第40讲 基因工程以及生物技术的安全性和伦理问题（培优专练）（26年高考真题+强化训练+限时模拟）（全国通用）2027年高考生物一轮复习高效培优系列

**基本信息** 以基因工程核心技术为主线，通过真题感知、情景探究、图表分析、实验探究及限时模拟，系统覆盖工具酶应用、载体构建、转化技术及生物安全伦理，强化科学思维与探究实践能力。 **专项设计** |模块|题量/典例|题型特征|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |真题·命题感知|3道高考真题|聚焦PCR扩增、酶切位点选择、融合蛋白构建|从基因操作基础到应用，体现结构与功能观| |进阶·情景探究|16题（农业/环保/伦理等）|结合生产生活实际，考查技术应用与安全评估|技术原理→实际应用→伦理分析，形成完整逻辑链| |进阶·图表分析|15题（电泳/数据表格/机制图）|解读实验结果、分析数据关联性|实验设计→结果呈现→结论推导，培养科学思维| |进阶·实验探究|7题（载体构建/工程菌培养等）|涉及实验设计、结果预测与误差分析|变量控制→方案设计→结果验证，强化探究实践| |拔高·限时模拟|20题（选择+非选择）|综合考查技术细节与跨模块知识整合|核心概念→技术流程→综合应用，提升应试能力|

第40讲 基因工程以及生物技术的安全性和伦理问题（一轮培优练）参考答案 真题·命题感知 题号 1 2 3 答案 B D C 进阶·强化演练 情境探究类 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 A B D B C C B D B A 题号 11 12 答案 C D 13.(1) 复制原点 终止子 终止目的基因的转录 (2) XhoⅠ NcoⅠ (3) b 重组表达载体总长度为5129bp，双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；DNA分子越小电泳迁移速率越快，目的基因更小，迁移更远，因此条带b对应目的基因 (4)工程菌适应环境后进入快速增殖阶段，菌体数量大量增加，合成的4αGT总量升高 14.(1) 四种脱氧核苷酸/dNTP、热稳定DNA聚合酶/Taq酶 引物D2和D3的碱基序列互补，放在同一体系会互相配对结合，形成引物二聚体，降低PCR扩增效率 (2) 5′ EcoRⅠ BamHⅠ (3) BglⅡ 感受 甲醇 (4) HSA-G4S-ONC融合蛋白能抑制肝癌细胞活性，且在一定浓度范围内，抑制效果随融合蛋白浓度升高而增强 HSA-G4S-ONC融合蛋白通过促进促凋亡蛋白Caspas8和BAX的合成，诱导肝癌细胞凋亡，从而抑制肿瘤 15.(1) 细胞核的亚显微 DNA和蛋白质 遗传信息库，是细胞代谢和遗传的控制中心 (2) mRNA从细胞核进入细胞质（或“组蛋白等从细胞质进入细胞核”等） 选择性 (3)排除假根中其他物质的影响，进一步证明细胞核控制伞帽的形状 (4)细胞核控制细胞的代谢和遗传，细胞核的存在对细胞的生存和繁殖等生命活动是必不可少的 (5)不支持。克隆人会带来一系列伦理问题，如克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念；克隆人是对人类尊严的侵犯；克隆技术还不成熟，可能克隆出有严重生理缺陷的人等 16.(1) 交换 最大限度地减少对CS基因的破坏 (2)无 (3)引物1和引物4，引物3和6 (4) MⅡ 使供体和受体的生理条件达到同步或一致 (5)引入外源基因 图表分析类 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 C A C C D C C D C C 11(1)细胞水平和分子 (2) 草 e (3)使转入的与生长有关的基因在肌肉组织中特异性地表达，促进肌肉增重以期增产 (4)①支持②外源基因经过人体消化道时会被分解，不会危害人体健康； ①支持②生态安全评估实验表明冠鲤的生存力、繁殖力和竞争力较差，种群无法在自然环境中生存繁衍； ①反对②生态安全评估实验仅持续5年，在更长的时间周期后是否会发生突变和基因扩散的可能性难以预知。 12 (1) 磷酸二酯键 AGAG 切割位点不在识别序列内部（切点位于识别序列外侧） (2) 外侧 0 (3) GGTCTCCAGAG 2n−2n (4) 含氨苄青霉素的固体培养基 菌落显现红色 13(1) 人工合成法（化学合成法） T4 未插入目的基因的pPK2空质粒 A D 染色体DNA B (2)工程菌的引诱能力更强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，附着的孢子量更多，孢子附着量决定蚊子死亡速度，因此致死速度更快，半数致死时间LT50缩短，第7天死亡率更高 (3)安全性 14．(1) Mg2+（或“镁离子”） 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 (2) Hind Ⅲ EcoRⅠ (3) 复合体对MRE序列的识别具有高度特异性 利用定点突变（或基因编辑）技术将启动子区的CCTGCC修正为CCTACC（或更换含天然CCTACC序列的小麦品种作为受体等） 白色 (4)转基因小麦的食品安全性（或对不同环境的适应性，花粉漂移对生态环境的影响，种子生产成本等合理答案） 15.(1) DNA 磷酸与脱氧核糖交替连接，排列在外侧 0 (2) 转录和翻译 细胞质（或拟核区） (3)GA与C基因过量表达的C蛋白结合（形成的复合体），激活GFP基因，合成绿色荧光蛋白，产生绿色荧光现象 实验探究类 1(1) 脱氧核苷酸（或原料） 引物设计特异性不足（或模板 DNA 污染、退火温度过低） (2) 在含氯霉素培养基上形成菌落,在含四环素培养基上不形成菌落 Spn Ⅰ (3) hok/sok（m） sok 基因碱基缺失导致 sokmRNA 结构异常,无法结合 hokmRNA,毒蛋白 hok 过量表达,含该质粒的细菌裂解死亡,导致质粒丢失率升高 2.(1)与人类基因同源性达87% (2)向导RNA与基因组序列匹配（向导RNA与目标DNA互补配对） (3)与基因组DNA切口相同的黏性末端（或Cas9内切酶的识别序列） (4) 1和5 只有引物1和5才能将重组DNA准确扩增出来且PCR产物的长度与检测结果相符（或符合PCR产物长度显示结果或出现特定的PCR产物条带） 3. (1)C (2)CD (3)AB (4) 减少 增加 ①②③ (5) ④⑤① 4. 抗原 基因工程 复制（的关键） 限制性核酸内切酶（限制酶） 使其保留侵染人体细胞的能力，但不能复制，不会让人患病 群体免疫不能通过让大量的人患病来实现，必须以科学为基准，通过疫苗接种来达成这样的目标 对小鼠（或其他动物）注射新冠病毒棘突蛋白，得到相应的B淋巴细胞，再将得到的B淋巴细胞与小鼠（或其他动物）骨髓瘤细胞融合，筛选出能产生新冠病毒棘突蛋白相应抗体的杂交瘤细胞，对其进行克隆化培养和抗体检测，获得足量的能分泌所需抗体的细胞，最后，在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠（或其他动物）腹腔内增殖，这样，从细胞培养液或小鼠（或其他动物）腹水中，就可以提取出大量的单克隆抗体 5.(1) dNTP、耐高温的DNA聚合酶 激活DNA聚合酶活性 5′ SalⅠ、EcoRⅠ (2) RNA聚合酶识别和结合 β (3) 受精卵 Gata3-GFP（融合蛋白） (4) A、C 1、5 (5)单克隆抗体 6.(1) 结构 基因工程 (2) 提高 ①③ (3) 引物F2和R1可发生碱基互补配对 Taq DNA聚合酶 7(1)5’ (2) 3 农杆菌中的 基因不会被整合到植物基因组中 (3) 组成 在干旱条件下，NtNAC1 基因表达增强，提高植物的抗逆性 (4) 个体/个体水平 ① → ⑤ → ② → ③ → ⑥ 拔高·限时模拟 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 D D A B B D B A D A 题号 11 12 13 14 15 答案 B C B D B 16．（除标注外，每空1分，共10分） (1) 胰蛋白酶（或胶原蛋白酶） 去除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成伤害(2分) 总mRNA (2) PvitⅡ T4DNA连接酶 没有启动子,没有拼接到受体细胞的DNA上(2分) (3) 温度、pH 短 17．（除标注外，每空1分，共10分） (1)碱基互补配对 (2)RNA 聚合酶 (3)系统X能抑制基因表达，靶向Q1时效果更好；P蛋白不影响系统X的抑制功能（2分） (4) Q4、Q6 （2分） 绿色荧光减弱，红色荧光增强（2分） (5)将靶向F基因的gRNA基因启动子替换为诱导型启动子，使其在大肠杆菌数量增殖到一定阶段才开始表达（2分） 18．（每空2分，共10分） (1) 外源基因可随染色体复制稳定遗传至手我细胞或避免了游离质粒因传代丢失的风险 避免等位基因干扰，基因型与表现型稳定对位，遗传筛选更直接 (2) 作为诱导剂、碳源 探究只添加甲醇与添加甲醇和甘油对毕赤酵母的细胞干重和胰蛋白酶活性的影响 (3) 中心法则 需要适度诱导自切位点的突变数，过多点突变会降低胰蛋白酶的催化效率 19．（除标注外，每1分，共13分） (1) 外来花粉的干扰 杂合子比例逐渐减小（或后代纯合率逐渐升高） (2) cpti基因（或有cpti基因的基因表达载体） 引物 无条带 (3) （2分） 抗虫基因所在的同源染色体片段发生交叉互换 （2分） 抗虫：不抗虫=15：1（2分） (4)已有药物可能会在使用一段时间后害虫出现抗药性，蛋白酶抑制剂不易使害虫产生耐受性；蛋白酶抑制剂可防止环境污染；蛋白酶抑制剂对人畜无副作用等（2分） 20．（除标注外，每空2分，共12分） (1)维持稳定和表达 (2) 标记基因 融合基因表达产物是GIF﹣GRF融合蛋白，GIF已与GRF结合，可更好发挥作用 (3) 带芽的愈伤组织÷胚×100% WUS+BBM促进脱分化，GRF﹣GIF促进愈伤组织再分化 GRF﹣GIF比WUS+BBM能更好地加速高粱的遗传改良 答案第1页，共2页 学科网（北京）股份有限公司 $ 第40讲 基因工程以及生物技术的安全性和伦理问题（一轮培优练） 目 录 真题·命题感知（含2026高考真题） 1 进阶·强化演练（含情景探究、图表分析、实验探究类） 4 拔高·限时模拟（75分钟 100分） 48 真题·命题感知 1．（2026·湖北·高考真题）为了研究大肠杆菌中蛋白A的结构与功能，通过设计特异性引物F1、F2，用PCR技术从大肠杆菌DNA中扩增基因A，再用质粒P构建表达载体。基因A和质粒P的部分酶切图谱如图所示。 下列叙述正确的是（     ） A．F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XhoⅠ酶切位点 B．F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点 C．F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点 D．F1、F2的5'-端分别含有PvuⅠ、ScaⅠ酶切位点 命题情境 本题以科研场景：利用 PCR 扩增大肠杆菌蛋白 A 基因、质粒构建表达载体为真实基因工程实验情境，结合限制酶酶切图谱，考查引物设计与酶切位点匹配逻辑，贴合高考依托分子生物学实验图谱、考查基因工程实操应用的命题趋势。 考点解读 核心考点：PCR 引物设计原则、限制酶切割位点、基因表达载体构建、黏性末端连接逻辑。 PCR 引物的酶切位点需加在引物5' 端（3' 端负责与模板互补配对延伸，不能加酶切位点）； 构建载体时，目的基因两端酶切位点需与质粒多克隆位点两种不同限制酶匹配，防止目的基因、质粒自身环化与反向连接； 需结合质粒图谱、目的基因两端酶切位点对应判断引物携带的限制酶。 解题方法 图谱匹配分析法：观察质粒多克隆位点可用酶、目的基因两端适配酶，确定上下游引物 F1、F2 分别携带 HindⅢ、XbaⅠ 位点，锁定正确选项 B； 引物结构规则直判：牢记酶切位点只能加在引物 5' 端，3' 端为互补序列，排除位点位置逻辑错误选项； 排除法：A 中 XhoⅠ、C 中 AccⅠ、D 中 PvuⅠ/ScaⅠ 均与质粒酶切位点不匹配，直接排除。 答案：B 2.（2026·江西·高考真题）蛋白酶E被广泛用作洗涤剂的生产原料，但洗涤剂中的物质S能将E的第n位甲硫氨酸氧化，降低其活性。研究人员将上述甲硫氨酸替换为丝氨酸，提高了E对S的耐受性。下列叙述错误的是（　　） A．第n位甲硫氨酸的氧化会影响E的空间结构，从而影响酶的活性 B．将第n位的甲硫氨酸替换为丝氨酸可通过基因工程实现 C．判断E的改造效果，需用S处理一段时间后测定酶活性 D．甲硫氨酸的替换在提高E对S耐受性的同时，降低了E的专一性 命题情境 本题依托洗涤剂工业生产实际问题：氧化剂 S 氧化蛋白酶甲硫氨酸导致酶失活，通过定点替换氨基酸改造酶的工业应用情境，将蛋白质工程、酶结构与活性结合生产生活，符合高考工业生物技术应用类命题风格。 考点解读 核心考点:蛋白质空间结构与酶活性、蛋白质工程（定点突变）、酶特性（专一性）、实验验证思路。 氨基酸改变会改变多肽链局部空间结构，进而影响酶活性； 定点替换特定氨基酸属于蛋白质工程，通过改造基因实现蛋白质改造； 验证改造效果的实验组处理：均加入物质 S，检测改造前后酶活性对比； 仅替换单个氨基酸提升氧化剂耐受性，不改变酶识别底物的结合位点，不会降低酶专一性（D 选项错误）。 解题方法 结构功能对应法：氨基酸序列→蛋白质空间结构→酶活性，直接判断 A 表述正确； 工程技术区分法：定点改造氨基酸属于蛋白质工程（基因工程延伸），B 正确； 实验逻辑分析法：自变量为蛋白酶是否改造，无关变量 S 统一处理后测酶活，C 正确； 概念辨析法：酶专一性由底物结合口袋结构决定，仅替换抗氧化位点氨基酸不影响底物识别，判定 D 错误。 答案：D 3．（2026·云南·高考真题）内含肽（Int）可通过自我催化实现自我切除并无痕连接两侧肽链。构建编码“内含肽+X蛋白”和“内含肽+Y蛋白”的基因，将其导入真核细胞表达后，内含肽自我切除生成X+Y融合蛋白，如图。 下列说法正确的是（　　） A．构建X+Y融合蛋白基因导入细胞，会因碱基序列相互影响而使蛋白功能异常 B．内含肽序列需嵌入X蛋白的功能结构内，以保证获得的融合蛋白功能正常 C．不同内含肽之间通过能匹配的结构相互识别，发挥特异性切除和连接作用 D．为X+Y融合蛋白提供“内含肽+某蛋白”，可赋予X+Y融合蛋白新的结构 命题情境 本题以新型蛋白拼接技术（内含肽自我催化切除、无痕融合蛋白制备）为前沿分子生物学科研情境，搭配过程示意图，依托图示信息考查蛋白质加工、分子识别、蛋白改造，贴合高考前沿生物技术 + 图表分析的命题特点。 考点解读 核心考点：蛋白质翻译后加工、蛋白结构特异性识别、内含肽催化功能、融合蛋白构建与功能。 内含肽分段（IntAᴺ、IntBᶜ、IntAᶜ、IntBᴺ）依靠互补空间结构特异性识别，自我催化切除并无痕连接两侧外肽链（X、Y 蛋白）； 内含肽不能嵌入 X 蛋白功能结构区，否则会破坏 X 原有功能； 单独构建融合基因不会直接导致蛋白功能异常，内含肽可切除分离； 外源添加 “内含肽 + 某蛋白” 无法直接改造已合成的 X+Y 成熟融合蛋白结构。 解题方法 图示信息提取法：从图中观察内含肽分段互补配对、特异性结合后切除，直接判定 C 正确； 功能分区逻辑排除：内含肽插入 X 蛋白非功能区才能保证蛋白活性，B 错误； 过程顺序分析法：融合基因表达后内含肽会自动切除，碱基序列不会持续干扰成熟蛋白功能，A 错误； 蛋白合成时序判断：内含肽仅在翻译过程中催化拼接，成熟 X+Y 蛋白无法通过外源内含肽片段改造结构，D 错误。 答案：C 进阶·强化演练 情境探究类 1．【农业转基因】科研人员培育抗虫转基因大豆，先后尝试两种转化方案：方案一利用农杆菌转化法处理大豆离体子叶的愈伤组织；方案二在大豆受粉后，利用花粉管通道法将含抗虫基因的DNA溶液导入胚囊。两种方案最终均获得部分转基因大豆植株。下列叙述错误的是（　　） A．方案一当农杆菌感染愈伤组织时，菌体进入愈伤组织细胞后留在细胞质内 B．方案二借助授粉后未闭合的花粉管通道，外源DNA可进入胚囊作用于受精卵 C．方案一转化细胞需经组织培养获得完整植株，方案二无需离体组织培养，操作更简单 D．方案一可在愈伤组织阶段用标记基因初步筛选，方案二不能在受精卵时期利用标记基因筛选 【答案】A 【详解】A、农杆菌转化法中，农杆菌感染植物细胞时仅将自身Ti质粒上的T-DNA转移并整合到植物细胞的染色体DNA上，农杆菌菌体本身不会进入植物细胞内，A错误； B、花粉管通道法的原理是借助授粉后尚未闭合的花粉管通道，外源DNA可进入胚囊，进而作用于受精卵或早期胚胎细胞，B正确； C、方案一的受体是离体的愈伤组织，需要经过植物组织培养的再分化过程才能发育为完整植株；方案二直接将外源DNA导入胚囊的受精卵，受精卵可在植株体内发育为种子，播种后即可得到植株，无需离体组织培养，操作更简单，C正确； D、方案一的愈伤组织是离体培养的细胞，可通过标记基因对应的抗性筛选等方式初步筛选成功转化的细胞；方案二的受精卵位于大豆的子房内，无法在受精卵时期直接进行标记基因相关的筛选，D正确。 2．【畜牧养殖】牛奶中的β-酪蛋白有A1和A2两种亚型，由一对等位基因控制，其中A1亚型蛋白会引发人肠胃胀气、腹痛等不适症状。只有纯种A2型奶牛才能产出只含有A2 亚型蛋白的牛奶。欲获得纯种A2型奶牛，下列做法不恰当的是（　　） A．利用基因测序等检测技术筛选纯种A2型奶牛 B．利用γ射线照射实现A1向A2基因的定向突变 C．利用人工选择，提高奶牛群体中A2基因的频率 D．利用体外受精和胚胎移植实现A2型奶牛的扩繁 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、基因测序等检测技术可以准确检测奶牛的基因组成，通过检测能够筛选出基因型为纯合的A2型奶牛，这种做法是可行的，A正确； B、射线照射会引起基因突变，但基因突变具有不定向性，利用射线照射不能实现从A1到A2基因的定向突变，无法按照人们的意愿获得纯合的A2型奶牛，B错误； C、人工选择可以选择产A2型蛋白的奶牛进行繁殖，经过多代选择，可以提高奶牛群体中A2基因的频率，从而逐渐获得更多纯合的A2型奶牛，该做法是合理的，C正确； D、利用体外受精和胚胎移植技术，可以对A2型奶牛的胚胎进行大量繁殖和移植，实现A2型奶牛的扩繁，有助于获得更多的纯合A2型奶牛，D正确。 故选B。 3．【基础分子实验】研究者从酵母菌中获取控制细胞色素氧化酶（存在于线粒体）的某一段肽合成的DNA片段，将其与小鼠的二氢叶酸还原酶（只存在于细胞质基质）基因融合。重组基因在酵母菌表达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶。该研究的目的是（    ） A．获得融合蛋白 B．研究该段肽的作用 C．引导二氢叶酸还原酶进入线粒体 D．研究重组基因的功能 【答案】D 【分析】基因是有遗传效应的DNA片段，基因的表达包括转录和翻译两个阶段。染色体是基因的主要载体，核基因在染色体上呈线性排列。 【详解】A、重组基因在酵母菌表达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶，该酶不是新融合蛋白，A错误； B、获得的是二氢叶酸还原酶，它由二氢叶酸还原酶基因指导合成，跟段肽没有关联，该研究的目的并不是研究该段肽的作用，B错误； C、该实验没有体现引导二氢叶酸还原酶直接进入线粒体的过程，C错误； D、该实验从酵母菌中获取控制细胞色素氧化酶（存在于线粒体）的某一段肽合成的DNA片段，将其与小鼠的二氢叶酸还原酶（只存在于细胞质基质）基因融合，得到重组基因，重组基因在酵母菌表达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶，可以体现基因的表达过程，该研究的目的就是研究重组基因的功能，或者是表达情况，D正确。 故选D。 4．【转基因作物】下列有关转基因植物的说法错误的是（    ） A．科学家可以利用一些调节细胞渗透压的基因，来提高作物的抗盐碱和抗旱的能力 B．