链以至于得不到目的基因片段或影响PCR扩增反应的效率。 (4)一条引物自身不能有大于4 bp(碱基)的反向重复序列或自身互补序列的存在，这种序列可形成发夹结构。如果这种结构在PCR条件下稳定，它会非常有效地阻止引物和模板之间的复性。 (5)两条引物的复性温度相差不能大于5 ℃。操作时一般选择较低的那个复性温度，如果相差太大，另一条引物的非特异性结合就会增加 返回导航 18 3.引物的特殊应用 返回导航 19 [反馈即练] 1．(2024·河北卷)下列相关实验操作正确的是(　　) A．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果 C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落 答案：B 返回导航 20 解析：配制PCR反应体系时，应加入4种脱氧核糖核苷酸溶液作为扩增原料，A错误；凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，B正确；配制的酵母培养基先进行高压蒸汽灭菌处理，然后再倒平板，C错误；烧红的接种环需在酒精灯火焰旁冷却后才能蘸取菌液，否则会杀死菌种，D错误。 返回导航 21 2．(2024·浙江6月卷)阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 返回导航 22 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。 返回导航 23 (1)下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是 (　　) A．F1—R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1—R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 答案：D 返回导航 24 解析：根据图乙结果显示可知，F1－R1引物只扩增出一条片段，说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确；根据图乙信息可知，F1－R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确；根据图乙信息可知，F1－R1能扩增一条目的条带，F2－R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确；根据图乙显示可知，F1－R1引物只扩增出一条片段，F1－R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。 返回导航 25 (2)为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。 注：泳道号对应血样号。 返回导航 26 1～6号血样中，来自氯喹抗性患者的是 (　　) A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 答案：B 解析：根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，具有氯喹抗性的基因组中没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条条带则为敏感型，只有一条条带的为抗性，所以1～6号血样中，来自氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确，A、C、D错误。 返回导航 27 3．(2025·河南卷)某二倍体植物松散株型与紧凑株型是一对相对性状，紧凑株型适合高密度种植，利于增产。研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型∶紧凑株型＝3∶1，控制该相对性状的基因为A/a。回答下列问题： (1)该紧凑株型性状由_____(填“A”或“a”)基因控制。 a 返回导航 28 (2)在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因(图Ⅰ)，a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短。造成此现象的原因是 ________________________________________________________________________。 插入序列后，a基因中编码终止密码子的序列提前，a基因转录产生的mRNA 提前终止翻译 返回导航 29 (3)研究人员设计了3条引物(P1～P3)，位置如图Ⅰ(→表示引物5′→3′方向)。以3个F2单株(甲、乙、丙)的DNA为模板，使用不同引物组合进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图Ⅱ-A和Ⅱ-B(不考虑PCR结果异常)。 返回导航 30 ①图Ⅱ-A中使用的引物组合是________；丙单株无扩增条带的原因是_________________________________________________________ _____________。 ②结合图Ⅱ-A的扩增结果，在图Ⅱ-B中，参照甲的条带补充乙与丙的电泳条带(将正确条带涂黑)。 P2和P3 丙的基因型为AA，无引物P3的结合序列，利用引物P2和P3扩增时，无法 得到扩增产物 答案： 返回导航 31 ③使用图Ⅱ-A中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松散株型∶无扩增条带松散株型＝________。 2∶1 返回导航 32 解析：(1)根据题意可知，研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型∶紧凑株型＝3∶1，说明紧凑株型为隐性性状，由a基因控制。