第32讲 基因工程的原理和应用（3大核心速记+3层专练突破）（浙江专用）2027年高考生物一轮复习讲练测

第32讲 基因工程的原理和应用（浙江专用） 专练·靶向攻关 两年模拟·基础通关 1．A 2．C 3．C 4．A 5．D 6．B 7．B 8．C 9．C 10．D 11．C 12．C 13．D 14．D 15．C 一年重难·情境应用 1．D 2．D 3．D 4．C 5．D 6．B 7． 【答案】(1) pH 不会 定期更换培养液 胰蛋白酶处理时间过长会过度分解细胞表面蛋白质，损伤细胞 (2) 启动子 复制原点 筛选导入重组质粒的受体细胞 (3) ③④ 将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细胞 (4) 抑制 促进 (5)BC 高考真题·考向感知 1．C 2．D 3．D 4．B 5．B 6．C 7．【答案】(1) 碱基对替换 终止密码子提前 (2) 隐性 E2E2 2/两/二 1/3 1/4 (3) (4)测交，自交，核酸分子杂交，基因测序 (5)C 8．【答案】(1) 沉淀 DNA 降低DNA酶的活性 (2) 遗传背景（单株存在个体差异） 无菌水 B (3) A 重组DNA (4) DNA marker（DNA相对分子质量标准物） 引物长度（变长） / 学科网（北京）股份有限公司 $ 第32讲 基因工程的原理和应用（浙江专用） 考情·精准定向 核心·主干速记 核心1 基因工程的概念及基本工具 核心2 基因工程的基本操作程序 核心3 DNA的粗提取、PCR扩增及电泳 专练·靶向攻关 浙江专练+全国视野 两年模拟·基础通关 & 一年重难·情境应用 & 高考真题·考向感知 考情·精准定向 考情概览 新课标要求 考题统计 1、概述基因工程的建立过程，运用科学思维阐明基因工程的理论基础，强化结构和功能观的生命观念。 2、说明基因工程的工具酶和载体的作用。 3、阐明基因工程的基本操作程序，运用科学思维分析基本操作程序的原理。 4、进行DNA的粗提取和鉴定操作，阐明其操作原理，提高科学探究能力。 2026年浙江卷6月卷 2026年浙江卷1月卷 2025年 浙江卷6月卷 2024年 浙江卷6月卷 2024年 浙江统1考卷 2023年 浙江统6考卷 考情分析： 1．考查频次：基因工程在选择题中出现的概率不大，但解答题中基本都会涉及基因工程，分值大约2-10分。选择题中考查较多的是基因工程的基本操作程序，解答题通过情境考查基因工程在生产实际中的应用。 2．考查要点：基因工程的工具；基因工程的基本程序；PCR扩增；DNA粗提取和电泳。 3．命题情境：解答题一般通过情境结合植物或动物细胞工程考查基因工程的基本程序，同时会结合PCR扩增考查。 备考策略 1．抓牢核心概念：限制酶和DNA连接酶；载体；目的基因的获取；重组DNA分子的构建；目的基因导入受体细胞以及目的基因的表达和检测；PCR扩增；DNA粗提取和电泳。 2．构建知识网络：以 “基因工程的基本工具”，“基因工程的原理和过程”“PCR扩增、DNA粗提取和电泳”为主线，首先分析基因工程的基本工具，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶以及载体质粒的特点和用途，再分析基因工程的基本过程，核心是目的基因的获取方式，重组DNA分子构建的原则，目的基因导入受体细胞的方法以及目的基因表达和鉴定的方法，最后分析PCR扩增目的基因及DNA粗提取和电泳的实验操作。 3．强化题型方法： 概念辨析题：准确区分易混概念，如DNA连接酶和DNA聚合酶；亚甲基蓝和溴麝香草酚蓝；基因组文库和cDNA文库。 功能应用题：理解并掌握限制性内切核酸酶的准确使用，重组DNA分子构建的基本步骤，PCR扩增的原理、过程及结果的鉴定；活动“DNA粗提取和电泳”。 核心·主干速记 核心1 基因工程的概念和基本工具 1.基因工程概念 （1）手段：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。 （2）目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 （3）水平：分子水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作重组DNA技术。 2.基因工程的理论基础 3.重组DNA技术的基本工具 （1）限制性内切核酸酶（简称：限制酶） ①存在：主要存在于原核生物中。 ②作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 ③特性：一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，并且能在特定的位点上切割DNA分子。 ④产生末端的种类：黏性末端和平末端。 图中可见，限制酶在识别序列中心轴线两侧切开产生的是黏性末端，在识别序列中心轴线处切开产生的是平末端。 （2）DNA连接酶 ①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。 ②类型 常用类型 E.coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 “缝合”黏性末端和平末端。E.coliDNA连接酶连接平末端的效率远远低于T4DNA连接酶 结果 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 （3）载体 ①作用：将基因送入细胞。 ②种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 ③重要的载体之一——质粒 1）质粒的本质：是一种裸露的、结构简单，独立于真核细胞的细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 2）质粒适于作基因载体的特点（载体须具备的条件） 特点（条件） 作用 有一个至多个限制酶切割位点 供外源DNA片段插入其中 能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体细胞DNA同步复制 便于目的DNA在受体细胞中稳定存在 带有标记基因（通常是人工改造后具有），一般为抗生素抗性基因或荧光基因等 便于重组DNA分子的筛选（鉴定目的基因是否导入成功） 4.与DNA有关的酶 酶 作用 作用相关“键” 限制酶 切割DNA片段，产生两个（具有相同黏性末端或平末端）DNA片段 破坏磷酸二酯键 DNA连接酶 催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而连接起来 形成磷酸二酯键 解旋酶 将双链DNA分子局部解旋为单链（ATP水解供能） 破坏氢键（氢键非化学键） DNA聚合酶 把游离的脱氧核苷酸连接到引物或者已有的DNA单链的3′端上 形成磷酸二酯键 DNA（水解）酶 将DNA水解为脱氧核苷酸 破坏磷酸二酯键 逆转录酶 以RNA为模板合成cDNA 形成磷酸二酯键 核心2 基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 （1）目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 （2）筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 （3）目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②常用PCR（聚合酶链式反应）特异性地快速扩增目的基因 PCR定义 在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 PCR原理 DNA半保留复制 条件 模板 目的基因的两条链 原料 4种脱氧核苷酸 酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。2种 在一定的缓冲溶液中进行；需要控制温度的变化 PCR反应过程 变性 当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 72℃左右时，在耐高温的DNA聚合酶作用下，从引物3′端开始进行互补链的合成 扩增 方向 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3′端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸 方式 指数形式扩增（约为2n，n为扩增循环的次数） 结果 短时间内大量扩增目的基因 产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳 ③通过构建基因文库来获取目的基因。 2.基因表达载体的构建——基因工程的核心工作 （1）操作目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）基因表达载体组成 ①目的基因：编码蛋白质的基因或具有调控作用的因子。 ②启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位；能驱动基因转录出mRNA。 ③终止子：起调控作用，使转录在所需要的地方停下来。 ④标记基因：便于重组DNA分子的筛选。 （3）构建过程 （4）启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（正常情况下，不编码氨基酸） 3.将目的基因导入受体细胞 细胞类型 方法 原理/操作步骤 植物细胞 花粉管通道法 ①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； ②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 农杆菌转化法 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T­DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。如果将目的基因插入Ti质粒的T­DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞 动物细胞（受精卵） 显微注射技术　　 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 微生物细胞（原核细胞） Ca2＋处理法 用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中 4.目的基因的检测与鉴定 （1）通过PCR等技术检测目的基因是否导入或是否转录出mRNA。 （2）利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译。 （3）进行个体生物学水平的抗虫、抗病、功能活性等鉴定。 核心3 DNA的粗提取、PCR扩增及电泳 1.DNA的粗提取与鉴定 （1）基本原理 ①提取原理：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol·L－1的NaCl溶液。 ②鉴定原理：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 （2）实验步骤（以洋葱为例） ①研磨材料：洋葱切碎，加研磨液充分研磨。 ②获取含DNA的滤液：过滤（纱布），4℃冰箱中静置后取上清液。或直接离心取上清液。 ③DNA的析出：在上清液中加入体积相等的体积分数为95%的预冷的酒精，静置2~3min后用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物。