由于抗虫棉可以抵抗一切危害棉花植株的害虫，所以抗虫棉已经推广应用 C．科学家往往将某种必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，以提高农作物的营养价值 D．植物体内的病原微生物主要有病毒、真菌和细菌等 【答案】B 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、调节细胞渗透压的基因（如脯氨酸合成相关基因）可增加细胞内溶质浓度，增强植物保水能力，从而提高抗盐碱和抗旱能力，A正确； B、抗虫棉通常转入Bt毒蛋白基因，仅对鳞翅目害虫（如棉铃虫）有效，对其他害虫（如蚜虫）无效，B错误； C、将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物（如富含赖氨酸的基因），可弥补植物中某些必需氨基酸的不足，提高营养价值，C正确； D、植物病原微生物包括病毒（如烟草花叶病毒）、真菌（如锈菌）和细菌（如软腐病菌），D正确。 故选B。 5．【新型基因编辑】与传统CRISPR-Cas9系统相比，利用大丝氨酸重组酶（如Kp03）进行基因组编辑的核心优势在于（    ） A．需要设计更长的向导RNA（gRNA）来寻找靶点 B．依赖于非同源末端连接（NHEJ）修复途径 C．在不造成DNA双链断裂的情况下实现大片段整合 D．只能用于细菌基因组的编辑，无法应用于动植物 【答案】C 【详解】A、大丝氨酸重组酶（如Kp03）通过识别特定DNA序列直接催化重组，无需向导RNA（gRNA）引导靶点定位，A错误； B、CRISPR-Cas9依赖DNA双链断裂（DSB）后的非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）途径，而大丝氨酸重组酶不引起DSB，故不依赖NHEJ修复途径，B错误； C、大丝氨酸重组酶通过位点特异性重组，直接实现DNA大片段的无断裂整合，避免了DSB导致的潜在风险如基因突变，这是其核心优势，C正确； D、该类重组酶已成功应用于真核生物（如动植物）的基因组编辑，D错误。 故选C。 6．【冬奥环保设备】2022年2月，冬奥会在国家体育场等使用了无水免冲智慧生态厕所。该款厕所利用微生物降解技术，全程不用水且无臭无味。经降解的排泄物最终会变成有机肥料，实现资源再利用。这项“黑科技”中小小的微生物起了大作用，下列叙述正确的是（    ） A．“智慧生态厕所”将排泄物发酵成优质有机肥料供农业种植使用，实现了物质和能量的循环利用 B．“智慧生态厕所”在选择菌种时需考虑循环、协调的原理，不需要考虑自生、整体的原理 C．可用硝化细菌除臭的原因是它能将有臭味的NH3等物质氧化为无味的产物 D．高效降解菌种的筛选需要用到微生物实验室培养的技术，不需要基因工程等现代技术 【答案】C 【分析】生态系统具有一定的自动调节能力，生物种类越多，营养结构越复杂，自我调节能力就越强，抵抗力稳定性越高，恢复力稳定性越低。 【详解】A、“智慧生态厕所”利用微生物发酵技术，将排泄物分解成优质有机肥料供农业种植使用，实现能量多级利用，提高能量利用效率，能量不能循环利用，A错误； B、“智慧生态厕所”在选择菌种时既需考虑循环、协调的原理，也需要考虑自生、整体的原理 ，B错误； C、硝化细菌可进行化能合成作用，能利用NH3转化为NO3-，可除臭，C正确； D、高效降解菌种的筛选需要用到微生物实验室培养的技术，也可通过转基因技术获得高效降解污染物的工程菌，D错误。 故选C。 7．【CRISPR 编辑】基因组编辑技术是研究基因生物学功能的重要手段，下图所示为对某二倍体生物染色体上的B基因进行定点编辑的过程，该过程中sgRNA可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的切割位点。相关叙述错误的是（    ） A．sgRNA能与靶基因部分序列进行碱基互补配对 B．Cas9通过断裂氢键实现对DNA特定位点的切割 C．被编辑后的B基因与原B基因互称为等位基因 D．可据B基因被破坏后生物体的变化推测B基因的功能 【答案】B 【分析】分析题图：用sgRNA可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的切割位点并进行切割，进而将基因Ⅱ切除，连接基因Ⅰ和Ⅲ，形成新的B基因。 【详解】A、sgRNA可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的切割位点，因此基因定点编辑前需要设计与被切割基因两端碱基序列配对的sgRNA，A正确； B、核酸内切酶Cas9可断裂脱氧核糖核苷酸之间的化学键，即磷酸二酯键，B错误； C、被编辑后的B基因与编辑前的B基因由于位于同源染色体的相同位置，所以它们互称为等位基因，C正确； D、蛋白质是生命活动的主要承担者，基因决定蛋白质的合成，通过破坏B基因后生物体的功能变化可推测B基因原有的功能，D正确。 故选B。 8．【人工酵母科研】中国科学院覃重军团队在国际上首次构建出具有一条染色体的活酵母细胞。他们利用基因编辑工具CRISPR-Cas9切割端粒附近的基因组序列，进而利用修复DNA 切口的酶让两条染色体融合在一起。同时，还移除了两条染色体中的一条染色体上的着丝粒。下列说法错误的是（    ） A．人造酵母菌属于真核细胞，遗传信息的表达遵循中心法则 B．仅保留一个着丝粒有助于保证细胞分裂时染色体的稳定性 C．染色体的切割和拼接过程发生了染色体的结构和数目变异 D．CRISPR-Cas9可以准确的识别目标序列并进行切割和修复 【答案】D 【分析】分析题干信息：他们利用基因编辑工具CRISPR-Cas9切割端粒附近的基因组序列，进而利用修复DNA 切口的酶让两条染色体融合在一起，说明该过程发生了染色体的结构变异和数目变异。 【详解】A、人造酵母菌也含有染色体，属于真核细胞，其DNA可以进行转录翻译，遗传信息的表达遵循中心法则，A正确； B、仅保留一个着丝粒可以避免染色体在细胞分裂时发生断裂，保证细胞分裂时染色体的稳定性，B正确； C、染色体的切割和拼接过程，发生了2条染色体的拼接导致数量上减少了，这属于染色体结构变异和数目变异，C正确； D、根据题干信息，CRISPR-Cas9只能识别目标序列并进行切割，进行修复的是其他的酶，D错误； 故选D。 9．【抗生素发酵】青霉素具有高效、低毒的特点，是人类发现的第一种抗生素，也是目前全球销量最大的抗生素，可利用现代生物发酵技术进行规模化生产。下列叙述错误的是（    ） A．青霉素的发酵生产多采用好氧、液体深层培养的方式进行 B．培养基的原料选择时，来源充足且廉价即可用于大规模发酵生产 C．可通过诱变、转基因、原生质体融合等方法培育高产菌种 D．可通过吸附、萃取等方法分离目标产物青霉素 【答案】B 【分析】青霉素是由青霉菌产生的一种抗生素，青霉菌是好氧型真菌；工业上可通过诱变、转基因、原生质体融合等方法培育高产菌种，以提高青霉素的产量。 【详解】A、青霉菌属于好氧型真菌，进行青霉素发酵生产多采用好氧、液体深层培养的方式进行，可充分利用培养基中的原理，A正确； B、培养基的原料选择时应考虑是否适合微生物的生长、来源是否充足等，满足微生物的生长至关重要，B错误； C、可通过诱变、转基因、原生质体融合等方法培育高产菌种，以提高青霉素的产量，C正确； D、分离青霉素的方法有多种，包括吸附、萃取、离子交换、沉淀等，D正确。 故选B。 10．【AI 合成生物安全】AI算法与合成生物学技术融合，可用于设计人工代谢途径、改造微生物细胞等，在医药、环境治理等领域展现巨大潜力，同时引发了生物安全性相关讨论。下列叙述错误的是（     ） A．AI构建的工程菌若进入自然环境，不会改变原有群落结构 B．AI设计合成的新功能微生物，可因基因扩散造成生态安全风险 C．AI辅助优化的合成生物学产品，需经严格的安全性评价方可应用 D．对AI设计的高风险生物元件实施严格管控，利于维护国家生物安全 【答案】A 【详解】A、人工构建的工程菌进入自然环境后，可能凭借改造获得的优势性状在种间竞争中占据有利生态位，影响本土生物的生存，会改变原有群落结构，A错误； B、AI设计的新功能微生物携带的特殊功能基因，可能通过基因交流扩散到其他野生生物中，造成基因污染，引发生态安全风险，B正确； C、合成生物学产品存在潜在的未知安全风险，必须经过严格的安全性评价，确认无危害后方可推广应用，C正确； D、对高风险生物元件实施严格管控，可避免其意外泄漏或被滥用引发生物安全事故，有利于维护国家生物安全，D正确。 11．【异种移植伦理】2024年，基因编辑猪肾成功移植入人体，标志着异种移植技术迈出关键一步。下列关于生物技术伦理与安全性的叙述，正确的是（     ） A．异种移植只需解决免疫排斥问题 B．不商业化即可设计基因编辑婴儿 C．个人基因信息不应用于招聘或保险定价 D．生物武器危害大，可作为军事防御手段 【答案】C 【详解】A、异种移植除需要解决免疫排斥问题外，还需考虑跨物种病原体传播、伦理争议等多方面问题，并非只需解决免疫排斥，A错误； B、基因编辑婴儿会修改人类生殖细胞的可遗传基因，违反人类伦理道德，我国明确禁止以生殖为目的的人类胚胎基因编辑活动，和是否商业化无关，B错误； C、个人基因信息属于隐私，若用于招聘或保险定价会引发基因歧视，损害社会公平，因此该行为被严格禁止，C正确； D、生物武器传染性强、危害范围大且难以控制，我国明确禁止在任何情况下研发、储存、使用生物武器，不能作为军事防御手段，D错误。 12．【生物安全伦理】电影《731》揭示了战争时期滥用生物武器曾经给我国人民带来了深重的苦难。为生物技术的研究与应用敲响了永恒的警钟。下列相关叙述中，最能体现我国所倡导的生物安全伦理核心原则的是（    ） A．为确保研究成果的领先性，科学家有权对任何未知病原体进行功能增益研究 B．我国不允许进行任何生殖性克隆人实验，主张对治疗性克隆进行鼓励和支持 C．对于可能造成严重威胁的病原体，其研究必须在高等级生物安全实验室中进行 D．所有涉及人体的生物医学研究，都必须将受试者的权益和福祉置于科学利益之上 【答案】D 【详解】A、该观点完全违背了生物安全伦理，功能增益研究等高风险活动受到严格管制，绝非科学家个人有权任意进行，A错误； B、我国不允许进行任何生殖性克隆人实验，主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查，B错误； C、高等级生物安全实验室研究严重威胁的病原体，主要是从技术层面防控风险，属于生物安全措施的具体实施，而非伦理核心原则的直接体现，C错误； D、生物安全伦理的核心是“以人为本”，强调人的尊严、权益和福祉高于一切。所有涉及人体的生物医学研究将受试者权益置于科学利益之上，直接体现了“尊重生命、保障人权”这一生物安全伦理的核心原则，是最根本的要求，D正确。 故选D。 13．【工业酶工程】4-α糖基转移酶（4αGT）在工业生产中发挥重要作用。为实现产业化生产，研究人员利用双酶切法，从重组克隆载体（仅用于目的基因的复制和保存）中获取目的基因，连入表达载体，构建了高效表达4αGT的工程菌，流程如图1所示。回答下列问题： （1）为确保目的基因正常复制，重组克隆载体和重组表达载体均应含有的元件为________。为确保目的基因正常表达，相较于重组克隆载体，重组表达载体目的基因两端的元件除启动子外，还有________，作用为________。 （2）根据限制酶识别序列和切割位点，以及目的基因片段的黏性末端（图1），判断所使用的限制酶1是________，限制酶2是________。 （3）琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子大小与迁移速率成反比。为检验重组表达载体是否构建成功，用限制酶1和限制酶2切割后，进行电泳鉴定。构建成功的重组表达载体酶切产物的电泳结果如图2所示，条带________（填“a”或“b”）对应目的基因片段，理由是________。 （4）将重组表达载体导入受体细胞，获得的工程菌接入液体培养基中培养。定时检测培养液中4αGT的含量，结果如图3所示。阶段2中4αGT含量迅速升高的原因可能是________（答出一点即可）。 【答案】(1) 复制原点 终止子 终止目的基因的转录 (2) XhoⅠ NcoⅠ （3） b 重组表达载体总长度为5129bp，双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；DNA分子越小电泳迁移速率越快，目的基因更小，迁移更远，因此条带b对应目的基因 （4）工程菌适应环境后进入快速增殖阶段，菌体数量大量增加，合成的4αGT总量升高 【详解】（1）载体要保证目的基因正常复制，必须含有复制原点（DNA复制的起始位点）。基因表达过程中，启动子启动转录，终止子终止转录，重组克隆载体仅用于保存目的基因，不需要目的基因表达，因此重组表达载体比克隆载体多了启动子和终止子。 （2）结合目的基因两端黏性末端和限制酶切割序列分析：目的基因一端黏性末端为5’-TCGAG，与XhoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶1为XhoⅠ；另一端黏性末端为5’-CATGG，与NcoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶2为NcoⅠ。 （3）根据题意，DNA分子大小和迁移速率成反比，分子越小，迁移速率越快，距离点样孔越远。重组表达载体总长度为5129bp，双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；目的基因长度小于载体长度，因此迁移更远，更靠下的条带b对应目的基因。 （4）工程菌液体培养过程中，阶段1为调整期，菌体适应环境，增殖缓慢；阶段2菌体完成适应后进入对数快速增殖期，菌体数量大量增加，因此4αGT含量迅速升高。 14．【抗肿瘤蛋白研发】豹蛙抗瘤酶（ONC）是一种RNA酶，对肿瘤细胞具有很强的杀伤力，但产量低、难溶、半衰期短。为解决上述问题，科研人员根据人血清白蛋白（HSA）对肿瘤组织具有高通透性、高滞留性的特性，通过重叠延伸PCR技术合成含有连接肽G4S的融合基因HSA-G4S-ONC，过程如下图1。请回答下列问题： （1）利用PCR技术扩增目的基因HSA-G4S-ONC时，反应体系中除了加入含Mg2+的缓冲液和图1中已有条件外，还需要加入________。合成HSA-G4S-ONC融合基因时，必须将引物A1、D2和引物D3、A4置于不同反应系统中，其原因是________________________________。 （2）图2是本实验中所用的表达载体，HSA和ONC基因两端不含限制酶识别序列。为确保基因HSA-G4S-ONC与载体在用E.coliDNA连接酶连接时连接的准确性和效率，在扩增基因HSA-G4S-ONC时可在引物A1、A4的________（填“5′”或“3′”）端分别添加限制酶________、________的识别序列。 图注： 5′AOX1：甲醇特异性诱导的强启动子 3′AOX1（TT）：终止子 Ampr：氨苄青霉素抗性基因 Kanr：卡那霉素抗性基因 3′AOX1：同源重组区段，便于载体整合到酵母染色体上限制酶的识别序列及切点 SnaBⅠ:5′TAC↓GTA3′ EcoRⅠ:5′G↓AATTC3′ BamHⅠ:5′G↓GATCC3′ BglⅡ:5′A↓GATCT3′ SacⅠ:5′GAGCT↓C3′ （3）将构建成功的HSA-G4S-ONC基因表达载体利用限制酶________处理，使表达载体线性化；用线性化表达载体转化处于________态的毕赤酵母，筛选转化成功的重组酵母菌株并置于含________的培养液中培养，诱导HSA-G4S-ONC融合蛋白表达，再进行分离、纯化。 （4）为评估HSA-G4S-ONC融合蛋白对癌细胞活性的影响，科研人员将不同浓度梯度的融合蛋白与大鼠肝癌细胞共同培养，一段时间后检测肝癌细胞的存活率，结果如图3。根据图3可得出的结论是________。科研人员进一步测定了细胞凋亡相关蛋白Caspas8、BAX蛋白的表达情况，结果如图4。据此推测HSA-G4S-ONC融合蛋白抑癌的分子机制是______________________________。 【答案】(1) 四种脱氧核苷酸/dNTP、热稳定DNA聚合酶/Taq酶 引物D2和D3的碱基序列互补，放在同一体系会互相配对结合，形成引物二聚体，降低PCR扩增效率 (2) 5′ EcoRⅠ BamHⅠ (3) BglⅡ 感受 甲醇 （4） HSA-G4S-ONC融合蛋白能抑制肝癌细胞活性，且在一定浓度范围内，抑制效果随融合蛋白浓度升高而增强 HSA-G4S-ONC融合蛋白通过促进促凋亡蛋白Caspas8和BAX的合成，诱导肝癌细胞凋亡，从而抑制肿瘤 【详解】（1）PCR反应体系需要缓冲液、模板DNA、引物、Mg²⁺、四种脱氧核苷酸（原料）、热稳定TaqDNA聚合酶，题干已有缓冲液和图中模板、引物，因此还需补充dNTP和Taq酶；引物D2对应连接肽的一条链，引物D3对应互补链，二者序列互补，若放在同一体系会互补结合形成引物二聚体，降低有效引物浓度，降低扩增效率，因此需要分开反应。 （2）DNA延伸方向为5'→3'，引物的3'端负责结合模板延伸，额外添加的限制酶识别序列需要加在引物的5'端；目的基因需要插入表达载体的启动子（5'AOX1）和终止子（3'AOX1(TT)）之间，不用SnaBⅠ酶切的原因是产生平末端，E.coliDNA连接酶连接平末端的效率较低，而该区域两个不同酶切位点EcoRⅠ（靠近启动子，产生黏性末端）和BamHⅠ（靠近终止子），故用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切可保证连接方向正确，提高连接准确性和效率。 （3）需要将环状质粒线性化，以整合到酵母染色体上，同源重组区段3'AOX1存在BglⅡ酶切位点，因此用BglⅡ切割即可得到线性化载体；将目的基因导入微生物（酵母）时，需要将酵母处理为感受态细胞，提高转化率；该载体的启动子5'AOX1为甲醇特异性诱导启动子，因此需要在培养液中加入甲醇诱导融合蛋白表达。 （4）从图3可知，随着融合蛋白浓度升高，肝癌细胞存活率逐渐降低，说明该融合蛋白浓度依赖性抑制肝癌细胞活性；从图4可知，融合蛋白处理组中，促凋亡蛋白BAX和Caspas8的表达量显著高于对照组，因此推测该融合蛋白通过促进这两种促凋亡蛋白的合成，诱导肝癌细胞凋亡，实现抑癌作用。 15．【细胞基础实验】细胞核是真核细胞特有的结构，在细胞的代谢、生长和分化中起着重要作用。如图所示为细胞核的模式图和电镜照片，回答下列相关问题： 资料1：有人用变形虫做实验，去掉细胞核的变形虫虽然还能存活几天，但不能取食，也不能生长，最终死亡。 资料2：动物精子形成过程中要经过变形，精子离开动物体后存活时间通常较短。 资料3：科学家用伞形帽伞藻和菊花形帽伞藻完成了伞藻的嫁接实验和核移植实验。 （1）图（b）中电镜下所示结构称为___________结构，其中的异染色质属于染色质的一种，它主要是由___________组成；细胞核的功能是___________。 （2）图（a）中的核孔是由蛋白质和核纤层紧密结合，形成核孔复合体；核孔复合体在核内外的大分子物质转运中起重要作用，请列举一例：___________；大分子出入细胞核不是简单的扩散，而是依据自身的核定位信号和与核孔复合体中受体蛋白结合而实现的“主动转运”，这说明核孔对于物质转运具有___________的特点。 （3）科学家用伞形帽伞藻和菊花形帽伞藻先完成嫁接实验后，再进行核移植实验，其目的是___________。 （4）结合资料1和资料2能得到的结论是：___________。 （5）体细胞克隆猴在我国已成功诞生，这是科学家首次成功克隆出非人灵长类动物，意义非凡。那么克隆人是否离我们也就不远了？你是否支持该技术实施，说出你的观点与理由：___________。 【答案】(1) 细胞核的亚显微 DNA和蛋白质 遗传信息库，是细胞代谢和遗传的控制中心 （2） mRNA从细胞核进入细胞质（或“组蛋白等从细胞质进入细胞核”等） 选择性 （3）排除假根中其他物质的影响，进一步证明细胞核控制伞帽的形状 （4）细胞核控制细胞的代谢和遗传，细胞核的存在对细胞的生存和繁殖等生命活动是必不可少的 （5）不支持。