2026届高三生物二轮复习课件：基因工程的应用—膀胱生物反应器

江苏省泗阳中学2026届高三二轮复习 基因工程的应用——膀胱生物反应器 1 一、人乳铁蛋白（hLF）的核心功能 1. 抗菌、抗病毒- 夺走细菌必需铁，抑制大肠杆菌、沙门氏菌等 - 直接结合病毒（HIV、轮状、疱疹等），阻止入侵 2. 免疫调节- 激活免疫细胞、促进抗体生成、抗炎 3. 促进铁吸收- 安全转运铁离子，改善缺铁性贫血 4. 保护肠道- 维护肠道屏障、促益生菌生长、防肠炎 5. 抗氧化、抗炎- 清除自由基、减轻炎症损伤 6. 抗癌、细胞保护- 抑制肿瘤增殖、增强放化疗耐受性 二、 目前主要提取来源 1. 天然来源（传统）- 人乳：最理想，但来源有限、伦理限制 - 牛乳/牛初乳：工业主流（含量约 0.02–0.35 mg/mL） 2. 现代生物工程（主流量产）- 重组 DNA 技术： - 转基因植物（水稻、玉米、大麦） - 转基因动物（奶牛、山羊）乳汁 1、回顾所学知识，可以用哪些方法获取hLF基因？ 利用PCR获取和扩增目的基因 用化学方法人工合成基因 从基因文库中获取…… 活动一：人乳铁蛋白基因（hLF）的获取 已知目的基因的两端的序列 目的基因序列较短且序列已知 目的基因序列全部未知 4 2、为了便于插入载体，我们想要利用PCR获取和扩增hLF（不含非编码区和内含子）。请小组合作，完善下面的流程图： 活动一：人乳铁蛋白基因（hLF）的获取 从 细胞中提取 作为模板 利用 酶来合成cDNA 以cDNA为模板，在PCR体系中加入 、 、 、 等，在合适的程序下扩增出大量hLF基因 人乳腺（腺泡）细胞 总RNA 逆转录 TaqDNA聚合酶 dNTP 缓冲液 引物 5 1、请用简图和文字呈现预期构建的基因表达载体。（箭头为转录方向） 活动二：人乳铁蛋白基因表达载体的构建 2、若将一个乳腺生物反应器的基因表达载体改为膀胱生物反应器的基因表达载体，以表达人乳铁蛋白，关键是改变重组质粒中哪个元件？ 启动子 将“乳腺特异性启动子”改为“膀胱特异性启动子” B启动子 ＋ 绿色荧光蛋白 A启动子 ＋ 绿色荧光蛋白 C启动子 ＋ 绿色荧光蛋白 PB—GFP PC—GFP PA—GFP 自变量 ①启动子的种类 ②受体细胞种类 因变量 荧光蛋白基因的表达情况 9组实验 3、现有三段含有不同启动子的DNA序列，其中只有一种为膀胱特异性启动子，两种为组成型启动子,如何快速从三种启动子中找出目标启动子？ 部分材料：含绿色荧光蛋白的质粒（pGFP）、各种组织细胞、各种肿瘤细胞如膀胱癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞等。 1.将三种启动子分别和含绿色荧光蛋白的质粒相连，构建重组质粒。 2.分别导入膀胱癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞中。 B启动子 ＋ 绿色荧光蛋白 A启动子 ＋ 绿色荧光蛋白 C启动子 ＋ 绿色荧光蛋白 PB—GFP PC—GFP PA—GFP 若某启动子组，只在膀胱癌细胞发出绿色荧光， 则该启动子为膀胱特异性启动子。 结果检测： 现象结论： 培养一段时间后在荧光显微镜下观察。 方法步骤： 4、以下是含绿色荧光蛋白基因的质粒（pGFP）部分酶切位点图和含A启动子（膀胱特异性启动子）序列酶切位点图。以该组实验为例，按照上述实验思路，请选择合适的工具酶构建重组质粒。 终止子 EcoRⅠ SmaⅠ MunⅠ EcoRⅠ GFP 原启动子 A启动子 EcoRⅠ NheⅠ XhoⅠ SmaⅠ 含GFP的质粒局部序列和酶切位点图 A启动子所在的DNA片段 限制性识别序列及切割位点： MunⅠ：C↓AATTG XhoⅠ：C↓TCGAG EcoRⅠ：G↓AATTC SmaⅠ：CCC↓GGG NheⅠ：G↓CTAGC 图中，A启动子应该用 酶切割，pGFP质粒应该用 酶切割，并用 酶连接绿色荧光蛋白质粒（pGFP）和A启动子序列构建重组质粒。 EcoRⅠ、SmaⅠ MunI、SmaⅠ DNA连接酶 活动二：人乳铁蛋白基因表达载体的构建 资料2：FLAG是一种短肽，与其它蛋白质连在一起构成融合蛋白，可使该融合蛋白与含有FLAG抗体的介质结合，便于收集和筛选，但不影响原蛋白质的结构和功能。该技术可以简化基因表达产物的收集，只要使混合产物流经含FLAG抗体的介质，FLAG融合蛋白便会吸附在含抗体的介质上，从而与其它物质分离。 1、结合资料信息，如果想用含FLAG抗体的介质来纯化收集人乳铁蛋白，需要怎样对基因表达载体进行优化？ 活动三：人乳铁蛋白基因表达载体的构建 复制原点 标记基因 膀胱特异性启动子 终止子 hLF FLAG-hLF 10 2、某科学兴趣小组设计了如图所示的融合基因，利用智能体推算，结果未能表达出正确的融合蛋白，请分析原因。