或离心取沉淀物。 ④溶解DNA：将丝状物或沉淀物溶解在2mol/L的NaCl溶液中。 ⑤DNA的鉴定：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，混合均匀后，将试管置于沸水浴中加热5min，待试管冷却后，可观察到明显的颜色反应（变成蓝色）。 （3）注意事项 ①该实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA）。可选用鸡血细胞作材料。 ②加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA的断裂，导致DNA不能形成丝状物。 ③二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。 ④在DNA进一步提纯时，选用预冷的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定 （1）PCR仪：PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 （2）电泳鉴定PCR产物的原理 ①PCR原理：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 ②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 ③鉴定原理：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长300nm的紫外灯下被检测出来。 （3）实验步骤 ①PCR实验操作步骤 1）移液：用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，向微量离心管中依次加入各组分。 2）离心：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在管的底部。 3）反应：设置好PCR仪的循环程序，将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min — — 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后 1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，10min ②DNA的电泳鉴定 1）琼脂糖凝胶制备：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液（一般质量分数为0.8%～1.2%）。熔化琼脂糖，稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 2）凝胶板制备：将温热的琼脂糖溶液倒入模具，插入梳子形成加样孔，凝胶溶液完全凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内。 3）点样：加电泳缓冲液，没过凝胶1mm为宜。然后用微量移液器将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）的混合液注入加样孔，留一孔加标准参照物。 4）电泳：接通电源，设定好电压，一般为1-5V/cm，进行电泳。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 5）观察：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 （4）注意事项 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 ④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 两年模拟·基础通关 1．某科研团队利用基因工程培育抗虫棉花，将Bt毒蛋白基因导入棉花细胞，通常用农杆菌转化法。下列操作步骤的叙述，正确的是（    ） A．Bt基因需插入Ti质粒的T-DNA区段上 B．利用DNA连接酶将Bt基因导入棉花细胞 C．抗虫棉自交后代均能稳定表达抗虫性状 D．检测到Bt基因存在即说明抗虫性状已表达 2．科研人员利用PCR技术从北极鱼中扩增抗冻基因。下列有关PCR的叙述，错误的是（    ） A．反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶 B．引物与模板链的3'端结合，延伸方向为5'→3' C．变性、复性、延伸三个步骤的温度依次升高 D．可通过电泳检测PCR扩增产物的大小和纯度 3．在活动“DNA的粗提取与鉴定”中，加入2mol/L的NaCl溶液的目的是（    ） A．使蛋白质变性并与DNA分离 B．抑制DNA酶活性 C．提取DNA D．析出DNA 4．下图表示基因表达载体的构建过程。下列相关叙述正确的是（　　） A．标记基因的作用是便于筛选含重组DNA的受体细胞 B．DNA连接酶的作用是将目的基因的黏性末端与载体的平末端连接 C．限制酶的作用是将目的基因与载体的切口处直接连接起来 D．用PCR扩增图中目的基因需要经过变性、退火、电泳三个步骤的多次循环 5．作为基因工程的运输工具载体，必须具备的条件及理由对应叙述正确的是（　　） A．基因工程中目的基因的运输工具只能是质粒 B．具有某些标记基因，以便目的基因能够准确定位与其结合 C．只有一个限制酶切割位点，便于目的基因的插入 D．能够在宿主细胞中稳定保存并大量复制，以便提供大量的目的基因 6．下列关于DNA的粗提取、DNA片段的扩增和电泳鉴定的叙述，正确的是（　　） A．可利用DNA在酒精中溶解度较大的特点来提取DNA B．粗提取DNA时，将香蕉滤液离心后取上清液进行后续实验 C．PCR反应体系中的TaqDNA聚合酶在退火中起作用 D．电泳缓冲液内含甘油可以增加DNA样品密度 7．作为基因工程的运输工具——载体，必须具备的条件及理由对应叙述错误的是（　　） A．对宿主细胞无伤害， 以免影响宿主细胞的正常生命活动 B．具有某些标记基因，以便目的基因能够准确定位与其结合 C．具有一个至多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入 D．能够在宿主细胞中稳定保存并大量复制，以便提供大量的目的基因 8．Sau3AI和BamHI的识别序列及切割位点如表所示。某DNA分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ分别切割以后，可形成4个和2个大小不同的片段。下列有关叙述正确的是（    ） 限制酶名称 识别序列和切割位点 BamHI G↓GATCC Sau3AI ↓GATC A．两种限制酶切割后形成的黏性末端不相同 B．能被Sau3AI识别的DNA位点均能被BamHI识别 C．该DNA分子上有2个BamHⅠ不能识别但Sau3AⅠ能识别的酶切位点 D．该DNA分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ共同切割后可形成6个片段 9．如图所示是限制性核酸内切酶切割某DNA分子的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切点是（    ）    A．CTTAAG，切点在C和T之间 B．CTTAAG，切点在G和A之间 C．GAATTC，切点在G和A之间 D．GAATTC，切点在C和T之间 10．2个来源不同的DNA片段A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段用限制酶XbaI进行切割，两种限制酶的识别序列和切割位点如图所示，产生的片段相连接形成重组DNA。若用限制酶SpeⅠ、限制酶XbaⅠ分别对重组DNA进行切割，结果是（　　）    A．两种限制酶都能识别重组DNA并将其切割成片段 B．只有限制酶SpeI能识别重组DNA并将其切割成片段 C．只有限制酶XbaI能识别重组DNA并将其切割成片段 D．两种限制酶都不能识别重组DNA，故不能将其切割成片段 11．分别用Xho I和Sal I两种酶处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如下图所示。下列叙述错误的是（　　） A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同 B．图1中被酶切的DNA片段是双链DNA C．图2中同一泳道中的酶切产物末端均不相同 D．图2中泳道①中是用SaI l处理得到的酶切产物 12．下列有关基因工程基本操作程序的叙述，正确的是（　　） A．目的基因检测时所用的核酸探针是指与目的基因相同的特定双链DNA B．基因文库包含基因库和cDNA文库 C．若基因比较小且核苷酸序列已知，则可直接通过化学方法合成 D．抗生素合成基因作为标记基因，可鉴别目的基因是否导入受体细胞 13．用农杆菌转化法培育转基因植物，下列叙述错误的是（　　） A．将目的基因插入Ti质粒的T-DNA片段 B．若目的基因的序列未知，可通过构建基因文库的方法从中获取 C．采用抗原-抗体杂交技术可检测目的基因在受体细胞中是否表达 D．植物受体细胞必须是受精卵细胞，因为其全能性最高 14．PCR技术是在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物技术。下列叙述正确的是（    ） A．双链DNA在高温下氢键和磷酸二酯键断裂形成2条DNA单链 B．温度降低后，单链DNA和引物结合的部分碱基序列相同 C．以2条DNA单链为模板，以4种NTP为原料，经耐高温酶在高温下合成2个新的DNA D．PCR结果出现较多非目的基因片段，可能是引物过短造成 15．基因芯片技术是一种可同时检测不同基因片段的新型检测技术，芯片制作和使用过程如图所示： 下列叙述错误的是（    ） A．探针和样品都必须是单链 B．基因芯片上具有多种不同序列的探针 C．探针和样品上都需携带相同的荧光标记 D．洗脱的目的是去除未与探针杂交的样品 一年重难·情境应用 1．P基因与编码FLAG的序列形成一个融合基因，其中5′ATGTGCA3′为P基因编码链起始序列，如图所示。融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列不正确。核糖体读取mRNA时，从起始密码子（AUG）开始，每3个核苷酸一组，形成连续、不重叠的读码框。下列分析及修复方案错误的是（     ） A．P基因对应的氨基酸序列异常原因是mRNA上密码子读码框错位 B．EcoR I识别序列末端碱基与P基因编码链起始序列碱基共同编码一种氨基酸 C．在图中EcoR I识别序列的3′端添加1个碱基，可恢复正确读码框 D．为使P基因的PCR产物能被限制酶切割，需在引物5′端添加EcoR I的基因序列 2．琼脂糖凝胶电泳是基因工程中分离鉴定DNA片段的常用技术。下列叙述正确的是（     ） A．DNA分子越大，其在电泳过程中迁移速率越快 B．低浓度的琼脂糖凝胶适合分离较小的DNA片段 C．电泳时指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 D．在电场作用下，DNA分子会向与它所带电荷相反的电极移动 3．CRISPR/Cas9系统通过sgRNA引导Cas9蛋白切割特定DNA序列使其断裂，细胞修复断裂有两条途径：非同源末端连接（直接连接末端，易引入碱基随机插入或缺失）和同源定向修复（需提供修复模板DNA进行定向编辑）。下列叙述错误的是（    ） A．同源定向修复需要修复模板，而非同源末端连接不需要 B．修复模板DNA含有与目标DNA同源的序列，可实现外源基因的定点插入 C．sgRNA与Cas9蛋白结合后，通过碱基互补配对识别目标DNA序列 D．