克隆人会带来一系列伦理问题，如克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念；克隆人是对人类尊严的侵犯；克隆技术还不成熟，可能克隆出有严重生理缺陷的人等 【分析】1、细胞核是细胞中的遗传信息库，是细胞代谢和遗传的控制中心。 2、在伞藻的嫁接实验中，伞藻的帽形与假根中细胞核的类型是一致的，说明伞藻的伞帽形态可能决定于细胞核。 3、在伞藻的核移植实验中，将菊花形的伞藻的细胞核移植到伞帽是帽形的去掉伞帽的伞藻中，长出的伞帽是菊花形，由此可以说明细胞核控制伞帽的形态，即细胞核具有控制生物的性状的功能。 【详解】（1）图（b）中电镜下所示结构称为细胞核的亚显微结构。染色质主要由DNA 和蛋白质组成，异染色质属于染色质的一种，所以也主要由 DNA 和蛋白质组成。 细胞核的功能是遗传信息库，是细胞代谢和遗传的控制中心。 （2）核孔复合体在核内外的大分子物质转运的例子有mRNA从细胞核进入细胞质（或“组蛋白等从细胞质进入细胞核”等）。大分子出入细胞核依据自身的核定信号与核孔复合体中受体蛋白结合而实现“主动转运”，这表明核孔对于物质转运具有选择性的特点。 （3）科学家用伞形帽伞藻和菊花形帽伞藻先完成嫁接实验后，再进行核移植实验，其目的是排除假根中其他物质的影响，进一步证明细胞核控制伞帽的形状。 （4）资料1中去掉细胞核的变形虫不能取食、生长，最终死亡；资料2中精子离开动物体后存活时间短。结合两者能得到的结论是：细胞核控制细胞的代谢和遗传，细胞核的存在对细胞的生存和繁殖等生命活动是必不可少的。 （5）不支持。克隆人会带来一系列伦理问题，如克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理道德观念；克隆人是对人类尊严的侵犯；克隆技术还不成熟，可能克隆出有严重生理缺陷的人等。 16．【基因编辑乳腺生物反应器】乳铁蛋白（LF）是猪初乳中富含的一种免疫活性蛋白，具有抗菌、抗病毒功能，但LF含量会随泌乳时间延长而显著下降。研究发现CS基因编码的酪蛋白在乳汁中持续高表达。研究人员利用CRISPR/Cas9技术将LF基因敲入CS基因获得基因编辑猪。 （1）如图1所示，CRISPR/Cas9系统中gRNA能与DNA特定碱基序列（靶点）结合，引导Cas9（核酸酶）定点切割，并通过同源重组修复，实现基因敲入。 ①修复时，DNA断裂处两侧与供体DNA的同源区段会发生_____________，实现供体DNA片段的插入。 ②本研究中未将gRNA靶点设计在CS基因中间序列，而设计在接近CS基因末端，紧邻终止密码子对应序列上游，实现在LF基因和CS基因共用同一启动子的同时，__________________。 （2）将构建好的gRNA、Cas9、LF基因表达载体共同转入猪胎儿成纤维细胞。转入前需利用PCR扩增Y染色体特异区域（SRY）进行性别鉴定，应选择______________（填“有”或“无”）SRY条带的细胞。 （3）图2为LF基因敲入后CS基因部分结构。据图分析，要筛选正确转入LF基因的细胞，同时避免内源LF基因干扰，PCR时应选择的两对最佳引物组合为__________________。 （4）将成纤维细胞注入培养到______________时期且去核的卵母细胞中，使两细胞融合，培养至重构胚后，移植入代孕母猪中。移植前应对供体和受体进行同期发情处理，目的是______________。最终获得在乳汁中持续高表达LF基因的基因编辑猪。 （5）本研究中所用载体不含抗性基因等筛选标记，从生物安全的角度分析，可以减少_______________。 【答案】(1) 交换 最大限度地减少对CS基因的破坏 （2）无 （3）引物1和引物4，引物3和6 （4） MⅡ 使供体和受体的生理条件达到同步或一致 （5）引入外源基因 【分析】基因工程的具体步骤为：目的基因的获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）①在同源重组修复过程中，DNA断裂处两侧与供体DNA的同源区段会发生交换 ，通过一系列的酶促反应实现供体DNA片段的插入。 ②本研究中未将gRNA靶点设计在CS基因中间序列，而设计在接近CS基因末端，紧邻终止密码子对应序列上游，这样实现在LF基因和CS基因共用同一启动子的同时，最大限度地减少对CS基因的破坏。 （2）因为要获得雌性猪的乳汁来获取LF蛋白（雄性猪一般不泌乳），Y染色体是雄性特有的，SRY是Y染色体上的性别决定基因，所以应选择无SRY条带的细胞（即雌性细胞）。 （3）要筛选正确转入LF基因的细胞，同时避免内源LF基因干扰，需要选择能特异性扩增LF基因与CS基因连接区域的引物组合。观察图2可知，引物1和引物4、以及引物3和6 均能够特异性扩增LF基因与CS基因连接区域，所以PCR时应选择的两对最佳引物组合为引物1和引物4，引物3和6 。 （4）在核移植技术中，用于接受细胞核的卵母细胞应培养到MⅡ中期（减数第二次分裂中期），此时卵母细胞的细胞质中含有促进细胞核全能性表达的物质，有利于重构胚的发育。 在胚胎移植前，对供体和受体进行同期发情处理，目的是使供体和受体的生理条件达到同步或一致。 （5）本研究中所用载体不含抗性基因等筛选标记，从生物安全的角度分析，可以减少引入外源基因。 图表分析类 1．【异种移植 + 移植伦理安全】某团队在经过动物实验伦理批准后，采用基因编辑猪作为供体，将单个猪肾移植给猕猴，最终移植肾在猕猴体内存活184天，实现了我国异种移植技术的重大突破。如图是简化后的流程，下列分析错误的是（　　）    A．对猪的体细胞进行基因编辑的目的主要是抑制猪抗原基因在受体内的表达 B．①过程会分别用到电融合法和电刺激法，但是二者的实验目的不同 C．②（胚胎移植）和④（器官移植）都会产生免疫排斥反应，需要使用免疫抑制剂处理 D．以猕猴作为器官移植受体会给猕猴带来伤害，可能引发一系列伦理问题 【答案】C 【分析】动物细胞核移植技术的一般步骤：①采集卵母细胞，体外培育到MII期，并进行去核操作；②将供体细胞注入去核的卵母细胞；③通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚；④用物理或化学方法（如电刺激、Ca2+载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂等）激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程；⑤将胚胎移入受体（代孕母动物）体内，并发育成与供体遗传物质基本相同的个体。 【详解】A、对猪的体细胞进行基因编辑的目的主要是抑制猪抗原基因在受体内的表达，保证移植器官的存活，A正确； D、①过程会分别用到电融合法和电刺激法，前者是为了促融，后者是为了激活重构胚，B正确； C、②（胚胎移植）不会产生免疫排斥反应，④（器官移植）一般需要使用免疫抑制剂处理，C错误； D、以猕猴作为器官移植受体会给猕猴带来伤害，可能引发一系列伦理问题，因此，实验设想需要获得行政审批，D正确。 故选C。 2．【转基因食品安全评价】为评估某种转基因玉米的安全性，科研团队开展非人灵长类动物食蟹猴的长期喂养实验，部分实验数据如下表。下列叙述最合理的是（     ） 指标 组别 BMD(g/cm2) F-B12(mg/kg) F0代（亲代） F1代（1-6岁） F0代（亲代） F1代（1-6岁） 转基因玉米组 0.58±0.09 0.47±0.03 0.03 0.06 非转基因玉米组 0.57±0.09 0.48±0.04 0.03 0.02 常规饲料组 0.57±0.09 0.47±0.03 0.02 0.03 注：骨密度（BMD）和粪便中维生素B12的含量（F-B12）能分别反馈骨健康和肠道菌群功能是否正常。 A．预判人类健康风险时，食蟹猴实验数据比啮齿类动物更具参考优势 B．若长期食用该种转基因玉米，会导致食蟹猴的骨健康水平显著降低 C．实验数据表明该种转基因玉米会导致肠道损伤，造成营养吸收障碍 D．结果显示该转基因玉米安全性较高，无需对其加工产品进行专门标识 【答案】A 【详解】A、食蟹猴属于非人灵长类动物，和人类的亲缘关系比啮齿类动物更近，生理结构、代谢特征等与人类相似度更高，因此预判人类健康风险时，其相关实验数据的参考价值更高，A正确； B、对比三组骨密度（BMD）数据，转基因玉米组的F0代、F1代BMD与非转基因玉米组、常规饲料组均无显著差异，说明长期食用该转基因玉米不会导致食蟹猴骨健康水平显著降低，B错误； C、粪便维生素B12含量仅可反映肠道菌群功能，实验中转基因组的相关数值和其余两组未出现显著病理性差异，无法得出该转基因玉米会导致肠道损伤、营养吸收障碍的结论，C错误； D、即使该转基因玉米安全性较高，按照我国转基因食品相关管理规定，其加工产品仍需要进行专门标识，D错误。 3．【绿色食品安全】在我国产自良好生态环境，无污染、安全、优质的食品，统称为绿色食品，下图中为绿色食品标志的是（　　） A． B． C． D． 【答案】C 【分析】绿色食品标志：    【详解】A、图中是安全食品标志，A不符合题意； B、图中是禁止吸烟标志，B不符合题意； C、绿色食品标志是由绿色食品发展中心在国家工商行政管理总局商标局正式注册的质量证明标志。它由三部分构成，即上方的太阳、下方的叶片和中心的蓓蕾，象征自然生态；颜色为绿色，象征着生命、农业、环保；图形为正圆形，意为保护。AA级绿色食品标志与字体为绿色，底色为白色，A级绿色食品标志与字体为白色，底色为绿色。整个图形描绘了一幅明媚阳光照耀下的和谐生机，告诉人们绿色食品是出自纯净、良好生态环境的安全、无污染食品，能给人们带来蓬勃的生命力，C符合题意； D、图中是动物产品检疫合格标志，D不符合题意。 故选C。 4．【转基因植物基因污染检测】为评估外源基因Vgb在菊花中的稳定性以及对生态环境的影响，研究人员在种植转基因菊花的第二年，随机选取转基因菊花株系及周边非转基因菊花和各种杂草，提取DNA。根据Vgb设计特异性引物进行PCR扩增，电泳结果如图。下列说法不正确的是（    ） 注：CK表示质粒阳性对照，1为空白对照，2～10 为转基因株系， 11～15为不同种类杂草，16～20 为非转基因菊花 A．设置空白实验是为了排除实验操作、试剂污染等对结果的影响 B．结果表明2年内Vgb基因在菊花细胞中稳定，且未发生向周边植物的扩散 C．转基因植物与周边其他植物之间不可能通过花粉发生基因交流 D．将Vgb基因转入其他植物时同样要经过安全性评价 【答案】C 【分析】据题意可知，1为空白对照，2～10 为转基因株系， 11～15为不同种类杂草，16～20 为非转基因菊花，图中2～10 含有Vgb基因，其他植物都不含Vgb基因，说明2年内Vgb基因在菊花细胞中稳定，且未发生向周边植物的扩散。 【详解】A、设置空白实验目的是排除无关变量对实验结果的干扰，本实验无关变量为实验操作、试剂污染等，A正确； B、据题意可知， 11～15为不同种类杂草，16～20 为非转基因菊花，图中它们都没有外源基因Vgb，因此推测2年内Vgb基因在菊花细胞中稳定，且未发生向周边植物的扩散，B正确； C、外源基因若转入细胞核就有可能通过花粉进行传播，发生基因交流，C错误； D、不同基因具有不同表达模式和功能，对植物自身和环境造成的影响以及带来的安全性问题，因此将Vgb基因转入其他植物时同样要经过安全性评价，D正确。 故选C。 5．【修复工程菌生态安全防控】矿业生产和农田不当使用化肥会导致重金属镉（Cd）在土壤过度积累。通过基因工程，将酵母液泡镉转运蛋白（YCF1）定位在不育杨树株系的液泡膜上，可获得液泡中富集Cd的转基因杨树。再通过收集杨树的组织器官异地妥善储存等后续处理，可对Cd污染土壤进行修复。将长势一致的野生型和转基因杨树苗栽植在Cd污染土壤中，半年后测定数据如图所示。下列说法错误的是（    ） A．培育转基因不育株系可避免YCF1基因扩散造成基因污染 B．由图1可知转基因植株对Cd污染具有更强的耐受能力 C．对杨树的茎叶进行后续处理对于修复Cd污染土壤最为方便有效 D．YCF1向液泡内转运镉离子过程不需要消耗细胞代谢释放的能量 【答案】D 【分析】由图1可知，与野生型比，转基因植株的干重更大，故转基因植株对Cd具有更强的耐性，据图2可知，叶片中的Cd含量是最高的，故后续对转基因植株的叶进行处理是缓解土壤Cd污染最为方便有效的方法。 【详解】A、培育转基因不育株系的配子不育，可避免YCF1基因随花粉扩散造成基因污染，A正确； B、由图1可知，与野生型比，转基因植株的干重更大，转基因植株对Cd污染具有更强的耐受能力，B正确； C、据图2可知，叶片中的Cd含量是最高的，故对杨树的茎叶进行后续处理对于修复Cd污染土壤最为方便有效，C正确； D、YCF1向液泡内转运镉离子是逆浓度梯度运输，故需要消耗细胞代谢释放的能量，D错误。 故选D。 6．【工程酵母发酵生物安全】研究人员利用基因编辑技术将酿酒酵母E酶基因替换成D酶基因，培育出能合成菜油甾醇的酵母菌。筛选出高产菌株后，再利用含有葡萄糖的培养基进行发酵，并在发酵过程中不断补加半乳糖，得到如下结果。 以下分析错误的是（　　） A．转入D酶基因后改变了酵母菌的代谢途径 B．D酶基因上游需连接酵母菌可识别的启动子 C．分批补料可保证发酵液中碳源和氮源的供应 D．油菜甾醇的产量与酵母菌的数量呈正相关 【答案】C 【解析】分析题图：随着时间的延长，半乳糖的不断补加，葡萄糖含量降低，菜油甾醇和酵母菌数量的含量不断上升。 【详解】A、转入D酶基因后改变了酵母菌的代谢途径，从原来的分解葡萄糖转变成分解半乳糖，A正确； B、D酶基因在酵母菌细胞中能表达产生D酶，故D酶基因上游需连接酵母菌可识别的启动子，B正确； C、半乳糖的组成元素是C、H、O，不含N元素，不能提供氮源，C错误； D、分析图可知：油菜甾醇的产量与酵母菌的数量呈正相关，D正确。 故选C。 7．【农杆菌转化转基因鉴定】研究人员利用农杆菌侵染水稻叶片，经组培、筛选最终获得了一株水稻突变体。利用不同的限制酶处理突变体的总DNA、电泳；并与野生型的处理结果对比，得到图所示放射性检测结果。（注：T-DNA上没有所用限制酶的酶切位点）对该实验的分析错误的是（    ） A．检测结果时使用了放射性标记的T-DNA片段做探针 B．该突变体产生的根本原因是由于T-DNA插入到水稻核DNA中 C．不同酶切显示的杂交带位置不同，说明T-DNA有不同的插入位置 D．若野生型也出现杂交带，则实验样本可能被污染，检测结果不准确 【答案】C 【分析】将目的基因插入到农杆菌的Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。它是将目的基因导入植物细胞采用最多的方法。 放射性标记的T-DNA片段做探针的目的是检测受体细胞的DNA中有无目的基因。均显示一条杂交带，说明在这一突变体中，T-DNA插入位置是唯一的。 【详解】A、图示结果突变体中出现放射性，说明使用了放射性标记的T-DNA片段做探针对目的基因进行检测，A正确； B、该突变体产生的根本原因是T-DNA携带目的基因插入到水稻的DNA中，B正确； C、不同酶切杂交带位置不同，说明不同酶切后带有T-DNA的片段长度不同（即：不同的酶切位点距离T-DNA的远近不同），C错误； D、由图所示放射性检测结果可知，野生型无放射性杂交条带，若野生型也出现杂交带，则实验样本可能被污染，检测结果不准确，D正确。 故选C。 【点睛】本题通过放射性同位素标记方法检测目的基因的方法，考查对基础知识的运用，以及对实验结果的分析和判断能力。 8．【限制酶载体构建基础】用XhoI和SalI两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（　　） A．如图中两种酶识别的核苷酸序列不同 B．如图中酶切产物可用于构建重组DNA C．泳道①中是用SalI处理得到的酶切产物 D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA 【答案】D 【详解】【分析】该题考查DNA的结构、限制酶的特点和功能等。DNA一般是双螺旋结构；限制酶可以识别特定的脱氧核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割。 【详解】限制酶识别特定的脱氧核苷酸序列，不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列，由电泳图可知XhoI和SalI两种酶分别切割时，识别的序列不同，A正确；同种限制酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，再用DNA连接酶进行连接，可以构成重组DNA，B正确；Sal I将DNA片段切成4段，Xho I将DNA片段切成3段，根据电泳结果可知泳道①为Sal I，泳道②为Xho I，C正确；限制酶切割双链DNA，酶切后的DNA片段仍然是双链DNA，D错误，所以选D。 【点睛】注意图1两种限制酶的识别位点数量，Sal I有3个识别位点，能将DNA片段切成4段，Xho I有2个识别位点，能将DNA片段切成3段。 9．【蛋白质工程产品安全】干扰素是一种具有抗病毒、免疫调节等重要功能的蛋白质。科研人员为了提高干扰素的稳定性和活性，利用蛋白质工程对其进行改造。下表是改造前后干扰素的相关参数对比，据此分析，下列有关叙述错误的是（　　） 对比项目 改造前 改造后 热稳定性（在50℃下活性保留时间） 2小时 8小时 与受体的结合亲和力 相对较弱 相对较强 氨基酸数量 166个 166个 第17位氨基酸 半胱氨酸 丝氨酸 A．蛋白质工程可通过改变氨基酸的种类来改造蛋白质 B．第17位氨基酸的替换可能降低了干扰素对高温的敏感性 C．改造前后氨基酸数量不变，说明蛋白质工程未改变相关基因结构 D．改造后干扰素与受体的结合亲和力增强，这可能提高其生物学效应 【答案】C 【详解】A、蛋白质工程可以通过定点突变等方法改变蛋白质的氨基酸序列，从而改变其结构和功能，该过程中第17位氨基酸从Cys变为Ser，说明通过改变氨基酸种类来改造蛋白质，A正确； B、改造后干扰素的热稳定性显著提高（从2小时到8小时），说明第17位氨基酸的替换（Cys→Ser）可能减少了高温下蛋白质的不稳定性，B正确； C、氨基酸数量不变，但第17位发生替换，说明基因发生了定点突变（如碱基对的替换），因此基因结构被改变，C错误； D、与受体结合亲和力增强（从“相对较弱”到“相对较强”）可能使干扰素更容易与靶细胞受体结合，从而增强其抗病毒或免疫调节功能，提高生物学效应，D正确。 故选C。 10．【重组质粒构建与工程菌培育】某种能以甲醇为唯一碳源的酵母菌可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以图1所示质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因HBsAg（图2）的重组质粒，将重组质粒导入组氨酸缺陷型大肠杆菌（在缺失组氨酸的培养基中无法生存）中进行扩增，再导入并整合到酵母菌染色体DNA上。下列说法错误的是（     ） A．构建HBsAg基因表达载体时，可选用SmaⅠ酶、BamHⅠ酶切割质粒 B．利用PCR扩增HBsAg基因时，选用的引物M的碱基序列与a链相同 C．应在含有组氨酸和氨苄青霉素的培养基中筛选成功导入重组质粒的大肠杆菌 D．培养转化的酵母菌时，培养中加入甲醇的作用是提供碳源并诱导HBsAg基因表达 【答案】C 【详解】A、构建表达载体时，需要将目的基因插入启动子和终止子之间的多克隆位点区。质粒上的SmaⅠ、BamHⅠ酶切位点位于该区间内，同时切割质粒可避免质粒自连，且能和处理后的目的基因末端匹配，保证目的基因插入启动子下游，A正确； B、在PCR技术获取HBsAg基因时，引物是与模板链的3'端结合，故引物M结合的单链是b链，部分序列与a链相同，B正确； C、将重组质粒导入大肠杆菌的目的是大量扩增重组质粒；据图可知，重组质粒含有氨苄西林抗性基因，且重组质粒导入组氨酸缺陷型大肠杆菌（在缺失组氨酸的培养基中无法生存）中进行扩增，故将重组载体导入大肠杆菌时，应在含有氨苄青霉素、不含组氨酸的培养基上进行筛选，能存活下来的大肠杆菌是导入了重组质粒的大肠杆菌，C错误； D、将大肠杆菌中获取的HBsAg基因导入酵母后，转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇，加入甲醇的作用有两点除能够提供碳源，促进酵母菌的生长和代谢外，关键可以诱导HBsAg基因表达，D正确。 