（AUG为起始密码子，UAA、UAG、UGA为终止密码子） ATGGAC...369...AAGTAGAATTCATGGCG...2124...AATTAA 框内为FLAG对应序列 框内为hLF对应序列 Met Asp ... 123... Lys ... ... Met Ala ...708 ... Asp 活动三：人乳铁蛋白基因表达载体的构建 ①会产生终止密码子，无法形成融合蛋白。 AT ②两基因中间有8个多余的碱基对（非3的倍数），使hLF基因的密码子出现了移码（错位读取），导致人乳铁蛋白氨基酸序列错误。 解决方法：在引物中的EcoRI序列一端加一个碱基，或去掉EcoRI之外的两个碱基 11 3、下图为已知的FLAG 和hLF 部分序列，利用重叠延伸PCR，可实现二者的无缝连接。 活动三：人乳铁蛋白基因表达载体的构建 FLAG编码链序列：5’-ATGGACCTGGAT…..AGCCTGGCAAAG-3’ hLF编码链序列：5’-ATGGCGGAATTC……GGCGAGAATTAA-3’ P OH FLAG P OH hLF 引物1 引物2 引物3 引物4 PCR1 PCR2 图中，引物1和引物4的设计依据是 ， 引物2和引物3的设计依据是 。 FLAG下游碱基序列和hLF上游碱基序列 引物1：SpeI识别序列和FLAG序列上游序列 引物4：XbaI识别序列和hLF基因下游序列 SpeⅠ XbaⅠ 4、下图为已知的FLAG 和hLF 部分序列，利用重叠延伸PCR，可实现二者的无缝连接。 活动三：人乳铁蛋白基因表达载体的构建 FLAG编码链序列：5’-ATGGACCTGGAT…..AGCCTGGCAAAG-3’ P OH FLAG P OH hLF 引物1 引物2 引物3 引物4 PCR1 PCR2 引物2和引物3应分别在下列选项中选用 。 D、C A. ATGGAC……AATTAA B. TTAATT……GTCCAT C. AGCCTG……GAATTC D. GAATTC……CAGGCT 5’-ATGGCGGAATTC……GGCGAGAATTAA-3’ hLF编码链序列： FLAG模板序列：3’-TACCTGGACCTA…..TCGGACCGTTTC-5’ ３’-TACCGCCTTAAG……CCGCTCTTAATT-５’ 引物２ 引物3 5、该小组成功构建FLAG-hLF融合基因后，选用SpeⅠ和XbaⅠ切割质粒，SpeⅠ切割目的基因，构建了基因表达载体。载体两限制酶之间距离为100bp 活动三：人乳铁蛋白基因表达载体的构建 SpeⅠ XbaⅠ a链 b链 P OH 384bp 2127bp SpeⅠ SpeⅠ EcoRⅠ 限制酶 识别序列 SpeⅠ 5’-A CTAGT-3’ XbaⅠ 5’-T CTAGA-3’ EcoRⅠ 5’-G AATTC-3’ 膀胱特异性启动子 复制原点 卡那霉素抗性基因 转录方向 终止子 质粒长度：5000bp FLAG-hLF融合基因 活动三：人乳铁蛋白基因表达载体的构建 SpeⅠ XbaⅠ a链 b链 限制酶 识别序列 SpeⅠ 5’-A CTAGT-3’ XbaⅠ 5’-T CTAGA-3’ EcoRⅠ 5’-G AATTC-3’ 膀胱特异性启动子 复制原点 卡那霉素抗性基因 转录方向 终止子 P OH SpeⅠ 384bp 2127bp SpeⅠ EcoRⅠ FLAG-hLF融合基因 ① 构建的基因表达载体一定能正确表达人乳铁蛋白吗？为什么？ 不一定 可能存在目的基因反接等情况 质粒长度：5000bp 载体两限制酶之间距离为100bp 15 SpeⅠ 膀胱特异性启动子 复制原点 卡那霉素抗性基因 终止子 XbaⅠ P OH 384bp SpeⅠ SpeⅠ EcoRⅠ 2127bp SpeⅠ 膀胱特异性启动子 复制原点 卡那霉素抗性基因 终止子 XbaⅠ P OH SpeⅠ 384bp 2127bp SpeⅠ EcoRⅠ ② 为了进一步筛选出正向连接的重组质粒，科研小组将重组质粒导入大肠杆菌中进行扩大培养，用 切割重组质粒，并进行电泳检测。请在下图中绘制重组质粒酶切后的预期电泳结果： SpeⅠ、EcoRⅠ Mark 正向连接 9000 7000 5000 3000 1000 500 400 300 200 100 ② 为了进一步筛选出正向连接的重组质粒，科研小组将重组质粒导入大肠杆菌中进行扩大培养，用 切割重组质粒，并进行电泳检测。请在下图中绘制重组质粒酶切后的预期电泳结果： SpeⅠ、EcoRⅠ 反向链接 P OH 384bp SpeⅠ SpeⅠ EcoRⅠ 2127bp SpeⅠ 膀胱特异性启动子 复制原点 卡那霉素抗性基因 终止子 XbaⅠ P OH SpeⅠ 384bp 2127bp SpeⅠ EcoRⅠ 质粒长度：5000bp 载体两限制酶相距100bp 正向：378和7133 反向：2133和5378 17 THANKS $