Cas9蛋白的功能与限制酶类似，都能切割磷酸二酯键，形成黏性末端 4．双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，降低了基因工程的成本与复杂性，研究人员利用双向启动子构建了下图所示表达载体，下列相关叙述错误的是（     ） A．为正确连接目的基因，可在其两端添加能产生不同黏性末端的不同限制酶的识别序列 B．表达载体中的GUS基因和LUC基因进行转录时，会使用DNA不同的单链作为模板 C．培养基中添加大观霉素可筛选出成功导入表达载体的植物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质检测双向启动子作用效果 5．关于“DNA粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列叙述正确的是（     ） A．提取到白色丝状物与二苯胺试剂充分混匀，沸水浴加热后变紫色 B．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，提取DNA的效率会提高 C．为避免外源DNA等因素污染，微量离心管和枪头在使用前必须消毒 D．指示剂与DNA样品混合后一同上样到加样孔中，待指示剂迁移接近凝胶前电泳 6．下列关于PCR技术及凝胶电泳鉴定的说法，正确的是（    ） A．DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小、形状、所带电荷等有关，与凝胶无关 B．若以某DNA片段作为模板，5次循环后理论上需要消耗31对引物 C．PCR所用的解旋酶和DNA聚合酶都具有耐高温的特性 D．凝胶中的DNA分子可以直接在光下被检测 7．肿瘤化疗通过诱导肿瘤细胞的DNA损伤，引发肿瘤细胞死亡。肿瘤细胞会激活DNA损伤修复途径，导致肿瘤对化疗药物耐药。为探究P基因在乳腺癌中的作用机制，科研人员进行了相关研究。回答下列问题： (1)培养细胞时，若恒温培养箱内CO2不足，会导致培养液__________异常；乳腺癌细胞培养时__________（填“会”或“不会”）出现接触抑制现象。为防止细胞代谢产生的有害物质危害细胞，应__________；细胞传代培养时需要用胰蛋白酶处理，使贴壁细胞分散成单个细胞，操作时需要控制处理时间，原因是__________。 (2)P基因及转录方向、质粒图谱及目的基因插入位点的相关信息如图1所示（实线方框内横线处表示限制酶的识别序列，箭头处表示酶切位点）。质粒载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是__________，载体上与其能自我复制相关的结构是__________，载体上添加卡那霉素抗性基因的目的是__________。 (3)为构建重组质粒，扩增P基因时，应选择的一对引物为__________（填图2中序号）。为探究P基因对乳腺癌细胞增殖的影响，将重组质粒导入乳腺癌细胞的处理组作为实验组，对照组的处理是__________。 (4)S基因主要通过抑制DNA损伤修复途径来抑制肿瘤增殖，引发肿瘤细胞死亡。研究发现，P蛋白能诱导S基因的启动子甲基化。这表明P基因__________（填“促进”或“抑制”）S基因的转录，从而__________（填“促进”或“抑制”）肿瘤耐药。 (5)可通过PCR技术和琼脂糖凝胶电泳技术检测目的基因是否导入受体细胞。P基因对应的DNA片段结构如图3所示，其中①～④表示DNA上引物可能结合的位置。下列叙述中正确的有哪几项？__________。 A．用PCR技术扩增P基因，可选择引物①和④ B．PCR过程在第3轮循环结束后可得到两端都含引物的P基因 C．若用限制酶从该DNA片段中直接切取P基因，则会破坏4个磷酸二酯键 D．若用PCR技术扩增循环n次，共需要2n-2个引物 高考真题·考向感知 1．（2026·浙江6月选考真题）细菌可通过“限制-修饰”系统抵御噬菌体的侵染，该系统存在能识别相同DNA序列的限制酶和甲基化酶，具体过程如图所示。 下列叙述正确的是（     ） A．细菌对噬菌体DNA进行甲基化，以抑制噬菌体基因表达 B．限制酶和甲基化酶作用于相同底物，体现了酶的专一性 C．限制酶可特异性切割未被甲基化的噬菌体DNA D．细菌中发生的DNA甲基化不能遗传给子代 2．（2026·浙江1月选考真题）利用转基因技术将口蹄疫病毒衣壳蛋白P1的基因导入水稻愈伤组织，获得了多个稳定表达P1的转基因水稻株系。转基因水稻的P1激活小鼠免疫反应的能力与大肠杆菌生产的P1相当，且给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应。下列叙述正确的是（　　） A．将愈伤组织进行脱分化和再分化，获得转基因水稻植株 B．不同株系转基因水稻P1蛋白的基因表达水平相同 C．转基因水稻与大肠杆菌生产的P1蛋白分子量相等 D．转基因水稻P1蛋白具备制成口服疫苗的潜力 阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。    3．（2024·浙江6月选考真题）下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（    ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 4．（2024·浙江6月选考真题）为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。    1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（    ） A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 5．（2023·浙江6月选考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。    下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 6．（2018·浙江6月选考真题）若利用根瘤农杆菌转基因技术将抗虫基因和抗除草剂基因转入大豆，获得若干转基因植物（T0 代），从中选择抗虫抗除草剂的单株S1、S2 和S3 分别进行自交获得T1 代，T1 代性状表现如图所示。已知目的基因能1次或多次插入并整合到受体细胞染色体上。下列叙述正确的是 A．抗虫对不抗虫表现为完全显性，抗除草剂对不抗除草剂表现为不完全显性 B．根瘤农杆菌Ti质粒携带的抗虫和抗除草剂基因分别插入到了S2的2条非同源染色体上，并正常表达 C．若给S1 后代T1 植株喷施适量的除草剂，让存活植株自交，得到的自交一代群体中不抗虫抗除草剂的基因型频率为 1/2 D．若取S2 后代T1 纯合抗虫不抗除草剂与纯合不抗虫抗除草剂单株杂交，得到的子二代中抗虫抗除草剂的纯合子占 1/9 7．（2025·浙江6月选考真题）玉米(2n=20)雌雄同株异花。从玉米某自交系(甲)中选育出2个雄性不育突变体(乙和丙)。已知雄性不育基因E1、E2由雄性可育基因E突变所致；如图1所示。甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，甲×丙的F2中雄性可育139株、雄性不育45株。利用引物P1和P2，对甲、乙、丙以及它们之间杂交的后代(丁和戊)基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经SnaBⅠ完全酶切后电泳，结果如图2所示。 回答下列问题： (1)E1基因与E基因相比，由于___________，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。E2基因与E基因相比，由于编码区增加了插入序列，导致___________，使编码的蛋白质中氨基酸数目减少。 (2)雄性不育对雄性可育是___________性状，乙的基因型是___________。甲×丙产生的F1其雌配子有___________种，F2可育植株中纯合子占___________。若甲×戊的F1随机交配，则F2中E1的基因频率是___________。 (3)写出丁×戊获得F1的遗传图解。 (4)雄性不育突变体不能自交繁殖。为了保存雄性不育突变体，需长期保留含不育基因的杂合子。该杂合子可采用上述“PCR结合限制性内切核酸酶酶切后分析条带”进行鉴定，还可采用的方法有___________(答出2点即可)。 (5)利用引物P1、P2对甲的基因组DNA进行PCR扩增和电泳，下列叙述错误的是___________。 A．PCR反应中TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸 B．图2中胶板的上端是电泳时的负极，且电泳时DNA片段由负极向正极泳动 C．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得16条含32P标记的DNA单链 D．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得8个含32P标记且长度为b的DNA分子 8．（2026·浙江6月选考真题）科研人员取无籽和有籽葡萄植株若干，分别提取单株基因组DNA，取等量混合后，分别构建无籽组和有籽组样本库。利用A、T、G、C随机组合且长度为10个碱基的随机引物，对无籽组和有籽组进行PCR扩增，获得与无籽性状相关的特异性DNA条带，以便于无籽葡萄的快速筛选。已知随机引物在葡萄基因组DNA上有若干结合位点。回答下列问题： (1)基因组DNA的提取：葡萄叶片用液氮速冻后研磨成粉末状，添加提取液后离心，最后在上清液中加入预冷的乙醇溶液，用于______。在提取中，液氮速冻叶片的作用是使组织脆化以便于研磨，及______以保证DNA的完整性。 (2)PCR扩增：为更准确获得与无籽基因相关的DNA条带，实验中需对无籽组和有籽组的样本库而非单株进行分析，原因是为了消除______的干扰。制备50μL PCR反应体系时，若试剂总量不足50μL，需添加______补足。用某一种随机引物进行PCR，电泳结果如图1所示，下列叙述正确的是______。 A．与有籽葡萄相比，无籽葡萄的基因组DNA所含有的碱基对数量更多 B．与有籽葡萄相比，无籽葡萄的基因组DNA上可能多2个该引物的结合位点 C．若在该引物的端增加3个碱基，则扩增出的DNA条带会增加3个碱基对 D．若在该引物的端增加3个碱基，则扩增出的DNA条带会增加6个碱基对 (3)特异性条带DNA的测序：已知Taq DNA聚合酶会在合成的DNA链端非特异性多加1个A。为使PCR扩增出的DNA能与克隆载体连接，克隆载体经限制酶切割产生平末端后，需要______（A．在端加1个T  B．在端加1个T  C．在端加1个A  D．在端加1个A）。回收图1箭头所指特异性条带DNA，连接到克隆载体形成______，经克隆后测序。 (4)PCR重扩增：根据测定的DNA两端序列再设计长度为24个碱基的1对引物，对无籽组和有籽组进行PCR重扩增，电泳结果如图2所示。通过与______比对，可推测扩增出的DNA大小。与用随机引物扩增相比，PCR重扩增的特异性显著增强，其原因是提高了退火温度以及______。 学科网（北京）股份有限公司 $ 第32讲 基因工程的原理和应用（浙江专用） 考情·精准定向 核心·主干速记 核心1 基因工程的概念及基本工具 核心2 基因工程的基本操作程序 核心3 DNA的粗提取、PCR扩增及电泳 专练·靶向攻关 浙江专练+全国视野 两年模拟·基础通关 & 一年重难·情境应用 & 高考真题·考向感知 考情·精准定向 考情概览 新课标要求 考题统计 1、概述基因工程的建立过程，运用科学思维阐明基因工程的理论基础，强化结构和功能观的生命观念。 