11．【转基因水产育种生态安全】学习以下材料，回答（1）～（4）题。 中国渔业育种的“双星” “中国克隆之父”童第周先生，上个世纪60年代在我国开创了鱼类的细胞核移植研究。鱼类的受精卵分裂过程，可在低倍镜下直接观察。童先生的实验过程如下图。    中国科学院院士——朱作言先生，在参与童先生的研究中发现，细胞质通过影响细胞核来改变生物性状的作用比较有限。因此，他提出将一种生物细胞核中的遗传物质提取出来，注射到另外一种生物的受精卵中，实现生物性状的改变。 1984年，朱先生的团队培育出世界上首例转基因鲤鱼，早于美国3年。上世纪80年代末期，该团队克隆出草鱼与生长有关的基因和鲤鱼肌动蛋白基因（能表达出肌肉组织中的重要蛋白质）的启动子序列，将两者进行重组，注射到鲤鱼受精卵中，得到快速生长的基因改良鲤鱼，经过6代选育，培育了“冠鲤”品系。该品系生长迅速，生活周期缩短，食物转换效率高。一般鲤鱼在长江中下游需要两年的养殖周期，冠鲤养殖仅需一年。 为进行安全评估，朱先生的团队专门构建了100亩的人工池塘，持续实验5年时间。自然演化过程中的5年很短，但实验表明，“冠鲤”在野外环境中的生存力、繁殖力和竞争力较差，在自然选择中，冠鲤处于弱势。即便是这样，研究团队也没有将其释放到野外自然水体，而是等待我国政府监管部门审批。 水产养殖业是农业的重要组分，它的繁荣发展直接影响食品安全和人民生活水平。一路走来，我国科学家致力于渔业育种的研究从未止步，对世界的贡献有目共睹。 （1）童第周先生和朱作言先生的育种研究，从生命层次的角度看，分别属于___________水平。 （2）文中图示过程获得的杂交鱼更接近于________鱼的性状，该过程不包括__________。 a．有丝分裂b．减数分裂c．细胞分化d．细胞凋亡e．胚胎移植 （3）获得“冠鲤”时，使用鲤鱼肌动蛋白基因的启动子序列，目的是_________。 （4）请从消费者的角度，表明对“冠鲤”上市持有的观点，并利用生物学原理或文中信息阐述支持该观点的依据，请按照下图结构填写在相应的序号位置______________。    【答案】(1）细胞水平和分子 (2) 草 e （3）使转入的与生长有关的基因在肌肉组织中特异性地表达，促进肌肉增重以期增产 （4）①支持②外源基因经过人体消化道时会被分解，不会危害人体健康； ①支持②生态安全评估实验表明冠鲤的生存力、繁殖力和竞争力较差，种群无法在自然环境中生存繁衍； ①反对②生态安全评估实验仅持续5年，在更长的时间周期后是否会发生突变和基因扩散的可能性难以预知。 【分析】细胞的全能性指已分化的细胞具有发育成完整个体的潜能，植物细胞的全能性大于动物细胞，但克隆动物的培育，证明高度分化的动物细胞的细胞核具有全能性。 【详解】（1）由题意可知，童第周进行的是细胞核移植研究，是在细胞水平进行的研究，朱作言将一种生物细胞核中的遗传物质提取出来，注射到另外一种生物的受精卵中，实现生物性状的改变，是在分子水平上进行的研究； （2）文中图示过程获得的杂交鱼的遗传物质主要来自细胞核的供体草鱼，因此杂交鱼更接近于草鱼的性状，该过程包括有丝分裂、减数分裂、细胞分化、细胞凋亡，没有进行胚胎移植； （3）启动子是RNA聚合酶识别结合位点，驱动基因转录，进而完成基因的表达，因此获得“冠鲤”时，使用鲤鱼肌动蛋白基因的启动子序列，目的是使转入的与生长有关的基因在肌肉组织中特异性地表达，促进肌肉增重以期增产； （4）从消费者的角度，表明对“冠鲤”上市持有的观点：支持上市销售，依据是外源基因经过人体消化道时会被分解，不会危害人体健康；支持上市销售，依据是生态安全评估实验表明冠鲤的生存力、繁殖力和竞争力较差，种群无法在自然环境中生存繁衍；反对上市销售，依据是生态安全评估实验仅持续5年，在更长的时间周期后是否会发生突变和基因扩散的可能性难以预知。 12．【多基因载体构建】传统的多基因载体构建需经历多轮次酶切、纯化与连接，操作繁琐。金门克隆技术利用Bsa I酶和DNA连接酶在同一个反应管中进行“一锅法”反应，即可实现多个片段的精准定向顺序组装。我国科学家利用此技术，成功将番茄红素（红色）合成通路中的三个关键目的基因（crtE、crtB、crtI）一次性定向组装至大肠杆菌表达载体中，实现了番茄红素的高效工业化生产。图1和图2为相关基因与序列示意图，回答下列问题。 （1）据图1分析，Bsa I酶催化断裂的化学键是_________。图2中该空载体经Bsa I酶完全切割后，在启动子P一侧产生的单链黏性末端序列为5′-_________-3′。从识别序列与切割位点位置关系的角度分析，Bsa I酶相较于EcoR I酶最显著的特点是_________。 （2）为了使“一锅法”反应能持续自发地向生成目标重组质粒的方向移动（即让反应产物不再被切开），利用PCR技术在目的基因两端引入Bsa I识别序列时，其识别序列应设计在切割位点的_________（填“内侧”或“外侧”，目的基因两端为外侧）；结合金门克隆的自发推进机制分析，若三个目的基因按图2顺序完全组装正确，最终获得的目标重组质粒中应含有_________个Bsa I酶的识别序列。 （3）构造基因表达载体时，模板crtE基因无Bsa I酶的识别序列，为了将crtE基因组装至上述载体切口处，需利用PCR技术扩增crtE基因。结合（1）中推导出的载体末端序列，设计扩增crtE基因的上游引物时，其5′端的特殊设计序列应为5′-_________-3′。（写出11个碱基即可）。若PCR过程中每条链都能充分延伸，理论上该反应中扩增n轮能获得_________个符合要求的目的基因。 （4）若要筛选番茄红素成功表达的目标菌，培养目标菌时可选用的筛选培养基为_________，筛选指标为_________。 【答案】(1) 磷酸二酯键 AGAG 切割位点不在识别序列内部（切点位于识别序列外侧） (2) 外侧 0 (3) GGTCTCCAGAG 2n−2n （4） 含氨苄青霉素的固体培养基 菌落显现红色 【详解】（1）Bsa I酶为限制酶，限制酶催化断裂的化学键是磷酸二酯键。Bsa I酶识别序列为5'-GGTCTCN-3'，切割位点在识别序列下游（箭头标注）：上链在N的3'侧切割，下链在N下游5个碱基的位置切割。 结合图2空载体中启动子P右侧的Bsa I识别序列：5'-CGATAGAGACC-3'，反向推导可知该段序列中属于Bsa I的6bp核心识别序列为GAGACC，对应识别序列的通式5'-GGTCTCN-3'的互补链，切割后会在启动子P的下游（切割后的暴露单链）产生4个碱基的黏性末端，序列为AGAG（5'→3'方向）。对比图1两种酶的切割特征： EcoR I的切割位点完全位于自身的识别序列（GAATTC）内部；而Bsa I的切割位点在识别序列的外侧（识别序列是固定的6bp序列，切割位点位于识别序列之外、下游的任意碱基区域）， （2）要让连接后的重组片段不再被Bsa I切割，需要保证酶切完成、片段连接后，Bsa I的识别序列不会出现在重组区域内：如果将识别序列设计在切割位点的外侧（远离目的基因的一侧），Bsa I切割后会将自身的识别序列随多余的侧翼片段一同切下，目的基因和载体连接的区域将不再带有Bsa I识别序列，避免产物被重新切开。空载体原本带有2个Bsa I识别序列（启动子侧1个、ccdB致死基因右侧1个），经Bsa I切割后，两个识别序列随ccdB致死基因一同被切离；同时3个目的基因的Bsa I识别序列都设计在切割位点外侧，酶切后也全部被去除。最终组装完成的重组质粒中，不存在完整的Bsa I识别序列，因此数量为0。 （3）上游引物需要包含Bsa I的完整识别序列，加上和载体启动子侧黏性末端互补的序列，凑出11个碱基：Bsa I的识别序列为GGTCTCN（7个碱基），后续搭配和载体黏性末端互补的4个碱基（载体P侧黏性末端为5'-AGAG-3'，因此引物上对应设计4个碱基为AGAG），拼接后11个碱基的序列为GGTCTCCAGAG。前2轮扩增无法得到两端均带有正确引物序列的完整目的基因片段，从第3轮开始大量合成符合要求的片段，理论上n轮扩增后，符合两端均为正确序列的目的基因数量为2n−2n。 （4）载体上带有氨苄青霉素抗性基因（），因此首先使用添加氨苄青霉素的固体培养基，该培养基可以淘汰未转入质粒的大肠杆菌，仅保留携带载体的宿主菌。番茄红素为红色，成功表达番茄红素的大肠杆菌菌落会呈现红色，因此筛选指标为菌落呈现红色（未成功组装出完整番茄红素合成通路的菌落为白色/无色）。 13．【真菌基因工程环境安全】平沙绿僵菌是一种昆虫病原真菌，通过分生孢子侵染蚊子，对蚊子致死率高，但引诱能力弱。利用松树长叶烯合酶基因（Tps）改造平沙绿僵菌，增强其引诱能力，据此研发“诱杀一体”的灭蚊剂。回答下列问题。 注：质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽略不计；kb：千碱基对。 （1）为提高Tps基因在平沙绿僵菌中的表达效率，重新设计了长叶烯合酶编码序列，该序列与天然基因序列存在较大差异，但编码的氨基酸序列不变，获取该目的基因的方法是________。 实验如上图，用限制酶EcoRV切割pPK2质粒，然后与Tps基因连接，用________（填“E．coli”或“T4”）DNA连接酶可获得更高的连接效率。 经卡那霉素筛选得到的农杆菌中，除含有目的基因的重组质粒外，还可能存在________。为鉴定重组质粒是否正确连接，利用限制酶切割并电泳检测，下列限制酶组合和片段大小，属于正确连接的是________和________。 A．BamHI/EcoRI、0.7kb＋6.1kb    B．BamHI/EcoRI、1.1kb＋5.7kb C．HindIII/EcoRI、0.7kb＋6.1kb    D．HindIII/EcoRI、1.1kb＋5.7kb 农杆菌转化后，重组质粒上的T-DNA会转移并整合到平沙绿僵菌的________上。 为筛选工程化平沙绿僵菌，用PCR技术进行鉴定。Tps基因的转录模板链部分序列为：5′-ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC-3′，下列引物对可用于扩增该片段的是________。 A．5′-ATGTC…-3′、5′-CCTCG…-3′    B．5′-ATGTC…-3′、5′-GGAGC…-3′ C．5′-TACAG…-3′、5′-CCTCG…-3′    D．5′-TACAG…-3′、5′-GGAGC…-3′ （2）研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程菌培养物对蚊子的诱杀效果，如下表。 相关指标培养物 访问次数 （次/小时） 停留时间 （分钟/小时） 2小时感染率 （%） LT50 （天） 第7天死亡率 （%） 平沙绿僵菌 0.9 1.1 100 5.84 62.4 工程菌 2.4 5.9 100 4.04 84.3 注：感染率：感染孢子的蚊子比例；LT50（半数致死时间）；导致50%蚊子死亡所需的平均时间。 已知孢子附着量决定蚊子死亡速度，结合表中数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显著缩短且第7天死亡率更高的原因是________。 （3）该工程菌制剂在推广前，需经过严格的________评价，符合标准后方可推广。 【答案】(1) 人工合成法（化学合成法） T4 未插入目的基因的pPK2空质粒 A D 染色体DNA B （2）工程菌的引诱能力更强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，附着的孢子量更多，孢子附着量决定蚊子死亡速度，因此致死速度更快，半数致死时间LT50缩短，第7天死亡率更高 （3）安全性 【详解】（1）已知氨基酸序列，重新设计编码序列，目的基因通过人工合成法（化学合成法）获取。限制酶EcoRV切割产生平末端，T4 DNA连接酶可以连接平末端，连接效率高于EcolDNA连接酶，因此选T4DNA连接酶。卡那霉素筛选只能筛选出含有质粒的农杆菌，因此除重组质粒外，还可能存在未插入目的基因的pPK2空质粒。原质粒5.0kb，目的基因总长度0.7+1.1=1.8kb，重组质粒总长度为6.8kb。目的基因正向插入后：BamHI/EcoRI酶切得到0.7kb+6.1kb（6.8−0.7=6.1）；HindIII/EcoRI酶切得到1.1kb+5.7kb（6.8−1.1=5.7），因此正确组合是A和D。农杆菌转化法中，T-DNA会转移并整合到受体真菌的染色体DNA上。PCR引物需要与DNA两端的3'端互补，子链的延伸方向为5'→3'。转录模板链为5′−ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC−3′，左侧引物序列为5′−ATGTC…−3′，右侧引物与模板右侧的序列5′…GCTCC−3′反向互补，序列为5′−GGAGC…−3′，因此选B。 （2）根据题干和表格数据，转入TPS基因后工程菌引诱能力增强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，孢子附着量更高；而孢子附着量决定死亡速度，因此致死更快，LT50​更短，最终第7天死亡率更高。 （3）转基因工程菌推广前，需要进行严格的生物安全性评价，确认不会对生态、人体造成风险后才可推广。 14．【转基因小麦食品生态安全】普通小麦籽粒为白色，不合成花青素。玉米中ZmC1和ZmR基因编码的蛋白形成复合体，可激活花青素合成通路。科研人员利用农杆菌转化法将ZmC1基因和ZmR基因导入普通小麦，获得了紫色籽粒的转基因小麦。 回答下列问题： （1）利用PCR技术扩增ZmC1基因和ZmR基因，在PCR的反应体系中，DNA聚合酶需要________激活，引物的作用是________________________________。 （2）为使目的基因能定向插入T-DNA中，需在基因两端添加限制酶识别序列，由图可知，目的基因A、B端分别添加的限制酶是________、________。 （3）研究发现，ZmC1-ZmR复合体需结合靶基因启动子区的MRE（花青素响应元件，序列为5'-CCTACC-3'）才能激活转录。若将MRE突变为5'-CCTGCC-3'，复合体结合力下降50%；若突变为5'-CCTACG-3'，结合力下降90%。据此推测，复合体与MRE的作用特点是________。若某小麦品种启动子区天然存在5'-CCTGCC-3'序列，直接导入ZmC1和ZmR后籽粒颜色较浅，为获得紫色籽粒，改良方案是__________________________。若ZmR基因发生突变导致其编码的蛋白无法进入细胞核，则转基因小麦籽粒颜色可能表现为________（填“紫色”或“白色”）。 （4）若要将该紫色小麦品种进行商业化推广，除产量和花青素含量外，还需研究的问题有________________________________（答出1点）。 【答案】(1) Mg2+（或“镁离子”） 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 (2) Hind Ⅲ EcoRⅠ （3） 复合体对MRE序列的识别具有高度特异性 利用定点突变（或基因编辑）技术将启动子区的CCTGCC修正为CCTACC（或更换含天然CCTACC序列的小麦品种作为受体等） 白色 （4）转基因小麦的食品安全性（或对不同环境的适应性，花粉漂移对生态环境的影响，种子生产成本等合理答案） 【详解】（1）PCR过程中需要用Mg2＋激活DNA聚合酶，引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 （2）由题图可知，目的基因内部含有BamHⅠ、SacⅠ和NotⅠ三种酶的酶切位点，所以为了避免破坏目的基因，可选择的限制酶只有EcoRⅠ和HindⅢ，观察质粒的结构可知HindⅢ更靠近终止子，EcoRⅠ更远离终止子，由于目的基因的转录从启动子开始，所以目的基因的A端应添加HindⅢ，B端应添加EcoRⅠ，这样才能保证目的基因插入方向正确，便于成功转录。 （3）花青素响应元件MRE在突变前后均可与复合体结合，但突变后与复合体的结合力下降，且突变结果不同，结合力下降程度显著不同，说明复合体对MRE序列的识别具有高度特异性。 由题目所给信息可知，当花青素合成通路被激活后，小麦籽粒可呈现紫色，该小麦启动子区天然存在的序列是“复合体结合力下降50%”时MRE的序列，因此若要获得紫色籽粒的小麦，可以利用定点突变技术，将启动子区域的序列改为“5′-CCTACC-3′”，也可更换含有“CCTACC”序列的小麦品种作为受体。若ZmR基因编码的蛋白质无法进入细胞核，则花青素响应元件MRE无法与复合体结合，导致小麦无法启动花青素合成通路，则籽粒为白色。 （4）该紫色小麦属于转基因食品，将转基因食品进行商业化推广之前，不仅需要研究其产量和花青素含量，还应评估其食品安全性、对不同环境的适应性和生产成本，以及这种小麦产生的花粉漂移对生态环境的影响等。 15．【工程菌代谢产物生物安全】葡萄糖二酸（GA）可作为原料应用于食品、能源和医药等领域，已知M酶和U酶是合成GA途径中的两个关键酶，科研人员尝试设计2种重组质粒导入不同的大肠杆菌分别实现对GA的工业化生产和检测。重组质粒、目的基因的构建及相互关系如图。 回答下列问题： （1）据图分析，断开的质粒与目的基因连接起来形成的重组质粒，其化学本质是_____，组成结构的基本骨架是_____，含有游离的磷酸基团数量是_____个。 （2）若培养液中存在GA，则说明在含重组质粒1的大肠杆菌中，目的基因已成功表达，表达的过程包括_____，发生场所是在______。 （3）已知激活后的GFP基因能合成绿色荧光蛋白，试述含有重组质粒2的大肠杆菌检测GA的原理：____。 【答案】(1) DNA 磷酸与脱氧核糖交替连接，排列在外侧 0 （2） 转录和翻译 细胞质（或拟核区） （3）GA与C基因过量表达的C蛋白结合（形成的复合体），激活GFP基因，合成绿色荧光蛋白，产生绿色荧光现象 【分析】这道题目通过图示展示了两种重组质粒的设计与应用：重组质粒1包含M酶基因和U酶基因，导入大肠杆菌后可表达关键酶，实现葡萄糖二酸（GA）的工业化生产；重组质粒2包含C基因和GFP基因，当GA与C蛋白结合后激活GFP基因表达绿色荧光蛋白，从而用于GA的检测。题目考查了重组质粒的DNA本质（环状结构、磷酸-脱氧核糖骨架）、基因表达的转录与翻译过程（拟核和细胞质），以及基因工程在代谢产物合成与检测中的实际应用，体现了基因操作技术在工业与检测领域的重要作用。 【详解】（1）由题图可知，质粒可以和目的基因拼接起来。质粒的化学本质是DNA，因此，重组质粒的化学本质也是DNA，即重组质粒的基本骨架是磷酸与脱氧核糖交替连接，排列在外侧，重组质粒是环状DNA，所以含有游离的磷酸基团数量是0个。 （2）由题干和题图可知，M酶和U酶是合成GA途径中的两个关键酶，因此GA是由基因通过控制酶的合成控制细胞代谢合成的。若培养液中存在GA，则说明在含重组质粒1的大肠杆菌中，目的基因已成功表达，表达的过程包括转录和翻译，发生场所是细胞质（或拟核区）。 （3）含有重组质粒2的大肠杆菌可以表达C蛋白，C蛋白和GA结合可以激活GFP基因的表达，从而产生绿色荧光蛋白，产生绿色荧光现象。 实验探究类 1．【质粒构建与工程菌安全】大肠杆菌的R1质粒上含有基因hok和基因sok，其中hok基因编码的毒蛋白会导致大肠杆菌自身裂解死亡，sok基因转录产生的sokmRNA能与hokmRNA结合，这两种mRNA结合形成的产物能被酶降解，从而阻止细胞死亡。实验小组以质粒pACYC184为载体，分别将hok/sok基因和突变基因hok/sok（m），插入到载体的Tc抗性基因的内部，构建了重组质粒，如图1所示（Cm-氯霉素抗性基因，Tc-四环素抗性基因，SpnⅠ和SmaHⅠ为限制酶酶切位点）。并通过对构建的重组菌进行连续传代培养和对不同代次的重组质粒进行酶切，探究了重组菌传代时质粒丢失情况，结果如图2所示。回答下列问题：    （1）在PCR扩增hok/sok基因时，反应体系中除模板DNA、引物、TaqDNA聚合酶、镁离子外，还需加入______。