(2)在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因(图Ⅰ)，a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短，说明终止密码子提前出现，因此推测可能是A基因内部插入一段序列后，使a基因中编码终止密码子的序列提前，a基因转录产生的mRNA提前终止翻译。 返回导航 33 (3)①子二代中的基因型为AA、Aa、aa，根据题图可知，A和a基因上均含有P1和P2引物互补的序列，而P3引物识别的序列只有a基因中才存在，若选择引物P1和P2进行扩增，则A基因和a基因均能扩增出相应产物，只是a基因扩增的产物长度要大于A基因扩增的产物，即AA的个体扩增产物的电泳条带与aa的个体扩增产物的电泳条带不同，且Aa的个体扩增产物的电泳条带应为两条，与图A不符，若选择引物P3和P2进行扩增，则只有Aa和aa的个体中因含有a基因而能扩增出产物，且扩增出的产物电泳条带相同，而AA的个体由于不含与P3引物结合的序列，因此不能扩增出产物，没有对应的电泳条带。即图Ⅱ-A中使用的引物组合是P2和P3，丙的基因型为AA，无引物P3的结合序列，利用引物P2和P3扩增时，无法得到扩增产物。 返回导航 34 ②图Ⅱ-B中，甲的基因型为Aa，有两条条带，说明基因A和a都进行了扩增，故所选引物为P1和P2，由于基因a比基因A长，在电泳过程中移动慢，离点样孔近，故上面条带代表a，下面条带代表A。乙(aa)只有上面的条带，丙(AA)只有下面的条带，故乙与丙的电泳条带为： 返回导航 35 ③使用图Ⅱ-A中的引物组合(P3和P2)扩增F2全部样本，由于只有含a基因的个体才能扩增出相应产物，且A_为松散株型，而子二代中Aa∶AA＝2∶1，所以使用图Ⅱ-A中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松散株型(Aa)∶无扩增条带松散株型(AA)＝2∶1。 返回导航 36 02.专题强化练43 返回导航 37 1．(2025·江西赣州二模)科研人员利用PCR技术扩增人乳铁蛋白基因，并进行电泳鉴定。 返回导航 2 4 5 3 1 38 下列叙述正确的是 (　　) A．目的基因扩增时，应添加的引物组合为引物Ⅰ、Ⅳ或引物Ⅱ、Ⅲ B．PCR循环6次可得到5种DNA分子，其中等长的DNA分子共52个 C．电泳所需缓冲液和酶应分装成小份在－20 ℃储存，使用前在室温下解冻 D．鉴定DNA时，应向提取的DNA中加入二苯胺试剂并置于沸水中加热 答案：B 返回导航 2 4 5 3 1 39 解析：利用PCR技术扩增目的基因时，引物应与模板链的3′端互补配对，且两条引物分别结合在两条模板链上，这样才能使子链从5′端向3′端延伸。观察可知，应添加的引物组合为引物Ⅱ、Ⅲ，A错误；题图中的 PCR 循环 6 次，可以得到 2 种“长链/中链”DNA 分子，2 种“中链/短链”DNA 分子，1 种“短链/短链”DNA 分子，共 5 种；其中等长 DNA 分子共26－2×6＝52(个)，B正确；电泳所需缓冲液应分装成小份，并在－20 ℃储存，使用前从冰箱拿出放在冰块上缓慢融化，C错误；鉴定 DNA 时，应先将提取的 DNA 部分溶于装有 NaCl 溶液的试管中，然后向试管内加入二苯胺试剂，再将试管置于沸水中加热，D错误。 返回导航 2 4 5 3 1 40 2．(2025·山东德州二模)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是 (　　) A．PCR过程中预变性与最后一次循环时，变性时间较长可使DNA充分解聚 B．PCR过程中，复性温度过低会导致无法扩增出DNA片段 C．DNA的电泳速率与DNA分子的大小和构象有关，与凝胶浓度无关 D．将PCR产物、核酸染料和凝胶载样缓冲液混合后，用微量移液器加入加样孔 答案：A 返回导航 2 4 5 3 1 41 解析：在PCR过程中，预变性的目的是使模板DNA完全解聚为单链，最后一次循环时变性时间较长，能确保所有的DNA双链充分解聚，为后续可能的反应提供足够的单链模板，A正确。PCR过程中，复性温度过低会导致引物与模板错配，但一般不会导致无法扩增出DNA片段，只是可能会出现非特异性扩增等问题，B错误。DNA的电泳速率与DNA分子的大小、构象有关，同时也与凝胶浓度有关。凝胶浓度越大，孔隙越小，DNA分子迁移受到的阻力越大，C错误。进行电泳鉴定时，应先将PCR产物与凝胶载样缓冲液混合，然后加入加样孔，核酸染料一般是在制胶时加入到琼脂糖凝胶中，而不是与PCR产物、凝胶载样缓冲液一起混合，D错误。 返回导航 2 4 5 3 1 42 3．(16分)(2025·广西一模)塑料的主要成分为聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)和聚丙烯(PP)等，会造成难以降解的“白色污染”。自然界有多种细菌可以降解塑料的不同成分，研究人员欲通过筛选，并利用基因工程技术培育能降解多种塑料成分的“超级菌”。 返回导航 2 4 5 3 1 43 (1)研究人员欲比较大肠杆菌YT1和芽孢杆菌YP1两类细菌降解PE塑料的能力，配置固体培养基，接种菌株后表层覆盖0.1 mm厚的PE塑料。分组实验结果如表所示： 返回导航 2 4 5 3 1 44 ①筛选能分解PE塑料的菌株时，应将菌株接种到以________为唯一碳源的培养基，从功能上讲，属于________培养基。 ②培养基3中接种混合培养后的YP1，其降解圈直径明显加大，其原因可能是___________________________________________________ ________________。 PE/聚乙烯 选择 混合培养过程中发生了转化，YT1的对PE塑料分解能力更高的基因 整合到了YP1菌株中 返回导航 2 4 5 3 1 45 (2)研究人员发现一种胞外酶基因A，有降解PVC塑料的功能。对A基因测序可知，其调节功能区增加一个碱基对A—T，可增强其表达能力。