2、说明基因工程的工具酶和载体的作用。 3、阐明基因工程的基本操作程序，运用科学思维分析基本操作程序的原理。 4、进行DNA的粗提取和鉴定操作，阐明其操作原理，提高科学探究能力。 2026年浙江卷6月卷 2026年浙江卷1月卷 2025年 浙江卷6月卷 2024年 浙江卷6月卷 2024年 浙江1月卷 2023年 浙江6月卷 考情分析： 1．考查频次：基因工程在选择题中出现的概率不大，但解答题中基本都会涉及基因工程，分值大约2-10分。选择题中考查较多的是基因工程的基本操作程序，解答题通过情境考查基因工程在生产实际中的应用。 2．考查要点：基因工程的工具；基因工程的基本程序；PCR扩增；DNA粗提取和电泳。 3．命题情境：解答题一般通过情境结合植物或动物细胞工程考查基因工程的基本程序，同时会结合PCR扩增考查。 备考策略 1．抓牢核心概念：限制酶和DNA连接酶；载体；目的基因的获取；重组DNA分子的构建；目的基因导入受体细胞以及目的基因的表达和检测；PCR扩增；DNA粗提取和电泳。 2．构建知识网络：以 “基因工程的基本工具”，“基因工程的原理和过程”“PCR扩增、DNA粗提取和电泳”为主线，首先分析基因工程的基本工具，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶以及载体质粒的特点和用途，再分析基因工程的基本过程，核心是目的基因的获取方式，重组DNA分子构建的原则，目的基因导入受体细胞的方法以及目的基因表达和鉴定的方法，最后分析PCR扩增目的基因及DNA粗提取和电泳的实验操作。 3．强化题型方法： 概念辨析题：准确区分易混概念，如DNA连接酶和DNA聚合酶；亚甲基蓝和溴麝香草酚蓝；基因组文库和cDNA文库。 功能应用题：理解并掌握限制性内切核酸酶的准确使用，重组DNA分子构建的基本步骤，PCR扩增的原理、过程及结果的鉴定；活动“DNA粗提取和电泳”。 核心·主干速记 核心1 基因工程的概念和基本工具 1.基因工程概念 （1）手段：按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。 （2）目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 （3）水平：分子水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作重组DNA技术。 2.基因工程的理论基础 3.重组DNA技术的基本工具 （1）限制性内切核酸酶（简称：限制酶） ①存在：主要存在于原核生物中。 ②作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 ③特性：一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，并且能在特定的位点上切割DNA分子。 ④产生末端的种类：黏性末端和平末端。 图中可见，限制酶在识别序列中心轴线两侧切开产生的是黏性末端，在识别序列中心轴线处切开产生的是平末端。 （2）DNA连接酶 ①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。 ②类型 常用类型 E.coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 功能 “缝合”黏性末端和平末端。E.coliDNA连接酶连接平末端的效率远远低于T4DNA连接酶 结果 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 （3）载体 ①作用：将基因送入细胞。 ②种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 ③重要的载体之一——质粒 1）质粒的本质：是一种裸露的、结构简单，独立于真核细胞的细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 2）质粒适于作基因载体的特点（载体须具备的条件） 特点（条件） 作用 有一个至多个限制酶切割位点 供外源DNA片段插入其中 能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体细胞DNA同步复制 便于目的DNA在受体细胞中稳定存在 带有标记基因（通常是人工改造后具有），一般为抗生素抗性基因或荧光基因等 便于重组DNA分子的筛选（鉴定目的基因是否导入成功） 4.与DNA有关的酶 酶 作用 作用相关“键” 限制酶 切割DNA片段，产生两个（具有相同黏性末端或平末端）DNA片段 破坏磷酸二酯键 DNA连接酶 催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而连接起来 形成磷酸二酯键 解旋酶 将双链DNA分子局部解旋为单链（ATP水解供能） 破坏氢键（氢键非化学键） DNA聚合酶 把游离的脱氧核苷酸连接到引物或者已有的DNA单链的3′端上 形成磷酸二酯键 DNA（水解）酶 将DNA水解为脱氧核苷酸 破坏磷酸二酯键 逆转录酶 以RNA为模板合成cDNA 形成磷酸二酯键 核心2 基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 （1）目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 （2）筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 （3）目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②常用PCR（聚合酶链式反应）特异性地快速扩增目的基因 PCR定义 在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 PCR原理 DNA半保留复制 条件 模板 目的基因的两条链 原料 4种脱氧核苷酸 酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。2种 在一定的缓冲溶液中进行；需要控制温度的变化 PCR反应过程 变性 当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 72℃左右时，在耐高温的DNA聚合酶作用下，从引物3′端开始进行互补链的合成 扩增 方向 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3′端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸 方式 指数形式扩增（约为2n，n为扩增循环的次数） 结果 短时间内大量扩增目的基因 产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳 ③通过构建基因文库来获取目的基因。 2.基因表达载体的构建——基因工程的核心工作 （1）操作目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）基因表达载体组成 ①目的基因：编码蛋白质的基因或具有调控作用的因子。 ②启动子：RNA聚合酶识别和结合的部位；能驱动基因转录出mRNA。 ③终止子：起调控作用，使转录在所需要的地方停下来。 ④标记基因：便于重组DNA分子的筛选。 （3）构建过程 （4）启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 DNA DNA mRNA mRNA 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（正常情况下，不编码氨基酸） 3.将目的基因导入受体细胞 细胞类型 方法 原理/操作步骤 植物细胞 花粉管通道法 ①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； ②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 农杆菌转化法 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T­DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。如果将目的基因插入Ti质粒的T­DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞 动物细胞（受精卵） 显微注射技术　　 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 微生物细胞（原核细胞） Ca2＋处理法 用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中 4.目的基因的检测与鉴定 （1）通过PCR等技术检测目的基因是否导入或是否转录出mRNA。 （2）利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译。 （3）进行个体生物学水平的抗虫、抗病、功能活性等鉴定。 核心3 DNA的粗提取、PCR扩增及电泳 1.DNA的粗提取与鉴定 （1）基本原理 ①提取原理：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol·L－1的NaCl溶液。 ②鉴定原理：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 （2）实验步骤（以洋葱为例） ①研磨材料：洋葱切碎，加研磨液充分研磨。 ②获取含DNA的滤液：过滤（纱布），4℃冰箱中静置后取上清液。或直接离心取上清液。 ③DNA的析出：在上清液中加入体积相等的体积分数为95%的预冷的酒精，静置2~3min后用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物。或离心取沉淀物。 ④溶解DNA：将丝状物或沉淀物溶解在2mol/L的NaCl溶液中。 ⑤DNA的鉴定：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，混合均匀后，将试管置于沸水浴中加热5min，待试管冷却后，可观察到明显的颜色反应（变成蓝色）。 （3）注意事项 ①该实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA）。可选用鸡血细胞作材料。 ②加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA的断裂，导致DNA不能形成丝状物。 ③二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。 ④在DNA进一步提纯时，选用预冷的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定 （1）PCR仪：PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 （2）电泳鉴定PCR产物的原理 ①PCR原理：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 ②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 ③鉴定原理：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长300nm的紫外灯下被检测出来。 （3）实验步骤 ①PCR实验操作步骤 1）移液：用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，向微量离心管中依次加入各组分。 