若PCR扩增产物电泳结果出现多条条带，可能的原因是______（答出1点即可）。 （2）为了鉴定某大肠杆菌是否导入了重组质粒，可将转化处理后的菌液充分稀释，并接种到普通培养基上，在无菌培养箱内培养适宜时间，再将获得的大肠杆菌单菌落分别编号，然后将同一编号的单菌落分别接种到含四环素的培养基和含氯霉素的培养基上，若实验现象为______，则证明该编号的菌株成功导入了重组质粒。若要判断hok/sok基因是否按照正确的方向导入质粒，最好选择限制酶______切割质粒，并对产物进行电泳。 （3）与野生型基因比较发现，突变基因hok/sok（m）的中sok基因的第274位上的碱基T缺失。根据实验结果可知，导入______基因的重组菌传代时质粒丢失情况更严重，试从hok和sok基因的调节机制的角度分析，其原因是______。 【答案】(1) 脱氧核苷酸（或原料） 引物设计特异性不足（或模板 DNA 污染、退火温度过低） （2） 在含氯霉素培养基上形成菌落，在含四环素培养基上不形成菌落 Spn Ⅰ （3） hok/sok（m） sok 基因碱基缺失导致 sokmRNA 结构异常，无法结合 hokmRNA，毒蛋白 hok 过量表达，含该质粒的细菌裂解死亡，导致质粒丢失率升高 【分析】mRNA是以DNA的一条链为模板通过转录过程产生的，需要RNA聚合酶的参与。位于基因首端的启动子是一段有特殊结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，可驱动基因转录出mRNA，因此RNA聚合酶识别序列的基本组成单位是脱氧核苷酸。 【详解】（1）PCR 体系需脱氧核苷酸提供原料，缓冲液维持反应条件；杂带出现常因引物错配、模板杂质或温度设置不当导致非特异性扩增。 （2）重组质粒插入目的基因使四环素抗性基因失活，故菌株对四环素敏感，对氯霉素不敏感，所以在含氯霉素培养基上形成菌落，在含四环素培养基上不形成菌落。按照不同方向导入目的基因时，两个 Spn Ⅰ酶切位点之间的片段长短是不同的，可通过酶切片段大小判断插入方向。 （3）由图 2 可知，导入 hok/sok(m) 基因的重组菌，随着传代次数增加，质粒保留比例下降更快，所以质粒丢失情况更严重。突变基因 hok/sok (m) 中 sok 基因的第 274 位上的碱基丢失，这会导致 sok 基因碱基缺失，使得 sokmRNA 结构异常。而 sokmRNA 原本能与 hokmRNA 结合，现在无法正常结合，就会导致毒蛋白 hok 过量表达。含该质粒的细胞会因 hok 过量表达而裂解死亡，从而使质粒丢失率升高。 2．【CRISPR 编辑动物安全】斑马鱼是一种热带观赏鱼，个体小，繁殖能力强，与人类基因同源性达87%，早期发育快且通体透明，便于科学研究。图1是对斑马鱼进行基因编辑技术的作用原理，据图回答下列问题： （1）斑马鱼常被用作研究人类疾病的模式生物，主要原因是________。 （2）据图1分析，Cas9内切酶能够精确切割基因组DNA的机理是向导RNA和Cas9内切酶形成复合物与PAM序列的识别，________，Cas9的核酸酶活性被激活对目标双链DNA切割。 （3）将供体DNA分子成功插入受体基因组DNA的前提条件是供体DNA分子两端应含有_______。 （4）利用PCR技术选择______引物组合获得的PCR产物，可以准确鉴定出供体DNA分子已成功插入，并获得图2所示结果，请说明理由________。 【答案】(1)与人类基因同源性达87% （2）向导RNA与基因组序列匹配（向导RNA与目标DNA互补配对） （3）与基因组DNA切口相同的黏性末端（或Cas9内切酶的识别序列） （4） 1和5 只有引物1和5才能将重组DNA准确扩增出来且PCR产物的长度与检测结果相符（或符合PCR产物长度显示结果或出现特定的PCR产物条带） 【分析】基因工程技术的主要步骤包括：获取目的基因、构建基因表达载体（核心步骤）、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）斑马鱼常被用作研究人类疾病的模式生物，主要原因是与人类基因同源性达87%。 （2）据图1分析Cas9内切酶能够精确切割基因组DNA的机理是向导RNA和Cas9内切酶形成复合物与PAM序列的识别，向导RNA与基因组序列匹配，Cas9的核酸酶活性被激活对目标双链DNA切割。 （3）将供体DNA分子成功插入基因组DNA的前提条件是供体分子两端应含有与基因组DNA切口相同的黏性末端或者供体分子含有Cas9内切酶的识别序列。 （4）引物要与模板链的3'端结合，为了鉴定供体DNA分子是否成功插入，要选择引物1和引物5，如果PCR产物的长度与检测结果相符，则说明实验成功。如果选择引物1和引物4，与检测长度结果不符。 3．【转基因油葵生态安全】近年来，盐碱地光伏产业发展迅速，为“双碳”目标的实现提供了重要支撑，各地在光伏板间隙种植农作物，以积极探索“农光互补”模式，耐盐能力较强的油葵（油用向日葵）成了“香饽饽”。图为探究不同遮荫处理对油葵生理指标的影响结果。 注：CK为无遮荫处理，S30、S60、S90分别为30%、60%、90%遮荫处理；羧化酶是固定过程中的关键酶：柱形图上方的不同字母表示数据间差异显著。 （1）油葵中叶绿素a含量的测定方法是______。 A．层析法 B．显微计数法 C．分光光度法 D．颜色反应 （2）结合图和已学知识分析，以下有利于油葵应对遮荫环境的是______。 A．施用氮肥可能会增加油葵的蛋白质含量 B．遮荫后的油葵更粗壮，更有利于光合作用的进行 C．叶绿素a含量均显著增加，以提高光能的转化效率 D．羧化酶的活性显著增强，光合作用碳反应显著增强，以产生更多的有机物 对不同处理组油葵各器官生物量积累量和各器官生物量比进行分析，结果如图所示。 （3）结合图和已学知识分析，下列说法不正确的是______。 A．油葵籽粒中含量最多的物质是脂肪 B．比较四组籽粒，S60组的生物量积累量最高 C．遮荫后改变了油葵各器官的生物量的分配方向 D．处理组与对照组相比，各器官生物量积累均显著下降 （4）油葵种子在萌发过程中，其有机物总量______（增加减少），有机物种类______（增加/减少）。为促进油葵种子萌发、生长，可以施用______。（编号选填） ①生长素    ②细胞分裂素    ③赤霉素    ④乙烯    ⑤脱落酸 （5）油葵育种过程中会涉及到很多技术方法，找出以下技术方法所对应的主要原理并进行连线______。盐碱地的油葵很容易受到棉铃虫侵袭，为快速获得抗虫油葵新品种并实现大规模种植，请选择相应技术方法并排序：______。（编号选填） 【答案】(1)C (2)CD (3)AB (4) 减少 增加 ①②③ (5) ④⑤① 【分析】光合作用过程分为光反应阶段和暗反应阶段，光反应阶段是水光解形成氧气和还原氢的过程，该过程中光能转变成活跃的化学能储存在ATP中；暗反应阶段包括二氧化碳的固定和三碳化合物的还原，二氧化碳固定是二氧化碳与1分子五碳化合物结合形成2分子三碳化合物的过程，三碳化合物还原是三碳化合物在光反应产生的还原氢和ATP的作用下形成有机物和五碳化合物的过程。影响光合作用的环境因素包括：光照强度、温度、二氧化碳浓度、含水量以及矿质元素的含量等。 【详解】（1）由于叶绿素a能吸收特定波长的光线，因此可以用特定波长的光照射叶绿素a，油葵中叶绿素a含量的测定方法是分光光度法，故选C。 （2）A、施用氮肥土壤中N元素含量升高，可能会增加油葵的蛋白质含量，但遮荫以后光合作用的光照不足，蛋白质含量不会显著提高影响光合作用，A错误； B、根据图示，遮荫以后茎粗逐渐下降，B错误； C、根据图示，叶绿素a含量在30%、60%遮荫处理组升高，可能在补偿光照不足对光合作用的影响，以提高对光能的转化效率，C正确； D、根据图示，30%、60%、90%遮荫处理的程度升高，羧化酶的活性升高，使光合作用的碳反应中酶对二氧化碳的固定能力增强，进而产生更多的有机物，D正确。 故选CD。 （3）A、根据题意，油葵为油料作物，但生物细胞鲜重含量最多的物质是水，因此油葵籽粒中含量最多的物质是水，A错误； B、根据图示，CK组的生物量积累最高，B错误； C、根据图示，遮荫后S30、S60、S90组油葵各器官的生物量比例与CK组相比各不相同，C正确； D、根据图示，处理组与对照组相比，遮荫后S30、S60、S90组油葵各器官生物量积累均显著下降，D正确。 故选AB。 （4）油葵种子在萌发过程中，由于没有叶片进行光合作用，因此只能消耗种子中储存的有机物，因此油葵种子在萌发过程中，其有机物总量在减少，但由于萌发过程中新陈代谢增加，因此需要各种酶，所以有机物种类会增加，油葵种子的萌发、生长需要细胞的生长和分裂，为促进油葵种子萌发、生长，可以施用生长素、细胞分裂素、赤霉素，因此为促进油葵种子萌发、生长，可以施用①②③。 （5）植物组织培养过程中植物细胞会发育成为完整的植株，因此原理是植物细胞的全能性；紫外线照射作为物理辐射，可以引起基因突变；单倍体育种时，离体的花粉通过植物组织培养，再通过秋水仙素使得染色体数目加倍，得到纯合子的个体，因此原理是染色体的变异；基因工程是将其他生物的基因重组到某种生物上，原理是基因重组；筛选出具有优良性状的个体，因此其原理人工选择；盐碱地的油葵很容易受到棉铃虫侵袭，为快速获得抗虫油葵新品种并实现大规模种植，应先通过基因工程将抗虫基因重组到棉花细胞内，再检测目的基因的表达，筛选出目的基因转入并能成功表达的个体，再通过植物组织培养获得更多的能抗虫的棉花个体，即④⑤①。 4．【病毒载体疫苗伦理】新型冠状病毒肺炎（COVID-19），简称“新冠肺炎”，世界卫生组织命名为“2019冠状病毒病”。人类对付传染病主要从预防与治疗两方面入手。接种疫苗是预防最好途径之一，获取相应抗体是治疗传染病的最佳方案之一。陈薇院士团队研发的腺病毒载体重组新冠病毒疫苗，早已二期临床试验，同时，陈薇院士团队还发现了首个靶向新冠病毒棘突蛋白N端结构域的高效中和单克隆抗体。下图是腺病毒载体新冠疫苗（Ad5-nCoV）工作机理示意图。 请回答下列问题： （1）新冠病毒S蛋白基因表达的产物S蛋白在人体内属于________ ， 腺病毒载体新冠疫苗（Ad5-nCoV）的制备技术属于__________________。 （2）Ad5腺病毒载体是较为成熟的平台，是将腺病毒中负责__________的基因片段用_________剪切掉，被称作复制缺陷型腺病毒载体。用复制缺陷型腺病毒作为载体的原因是__________________。 （3）群体免疫，是指人群或牲畜群体对传染病的抵抗力。2020年3月13日，英国政府首席科学顾问帕特里克·瓦兰斯表示，将需要大约60%的英国人感染新冠病毒以获得“群体免疫力”，对此引发不少争议。你认为这样可行吗?对于建立群体免疫你的建议是__________________。 （4）请写出制备高效中和新冠病毒的单克隆抗体的思路：__________________。 【答案】 抗原 基因工程 复制（的关键） 限制性核酸内切酶（限制酶） 使其保留侵染人体细胞的能力，但不能复制，不会让人患病 群体免疫不能通过让大量的人患病来实现，必须以科学为基准，通过疫苗接种来达成这样的目标 对小鼠（或其他动物）注射新冠病毒棘突蛋白，得到相应的B淋巴细胞，再将得到的B淋巴细胞与小鼠（或其他动物）骨髓瘤细胞融合，筛选出能产生新冠病毒棘突蛋白相应抗体的杂交瘤细胞，对其进行克隆化培养和抗体检测，获得足量的能分泌所需抗体的细胞，最后，在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠（或其他动物）腹腔内增殖，这样，从细胞培养液或小鼠（或其他动物）腹水中，就可以提取出大量的单克隆抗体 【分析】（1）病毒不具有细胞结构，只是由蛋白质外壳和由遗传物质组成的核心构成。 （2）传染病是由病原体引起的，能够在生物体之间传播的一种疾病，具有传染性和流行性等特点。传染病能够在人群中流行，必须具备传染源、传播途径、易感人群这三个环节，缺少其中任何一个环节，传染病的预防措施包括控制传染源、切断传播途径、保护易感人群等措施。 （3）免疫分为非特异性免疫和特异性免疫，非特异性免疫是人人生来就有的，包括人体的第一和第二道防线，对大多数病原体有防御功能的免疫；特异性免疫是指第三道防线，产生抗体，消灭抗原，是出生后才有的，只能对特定的病原体或异物有防御作用。 【详解】（1）新冠病毒S蛋白基因表达的产物S蛋白可以刺激机体产生抗体，所以属于抗原；腺病毒载体新冠病毒S蛋白基因导入人体细胞，属于基因工程。 （2）病毒的可怕之处就在于它的大量繁殖，所以将腺病毒中负责复制的关键基因片段用限制性核酸内切酶剪切掉，使其保留侵染人体细胞的能力，但不能复制不会使人患病。 （3）群体免疫如果通过让人群患病获得，会使很多人患病死亡，这是对生命的漠视，必须以科学为基准，通过疫苗接种来达成这样的目标。 （4）按照选修3课本中制备单克隆抗体的思路来写：对小鼠（或其他动物）注射新冠病毒棘突蛋白，得到相应的B淋巴细胞，再将得到的B淋巴细胞与小鼠（或其他动物）骨髓瘤细胞融合，筛选出能产生新冠病毒棘突蛋白相应抗体的杂交瘤细胞，对其进行克隆化培养和抗体检测，获得足量的能分泌所需抗体的细胞，最后，在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠（或其他动物）腹腔内增殖，这样，从细胞培养液或小鼠（或其他动物）腹水中，就可以提取出大量的单克隆抗体。 【点睛】解答此题的关键是熟练掌握传染病及免疫相关的基础知识。 5．【融合蛋白表达载体构建】研究显示Gata3基因是大量肿瘤细胞的潜在突变位点。为研究Gata3蛋白在细胞中的定位，科研人员将GFP（绿色荧光蛋白）基因与Gata3基因融合，形成Gata3-GFP（融合蛋白）基因。图甲为构建重组载体的过程及相关限制酶识别序列和作用位点，A、B、C、F、R为不同引物。请回答下列问题： （1）在PCR扩增GFP编码区序列的过程中，除图示条件外还需添加_________和含Mg2+的缓冲液，其中Mg2+的作用是_________。为使GFP基因能正确插入载体中，在设计引物时，F和R的_________端需分别添加限制酶_________的识别序列。 （2）图乙为构建后的重组载体，图中启动子是_________的部位，能驱动转录进行。重组质粒的外侧链为α链，内侧链为β链，据图判断，基因GFP转录的模板链属于_________链的片段。 （3）如果要在活体小鼠中观察Gata3的表达情况，定位体内癌变位点，需制备转基因小鼠。科研人员将重组载体导入小鼠的_________中，对出生的小鼠进行筛选，获得能正常表达出_________的杂合小鼠。 （4）对于定位研究，荧光信号越强，结果越可靠，纯合小鼠能提供更强的荧光信号。为获得转入Gata3-GFP融合基因的纯合小鼠。科研人员将两只雌、雄杂合小鼠进行杂交获得F1若干，从F1小鼠中选取5只，提取它们的Gata3基因相关DNA片段扩增后电泳，结果如图丙。据图甲、丙判断，扩增时所选引物应是_________，其中小鼠_________（填编号）是Gata3-GFP基因纯合小鼠。 （5）除该技术外，通过荧光标记的_________也能精准定位诊断肿瘤，原因是该物质能准确地识别抗原的细微差异。 【答案】(1) dNTP、耐高温的DNA聚合酶 激活DNA聚合酶活性 5′ SalⅠ、EcoRⅠ （2） RNA聚合酶识别和结合 β （3） 受精卵 Gata3-GFP（融合蛋白） (4) A、C 1、5 （5）单克隆抗体 【详解】（1）PCR反应体系必备模板DNA、引物、缓冲液（Mg²⁺）、dNTP、Taq聚合酶。激活DNA聚合酶活性Mg²⁺是Taq酶的关键辅因子，可稳定引物与模板的结合、激活DNA聚合酶，保证PCR扩增顺利进行。DNA聚合酶只能从引物3' 端延伸子链，限制酶酶切位点要加在引物不延伸的5' 端，不会破坏扩增的目的基因序列。 由图甲重组载体知，为了保持正确的阅读框和转录方向，GFP基因的“左端”（靠近启动子的一端，即引物F结合的一侧）必须连接到载体的右侧接口；GFP基因的“右端”（靠近终止子的一端，即引物R结合的一侧）必须连接到载体的左侧接口。载体Gata3上的酶切位点：MunⅠ （左端）、XhoⅠ（右端）；GFP片段左侧引物F匹配XhoⅠ、右侧引物R匹配MunⅠ；因为XhoⅠ和MunⅠ会破坏GFP基因结构，所以不能直接添加这两种酶的识别序列。MunⅠ与EcoRⅠ产生的黏性末端相同，XhoⅠ与SalⅠ产生的黏性末端相同，因此在设计引物时，F和R的5'端需分别添加限制酶SalⅠ、EcoRⅠ的识别序列。 （2）启动子是基因上游一段DNA序列，是RNA聚合酶特异性识别、结合的位点，结合后启动下游基因转录。转录时RNA聚合酶沿模板链3'→5'方向移动，合成的mRNA沿5'→3'延伸；图乙中GFP转录方向与箭头B一致，重组质粒内侧β链的走向符合转录模板链读取方向，结合甲图中目的基因所在DNA片段图，可推知GFP转录的模板链为β链。 （3）制备转基因动物时，受体细胞选用受精卵，受精卵全能性最高，外源DNA可整合到生殖细胞基因组，发育为完整转基因个体。载体中Gata3编码区与GFP编码区连接，共用一套启动子调控转录，小鼠体内会翻译产生Gata3-GFP融合蛋白，借助GFP绿色荧光，可直观观察Gata3蛋白在细胞、组织中的分布，实现蛋白定位。 （4）首先需要区分野生型小鼠（无GFP）、杂合子（一条染色体有GFP）和纯合子（两条染色体都有GFP）。为了检测是否插入了GFP基因，引物设计通常是一条在基因组原位，另一条在插入的GFP基因上，或者扩增包含插入位点的片段。引物A、C组合能根据扩增的片段长度区分有无插入GFP基因。若扩增出大片段（Gata3-GFP）则说明GFP基因插入成功，若扩增出小片段（Gata3的一部分序列）则说明未插入GFP基因。纯合转基因小鼠（两条染色体都有Gata3-GFP）基因组不存在野生Gata3，只能扩增出Gata3-GFP大片段（单一条带），也就是图里1、5号。 （5）单克隆抗体特异性极强，可精准识别肿瘤细胞特异性抗原，利用荧光标记单克隆抗体，特异性结合肿瘤抗原，实现肿瘤精准定位诊断。 6．【胰岛素蛋白工程安全】天然胰岛素制剂易形成多聚体，需解离为单体方可起效。研究发现，胰岛素B链的第20～29位氨基酸是胰岛素分子相互作用形成多聚体的关键区域。研究人员希望对胰岛素进行改造降低其聚合作用，研究思路和部分DNA序列如图所示。 （1）蛋白质工程构建目标胰岛素是根据人们对目标胰岛素功能的特定需求，对目标胰岛素的______________进行设计改造，最终需借助__________技术来实现。 （2）研究人员拟利用PCR技术对胰岛素基因进行精准改造，将胰岛素B链第28位的脯氨酸与第29位的赖氨酸互换，进而获得目标胰岛素基因（INS）。获取目标胰岛素基因时，为减少非特异性条带的产生，可适当_________（填“提高”或“降低”）PCR中复性过程的温度。据图分析，突变引物R1和F2对应的序列分别为_________（填序号）。 ①5'-GGGTGGGCTTTGTGT-3'    ②5'-CCCAGAACCCACACA-3' ③5'-ACACAAAGCCCACCC-3'    ④5'-TGTGTGGGTTCTGGG-3' （3）对胰岛素基因进行改造时，首先以天然胰岛素基因为模板，设计了“PCR体系1”和“PCR体系2”，分别进行PCR扩增，获得含突变序列的两种DNA片段。上述两个反应体系必须分开进行的原因是___________。然后，取适量且等量的含突变序列的上述两种DNA片段，利用“PCR体系3”获得全长INS。最后利用引物F1和R2进行PCR获得大量INS基因。为保证反应顺利进行，上述“PCR体系3”中除加入含Mg2+的缓冲液和4种脱氧核苷酸外，体系中还必需添加__________。 【答案】(1) 结构 基因工程 (2) 提高 ①③ （3） 引物F2和R1可发生碱基互补配对 Taq DNA聚合酶 【详解】（1）蛋白质工程的基本流程是：从预期蛋白质功能出发 → 设计预期的蛋白质结构 → 推测应有的氨基酸序列 → 找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。所以，改造的直接对象是蛋白质的结构（或氨基酸序列），因为功能由结构决定。 蛋白质工程本质上是第二代基因工程，它通过改造基因来实现对蛋白质的改造，最终依赖基因工程技术来完成基因的表达与生产。 （2）PCR 的复性阶段，引物与模板 DNA 结合。