通过PCR定点诱变技术在体外改造A基因(如图甲)，然后构建表达载体(如图乙)，导入受体菌培育“超级菌”。 注：LacZ基因编码产生的酶能分解β-半乳糖苷，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。 返回导航 2 4 5 3 1 46 ①图甲所示，大引物b是指以________(填“引物1”或“诱变引物”)延伸得到的DNA链为模板，________(填“引物1”或“诱变引物”)与之结合延伸得到的DNA子链。获得图甲中的改良A基因至少需要________个PCR循环。 诱变引物 引物1 4/四 返回导航 2 4 5 3 1 47 ②图乙中要实现质粒和改良A基因的正确连接，应选用的限制酶是______________。将构建的表达载体导入受体菌后，在含氨苄青霉素和β-半乳糖苷的平板上培养，长出的________(填“蓝色”或“白色”)菌落是成功导入重组质粒的菌株，依据是 _____________________________________________________________________________________________。 XmaⅠ和BglⅡ 白色 含有改良基因A的重组质粒上LacZ基因被破坏，受体菌不能产生相应的酶， 无法分解β-半乳糖苷，不能产生蓝色物质 返回导航 2 4 5 3 1 48 解析：(1)①在筛选分解PE塑料能力大小的菌株时，应将两类菌株接种到以PE为唯一碳源的培养基，不能分解PE塑料的细菌，因为缺少营养物质碳源死亡；该培养基能筛选出能分解PE塑料的细菌，所以从功能上讲属于选择培养基。②原本YP1对PE塑料的分解能力弱于YT1，而培养基3中接种混合培养后的YP1，其降解圈直径明显加大，其原因可能是YP1菌株整合了YT1的对PE塑料分解能力更高的基因，发生了转化。 返回导航 2 4 5 3 1 49 (2)①观察图甲，根据大引物的方向，PCR1大引物b是指以诱变引物延伸得到的DNA链为模板，引物1与之结合延伸得到的DNA子链；经过PCR1得到大引物需要2次PCR，再利用大引物和引物2至少2个PCR循环才能获得完整的改良A基因，共需经过4次PCR。 返回导航 2 4 5 3 1 50 ②构建改良基因表达载体时，为实现质粒和改良基因的准确连接，应选用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡ，酶切位点在目的基因两侧，且在质粒中这两个酶切位点在启动子和终止子之间，不破坏氨苄青霉素抗性基因，复制原点等重要元件，两种限制酶，形成的黏性末端不同，所以不会出现目的基因和质粒的自我环化以及目的基因的反向连接；在含氨苄青霉素和β-半乳糖苷的平板上培养一段时间后，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是含有改良基因A的重组质粒不含有完整的LacZ基因，受体菌不能产生相应的酶，无法分解β-半乳糖苷而使培养基变蓝。 返回导航 2 4 5 3 1 51 4．(15分)(2025·福建龙岩一模)科研人员采用重叠延伸PCR技术，成功构建了突变的IKBA基因(以下称IKBAm)，使IKBA蛋白中第32、36位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸，阻断了IKBA蛋白的磷酸化，IKBA蛋白磷酸化与哺乳动物组织中广泛存在的某种转录因子的功能有关。该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸。 返回导航 2 4 5 3 1 52 将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，获得定点突变的新基因，原理如图，回答下列问题： 返回导航 2 4 5 3 1 53 (1)利用重叠延伸PCR技术诱变IKBA基因时，将预期的突变碱基设计在PCR的引物3和引物4中，分别进行PCR体系1和PCR体系2的扩增。PCR体系1中加入的引物是______________。PCR体系1和PCR体系2必须分开进行的原因是_________________________________________ ____________________。 引物1和引物3　 引物3和引物4存在碱基互补配对片段，置于同一反应 体系会导致引物失效 返回导航 2 4 5 3 1 54 (2)将PCR体系1、2的产物(图中a、b和c、d)混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到55 ℃，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有____种结合的可能，其中能进行进一步延伸的是________组合的DNA片段。 4 a和d 返回导航 2 4 5 3 1 55 (3)质粒A上有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ的识别序列，为将IKBAm与质粒A正确连接，在设计IKBAm的扩增引物时，需在引物________的5′端分别添加相应的限制酶的识别序列。下表为重叠延伸PCR引物序列表，引物3的①位置上有关的碱基序列是________(填写出6个碱基)。 1和2 TCGTCT 返回导航 2 4 5 3 1 56 (4)已知IKBA基因的部分序列为： 数字94、95、96、106表示碱基位置，丙氨酸的密码子：GCU、GCC、GCA、GCG，则突变引物4中省略的碱基是______(填序号)。 ①AGC、GGC、CTG、GAC、GCC ②UCG、GGC、CTG、GAC、ACC ③GCC、GGC、CTG、GAC、GCC ④TCG、CCG、GAC、CTG、AGG ③ 返回导航 2 4 5 3 1 57 解析：(1)为了获得定点突变的新基因，采用PCR扩增时需要改变引物的部分碱基，引物是与目的基因复制起始端互补配对的单链DNA，结合题图和题干信息分析，PCR体系1需要引物1和引物3，PCR体系2需要引物2和引物4。