2）离心：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在管的底部。 3）反应：设置好PCR仪的循环程序，将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min — — 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后 1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，10min ②DNA的电泳鉴定 1）琼脂糖凝胶制备：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液（一般质量分数为0.8%～1.2%）。熔化琼脂糖，稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 2）凝胶板制备：将温热的琼脂糖溶液倒入模具，插入梳子形成加样孔，凝胶溶液完全凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内。 3）点样：加电泳缓冲液，没过凝胶1mm为宜。然后用微量移液器将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）的混合液注入加样孔，留一孔加标准参照物。 4）电泳：接通电源，设定好电压，一般为1-5V/cm，进行电泳。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 5）观察：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 （4）注意事项 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 ④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 两年模拟·基础通关 1．某科研团队利用基因工程培育抗虫棉花，将Bt毒蛋白基因导入棉花细胞，通常用农杆菌转化法。下列操作步骤的叙述，正确的是（    ） A．Bt基因需插入Ti质粒的T-DNA区段上 B．利用DNA连接酶将Bt基因导入棉花细胞 C．抗虫棉自交后代均能稳定表达抗虫性状 D．检测到Bt基因存在即说明抗虫性状已表达 【答案】A 【详解】A、农杆菌的Ti质粒上的T-DNA（可转移DNA）能够转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此Bt基因需要插入Ti质粒的T-DNA区段上，才能随T-DNA整合到棉花细胞的染色体中，A正确； B、DNA连接酶的作用是将Bt基因和Ti质粒连接，构建基因表达载体，无法直接将目的基因导入棉花细胞，导入过程依靠农杆菌的侵染作用完成，B错误； C、通常培育获得的抗虫棉为杂合子，即目的基因仅整合到一对同源染色体的其中一条上，自交后代会发生性状分离，并非所有个体都能稳定表达抗虫性状，C错误； D、检测到Bt基因仅说明目的基因成功导入棉花细胞，抗虫性状表达需要Bt基因经过转录和翻译合成Bt毒蛋白，还需检测对应蛋白质或进行抗虫接种实验才能证明性状成功表达，D错误。 2．科研人员利用PCR技术从北极鱼中扩增抗冻基因。下列有关PCR的叙述，错误的是（    ） A．反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶 B．引物与模板链的3'端结合，延伸方向为5'→3' C．变性、复性、延伸三个步骤的温度依次升高 D．可通过电泳检测PCR扩增产物的大小和纯度 【答案】C 【详解】A、PCR的变性步骤需要高温处理，普通DNA聚合酶高温下会失活，因此反应体系中需要加入耐高温的Taq DNA聚合酶，A正确； B、DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸子链，因此引物需与模板链的3'端结合，子链的延伸方向为5'→3'，B正确； C、PCR的变性温度通常为90℃以上，复性温度通常为50℃左右，延伸温度通常为72℃左右，三个步骤的温度并非依次升高，C错误； D、电泳可依据DNA分子的大小、带电量差异分离不同片段，因此可通过电泳检测PCR扩增产物的大小和纯度，D正确。 3．在活动“DNA的粗提取与鉴定”中，加入2mol/L的NaCl溶液的目的是（    ） A．使蛋白质变性并与DNA分离 B．抑制DNA酶活性 C．提取DNA D．析出DNA 【答案】C 【详解】DNA粗提取与鉴定实验的核心原理之一是：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度很高，蛋白质等杂质溶解度很低，加入该浓度NaCl可以让DNA溶解在溶液中，过滤除去不溶的杂质，从而提取出溶解的DNA，C正确，ABD错误。 4．下图表示基因表达载体的构建过程。下列相关叙述正确的是（　　） A．标记基因的作用是便于筛选含重组DNA的受体细胞 B．DNA连接酶的作用是将目的基因的黏性末端与载体的平末端连接 C．限制酶的作用是将目的基因与载体的切口处直接连接起来 D．用PCR扩增图中目的基因需要经过变性、退火、电泳三个步骤的多次循环 【答案】A 【详解】A、标记基因的功能就是筛选出成功导入重组DNA的受体细胞（例如抗生素抗性基因可让含重组质粒的受体细胞在对应抗生素培养基存活），A正确； B、DNA连接酶只能连接互补/相同类型的DNA末端，无法将目的基因的黏性末端与载体的平末端连接，B错误； C、限制酶的作用是切割DNA分子，获得带特定末端的目的基因和载体，连接DNA片段是DNA连接酶的功能，C错误； D、PCR扩增目的基因的循环步骤是：变性、退火（复性）、延伸，电泳是PCR产物的分离检测步骤，不是扩增循环的步骤，D错误。 5．作为基因工程的运输工具载体，必须具备的条件及理由对应叙述正确的是（　　） A．基因工程中目的基因的运输工具只能是质粒 B．具有某些标记基因，以便目的基因能够准确定位与其结合 C．只有一个限制酶切割位点，便于目的基因的插入 D．能够在宿主细胞中稳定保存并大量复制，以便提供大量的目的基因 【答案】D 【详解】A、基因工程中目的基因的运输工具即运载体，常见类型有质粒、噬菌体、动植物病毒等，并非只能是质粒，A错误； B、运载体上标记基因的作用是筛选出成功导入目的基因的受体细胞，目的基因与运载体结合依赖的是同种限制酶切割产生的相同黏性末端和DNA连接酶的作用，与标记基因无关，B错误； C、运载体需要具有一个或多个限制酶切割位点，便于适应不同限制酶切割的目的基因完成插入，并非只能有一个限制酶切割位点，C错误； D、运载体需要能在宿主细胞中稳定保存并大量复制，其携带的目的基因会随运载体同步复制，从而获得大量的目的基因，D正确。 6．下列关于DNA的粗提取、DNA片段的扩增和电泳鉴定的叙述，正确的是（　　） A．可利用DNA在酒精中溶解度较大的特点来提取DNA B．粗提取DNA时，将香蕉滤液离心后取上清液进行后续实验 C．PCR反应体系中的TaqDNA聚合酶在退火中起作用 D．电泳缓冲液内含甘油可以增加DNA样品密度 【答案】B 【详解】A、DNA提取纯化的一个关键原理是利用DNA在不同溶剂中的溶解度差异。DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，而在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度最高；同时，DNA不溶于酒精，特别是体积分数为95%的冷酒精，而细胞中的蛋白质、糖类等杂质在酒精中有一定的溶解度。因此，实验中向含有DNA的滤液中加入酒精，目的是使DNA析出（沉淀），而不是溶解，A错误； B、在离心力作用下，密度较大的不溶性杂质会沉到管底形成沉淀，而DNA分子溶解在溶液中，密度较小，会保留在上清液中。因此，取上清液进行下一步的酒精沉淀操作是正确的步骤，B正确； C、Taq DNA聚合酶主要在延伸阶段发挥催化作用，而不是在退火阶段，C错误； D、电泳缓冲液是充满整个电泳槽的液体，主要作用是导电和维持pH稳定，它本身不含甘油，D错误。 故选B。 7．作为基因工程的运输工具——载体，必须具备的条件及理由对应叙述错误的是（　　） A．对宿主细胞无伤害， 以免影响宿主细胞的正常生命活动 B．具有某些标记基因，以便目的基因能够准确定位与其结合 C．具有一个至多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入 D．能够在宿主细胞中稳定保存并大量复制，以便提供大量的目的基因 【答案】B 【详解】A、载体会和目的基因一起进入宿主细胞，因此载体对宿主细胞无伤害，以免影响宿主细胞的正常生命活动，A正确； B、载体必须具有某些标记基因，以便于重组后进行重组DNA分子的筛选，B错误； C、载体必须具有一个至多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入形成重组载体，C正确； D、载体必须能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便通过复制提供大量的目的基因，D正确。 故选B。 8．Sau3AI和BamHI的识别序列及切割位点如表所示。某DNA分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ分别切割以后，可形成4个和2个大小不同的片段。下列有关叙述正确的是（    ） 限制酶名称 识别序列和切割位点 BamHI G↓GATCC Sau3AI ↓GATC A．两种限制酶切割后形成的黏性末端不相同 B．能被Sau3AI识别的DNA位点均能被BamHI识别 C．该DNA分子上有2个BamHⅠ不能识别但Sau3AⅠ能识别的酶切位点 D．该DNA分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ共同切割后可形成6个片段 【答案】C 【详解】A、BamHI和Sau3AI两种限制酶切割后形成的黏性末端均为GATC，A错误； B、分析表格可知，BamHI的识别序列为GGATCC，Sau3AI的识别序列为GATC，由此可知，能被BamHⅠ识别的序列中包含了被Sau3AI识别的序列，所以能被BamHⅠ识别的序列也一定能被Sau3AI识别，但能被Sau3AI识别的DNA位点不一定能被BamHI识别，B错误； C、分析题意，某DNA分子经Sau3AⅠ和BamHⅠ分别切割以后，可形成4个和2个大小不同的片段，由此可知，该DNA分子上有2个BamHⅠ不能识别但Sau3AⅠ能识别的酶切位点，C正确； D、该DNA分子上有4个Sau3AI的酶切位点，有2个BamHI的酶切位点，但是BamHI识别序列中包含Sau3AI的识别序列，所以同时用两种酶共同处理，不会形成6个大小不同的DNA片段，D错误。 故选C。 9．如图所示是限制性核酸内切酶切割某DNA分子的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切点是（    ）    A．CTTAAG，切点在C和T之间 B．CTTAAG，切点在G和A之间 C．GAATTC，切点在G和A之间 D．GAATTC，切点在C和T之间 【答案】C 【详解】一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。据图可知，该限制酶能专一性识别GAATTC的序列，并在G和A之间将这段序列切开，C正确，ABD错误。 故选C。 10．2个来源不同的DNA片段A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段用限制酶XbaI进行切割，两种限制酶的识别序列和切割位点如图所示，产生的片段相连接形成重组DNA。