提高复性温度可以减少引物与模板之间的非特异性碱基配对（因为温度越高，非互补的氢键越难形成），从而减少非特异性条带。天然胰岛素B链的碱基序列为： 5′……ACACACCCAAGACCC……3′ 3′……TGTGTGGGTTCTGGG……5′ 突变后，编码第28、29位氨基酸的碱基发生改变（B28为Pro，B29 为Lys），序列变为：5′……ACACAAAGCCCACCC……3′，分析图2的引物方向引物F1和F2是正向引物，与模板链的3′ 端互补，方向为5′→3′。 引物R1和R2是反向引物，与编码链的3′ 端互补，方向为5′→3′。 与突变后的模板链（3′→5′）互补，突变后序列为3′……TGTGTTTCGGGTGGG……5′ ，因此F2的 5′→3′ 序列为：5′—ACACAAAGCCCACCC—3′ → 对应选项③；引物R1：与突变后的编码链（5′→3′）互补，因此R1的 5′→3′ 序列为：5′—GGGTGGGCTTTGTGT—3′ → 对应选项①。 （3）从图中可以看出，引物 F₂和 R₁的序列是互补的。如果将两个体系放在一起，引物 F₂和 R₁会发生碱基互补配对（引物二聚体），无法分别与各自的模板结合，导致 PCR 扩增失败，无法得到含突变的两种 DNA 片段。PCR 反应的核心成分包括：模板 DNA（两种含突变的片段）、引物（F1 和 R2）、dNTP、Mg²⁺缓冲液、Taq DNA 聚合酶（热稳定 DNA 聚合酶）。题目中已给出缓冲液和 dNTP，因此还需要添加Taq DNA聚合酶。 7．【转基因植物生态安全】河南省伏牛山地区分布着多种耐旱植物，柽柳是其中重要的生态修复物种。研究发现，柽柳基因的表达产物可显著增强植物对干旱和高盐胁迫的耐受性。某科研团队利用下图所示质粒构建基因表达载体，然后通过农杆菌转化法将基因导入伏牛山濒危植物太行花中，以提高其抗逆性。回答下列问题。 （1）启动子①应与基因链的________（填“3'”或“5'”）端相连。 （2）为验证转化后的农杆菌是否携带重组质粒，该科研团队采用多重技术（一种在单次反应中通过多对引物同时扩增多个目标序列的技术）进行检测。具体方法为：将下表所示的3对引物加入同一体系中，对转化后的农杆菌进行扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离检测。 引物 扩增片段 扩增基因 扩增基因 扩增基因 转化成功的农杆菌电泳结果应显示________个条带；如果用同样的方法检测转化成功的太行花植株，结果仅显示2个条带，原因是________。 （3）已知组成型启动子可以持续、高效地启动基因的表达，干旱诱导型启动子仅在干旱胁迫下启动基因表达。若将启动子①设计为干旱诱导型启动子，则启动子②应设计为________（填“组成”或“干旱诱导”）型启动子，这样导入太行花组织细胞的结果是________。 （4）科研团队对转基因太行花进行________水平验证，结果显示转基因太行花的抗逆性并未达到预期。为提升蛋白的生物活性，科研团队计划通过蛋白质工程对其进行改造。以下是相关步骤（含2个干扰项），请按正确顺序排列：________。 ①通过射线衍射技术分析原始蛋白的盐碱敏感区域空间结构 ②利用计算机优化原始蛋白三维构象 ③采用定点突变技术修改基因的脱氧核苷酸序列 ④通过技术随机诱变基因序列 ⑤推导出耐盐碱功能所需的关键氨基酸替换位点 ⑥将改造后的基因导入受体细胞并检测其耐盐碱能力 ⑦推测出序列并人工合成新的氨基酸链 【答案】(1)5’ （2） 3 农杆菌中的 基因不会被整合到植物基因组中 （3） 组成 在干旱条件下，NtNAC1 基因表达增强，提高植物的抗逆性 (4) 个体/个体水平 ① → ⑤ → ② → ③ → ⑥ 【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）启动子①应与 NtNAC1 基因的 5’ 端相连，启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，使得转录开始； （2）转化成功的农杆菌电泳结果应显示 3 个条带，包括基因，基因，基因；如果用同样的方法检测转化成功的太行花植株，结果仅显示 2 个条带，原因是 农杆菌中的 Hyg 基因不会被整合到植物基因组中，所以不会显示出Hyg基因对应的条带； （3）若将启动子①设计为干旱诱导型启动子，则启动子②应设计为 组成 型启动子，这样导入太行花组织细胞的结果是 在干旱条件下，NtNAC1 基因表达增强，提高植物的抗逆性； （4）科研团队对转基因太行花进行 个体水平验证，结果显示转基因太行花的抗逆性并未达到预期。为提升 NtNAC1 蛋白的生物活性，科研团队计划通过蛋白质工程对其进行改造。以下是相关步骤（含2个干扰项），请按正确顺序排列：① → ⑤ → ② → ③ → ⑥。 拔高·限时模拟 一、选择题：本题共15小题，每小题3分，共45分。 1．一种双链DNA分子被两种不同的限制酶进行三种切割，切割产物通过电泳分离，用大小已知的DNA片段的电泳结果作为相对分子质量大小标记（如图左边一列）。关于该双链DNA，下列说法错误的是（    ）    A．呈环状结构 B．相对分子质量大小为10kb C．有一个Not I切割位点和两个EcoR I切割位点1 D．其Not I切割位点与EcoR I切割位点的最短距离为2kb 【答案】D 【分析】通过与分子量标记比较可知单用EcoRI处理后产生了4kb和6kb两个条带；而利用EcoRI和NotI双酶切时产生了6kb、3kb、1kb三条带，即4kb的片段进一步被NotI酶切为3kb和1kb的片段，因此DNA含有一个NotI酶切位点，因为用NotI处理只产生了一个10kb的条带，所以该分子必须是环状的，长度一定是10kb，据此答题。 【详解】AB、单用EcoRI处理和利用EcoRI和NotI双酶切时产生的结果不同，说明DNA含有NotI酶切位点，因为用NotI处理只产生了一个10kb的条带，所以该分子必须是环状的，且长度一定是10kb，A正确；B正确； C、因为用NotI处理只产生了一个10kb的条带，说明该环状DNA上含有一个NotI切割位点，单用EcoRI处理后产生了4kb和6kb两条带，说明该环状DNA上含有2个EcoRI切割位点，C正确； D、用EcoRI处理后产生的4kb的片段，进一步被NotI酶切为3kb和1kb的片段，可以得知NotI切点与EcoRI切点的最短距离为1kb，最大距离为3kb，D错误。 故选D。 2．下列研究方法与研究内容相匹配的是（　　） 　 研究方法 研究内容 A 在固体培养基表面划线并培养 计数某种微生物的菌落数目 B 诱变剂处理愈伤组织细胞并观察其分裂 特定基因在减数分裂过程中的分配 C 标记重捕法进行调查 非本地鸟类种群的年龄结构 D 标记抗体与抗原特异性结合 转入的目的基因是否成功表达 A．A B．B C．C D．D 【答案】D 【分析】微生物常见的接种方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落；②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 【详解】A、在固体培养基表面划线并培养，属于平板划线法，只能用于微生物的分离和纯化，不能用于计数，A错误； B、愈伤组织发生的分裂是有丝分裂，不能用于研究特定基因在减数分裂过程中的分配，B错误； C、标记重捕法要求在调查期间无迁入和迁出，而非本地鸟由于迁出率较高，故不适用标记重捕法，C错误； D、抗原与抗体的结合具有特异性，且转入的目的基因表达产物通常是蛋白质，故标记抗体与抗原特异性结合可检测转入的目的基因是否成功表达，D正确。 故选D。 3．DNA琼脂糖凝胶电泳是一种分离、纯化DNA片段的技术。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子构象等有关。超螺旋DNA以超螺旋形式存在，分子体积小；线性DNA分子伸展，在凝胶中移动时受到的摩擦力较大；开环DNA是由环状DNA双链中的一条链发生断裂形成，分子更松散。下列说法正确的是（    ） A．电泳缓冲液在电泳过程中能维持合适的pH，并具有一定的导电性 B．DNA分子在电场作用下，会朝着与它们所带电荷相同的电极移动 C．电泳时电泳指示剂加在凝胶中，核酸染料与PCR产物混合加入加样孔 D．三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率一定不同 【答案】A 【分析】DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 【详解】A、电泳缓冲液的作用是维持溶液的pH稳定（确保DNA带负电荷）并提供导电离子，保证电流传导，A正确； B、DNA分子带负电荷，在电场中应向正极移动，故DNA分子在电场作用下，会朝着与它们所带电荷相反的电极移动，B错误； C、电泳指示剂通常与DNA样品混合后加入加样孔，而核酸染料需在电泳后染色或预先加入凝胶中，C错误； D、三种构象的DNA迁移速率受凝胶浓度影响，但不同浓度的凝胶可能导致某些构象的DNA迁移速率相同，D错误。 故选A。 4．下列关于生物工程相关知识的叙述，正确的有（　　） ①在基因工程操作中为了获得重组质粒，可以用不同的限制性内切酶切割质粒和目的基因，但露出的黏性末端必须相同 ②只要B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，就能产生单克隆抗体 ③蛋白质工程的目标是通过基因重组，合成生物体本来没有的蛋白质 ④生态农业使废物资源化，提高能量的传递效率，减少了环境污染 ⑤诱导细胞融合之前，需将抗原反复注射给实验小鼠，目的是获得产生单一抗体的浆细胞。 A．① B．①⑤ C．①④⑤ D．①②④⑤ 【答案】B 【详解】①基因工程中可用不同限制酶切割质粒和目的基因，只要切割后露出的黏性末端相同，即可通过DNA连接酶构建重组质粒，①正确； ②B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后会出现多种融合类型，需经两次筛选才能获得产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，②错误； ③蛋白质工程的目标是根据需求改造现有蛋白质或合成新蛋白质，并非仅以合成自然界不存在的蛋白质为唯一目标，③错误； ④生态农业提高的是能量利用率，营养级间的能量传递效率稳定在10%~20%，无法人为提高，④错误； ⑤单克隆抗体制备前反复注射抗原，目的是诱导小鼠产生能分泌单一特异性抗体的浆细胞，⑤正确。 5．研究者从嗜热菌中提取了耐高温淀粉酶，开展相关实验，结果如图所示。（残余酶活性是指将酶在不同温度下保温足够长时间，然后在最适温度下测得的酶活性）。据图判断，下列叙述正确的是（    ）    A．曲线②代表相对酶活性 B．该酶可在低温下保存 C．该酶最适合在80℃左右条件下使用 D．该酶耐高温可用于PCR技术和发酵工程 【答案】B 【分析】 图中的曲线①表示酶在各种温度下酶活性相对最高酶活性的百分比。将酶在不同温度下保温足够长的时间，再在酶活性最高的温度下测其残余酶活性，由此得到的数据为酶的热稳定性数据，即图中的曲线②。在使用该酶时，应保证活性较高、酶的热稳定性较好的温度范围。由图中数据可知，60℃～70℃符合要求。 【详解】A、图示为耐高温的淀粉酶在不同温度下的酶活性，由曲线①可知，随温度的升高，酶活性先升后降，故曲线①表示相对酶活性，而曲线②在低温下活性较高，高温下活性降低，应该表示残余酶活性，A错误； B、由图可知，在低温下保存，残余酶活性较高，故可在低温下保存，B正确； C、由曲线①可知，该酶的最适温度是80℃，但在曲线②中，温度超出70℃保存足够长的时间后，在最适宜温度下的酶活性会急剧下降，所以80℃不是该酶的最佳使用温度，C错误； D、该酶是淀粉酶，而PCR中需要的是耐高温的DNA聚合酶，故该酶不能用于PCR，D错误。 故选B。             6．研究人员采用 PCR技术扩增 M、N基因，然后用限制酶 Smal （识别序列为一 GGG↓CCC—）切割，再用 DNA连接酶将其连接成融合基因，最后构建出基因表达载体，如下图所示。 下列叙述错误的是（    ） A．引物 2和引物 4的 5'端均应添加限制酶 SmaI的识别序列 B．引物 1 和引物 3的 5'端应分别添加 KpnI和 XhoI的识别序列 C．建议用 T4DNA 连接酶将切割后的 M、N基因连接成融合基因 D．用PCR鉴定目的基因是否导入受体细胞应选择引物 2和引物3 【答案】D 【分析】由图可知，选择引物1和2扩增M基因，选择引物3和4扩增N基因，顺着转录方向，依次是M基因、N基因，转录时子链的延伸方向是5'到3'，结合两个基因的模板链可知，M基因的左端需要与N基因的左端相连接。根据质粒上的限制酶识别序列可知，需要在融合基因的左端即M基因的右端应该加上KpnⅠ的识别序列，右侧（即N基因的右侧）加上XhoⅠ的识别序列。 【详解】A、根据上述分析可知，M基因的左端需要与N基因的左端相连接，才能保证融合基因的正常转录，所以引物2和引物4的5'端均应添加限制酶 SmaI的识别序列，方便扩增后用该酶切割并实现二者的连接，A正确； B、结合上述分析可知，融合基因的左端（即M基因的右端）应该加上KpnⅠ的识别序列，右侧（即N基因的右侧）加上XhoⅠ的识别序列，故引物 1 和引物 3的 5'端应分别添加 KpnI和 XhoI的识别序列，B正确； C、由于限制酶 Smal 切割后的末端为平末端，故应选择 T4DNA 连接酶将切割后的 M、N基因连接成融合基因，C正确； D、引物2和3结合在融合基因的同一条链上，无法扩增得到产物，无法鉴定目的基因是否导入受体细胞，D错误。 故选D。 7．限制酶是基因工程中必需的工具之一，下表是几种限制酶的识别序列和切割位点，图表示限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列说法正确的是（    ） 限制酶 识别序列和切割位点 BamHI 5'-G↓GATCC-3' Sau3AI 5'-↓GATC-3' BglⅡ 5’-A↓GATCT-3' A．利用BamHⅠ和BglⅡ切割产生的片段，经DNA连接酶连接后能被BamHⅠ切割 B．分别用Sau3AⅠ和BamHⅠ切割果蝇基因组DNA，前者得到的片段往往多于后者 C．用DNA连接酶连接①②两个片段形成的DNA序列是 D．可利用DNA聚合酶将①②两个片段的黏性末端补平 【答案】B 【详解】A、BamHⅠ和BglⅡ切割产生的黏性末端相同，连接后形成的序列为-GGATCT-（或-AGATCC-），不再是BamHⅠ的识别序列GGATCC，因此无法被BamHⅠ切割，A错误； B、Sau3AⅠ的识别序列为4个碱基（GATC），BamHⅠ的识别序列为6个碱基（GGATCC），识别序列越短，在基因组DNA中出现频率越高，酶切位点越多，切割得到的片段数越多，因此前者得到的片段往往多于后者，B正确； C、DNA双链反向平行，若上链按5'→3'方向写为-CTGCAG-，则下链按5'→3'方向写应为-CTGCAG-，选项中下链写为-GACGTC-（默认5'→3'方向）不符合双链反向平行的特点，C错误； D、DNA聚合酶的功能是将单个脱氧核苷酸添加到已有核酸片段的3'端，需要模板链，①②为3'突出的黏性末端，无法用DNA聚合酶补平，D错误。 8．果蝇红眼（A）对白眼（a）为显性，基因位于 X 染色体上。研究人员将红眼雄蝇与白眼雌蝇杂交，子代中出现一例白眼雌蝇（记为 M）。关于 M 出现的原因，提出两种假说： 假说 1：亲代红眼雄蝇减数分裂时发生基因突变，产生含 a 基因的精子； 假说 2：亲代白眼雌蝇产生含两条 X 染色体的卵细胞，导致 M 的性染色体组成为 XXY（可育） 已知几种性染色体异常果蝇的性别如表所示 染色体组成 XXY XO、XYY YY、YO、XXX 性别 雌性 雄性 死亡 下列实验方案及结果分析中，能区分上述两种假说的是（    ） A．将 M 与正常红眼雄蝇杂交，统计子代表型及比例 B．将 M 与正常白眼雄蝇杂交，观察子代的雌雄比例 C．显微镜观察 M 的染色体形态 D．提取 M 的 DNA 进行 PCR 扩增，检测是否含 a 基因 【答案】A 【详解】A、若为假说1，M的基因型为XaXa，与正常红眼雄蝇（XAY）杂交，子代基因型及比例为XAXa：XaY=1:1，子代表型及比例为红眼雌蝇：白眼雄蝇=1:1；若为假说2，M的基因型为XaXaY，产生的配子类型及比例为Xa：XaY：XaXa：Y=2:2:1:1，与正常红眼雄蝇（XAY）杂交，子代中，2XAXa（红眼雌蝇）、2XAXaY（红眼雌蝇）、1XAXaXa（死亡）、1XAY（红眼雄蝇）、2XaY（白眼雄蝇）、2XaYY（白眼雄蝇）、1XaXaY（白眼雌蝇）、1YY（死亡）等，子代表型及比例与假说1不同，可区分，A正确； B、若为假说1，M（XaXa）与正常白眼雄蝇（XaY）杂交，子代基因型为XaXa（白眼雌蝇）、XaY（白眼雄蝇），子代表型及比例为白眼雌蝇：白眼雄蝇=1:1；若为假说2，M（XaXaY）与正常白眼雌蝇（XaY）杂交，XaXaY产生的配子类型及比例为Xa：XaY：XaXa：Y=2:2:1:1，故子代中会出现2XaXa（白眼雌蝇）、3XaXaY（白眼雌蝇）、1XaXaXa（死亡）、3XaY（白眼雄蝇）、2XaYY（白眼雄蝇）、1YY（死亡），子代表型及比例为白眼雌蝇：白眼雄蝇=1:1，两种假说的子代雌雄表型相同，无法区分，B错误； C、显微镜只观察染色体形态，无法区分是基因突变XaY还是染色体数目变异（XaXaY）导致的，C错误； D、两种假说下M都含a基因，提取DNA进行PCR扩增检测是否含a基因，无法区分，D错误。 故选A。 9．在基因工程中，标记基因有助于重组DNA的筛选，但可能存在安全性问题。某研究小组将抗虫基因与有两个T-DNA的Ti质粒连接后，导入小麦细胞以获得不含标记基因的转基因抗虫小麦（不考虑减数分裂时发生互换），实验过程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．质粒上常用抗生素合成基因作为标记基因以便筛选重组DNA分子 B．P中T-DNA1和T-DNA2在一对同源染色体上所对应的是类型甲 C．P中T-DNA1和T-DNA2在同一条染色体上的植株所对应的是类型丙 D．P中T-DNA1和T-DNA2在两对非同源染色体上所对应的是类型乙 【答案】D 【详解】A、基因工程中，质粒的标记基因一般是抗生素抗性基因，通过含抗生素的培养基筛选出含重组质粒的受体细胞，A错误； B、若T−DNA1和T−DNA2分别位于一对同源染色体的两条染色体上，亲本产生配子只有2种：仅含T−DNA1、仅含T−DNA2，自交后代共3种类型：仅含抗虫基因、同时含抗虫和标记基因、仅含标记基因，对应图中的类型丙，B错误； C、若T−DNA1和T−DNA2位于同一条染色体上，亲本产生配子只有2种：同时含T−DNA1和T−DNA2、不含两种T−DNA，自交后代仅2种类型：同时含两个基因、不含两个基因，对应图中的类型甲，C错误； D、若T−DNA1和T−DNA2位于两对非同源染色体上，遵循基因自由组合定律，自交后代共4种类型：仅含抗虫基因、同时含两个基因、仅含标记基因、不含两个基因，对应图中的类型乙，D正确。 10．荧光定量PCR可以对特定基因进行检测。某兴趣小组利用该方法检测市面上的牛肉制品中是否含其他肉类（如鸡肉、鸭肉），设计了不同探针分别与牛肉、鸡肉、鸭肉特定基因片段互补配对，将不同探针与待测牛肉制品中的DNA混合后进行PCR（如下图）。探针同时含荧光基团与淬灭基团时不发荧光，当探针被水解，荧光基团脱离后发出荧光。荧光强度达设定阈值所需的循环数为Ct值。下表是等量牛肉制品的检测结果。下列叙述正确的是（　　） A．过程3中，DNA聚合酶可催化子链延伸和探针水解 B．在设计探针时，荧光基团应该连接在探针的3'端 C．待测牛肉制品中能与探针结合的特定基因越多，荧光亮度越低 D．