引物3和DNA一条链互补配对，引物4和DNA对应部位的另一条链互补配对，即引物3和引物4碱基互补配对，若PCR体系1和PCR体系2混合进行，两种引物结合形成双链，引物失效则无法高效地进行PCR扩增，因此必须分开进行扩增。 返回导航 2 4 5 3 1 58 (2)由于引物3和引物4碱基序列互补配对，PCR扩增产物经过高温变性后会形成a、b、c、d四种单链，当温度下降到55 ℃，能够互补配对的DNA链相互结合，a和b结合，a和d结合，b和c结合，c和d结合，共4种结合方式。a和b结合以及c和d结合没有突出的单链部分，不能延伸，b和c结合有突出的单链部分，但是DNA延伸方向必须是从自身的5′→3′，b和c结合也不能延伸，能进行进一步延伸的是a和d组合的DNA片段。 返回导航 2 4 5 3 1 59 (3)由于引物3和引物4是和目的基因的中间碱基序列互补配对的，要将目的基因和质粒连接形成重组的DNA分子，则需要在目的基因的两端增加限制酶识别序列，因此需要在引物1和2的5′端分别添加相应的限制酶的识别序列。由于引物3和4是碱基互补配对的，引物4的3′端前6个碱基是AGCAGA，则引物3的①位置上有关的碱基序列是TCGTCT。 返回导航 2 4 5 3 1 60 (4)结合引物4的已知序列和IKBA基因的部分序列可知，引物4的碱基序列和题图中的IKBA基因的单链部分序列基本相同(除突变位点外)，已知第32位氨基酸需要是丙氨酸，根据丙氨酸对应的密码子分析，94、95、96对应的碱基是GCC，96和106号碱基之间的序列和题图相同，为GGCCTGGAC，第36位氨基酸也需要是丙氨酸，因此TCC改变为GCC，综合分析，突变引物4中省略的碱基是③GCC、GGC、CTG、GAC、GCC。 返回导航 2 4 5 3 1 61 5．(15分)(2025·黑龙江哈尔滨一模)金黄色葡萄球菌(简称Sa)可能引发从轻微皮肤感染到严重的全身感染，尤其对免疫力低下者危害更大。预防感染的关键在于良好的卫生习惯和合理使用抗生素。但不规范使用抗生素易出现抗药性Sa。推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。 返回导航 2 4 5 3 1 62 为验证该推测，以下图中R基因的上、下游片段及质粒1共同构建质粒2，然后通过同源重组(质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换)敲除Sa的R基因。 返回导航 2 4 5 3 1 63 (1)操作步骤如下： ①根据图甲信息，质粒2的构建过程中用引物________(填数字)进行PCR扩增，每次循环一般可以分为________________三步，n次循环后可以得到等长的目的基因________个。然后选择限制酶______________对扩增产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacⅡ酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含氯霉素的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 1、4 变性、复性、延伸 (2n－2n) SacⅡ和EcoRⅠ 返回导航 2 4 5 3 1 64 ③将步骤②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的概率，随后稀释涂布在含__________的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落中分别挑取少许菌体，依次接种到含________的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因可能被敲除。 脱水四环素 头孢霉素 返回导航 2 4 5 3 1 65 (2)以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，产物一般通过________________(技术名称)来鉴定。检测结果如图乙所示，表明R基因已被敲除的是________。 琼脂糖凝胶电泳 D 返回导航 2 4 5 3 1 66 解析：(1)①由图甲可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因。PCR反应过程是：变性→复性→延伸，n次循环后可以得到等长的目的基因(2n－2n)个。用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacⅡ酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 返回导航 2 4 5 3 1 67 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素的平板上，能生存下来的菌落就是含质粒2的Sa单菌落。③为验证该推测需要敲除R基因，因为质粒2上含有Y可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因，所以将步骤②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R基因死亡，推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关，因此可从这些菌落中分别挑取少许菌体，依次接种到含头孢霉素的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 返回导航 2 4 5 3 1 68 (2)以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。由图甲可知，R基因两侧含有的引物为2和3，所以扩增后含有引物2或3，或者2和3的可能含有R基因，所以表明R基因已被敲除的是D组。 返回导航 2 4 5 3 1 69 $