若用限制酶SpeⅠ、限制酶XbaⅠ分别对重组DNA进行切割，结果是（　　）    A．两种限制酶都能识别重组DNA并将其切割成片段 B．只有限制酶SpeI能识别重组DNA并将其切割成片段 C．只有限制酶XbaI能识别重组DNA并将其切割成片段 D．两种限制酶都不能识别重组DNA，故不能将其切割成片段 【答案】D 【详解】限制酶的识别序列有4个、6个或8个核苷酸组成，大多数限制酶识别的序列是由6个，根据题意可知，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段用限制酶XbaI进行切割，由图可知，经Spe I和Xba I切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，所以可形成重组DNA分子，重组后的DNA分子没有这两种酶的酶切识别位点，所以两种限制酶都不能识别重组DNA，故不能将其切割成片段，ABC错误，D正确。 故选D。 11．分别用Xho I和Sal I两种酶处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如下图所示。下列叙述错误的是（　　） A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同 B．图1中被酶切的DNA片段是双链DNA C．图2中同一泳道中的酶切产物末端均不相同 D．图2中泳道①中是用SaI l处理得到的酶切产物 【答案】C 【详解】A、限制酶识别特定的脱氧核苷酸序列，不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列，故Xho I和Sal I两种酶识别的核苷酸序列不同，A正确； B、限制酶的作用部位是DNA分子中特定部位的磷酸二酯键，图1中被酶切的DNA片段是双链DNA，B正确； C、图2中同一泳道中的酶切产物是由同一种限制酶切割形成的，末端均相同，C错误； D、分析图1可知，DNA片段上有三个限制酶Sal I的切割位点，故Sal I可将DNA切割成四个片段，分析提图2电泳结果示意图，泳道①中是用Sal I处理得到的酶切产物，D正确； 故选C。 12．下列有关基因工程基本操作程序的叙述，正确的是（　　） A．目的基因检测时所用的核酸探针是指与目的基因相同的特定双链DNA B．基因文库包含基因库和cDNA文库 C．若基因比较小且核苷酸序列已知，则可直接通过化学方法合成 D．抗生素合成基因作为标记基因，可鉴别目的基因是否导入受体细胞 【答案】C 【详解】A、DNA探针是指用放射性同位素或荧光分子标记的DNA单链，利用碱基互补配对原则，检测目的基因是否导入受体细胞中，A错误； B、基因文库包括基因组文库和cDNA文库，B错误； C、若基因比较小且核苷酸序列已知，则可直接通过人工合成的方法获取，C正确； D、运载体上的抗生素抗性基因作为标记基因，可用于检测目的基因是否导入受体细胞，D错误。 故选C。 13．用农杆菌转化法培育转基因植物，下列叙述错误的是（　　） A．将目的基因插入Ti质粒的T-DNA片段 B．若目的基因的序列未知，可通过构建基因文库的方法从中获取 C．采用抗原-抗体杂交技术可检测目的基因在受体细胞中是否表达 D．植物受体细胞必须是受精卵细胞，因为其全能性最高 【答案】D 【详解】A、将目的基因插入Ti质粒的T-DNA片段，而T-DNA片段可以发生转移，并整合到宿主细胞的染色体DNA上，得到转基因植物，A正确； B、目的基因的获取方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成，若目的基因的序列未知，可以通过构建基因文库的方法从中获取，B正确； C、在分子水平上，采用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否在受体细胞中表达形成蛋白质，若出现杂交带，则表明目的基因在受体细胞内成功表达，C正确； D、虽然受精卵细胞全能性最高，但植物受体细胞一般是体细胞，利用农杆菌侵染植物的特点完成目的基因导入到植物细胞，再通过植物组织培养获得转基因植物，D错误。 故选D。 14．PCR技术是在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物技术。下列叙述正确的是（    ） A．双链DNA在高温下氢键和磷酸二酯键断裂形成2条DNA单链 B．温度降低后，单链DNA和引物结合的部分碱基序列相同 C．以2条DNA单链为模板，以4种NTP为原料，经耐高温酶在高温下合成2个新的DNA D．PCR结果出现较多非目的基因片段，可能是引物过短造成 【答案】D 【详解】A、双链DNA在高温下解旋使得DNA双链打开，破坏的是碱基对之间的氢键，磷酸二酯键没有断裂，A错误； B、当温度降低时，引物与模板链结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成2个DNA分子，此过程以4种脱氧核苷酸为原料，遵循碱基互补配对原则，单链DNA和引物结合的部分碱基序列互补，B错误； C、以2条DNA单链为模板，以4种NTP为原料，温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成2个新的DNA，C错误； D、引物过短，特异性差，可能会和非目的基因片段结合，导致PCR结果出现较多非目的基因片段，D正确。 故选D。 15．基因芯片技术是一种可同时检测不同基因片段的新型检测技术，芯片制作和使用过程如图所示： 下列叙述错误的是（    ） A．探针和样品都必须是单链 B．基因芯片上具有多种不同序列的探针 C．探针和样品上都需携带相同的荧光标记 D．洗脱的目的是去除未与探针杂交的样品 【答案】C 【详解】AC、基因芯片是利用核酸分子杂交原理进行基因检测的，因此探针和样品都必须是单链，同时应该在样品上放置荧光标记的探针，从而才能通过是否出现荧光来判定是否有特定序列，A正确，C错误； B、基因芯片的测序原理是杂交测序方法，基因芯片可以放置多种探针，检测多种不同序列，B正确； D、样品和探针的杂交后，需要将未结合的样品去除，避免影响信号检测，D正确。 故选C。 一年重难·情境应用 1．P基因与编码FLAG的序列形成一个融合基因，其中5′ATGTGCA3′为P基因编码链起始序列，如图所示。融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列不正确。核糖体读取mRNA时，从起始密码子（AUG）开始，每3个核苷酸一组，形成连续、不重叠的读码框。下列分析及修复方案错误的是（     ） A．P基因对应的氨基酸序列异常原因是mRNA上密码子读码框错位 B．EcoR I识别序列末端碱基与P基因编码链起始序列碱基共同编码一种氨基酸 C．在图中EcoR I识别序列的3′端添加1个碱基，可恢复正确读码框 D．为使P基因的PCR产物能被限制酶切割，需在引物5′端添加EcoR I的基因序列 【答案】D 【详解】A、题干明确FLAG的氨基酸序列正确，说明核糖体在FLAG序列区域的读码框是正常的；但P基因对应氨基酸序列异常，是因为衔接区域的碱基总数不是3的整数倍，导致核糖体进入P基因区域后读码框发生错位，A正确； B、EcoR I的识别序列是GAATTC，从图中编码链序列可见，EcoR I识别序列的末端两个碱基TC，和P基因编码链起始序列的第一个碱基A（P基因正确起始编码序列为5'ATGTGCA3'），共同组成密码子对应的编码链序列TCA，对应丝氨酸，即二者共同编码一种氨基酸，B正确； C、当前衔接后，FLAG末尾的Lys之后的读码为GCG/AAT/TCA/TGT/GCA...，而P基因正确的起始读码应为ATG/TGC/A...，目前P基因的第一个碱基A被拆分到了上一个密码子的末尾，读码框错位了2个碱基。在EcoR I识别序列3'端添加1个碱基后，总偏移碱基数变为3，即可让后续P基因区域的读码框恢复为每3个碱基一组的正确状态，C正确； D、PCR的引物是与模板互补的短单链核酸，为了让P基因的PCR产物能被限制酶切割，需要在引物的5'端添加的是EcoR I的识别序列，并非EcoR I这种限制酶的基因序列，D错误。 2．琼脂糖凝胶电泳是基因工程中分离鉴定DNA片段的常用技术。下列叙述正确的是（     ） A．DNA分子越大，其在电泳过程中迁移速率越快 B．低浓度的琼脂糖凝胶适合分离较小的DNA片段 C．电泳时指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 D．在电场作用下，DNA分子会向与它所带电荷相反的电极移动 【答案】D 【详解】A、琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子越大，受到凝胶的阻力越大，迁移速率越慢，A错误； B、低浓度琼脂糖凝胶孔隙更大，适合分离较大的DNA片段，高浓度凝胶孔隙小，才适合分离较小的DNA片段，B错误； C、电泳指示剂的作用是指示电泳的迁移进度，避免样品跑出凝胶，不能指示DNA分子的具体位置，DNA需要经特殊染色后才可观察到位置，C错误； D、DNA分子的磷酸基团带负电，在电场作用下会向带正电的（与自身所带电荷相反的）电极移动，D正确。 3．CRISPR/Cas9系统通过sgRNA引导Cas9蛋白切割特定DNA序列使其断裂，细胞修复断裂有两条途径：非同源末端连接（直接连接末端，易引入碱基随机插入或缺失）和同源定向修复（需提供修复模板DNA进行定向编辑）。下列叙述错误的是（    ） A．同源定向修复需要修复模板，而非同源末端连接不需要 B．修复模板DNA含有与目标DNA同源的序列，可实现外源基因的定点插入 C．sgRNA与Cas9蛋白结合后，通过碱基互补配对识别目标DNA序列 D．Cas9蛋白的功能与限制酶类似，都能切割磷酸二酯键，形成黏性末端 【答案】D 【详解】A、根据题干信息，同源定向修复需要提供修复模板DNA，非同源末端连接是直接连接断裂的DNA末端，不需要模板，A正确； B、修复模板DNA含有与目标DNA同源的序列，可通过同源重组将指定序列精准插入目标位点，实现外源基因的定点插入，完成定向编辑，B正确； C、sgRNA为单链RNA，可通过碱基互补配对识别目标DNA的特定序列，从而引导结合的Cas9蛋白定位到切割位点，C正确； D、Cas9蛋白和限制酶都能切割DNA的磷酸二酯键，但二者切割DNA后既可能形成黏性末端，也可能形成平末端，并非都形成黏性末端，D错误。 4．双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，降低了基因工程的成本与复杂性，研究人员利用双向启动子构建了下图所示表达载体，下列相关叙述错误的是（     ） A．为正确连接目的基因，可在其两端添加能产生不同黏性末端的不同限制酶的识别序列 B．表达载体中的GUS基因和LUC基因进行转录时，会使用DNA不同的单链作为模板 C．培养基中添加大观霉素可筛选出成功导入表达载体的植物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质检测双向启动子作用效果 【答案】C 【详解】A、在构建基因表达载体时，在目的基因两端添加不同限制酶的识别序列，酶切后会产生不同的黏性末端，可以避免目的基因反向连接、载体自连，保证目的基因正确方向插入载体，A正确； B、由图可知，双向启动子向两个相反方向驱动转录，GUS基因转录方向向左、LUC基因转录方向向右，说明两个基因的模板链是T-DNA的两条不同DNA链，B正确； C、由图可知，壮观霉素抗性基因位于T-DNA区域外，农杆菌转化法中，只有T-DNA会整合到受体细胞的染色体DNA上，因此壮观霉素抗性基因不会进入受体细胞染色体，无法筛选出成功导入表达载体的植物受体细胞，C错误； D、根据题干信息，LUC基因表达的荧光素酶可催化产生荧光，GUS基因表达的酶可催化产生蓝色物质；若双向启动子能正常发挥功能，两个基因都会表达，可通过观察是否出现荧光和蓝色物质，检测双向启动子的作用效果，D正确。 5．关于“DNA粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列叙述正确的是（     ） A．提取到白色丝状物与二苯胺试剂充分混匀，沸水浴加热后变紫色 B．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，提取DNA的效率会提高 C．为避免外源DNA等因素污染，微量离心管和枪头在使用前必须消毒 D．指示剂与DNA样品混合后一同上样到加样孔中，待指示剂迁移接近凝胶前电泳 【答案】D 【详解】A、提取到白色丝状物溶于2mol/L的NaCl后，与二苯胺试剂在沸水浴条件下反应，冷却后呈现蓝色，A错误； B、研磨液中含有破坏细胞膜、核膜的成分以及DNA酶抑制剂，既可以促进DNA释放，又能避免DNA被降解，若更换为蒸馏水，细胞破碎效率低且DNA易被细胞内的DNA酶分解，提取效率会降低，B错误； C、为避免外源DNA等污染，微量离心管和枪头使用前必须进行灭菌处理，消毒仅能杀死部分微生物，无法彻底清除外源核酸残留，达不到防污染的要求，C错误； D、电泳操作时，需将含指示剂的上样缓冲液与DNA样品混合后一同加入加样孔，随后启动电泳，待指示剂迁移至接近凝胶前沿时停止电泳即可，D正确。 6．下列关于PCR技术及凝胶电泳鉴定的说法，正确的是（    ） A．DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小、形状、所带电荷等有关，与凝胶无关 B．若以某DNA片段作为模板，5次循环后理论上需要消耗31对引物 C．PCR所用的解旋酶和DNA聚合酶都具有耐高温的特性 D．凝胶中的DNA分子可以直接在光下被检测 【答案】B 【详解】A、DNA分子在凝胶中的迁移速率不仅与DNA分子大小、形状、所带电荷有关，还与凝胶的种类、浓度（决定孔径大小）有关，A错误； B、PCR扩增n次后共得到2n个DNA分子，除初始模板的2条母链外，每条新合成的子链都需要1个引物；5次循环后新合成子链总数为2×25-2=62条，即需要62个引物，共31对，B正确； C、PCR通过高温变性实现DNA解旋，不需要添加解旋酶，仅所用的DNA聚合酶具有耐高温特性，C错误； D、凝胶中的DNA分子本身不能在可见光下显色，需经染色剂染色后在紫外光下才能被检测，无法直接在光下观察，D错误。 7．肿瘤化疗通过诱导肿瘤细胞的DNA损伤，引发肿瘤细胞死亡。肿瘤细胞会激活DNA损伤修复途径，导致肿瘤对化疗药物耐药。为探究P基因在乳腺癌中的作用机制，科研人员进行了相关研究。回答下列问题： (1)培养细胞时，若恒温培养箱内CO2不足，会导致培养液__________异常；乳腺癌细胞培养时__________（填“会”或“不会”）出现接触抑制现象。为防止细胞代谢产生的有害物质危害细胞，应__________；细胞传代培养时需要用胰蛋白酶处理，使贴壁细胞分散成单个细胞，操作时需要控制处理时间，原因是__________。 (2)P基因及转录方向、质粒图谱及目的基因插入位点的相关信息如图1所示（实线方框内横线处表示限制酶的识别序列，箭头处表示酶切位点）。质粒载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是__________，载体上与其能自我复制相关的结构是__________，载体上添加卡那霉素抗性基因的目的是__________。 (3)为构建重组质粒，扩增P基因时，应选择的一对引物为__________（填图2中序号）。为探究P基因对乳腺癌细胞增殖的影响，将重组质粒导入乳腺癌细胞的处理组作为实验组，对照组的处理是__________。 (4)S基因主要通过抑制DNA损伤修复途径来抑制肿瘤增殖，引发肿瘤细胞死亡。研究发现，P蛋白能诱导S基因的启动子甲基化。这表明P基因__________（填“促进”或“抑制”）S基因的转录，从而__________（填“促进”或“抑制”）肿瘤耐药。 (5)可通过PCR技术和琼脂糖凝胶电泳技术检测目的基因是否导入受体细胞。P基因对应的DNA片段结构如图3所示，其中①～④表示DNA上引物可能结合的位置。下列叙述中正确的有哪几项？__________。 A．用PCR技术扩增P基因，可选择引物①和④ B．PCR过程在第3轮循环结束后可得到两端都含引物的P基因 C．若用限制酶从该DNA片段中直接切取P基因，则会破坏4个磷酸二酯键 D．若用PCR技术扩增循环n次，共需要2n-2个引物 【答案】(1) pH 不会 定期更换培养液 胰蛋白酶处理时间过长会过度分解细胞表面蛋白质，损伤细胞 (2) 启动子 复制原点 筛选导入重组质粒的受体细胞 (3) ③④ 将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细胞 (4) 抑制 促进 (5)BC 【详解】（1）CO₂溶于培养液形成碳酸，维持培养液 pH，CO₂不足，pH异常升高；癌细胞失去接触抑制，会无限增殖，长满培养瓶后继续分裂；定期更换培养液可清除代谢废物，补充营养，防止代谢有害物质积累伤害细胞；胰蛋白酶处理时间过长，会过度分解细胞膜表面蛋白质，损伤细胞，甚至造成细胞破裂死亡。 （2）启动子是RNA聚合酶识别、结合位点，驱动基因转录；质粒上复制原点保证质粒在受体细胞自主复制；卡那霉素抗性基因的目的是作为标记基因，筛选成功导入质粒（ 重组质粒 ）的受体细胞。 （3）转录方向向左，P基因右侧（ATGCCT）要匹配 BglⅡ 位点，左侧（CCGTGT）匹配SpeⅠ；引物5'端要带上对应限制酶识别序列。上游引物（与模板3'端结合）选③，下游引物选④。对照原则需遵循单一变量，排除质粒载体本身对细胞增殖的影响，对照组需将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细胞。 （4）启动子甲基化，会抑制基因转录，使S基因难以转录出mRNA；S基因抑制DNA损伤修复、抑制肿瘤增殖；P抑制S基因 →DNA损伤修复恢复，肿瘤细胞抵抗化疗药物，促进肿瘤耐药。 （5）A、PCR引物方向是5'→3'，子链沿5'→3'延伸，应选引物②和③，不是①和④，A错误； B、PCR第3轮循环结束，首次出现两端都结合引物的目标片段，B正确；   C、限制酶在目的基因两侧各切1处，每切1个切口断裂2个磷酸二酯键；2个切口，一共破坏4个磷酸二酯键，C正确； D、PCR循环n次共产生2n个DNA分子，共含2×2n条脱氧核苷酸链，其中2条为原始模板链无需引物，新合成的DNA链数为2(n+1)-2条，每条新链需要1个引物，因此共需要2(n+1)-2个引物，D错误。 高考真题·考向感知 1．（2026·浙江6月选考真题）细菌可通过“限制-修饰”系统抵御噬菌体的侵染，该系统存在能识别相同DNA序列的限制酶和甲基化酶，具体过程如图所示。 下列叙述正确的是（     ） A．细菌对噬菌体DNA进行甲基化，以抑制噬菌体基因表达 B．限制酶和甲基化酶作用于相同底物，体现了酶的专一性 C．限制酶可特异性切割未被甲基化的噬菌体DNA D．细菌中发生的DNA甲基化不能遗传给子代 【答案】C 【详解】A、由图可知，细菌的甲基化酶仅对自身DNA进行甲基化，避免自身DNA被限制酶切割，不会对噬菌体DNA进行甲基化，A错误； B、酶的专一性指一种酶只能催化一种或一类化学反应，限制酶和甲基化酶是两种不同的酶，二者作用于相同底物不能体现酶的专一性，B错误； C、由图可知，噬菌体DNA未被甲基化，可被细菌的限制酶特异性切割，C正确； D、DNA甲基化属于表观遗传的修饰方式，该修饰是可以遗传给子代的，D错误。 2．（2026·浙江1月选考真题）利用转基因技术将口蹄疫病毒衣壳蛋白P1的基因导入水稻愈伤组织，获得了多个稳定表达P1的转基因水稻株系。转基因水稻的P1激活小鼠免疫反应的能力与大肠杆菌生产的P1相当，且给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应。下列叙述正确的是（　　） A．将愈伤组织进行脱分化和再分化，获得转基因水稻植株 B．不同株系转基因水稻P1蛋白的基因表达水平相同 C．转基因水稻与大肠杆菌生产的P1蛋白分子量相等 D．转基因水稻P1蛋白具备制成口服疫苗的潜力 【答案】D 【详解】A、水稻愈伤组织是已经完成脱分化的产物，要获得转基因水稻植株，只需对愈伤组织进行再分化（不需要再次脱分化）。植物组织培养的流程是：外植体→脱分化→愈伤组织→再分化→完整植株，A错误； B、转基因过程中，外源基因（P1基因）插入水稻染色体的位置是随机的（位置效应），不同株系的基因表达水平通常存在差异，B错误； C、水稻是真核生物，其细胞内的内质网和高尔基体可对表达的P1蛋白进行糖基化等修饰；而大肠杆菌是原核生物，缺乏这些细胞器，无法对蛋白质进行类似修饰。因此两者生产的P1蛋白分子量可能不同，C错误； D、题目明确指出“给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应”，说明口服P1蛋白可被小鼠免疫系统识别并引发免疫应答，具备制成口服疫苗的潜力，D正确。 故选D。 阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。    3．（2024·浙江6月选考真题）下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（    ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 4．（2024·浙江6月选考真题）为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。    1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（    ） A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 【答案】3．D 4．B 3．A、根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确； B、根据图乙信息可知，F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确； C、根据图乙信息可知，F1-R1能扩增目的1条带，F2-R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确； D、根据图乙显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。 故选D。 4．根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确，ACD错误。 故选B。 5．（2023·浙江6月选考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。    下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 【答案】B 【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合于Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误； B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确； C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误； D、用引物1和引物3进行PCR扩增，杂合子和Gata3—GFP基因纯合子都能扩增出相应片段，因此无法区分杂合子和纯合子，D错误。 故选B。 6．（2018·浙江6月选考真题）若利用根瘤农杆菌转基因技术将抗虫基因和抗除草剂基因转入大豆，获得若干转基因植物（T0 代），从中选择抗虫抗除草剂的单株S1、S2 和S3 分别进行自交获得T1 代，T1 代性状表现如图所示。已知目的基因能1次或多次插入并整合到受体细胞染色体上。下列叙述正确的是 A．抗虫对不抗虫表现为完全显性，抗除草剂对不抗除草剂表现为不完全显性 B．根瘤农杆菌Ti质粒携带的抗虫和抗除草剂基因分别插入到了S2的2条非同源染色体上，并正常表达 C．若给S1 后代T1 植株喷施适量的除草剂，让存活植株自交，得到的自交一代群体中不抗虫抗除草剂的基因型频率为 1/2 D．若取S2 后代T1 纯合抗虫不抗除草剂与纯合不抗虫抗除草剂单株杂交，得到的子二代中抗虫抗除草剂的纯合子占 1/9 【答案】C 【详解】图中S3自交获得的T1代：抗虫抗除草剂：抗虫不抗除草剂：不抗虫抗除草剂：不抗虫不抗除草剂=9:3:3:1，因此说明抗虫对不抗虫表现为完全显性，抗除草剂对不抗除草剂为完全显性，A项错误；只有单株S3符合抗虫和抗除草剂基因分别插入到了2 条非同源染色体上，并正常表达，而S2自交后代T1代中，抗虫抗除草剂植株有70株，而抗虫不抗病和不抗虫抗除草剂植株都只有5株，说明分别有两个抗虫基因和两个抗除草剂基因插入在S2植株细胞的两对同源染色体上，B项错误；S1自交获得的T1代中，抗虫抗除草剂：抗虫不抗除草剂：不抗虫抗除草剂=2:1:1，设抗除草剂与不抗除草剂分别由A和a控制，抗虫与不抗虫由B和b基因控制，当S1植株的A基因与b基因在一条染色体上，B基因与a基因位于另一条同源染色体上，才会出现T1代的抗虫抗除草剂（AaBb）：不抗虫抗除草剂（AAbb）：抗虫不抗除草剂（aaBB）=2:1:1，喷施除草剂后，S1 后代T1 植株中抗虫不抗除草剂植株（aaBB）死亡，剩余的抗除草剂植株（2AaBb+1AAbb）自交一代获得的群体的基因型为：（AAbb+ AaBb+aaBB）+AAbb，其中不抗虫抗除草剂的基因型（AAbb）频率为×+=，C项正确；S2自交后代T1代中，抗虫抗除草剂植株有70株，而抗虫不抗病和不抗虫抗除草剂植株都只有5株，说明分别有两个抗虫基因与抗除草剂基因在S2植株细胞的两对同源染色体上，则T1 纯合抗虫不抗除草剂（AAAAbbbb）与纯合不抗虫抗除草剂（aaaaBBBB）单株杂交，得到的子二代均为抗虫抗除草剂（AAaaBBbb），没有纯合子，D项错误。 7．（2025·浙江6月选考真题）玉米(2n=20)雌雄同株异花。从玉米某自交系(甲)中选育出2个雄性不育突变体(乙和丙)。已知雄性不育基因E1、E2由雄性可育基因E突变所致；如图1所示。甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，甲×丙的F2中雄性可育139株、雄性不育45株。利用引物P1和P2，对甲、乙、丙以及它们之间杂交的后代(丁和戊)基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经SnaBⅠ完全酶切后电泳，结果如图2所示。 回答下列问题： (1)E1基因与E基因相比，由于___________，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。E2基因与E基因相比，由于编码区增加了插入序列，导致___________，使编码的蛋白质中氨基酸数目减少。 (2)雄性不育对雄性可育是___________性状，乙的基因型是___________。甲×丙产生的F1其雌配子有___________种，F2可育植株中纯合子占___________。若甲×戊的F1随机交配，则F2中E1的基因频率是___________。 (3)写出丁×戊获得F1的遗传图解。 (4)雄性不育突变体不能自交繁殖。为了保存雄性不育突变体，需长期保留含不育基因的杂合子。该杂合子可采用上述“PCR结合限制性内切核酸酶酶切后分析条带”进行鉴定，还可采用的方法有___________(答出2点即可)。 (5)利用引物P1、P2对甲的基因组DNA进行PCR扩增和电泳，下列叙述错误的是___________。 A．PCR反应中TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸 B．图2中胶板的上端是电泳时的负极，且电泳时DNA片段由负极向正极泳动 C．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得16条含32P标记的DNA单链 D．若用32P标记引物P1，每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得8个含32P标记且长度为b的DNA分子 【答案】(1) 碱基对替换 终止密码子提前 (2) 隐性 E2E2 2/两/二 1/3 1/4 (3) (4)测交，自交，核酸分子杂交，基因测序 (5)C 【详解】（1）由图1可知，E1基因与E基因相比，由于碱基对替换，导致编码的蛋白质中1个氨基酸发生改变。由图1可知，E2基因与E基因相比，编码区增加了插入序列，结果编码的蛋白质中氨基酸数目减少，说明翻译提前终止，故反推出编码区增加了插入序列，导致mRNA上终止密码子提前。 （2）由题意可知，甲×乙的F2中雄性可育285株、雄性不育94株，即F2中雄性可育：雄性不育=285：94≈3：1，可知雄性不育为隐性性状，雄性可育为显性性状。甲基因型为EE，故图2中b片段对应E基因，E2基因长度大于E1，故a片段为E2，E1内部存在限制酶SnaBⅠ的识别序列，可被切割为c和d，据此可知乙的基因型为E2E2，丙的基因型为E1E1。甲×丙产生的F1的基因型为EE1，故其可产生2种类型的雌配子，分别是E、E1，F1自交，F2中的基因型及比例为EE：EE1：E1E1=1：2：1，其中EE、EE1雄性可育，因此F2可育植株中纯合子占1/3。由图2可知戊的基因型为E1E2，甲×戊的F1的基因型及比例为EE1：EE2=1：1，F1均可育，随机交配，基因频率不变，因此F2中E1的基因频率与F1中的相同，为1/2×1/2=1/4。 （3）由图2可知戊的基因型为E1E2，雄性不育，可作母本，产生两种类型的雌配子，分别是E1：E2=1：1；丁基因型为EE1，雄性可育，可作父本，产生两种类型雄配子，分别是E：E1=1：1，雌雄配子随机结合，F1的基因型为EE1：EE2：E1E1：E1E2=1：1：1：1，其中EE1和EE2为雄性可育，E1E1和E2E2为雄性不可育，因此丁×戊获得F1的遗传图解为： （4）鉴定基因有无常用的方法有PCR技术、核酸分子杂交、基因测序等，同时也可采用自交和杂交的方法进行鉴定，如含不育基因的杂合子EE1或EE2，测交后代雄性可育：雄性不育=1：1；自交后代雄性可育：雄性不育=3：1。 （5）A、PCR反应中的引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，故TaqDNA聚合酶是沿着模板链的3'端向5'端聚合核苷酸，A正确； B、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，因此若图2中胶板的上端是电泳时的负极，电泳时DNA片段由负极向正极泳动，B正确； CD、在PCR扩增中，1对引物中的每个引物P1和P2分别结合互补的链后进行延伸。每个DNA分子经4轮PCR循环后，可获得24=16个双链DNA分子，其中的15个双链DNA分子都有1条链结合P1引物。若用32P标记引物P1，可获得15条含32P标记的DNA单链，其中第1次扩增时，与P2引物结合的链最终形成的双链DNA分子没有被32P标记。同时获得长度为b，即目的基因片段长度的双链DNA分子为24-2×4=8个。C错误，D正确。 故选C。 8．（2026·浙江6月选考真题）科研人员取无籽和有籽葡萄植株若干，分别提取单株基因组DNA，取等量混合后，分别构建无籽组和有籽组样本库。利用A、T、G、C随机组合且长度为10个碱基的随机引物，对无籽组和有籽组进行PCR扩增，获得与无籽性状相关的特异性DNA条带，以便于无籽葡萄的快速筛选。已知随机引物在葡萄基因组DNA上有若干结合位点。回答下列问题： (1)基因组DNA的提取：葡萄叶片用液氮速冻后研磨成粉末状，添加提取液后离心，最后在上清液中加入预冷的乙醇溶液，用于______。在提取中，液氮速冻叶片的作用是使组织脆化以便于研磨，及______以保证DNA的完整性。 (2)PCR扩增：为更准确获得与无籽基因相关的DNA条带，实验中需对无籽组和有籽组的样本库而非单株进行分析，原因是为了消除______的干扰。制备50μL PCR反应体系时，若试剂总量不足50μL，需添加______补足。用某一种随机引物进行PCR，电泳结果如图1所示，下列叙述正确的是______。 A．与有籽葡萄相比，无籽葡萄的基因组DNA所含有的碱基对数量更多 B．与有籽葡萄相比，无籽葡萄的基因组DNA上可能多2个该引物的结合位点 C．若在该引物的端增加3个碱基，则扩增出的DNA条带会增加3个碱基对 D．若在该引物的端增加3个碱基，则扩增出的DNA条带会增加6个碱基对 (3)特异性条带DNA的测序：已知Taq DNA聚合酶会在合成的DNA链端非特异性多加1个A。为使PCR扩增出的DNA能与克隆载体连接，克隆载体经限制酶切割产生平末端后，需要______（A．在端加1个T  B．在端加1个T  C．在端加1个A  D．在端加1个A）。回收图1箭头所指特异性条带DNA，连接到克隆载体形成______，经克隆后测序。 (4)PCR重扩增：根据测定的DNA两端序列再设计长度为24个碱基的1对引物，对无籽组和有籽组进行PCR重扩增，电泳结果如图2所示。通过与______比对，可推测扩增出的DNA大小。与用随机引物扩增相比，PCR重扩增的特异性显著增强，其原因是提高了退火温度以及______。 【答案】(1) 沉淀 DNA 降低DNA酶的活性 (2) 遗传背景（单株存在个体差异） 无菌水 B (3) A 重组DNA (4) DNA marker（DNA相对分子质量标准物） 引物长度（变长） 【详解】（1）DNA不溶于预冷的乙醇，加入预冷的乙醇溶液后，可以让DNA从溶液中析出（沉淀DNA）；液氮的低温除了脆化组织便于研磨，还能降低DNA酶的活性，避免DNA被降解，保证DNA的完整性。 （2）混合多株的DNA建库，可以避免单个植株自身和无籽/有籽性状无关的随机遗传差异干扰，确保筛选到的条带是和无籽性状普遍关联的。 PCR体系需要用无核酸酶的无菌水补足体积，避免引入杂质影响反应。 A、电泳条带是扩增出的片段，不能代表整个基因组的碱基对总数差异，A错误； B、扩增一个片段需要两个引物，图1无籽组比有籽组多1条特异性扩增条带，说明无籽基因组上可能多了2个该随机引物的结合位点，扩增出对应片段，B正确； C、扩增一个片段需要两个引物，所以在引物5'端添加3个碱基，新合成的两条互补链都会对应多出3个碱基，总共使扩增片段增加6个碱基对，C错误； D、DNA聚合酶是从引物的3'端连接核苷酸，所以在该引物的端增加3个碱基，若引物仍能与原位置配对，则只是改变了引物的长度，扩增出的DNA条带长度不变，D错误。 （3）PCR产物的3'端多出1个A（A末端），为了实现互补的粘性末端连接，需要将载体的平末端处理后在3'端加1个T，即T-A克隆的原理，A正确，BCD错误。 （4）电泳图的M是DNA分子量标准（Marker），通过和Marker的条带比对，就可以估算扩增出的DNA片段的大小；相比10个碱基的随机引物，新设计的24碱基引物序列更长，和基因组DNA发生非特异性互补结合的概率大幅降低，同时更高的退火温度也进一步减少错配，因此扩增特异性显著增强。 学科网（北京）股份有限公司 $