由表中数据可知，上述牛肉制品中红柳牛肉串的牛肉含量最高 【答案】A 【详解】A、过程3是PCR的子链延伸阶段，荧光定量PCR使用的热稳定DNA聚合酶（Taq酶）同时具有5′→3′的聚合活性（催化子链延伸）和5′→3′外切酶活性（水解结合在模板上的探针），A正确； B、据图可知，探针设计中，荧光基团一般连接在探针的5′端，淬灭基团连接在3′端；若荧光基团连接在3′端，DNA聚合酶从5′端开始水解探针时，荧光基团仍会留在探针片段上，无法发出荧光，B错误； C、能与探针结合的特定基因越多，PCR过程中被水解的探针越多，释放的荧光基团越多，荧光亮度越高，C错误； D、牛肉含量越高，牛特定基因数量越多，牛特定基因探针的Ct值越小。表格中牛特定基因Ct值：鲜嫩牛肉串（15.35）<卤牛肉（17.65）<红柳牛肉串（30.86），因此牛肉含量最高的是鲜嫩牛肉串，不是红柳牛肉串，D错误。 11．科研人员为研究M蛋白，构建了编码M蛋白的M基因与编码荧光蛋白的G基因融合表达的重组质粒，该质粒的部分结构如图1。为确定融合基因是否正确表达，科研人员提取了发荧光的受体细胞中的总蛋白，分成两组进行相关实验，并分别用抗M蛋白抗体和抗荧光蛋白抗体检测相应蛋白的表达情况，结果如图2和图3（抗体与相应蛋白结合后会显示出条带，条带位置与蛋白质大小有关）。下列叙述错误的是（    ） A．用PCR检测重组质粒中是否插入完整的G-M融合基因时，应选择引物2和引物3 B．G-M融合基因在受体细胞内转录时，以a链作为模板 C．条带1检出的蛋白为受体细胞表达的G-M融合蛋白 D．条带2检出的蛋白可能是受体细胞自身的M基因控制合成的M蛋白 【答案】B 【详解】A、重组质粒的模板链为3'→5'方向，PCR扩增需要引物与模板链的3'端结合。引物1结合在a链5'端，方向与扩增方向不符；引物4结合在b链5'端，方向也不符；正确引物应为引物2和引物3，A正确； B、启动子位于G基因上游（a链的5'端），转录时RNA聚合酶结合启动子，沿5'→3'方向合成RNA，因此模板链是b链（3'→5'），B错误； C、据图2可知，用抗M蛋白抗体和抗荧光蛋白抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是G-M融合蛋白，C正确； D、据图2可知，抗M蛋白抗体检测出现条带2，抗荧光蛋白抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的M基因表达的，可能是受体细胞自身的M基因控制合成的M蛋白，D正确。 12．研究者利用某种RNA聚合酶（T7RNAP）、通用型启动子PBAD（被工程菌RNA聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）来构建酪氨酸酶（催化黑色素形成）的光控表达载体（含大观霉素抗性基因），将其转入驹形杆菌筛选后大量培养，实现蓝光照射下形成由黑色素呈现的特定图形或文字，相关原理如图。下列分析错误的是（    ） 注：N端为该蛋白的氨基端，C端为羧基端。基因1编码酪氨酸酶，基因2编码T7RNAPN端-nMag，基因3编码pMag-T7RNAPC端。 A．T7RNAP可识别结合PT7驱动基因转录 B．可使用含大观霉素的培养基大量培养新型菌株 C．启动子①②③分别为PBAD、PBAD和PT7 D．只有在蓝光照射下基因1才可以转录 【答案】C 【详解】A、题干明确说明PT7仅被T7RNAP识别，因此T7RNAP可结合PT7驱动下游基因转录，A正确； B、该载体携带大观霉素抗性基因，可作为筛选标记，因此可用含大观霉素的培养基培养保留成功转入载体的菌株，B正确； C、基因2、基因3需要先表达出T7RNAP的两个片段，才能在蓝光下组装出活性T7RNAP，因此二者的启动子②、③都要能被工程菌自身RNA聚合酶识别，均为PBAD；基因1是受T7RNAP调控的目的基因，启动子①应为PT7。即启动子①②③依次为PT7、PBAD、PBAD， C错误； D、只有蓝光照射才能形成有活性的T7RNAP，进而启动PT7下游基因1的转录，避光时T7RNAP无活性，基因1无法转录，因此只有蓝光照射下基因1才能转录，D正确。 13．双脱氧终止法常用来对DNA进行测序。其原理如图，在4支试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）和1种双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）；ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。在4支试管中DNA链将会分别在A、C、G及T位置中止，并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被电泳分开并显示出来。相关叙述错误的是（　　） A．这种测序方法需要引物和耐高温的DNA聚合酶 B．电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以胞嘧啶结尾 C．测得未知DNA的序列为5′—TCAGCTCGAATC—3′ D．ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3′末端 【答案】B 【分析】PCR技术：1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；2、原理：DNA复制；3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物；4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；5、过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】A、PCR是一种体外扩增DNA的技术，与细胞内DNA复制相似，需要一定的条件，主要包括Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）、引物，dNTP、一定的（含Mg2+）缓冲液和DNA模板，A正确； B、电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤（G）结尾，B错误； C、由图可知：由下往上读出的序列是GATTCGAGCTGA，所以原来的互补序列是3’→5’：CTAAGCTCGACT，测得未知DNA的序列为5＇-TCAGCTCGAATC-3＇，C正确； D、DNA的延伸，是通过前一个dNTP的3位碳上的羟基官能团与后一位dNTP的5位碳上的磷酸基团反应形成磷酸二酯键来实现的。而ddNTPs的三位碳上没有羟基官能团，也就不能形成磷酸二酯键，从而终止DNA的合成。ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3’末端，D正确。 故选B。 14．人工智能（AI）在多个生物技术领域开展应用研究，AI技术通过大数据分析、深度学习解析蛋白质序列与三维结构的关系，可实现从头设计全新蛋白质的结构或对蛋白质进行改造的目的。下列叙述错误的是（　　） A．AI技术在设计全新蛋白质时，需先预期该蛋白质的功能 B．AI技术设计的某种蛋白质的氨基酸序列对应的基因序列可能有多种 C．AI技术改造蛋白质可用PCR技术进行定点突变来进行基因的碱基替换 D．可利用蛋白质工程直接对X蛋白的氨基酸序列进行改造，增强其稳定性 【答案】D 【详解】A、蛋白质工程的基本流程为：预期蛋白质功能→设计预期蛋白质结构→推测对应氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），因此设计全新蛋白质首先要预期其功能，A正确； B、密码子具有简并性，同一种氨基酸可对应多种密码子，因此相同的氨基酸序列可对应多种不同的mRNA序列，进一步对应多种基因序列，B正确； C、蛋白质工程的操作对象是基因，PCR技术可实现基因的定点突变，通过碱基替换改造基因序列，进而实现对蛋白质的改造，C正确； D、蛋白质工程的操作对象是基因，不能直接改造蛋白质的氨基酸序列，需要先改造对应的目的基因，再通过基因表达获得改造后的蛋白质，D错误。 15．南通某中学学生以新鲜花菜为实验材料开展了DNA的粗提取与鉴定实验，部分过程如下图。相关叙述错误的是（    ）    A．过程①中的研磨液具有瓦解细胞膜、使蛋白质变性的作用 B．过程②中应用定性滤纸进行过滤以提高滤液中DNA的含量 C．过程③依据的原理是蛋白质等杂质能溶于酒精，而DNA不溶 D．过程④沸水浴后，试管a、b中溶液颜色分别为无色、蓝色 【答案】B 【分析】DNA粗提取和鉴定的过程： （1）实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。 （2）破碎细胞，获取含DNA的滤液：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。 （3）去除滤液中的杂质：方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。 （4）DNA的析出与鉴定①将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min,溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA．用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。②取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml,将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。 【详解】A、过程①中的SDS可以使核蛋白变性便于DNA分离，A错误； B、不能用滤纸过滤，滤纸会吸附DNA，造成DNA损失，应该用纱布过滤，B错误； C、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，故过程③依据的原理是蛋白质等杂质能溶于酒精，而DNA不溶，C正确； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，试管a中无DNA，试管b中含有DNA，过程④沸水浴后，试管a、b中溶液颜色分别为无色、蓝色，D正确。 故选B。 二、非选择题：本题共5题，共55分。 16．（除标注外，每空1分，共10分）凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶，它能水解多肽链中苯丙氨酸和甲硫氨酸之间的肽键以促使牛奶凝结来生产奶酪；提取凝乳酶的传统方法是从未断奶小牛的胃黏膜里提取．此方法产量低且昂贵。如今科学家运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中，实现了牛凝乳酶的批量生产。图1和图2表示质粒和凝乳酶基因的结构示意图，如表为不同限制酶识别的碱基序列及切割位点。回答下列相关问题：    限制酶 PvitⅡ K pnⅠ EcoRⅠ PstⅠ Bam HⅠ Sau3AⅠ 识别序列 CAG↓CTG G↓GTACC G↓AATTC CTGC↓AG G↓GATCC ↓GATC （1）获取小牛胃黏膜的单细胞需要将剪碎的小牛胃黏膜用____处理；对获得的单细胞进行培养时需要定期更换培养液，目的是____。从培养的牛胃黏膜细胞中提取____，再逆转录形成DNA，再以此DNA为模板利用PCR技术获得凝乳酶基因。 （2）将图2中的凝乳酶基因与图1质粒构建基因表达载体时，最好选择____切割目的基因和质粒，并利用____（只写1种）连接酶进行连接。若将该基因表达载体导入受体细胞后，凝乳酶基因能稳定存在但不能表达，原因可能是____。 （3）可用非转基因牛凝乳酶作为对照检验由酵母菌发酵工程生产的凝乳酶的活性。已知凝乳酶能催化乳汁凝固，将一定量的凝乳酶与一定量的乳汁混合，控制____（写出2点）等条件适宜，观察凝乳需要的时间越____（填“长”或“短”），说明凝乳酶的活性越高。 【答案】(1) 胰蛋白酶（或胶原蛋白酶） 去除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成伤害（2分） 总mRNA （2） PvitⅡ T4DNA连接酶 没有启动子，没有拼接到受体细胞的DNA上（2分） (3) 温度、pH 短 【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定； 2、动物细胞悬液的制备方法：取动物胚胎或幼龄动物器官、组织，将材料剪碎，并用胰蛋白酶或用胶原蛋白酶处理，形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。 【详解】（1）要获得小牛胃黏膜的单细胞需要将剪碎的小牛胃黏膜组织用胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）处理；对获得的单细胞进行培养时需要定期更换培养液，目的是去除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成伤害；从培养的牛胃黏膜细胞中提取总mRNA再逆转录形成DNA，再以此DNA为模板利用PCR技术获得凝乳酶基因； （2）由图1和图2可知，质粒和含目的基因的DNA分子中都有限制酶PvitⅡ的酶切位点，因此将图2中的凝乳酶基因与图1质粒构建基因表达载体时，最好选择限制酶PvitⅡ切割目的基因和质粒，以产生相同的黏性末端，且为平末端，所以用T4DNA连接酶进行连接；若将该基因表达载体导入受体细胞后，凝乳酶基因能稳定存在但不能表达，原因可能是没有启动子，没有拼接到受体细胞的DNA分子上，导致该基因无法表达； （3）检验由酵母菌发酵工程生产的凝乳酶的活性时，将一定量的凝乳酶与一定量的乳汁混合，要控制温度、pH等影响酶活性的条件；如果凝乳酶的活性越高，则凝乳需要的时间就越短。 17．（除标注外，每空1分，共10分）研究者设计基因编辑系统X，将其导入某大肠杆菌菌株中，可以实现对多个基因的同步激活与抑制，以提高该菌抗肿瘤化合物Z的产量。 （1）系统X中dCas蛋白和P蛋白相连，gRNA可以与dCas自动组装到一起。系统X中可以含有多种序列不同的gRNA，gRNA依据_______原则与目标序列特异性结合，引导dCas结合到DNA上，P蛋白是转录激活因子。 （2）研究者检测了系统X对基因的激活效果，当gRNA靶向R基因（核糖体生物合成相关基因）时，Z产量提升约2.9倍。推测当gRNA与R基因的特定区域结合，P蛋白可募集_______启动R基因转录，有利于Z的合成。 （3）研究者检测了系统X对基因的抑制效果，设计了能靶向结合F基因（与细胞分裂相关）不同区域Q1和Q2的gRNA1、gRNA2，分别转入不同的大肠杆菌中，细胞数量相对值如图1。 实验表明：_____________________________。 （4）研究者以绿色和红色荧光蛋白（分别记为GFP和RFP）的荧光强度为检测指标，验证系统X对不同基因的同步激活与抑制功能，系统X中gRNA3、gRNA4的最佳结合区域分别为_______（从Q3～Q8中选择填入）。 若结果显示：_______，可证实系统X在同一细胞中能同时实现激活与抑制。 （5）实验室条件下，利用系统X促进R基因表达且抑制F基因表达时，Z含量最高。但在工厂扩大培养时，外界条件均适宜，系统X能正常运转，Z产量并未达到最大值。请结合发酵工程的基本环节，写出对系统X表达载体的进一步改进措施。_______________________。 【答案】(1)碱基互补配对 （2）RNA 聚合酶 （3）系统X能抑制基因表达，靶向Q1时效果更好；P蛋白不影响系统X的抑制功能（2分） （4） Q4、Q6 （2分） 绿色荧光减弱，红色荧光增强（2分） （5）将靶向F基因的gRNA基因启动子替换为诱导型启动子，使其在大肠杆菌数量增殖到一定阶段才开始表达（2分） 【分析】基因编辑系统 X 作用机制流程图 1、系统组装：dCas 蛋白与 P 蛋白相连，gRNA 通过碱基互补配对原则识别并结合到目标 DNA 序列上，同时与 dCas 蛋白结合形成复合物。 2、靶向结合：复合物通过 gRNA 与目标 DNA 的配对，精准定位到基因的特定区域（如启动子附近的 Q1/Q2 或 Q3/Q8 位点）。 3、功能执行（激活 / 抑制）：激活模式：当复合物结合到目标基因（如 R 基因）的启动子区域时，P 蛋白作为转录激活因子募集 RNA 聚合酶，启动基因转录，促进产物（如 Z 物质）合成。 抑制模式：当复合物结合到目标基因（如 F 基因）的启动子区域时，会阻碍 RNA 聚合酶与启动子的结合，抑制基因转录，从而降低细胞增殖速率。 【详解】（1）gRNA 依据碱基互补配对原则与目标序列特异性结合，引导 dCas 结合到 DNA 上。 （2）P 蛋白是转录激活因子，可募集RNA 聚合酶启动 R 基因转录，从而有利于 Z 的合成。 （3）对照组不含 gRNA（无靶向结合），细胞数量相对值为 1；实验组转入 gRNA1（靶向 Q1）或 gRNA2（靶向 Q2），均含 dCas（系统 X 的核心组件），部分组含 P 蛋白。 结果分析： 与对照组相比，靶向 Q1 和 Q2 的实验组细胞数量均低于 1，说明 dCas 结合到 F 基因（细胞分裂相关基因）后，抑制了 F 基因的表达（F 基因表达受抑会导致细胞分裂减慢，数量减少）。 靶向 Q1 的实验组细胞数量比靶向 Q2 的更低，说明 靶向 F 基因的 Q1 区域时，抑制效果更显著。 含 P 蛋白与不含 P 蛋白的组（对比同一靶向区域）细胞数量无明显差异，说明 P 蛋白（转录激活因子）不影响系统 X 的抑制功能（抑制功能由 dCas 结合目标基因阻断转录实现，与 P 蛋白无关）。 （4）目标：验证 “同步激活与抑制”—— 需激活一个基因（如低表达的 RFP），抑制另一个基因（如高表达的 GFP）。 抑制基因的原理：dCas 结合到基因的 启动子区域或转录起始区，阻断 RNA 聚合酶结合，从而抑制转录。图 2 中 GFP 为高表达启动子，需抑制其表达，应选择启动子附近的 Q4区域（gRNA4 靶向 Q4，抑制 GFP）。 激活基因的原理：P 蛋白（转录激活因子）需结合到基因的 启动子上游或增强子区域，募集 RNA 聚合酶促进转录。RFP 为低表达启动子，需激活其表达，应选择启动子上游的 Q6 区域（gRNA3 靶向 Q6，结合 dCas-P 复合物，激活 RFP）。 第二步：验证结果： 若系统 X 发挥作用：被抑制的 GFP（绿色荧光）表达减弱，荧光强度降低；被激活的 RFP（红色荧光）表达增强，荧光强度升高。因此结果为 绿色荧光减弱，红色荧光增强。 （5）F 基因与细胞分裂相关，若全程抑制 F 基因，会导致大肠杆菌增殖缓慢，总菌体数量少 —— 即使单个菌体 Z 产量高，整体产量（总菌体数 × 单个菌体 Z 产量）仍较低。 改进逻辑：发酵工程中，需先让菌体 “大量增殖”（获得足够生物量），再诱导合成目标产物（Z）。因此需 调控 F 基因的抑制时机： 将靶向 F 基因的 gRNA 的启动子替换为 诱导型启动子（如乳糖诱导型、温度诱导型）。 发酵初期：诱导型启动子不启动，gRNA 不表达，F 基因正常表达，大肠杆菌快速增殖（积累生物量）。 发酵后期：加入诱导剂，启动 gRNA 表达，抑制 F 基因，同时 R 基因持续高表达，单个菌体大量合成 Z，最终总产量最大化。 18．（每空2分，共10分）胰蛋白酶广泛用于工业、科学研究中。胰蛋白酶存在明显的自切（自己分解自己）现象，影响了其稳定和水解效率。有研究人员将链霉菌胰蛋白酶基因经过改造后转入毕赤酵母GS115生产新型的高产、高活性、抗自切重组胰蛋白酶的过程如图。请回答： （1）据图1所示，借助组氨酸脱氢酶基因间的同源属性，含有胰蛋白酶基因的重组质粒片段可重组到毕赤酵母G115的染色体库，与保持环状独立质粒的方案相比，这样做的好处是______。选用的受体菌毕赤酵母通常为单倍体而非二倍体，这样做的便利之处有______    （2）经重组后的毕赤酵母在发酵罐中先经阶段Ⅰ|培养，待碳源基本耗尽后进入阶段Ⅱ培养。据图2、图3可知，甲醇在实验中的作用是______，本实验的研究目的是______。 阶段1培养基成分（g．L-1）：甘油40；OH 4.13；MgSO4.7H20 14.9：H3PO427mL；CaSO4 0.948；微量元素离子液4.4mL；121℃灭菌15min．    （3）为达成重组胰蛋白酶的高分泌、高活性、抗自切的目的，研究人员对决定胰蛋白酶中的部分氨基酸的碱基序列进行改造，这利用了遗传学中的______（原理）。在关于抗自切的改造中，将原胰蛋白酶基因（mt）的几个关键易自切的位点进行改造，然后再分别获取①-⑦组等量的胰蛋白酶进行活性对比，结果如图4，得出的实验结论是：______。    【答案】(1) 外源基因可随染色体复制稳定遗传至手我细胞或避免了游离质粒因传代丢失的风险 避免等位基因干扰，基因型与表现型稳定对位，遗传筛选更直接 （2） 作为诱导剂、碳源 探究只添加甲醇与添加甲醇和甘油对毕赤酵母的细胞干重和胰蛋白酶活性的影响 （3） 中心法则 需要适度诱导自切位点的突变数，过多点突变会降低胰蛋白酶的催化效率 【分析】影响酶促反应速率的因素有①酶浓度②底物浓度③酶活性，其中酶活性又受温度和pH的影响。在最适温度（pH）前，随着温度（pH）的升高，酶活性增强，酶促反应速率加快；到达最适温度（pH）时，酶活性最强，酶促反应速率最快；超过最适温度（pH）后，随着温度（pH）的升高，酶活性降低，酶促反应速率减慢。另外低温不会导致酶变性失活，但高温、pH过高或过低都会使酶变性失活。 【详解】（1）基因表达载体构建的目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用，借助组氨酸脱氢酶基因间的同源属性，含有胰蛋白酶基因的重组质粒片段可重组到毕赤酵母G115的染色体库，与保持环状独立质粒的方案相比，这样做的好处是外源基因可随染色体复制稳定遗传至后代或避免了游离质粒因传代丢失的风险。该受体菌毕赤酵母单倍体不存在同源染色体，也就不存在等位基因，选用的受体菌毕赤酵母避免等位基因干扰，基因型与表现型稳定对位，遗传筛选更直接。 （2）该重组质粒中含有甲醇诱导型启动子，而培养基中含有甲醇的作用除了作为诱导剂激活启动子还具有提供碳源的作用，分析图2图3可知，该实验的自变量为添加甲醇与添加甲醇和甘油，因变量为细胞干重和胰蛋白酶活性，故本实验的研究目的是探究只添加甲醇与添加甲醇和甘油对毕赤酵母的细胞干重和胰蛋白酶活性的影响。 （3）基因上的碱基序列决定了mRNA上的密码子，密码子决定了氨基酸序列，故研究人员对决定胰蛋白酶中的部分氨基酸的碱基序列进行改造，这利用了遗传学中的中心法则原理。 由图4分析可知，突变位点的多少影响胰蛋白酶比活性，①-③随着突变位点的增多，胰蛋白酶比活性逐渐增大，④-⑦随着突变位点的增多，胰蛋白酶比活性逐渐减小，故需要适度诱导自切位点的突变数，过多点突变会降低胰蛋白酶的催化效率。 19．（除标注外，每1分，共13分）豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTT）来自豇豆的可食用部分，其具有抗虫谱广、昆虫不易对其产生耐受性且对人畜无副作用的特点，cpti基因已经被转到烟草、水稻等多种作物中。某研究团队欲以cpti基因转化大麦，获得转基因植株。回答下列问题： （1）大麦是严格自交的二倍体农作物，自然条件下大麦大多是纯合子，主要原因有：①自花传粉，可避免________________；②偶有杂种，经连续自交，______________。 （2）将酶切后的cpti基因和质粒拼接构建的基因表达载体转入大麦细胞后，进一步培养筛选共获得9株待测个体。现对筛选出的个体进行DNA水平的检测。请填写表格，完成实验： 组别 植株编号1-9 对照组1 对照组2 模板 1-9植株DNA ①____ 普通大麦DNA PCR体系中其他物质 缓冲液（添加Mg2+）、水、②____、4种dNTP的等量混合液、Taq DNA聚合酶 电泳结果 编号1、2、4、5、9植株无条带；编号3、6、7、8植株有条带 有条带 ③____ （3）进一步做抗虫的效果鉴定，该团队获得了三个抗虫大麦品系甲、乙、丙。将三个抗虫品系分别与普通品系大麦杂交，F1均表现为抗虫，且F1自交所得F2的表型及比例为抗虫：不抗虫=3:1．又将上述过程获得的甲、乙、丙三个品系相互杂交，得到的结果如下： 甲×乙→F1抗虫→F2抗虫：不抗虫=15:1：乙×丙→F1抗虫→F2抗虫：不抗虫=15:1： 丙×甲→F1抗虫→F2抗虫：不抗虫=99:1 ①若依次用Ala、B/b、D/d表示甲、乙、丙三个品系染色体上与抗虫性状相关的基因，可由杂交实验结果判断甲、乙、丙三个品系中cpti基因所在的染色体的位置关系，请在如 图细胞中画出甲丙杂交所得F1中相关基因在染色体上的位置_____________。 ②甲与丙杂交，F2出现不抗虫植株，这最有可能与F1减数分裂中_____________有关。 甲、乙杂交的F1与乙、丙杂交的F1杂交，所得F2的表型及比例为____________。 （4）目前有较多的药物具有良好的杀虫效果，但研制蛋白酶抑制剂这类的新型药物仍有重要的意义，其理由是________________（说出2点）。 【答案】(1) 外来花粉的干扰 杂合子比例逐渐减小（或后代纯合率逐渐升高） （2） cpti基因（或有cpti基因的基因表达载体） 引物 无条带 （3） （2分） 抗虫基因所在的同源染色体片段发生交叉互换 （2分） 抗虫：不抗虫=15:1（2分） （4）已有药物可能会在使用一段时间后害虫出现抗药性，蛋白酶抑制剂不易使害虫产生耐受性；蛋白酶抑制剂可防止环境污染；蛋白酶抑制剂对人畜无副作用等（2分） 【分析】1、连续自交的结果是纯合子所占的比例越来越大，杂合子所占的比例越来越小； 2、PCR反应体系的主要成分应扩增缓冲液（含Mg2+）、水，4种脱氧核糖苷酸、模板DNA 、TaqDNA聚合酶、两种引物。 3、基因分离定律的实质：在杂合子的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；生物体在进行减数分裂形成配子时，等位基因会随着同源染色体的分开而分离，分别进入到两个配子中，独立地随配子遗传给后代4.基因自由组合定律的实质：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的，在减数分裂过程中，同源染色体上等位基因分离的同时，位于非同源染色体上的非等位基因进行自由组合。 【详解】（1）大麦是严格自交的二倍体农作物，自然条件下大麦大多是纯合子，其原因①自花传粉，可避免外来花粉的干扰；②连续自交，纯合子的比例会逐渐升高，杂合子所占的比例越来越小。 （2）实验目的是检测1~9号植株是否含有cpti基因，且电泳结果中对照组1有条带，所以对照组1处a是epti基因。表中的实验设计的自变量是模板的不同，也就是分别是植株1~9号各自的DNA（待测DNA）、对照组1的基因表达载体或目的基因（已知的cpti 基因）、对照组2普通大麦DNA。加入模板DNA后，分别进行PCR扩增。扩增的条件是在反应体系中加入缓冲液（含Mg2+）、4种脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶、两种引物；多次循环后，进行电泳检测。待测DNA中有条带说明该植株是成功导入目的基因的植株，无条带说明待测植株是未成功导入目的基因的植株。对照组2的模板是普通大麦DNA，因此检测结果表现应该为无条带。 （3） ①将三个抗虫品系与普通品系大麦杂交，F1均表现为抗虫，且F1自交所得F2的表现型及比例为抗虫：不抗虫=3: 1，说明三个品系中的cpti基因的遗传都遵循分离定律。甲x乙、乙x丙的F1均表现为抗虫，F2的表型及比例均为抗虫：不抗虫=15: 1，即（9+3+3) : 1，满足自由组合定律，说明甲和乙、乙和丙的抗虫基因各自位于两对同源染色体上；再结合丙x甲的F1均为抗虫，F2几乎表现为抗虫，说明甲和丙的cpti基因位于同一对同源染色体上（也就是连锁）。若依次用A/a、B/b、D/d表示染色体上的cpli抗虫基因，则根据杂交结果可看出，甲、乙杂交后为双杂合子，乙、丙杂交后出现与甲、乙杂交结果不同的双杂合子；甲、丙杂交结果也为双杂合子，但抗虫基因出现连锁，所以甲、乙、丙三个品系的基因型分别可用AAbbdd、aaBBdd、aabbDD表示。甲、丙杂交所得F1中相关基因在染色体上的位置如下： 。 ②甲与丙杂交，F2出现不抗虫植株，可能F1在减数分裂过程中，抗虫基因所在的同源染色体发生了互换，产生了abd类型的配子。根据上述分析，甲、乙杂交的F1的基因型为AaBbdd，乙、丙杂交的F1基因型为aaBbDd，又由于A/a与D/d在同一条染色体上，D/d在另一条非同源染色体上，所以若不发生交叉互换的情况下，根据自由组合定律的实质，可分别产生ABd、Abd、aBd.abd和aBD、aBd、abD、abd四种类型的配子，所得F2的表型及比例为抗虫：不抗虫=15:1。 （4） 研制蛋白酶抑制剂这类的新型药物具有重要意义的原因是已有药物可能会在使用一段时间后使害虫出现抗药性，蛋白酶抑制剂不易使害虫产生耐受性；蛋白酶抑制剂可防止环境污染；蛋白酶抑制剂对人畜无副作用等。 20．高粱是重要的粮食和经济作物。为加速其遗传改良进程，科研人员进行了一系列研究。 （1）目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内__________________________的过程称为转化。已有研究发现，过表达植物发育调节因子（WUS、BBM、GRF、GIF等）可有效提高转化效率。 （2）科研人员欲利用上述四种调节因子加速高粱的遗传改良，构建了如图所示的三种基因表达载体，其中LB和RB分别是T-DNA的左右边界，DsRed和NPTH作为_______________用于筛选转化成功的受体细胞。GIF是GRF的辅助因子，从蛋白质结构和功能角度推测GRF-GIF以融合基因的形式插入的意义是____________________________________________________。 （3）将三种载体分别导入高粱胚中，统计结果如表。 组别 载体 胚 愈伤组织 存活率（%） 带芽的愈伤组织 转化效率（%） 1 对照载体 121 56 46.28 8 6.61 2 WUS+BBM 98 55 56.12 21 21.43 3 GRF-GIF 96 46 47.92 25 26.04 ①转化效率的计算公式为___________________________。 ②结果显示WUS+BBM的存活率高而转化效率低，GRF-GIF则相反。对此合理的解释是______________。 ③观察3月龄植物生长状况，发现WUS+BBM会造成叶片扭曲、生育能力降低等生长缺陷，而GRF-GIF与对照组相比没有明显差异，说明____________________________________。 【答案】(1）维持稳定和表达 （2） 标记基因 融合基因表达产物是GIF﹣GRF融合蛋白，GIF已与GRF结合，可更好地发挥作用 （3） 带芽的愈伤组织÷胚×100% WUS+BBM促进脱分化，GRF﹣GIF促进愈伤组织再分化 GRF﹣GIF比WUS+BBM能更好地加速高粱的遗传改良 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化，转化不仅仅是目的基因的进入和稳定存在，还包括其在受体细胞内的表达。 （2）据题干信息“DsRed是红色荧光基因，NPTH是新霉素抗性基因”可知，DsRed和NPTⅡ作为标记基因，可用于筛选转化成功的受体细胞；已知GIF是GRF的辅助因子，GRF-GIF以融合基因形式插入可以确保融合基因表达产物是GIF﹣GRF融合蛋白，GIF已与GRF结合，可更好地发挥作用。 （3）①分析题意，将三种载体分别导入高粱胚中，据表中数据可知，转化效率的计算公式为（带芽的愈伤组织数量 / 胚的数量）× 100%。 ②分析表格数据可知，WUS+BBM的存活率高而转化效率低，GRF-GIF则相反，说明外源基因的转化和表达可能会对原有基因的功能造成不同程度的影响：WUS+BBM促进脱分化，GRF﹣GIF促进愈伤组织再分化。 ③观察3月龄植物生长状况，发现WUS+BBM会造成叶片扭曲、生育能力降低等生长缺陷，而GRF-GIF与对照组相比没有明显差异，说明GRF-GIF嵌合蛋白在提高转化效率的同时，不会对植株的正常生长和发育产生明显的负面影响，而WUS+BBM的表达则可能导致植株生长异常，故GRF﹣GIF比WUS+BBM能更好地加速高粱的遗传改良。 第1页，共2页 学科网（北京）股份有限公司 $ 第40讲 基因工程以及生物技术的安全性和伦理问题（一轮培优练） 目 录 真题·命题感知（含2026高考真题） 1 进阶·强化演练（含情景探究、图表分析、实验探究类） 4 拔高·限时模拟（75分钟 100分） 48 真题·命题感知 1．（2026·湖北·高考真题）为了研究大肠杆菌中蛋白A的结构与功能，通过设计特异性引物F1、F2，用PCR技术从大肠杆菌DNA中扩增基因A，再用质粒P构建表达载体。基因A和质粒P的部分酶切图谱如图所示。 下列叙述正确的是（     ） A．F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XhoⅠ酶切位点 B．F1、F2的5'-端分别含有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点 C．F1、F2的5'-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点 D．F1、F2的5'-端分别含有PvuⅠ、ScaⅠ酶切位点 2.（2026·江西·高考真题）蛋白酶E被广泛用作洗涤剂的生产原料，但洗涤剂中的物质S能将E的第n位甲硫氨酸氧化，降低其活性。研究人员将上述甲硫氨酸替换为丝氨酸，提高了E对S的耐受性。下列叙述错误的是（　　） A．第n位甲硫氨酸的氧化会影响E的空间结构，从而影响酶的活性 B．将第n位的甲硫氨酸替换为丝氨酸可通过基因工程实现 C．判断E的改造效果，需用S处理一段时间后测定酶活性 D．甲硫氨酸的替换在提高E对S耐受性的同时，降低了E的专一性 3．（2026·云南·高考真题）内含肽（Int）可通过自我催化实现自我切除并无痕连接两侧肽链。构建编码“内含肽+X蛋白”和“内含肽+Y蛋白”的基因，将其导入真核细胞表达后，内含肽自我切除生成X+Y融合蛋白，如图。 下列说法正确的是（　　） A．构建X+Y融合蛋白基因导入细胞，会因碱基序列相互影响而使蛋白功能异常 B．内含肽序列需嵌入X蛋白的功能结构内，以保证获得的融合蛋白功能正常 C．不同内含肽之间通过能匹配的结构相互识别，发挥特异性切除和连接作用 D．为X+Y融合蛋白提供“内含肽+某蛋白”，可赋予X+Y融合蛋白新的结构 进阶·强化演练 情境探究类 1．【农业转基因】科研人员培育抗虫转基因大豆，先后尝试两种转化方案：方案一利用农杆菌转化法处理大豆离体子叶的愈伤组织；方案二在大豆受粉后，利用花粉管通道法将含抗虫基因的DNA溶液导入胚囊。两种方案最终均获得部分转基因大豆植株。下列叙述错误的是（　　） A．方案一当农杆菌感染愈伤组织时，菌体进入愈伤组织细胞后留在细胞质内 B．方案二借助授粉后未闭合的花粉管通道，外源DNA可进入胚囊作用于受精卵 C．方案一转化细胞需经组织培养获得完整植株，方案二无需离体组织培养，操作更简单 D．方案一可在愈伤组织阶段用标记基因初步筛选，方案二不能在受精卵时期利用标记基因筛选 2．【畜牧养殖】牛奶中的β-酪蛋白有A1和A2两种亚型，由一对等位基因控制，其中A1亚型蛋白会引发人肠胃胀气、腹痛等不适症状。只有纯种A2型奶牛才能产出只含有A2 亚型蛋白的牛奶。欲获得纯种A2型奶牛，下列做法不恰当的是（　　） A．利用基因测序等检测技术筛选纯种A2型奶牛 B．利用γ射线照射实现A1向A2基因的定向突变 C．利用人工选择，提高奶牛群体中A2基因的频率 D．利用体外受精和胚胎移植实现A2型奶牛的扩繁 3．【基础分子实验】研究者从酵母菌中获取控制细胞色素氧化酶（存在于线粒体）的某一段肽合成的DNA片段，将其与小鼠的二氢叶酸还原酶（只存在于细胞质基质）基因融合。重组基因在酵母菌表达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶。该研究的目的是（    ） A．获得融合蛋白 B．研究该段肽的作用 C．引导二氢叶酸还原酶进入线粒体 D．研究重组基因的功能 4．【转基因作物】下列有关转基因植物的说法错误的是（    ） A．科学家可以利用一些调节细胞渗透压的基因，来提高作物的抗盐碱和抗旱的能力 B．由于抗虫棉可以抵抗一切危害棉花植株的害虫，所以抗虫棉已经推广应用 C．科学家往往将某种必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，以提高农作物的营养价值 D．植物体内的病原微生物主要有病毒、真菌和细菌等 5．【新型基因编辑】与传统CRISPR-Cas9系统相比，利用大丝氨酸重组酶（如Kp03）进行基因组编辑的核心优势在于（    ） A．需要设计更长的向导RNA（gRNA）来寻找靶点 B．依赖于非同源末端连接（NHEJ）修复途径 C．在不造成DNA双链断裂的情况下实现大片段整合 D．只能用于细菌基因组的编辑，无法应用于动植物 6．【冬奥环保设备】2022年2月，冬奥会在国家体育场等使用了无水免冲智慧生态厕所。该款厕所利用微生物降解技术，全程不用水且无臭无味。经降解的排泄物最终会变成有机肥料，实现资源再利用。这项“黑科技”中小小的微生物起了大作用，下列叙述正确的是（    ） A．“智慧生态厕所”将排泄物发酵成优质有机肥料供农业种植使用，实现了物质和能量的循环利用 B．“智慧生态厕所”在选择菌种时需考虑循环、协调的原理，不需要考虑自生、整体的原理 C．可用硝化细菌除臭的原因是它能将有臭味的NH3等物质氧化为无味的产物 D．高效降解菌种的筛选需要用到微生物实验室培养的技术，不需要基因工程等现代技术 7．【CRISPR 编辑】基因组编辑技术是研究基因生物学功能的重要手段，下图所示为对某二倍体生物染色体上的B基因进行定点编辑的过程，该过程中sgRNA可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的切割位点。相关叙述错误的是（    ） A．sgRNA能与靶基因部分序列进行碱基互补配对 B．Cas9通过断裂氢键实现对DNA特定位点的切割 C．被编辑后的B基因与原B基因互称为等位基因 D．可据B基因被破坏后生物体的变化推测B基因的功能 8．【人工酵母科研】中国科学院覃重军团队在国际上首次构建出具有一条染色体的活酵母细胞。他们利用基因编辑工具CRISPR-Cas9切割端粒附近的基因组序列，进而利用修复DNA 切口的酶让两条染色体融合在一起。同时，还移除了两条染色体中的一条染色体上的着丝粒。下列说法错误的是（    ） A．人造酵母菌属于真核细胞，遗传信息的表达遵循中心法则 B．仅保留一个着丝粒有助于保证细胞分裂时染色体的稳定性 C．染色体的切割和拼接过程发生了染色体的结构和数目变异 D．CRISPR-Cas9可以准确的识别目标序列并进行切割和修复 9．【抗生素发酵】青霉素具有高效、低毒的特点，是人类发现的第一种抗生素，也是目前全球销量最大的抗生素，可利用现代生物发酵技术进行规模化生产。下列叙述错误的是（    ） A．青霉素的发酵生产多采用好氧、液体深层培养的方式进行 B．培养基的原料选择时，来源充足且廉价即可用于大规模发酵生产 C．可通过诱变、转基因、原生质体融合等方法培育高产菌种 D．可通过吸附、萃取等方法分离目标产物青霉素 10．【AI 合成生物安全】AI算法与合成生物学技术融合，可用于设计人工代谢途径、改造微生物细胞等，在医药、环境治理等领域展现巨大潜力，同时引发了生物安全性相关讨论。下列叙述错误的是（     ） A．AI构建的工程菌若进入自然环境，不会改变原有群落结构 B．AI设计合成的新功能微生物，可因基因扩散造成生态安全风险 C．AI辅助优化的合成生物学产品，需经严格的安全性评价方可应用 D．对AI设计的高风险生物元件实施严格管控，利于维护国家生物安全 11．【异种移植伦理】2024年，基因编辑猪肾成功移植入人体，标志着异种移植技术迈出关键一步。下列关于生物技术伦理与安全性的叙述，正确的是（     ） A．异种移植只需解决免疫排斥问题 B．不商业化即可设计基因编辑婴儿 C．个人基因信息不应用于招聘或保险定价 D．生物武器危害大，可作为军事防御手段 12．【生物安全伦理】电影《731》揭示了战争时期滥用生物武器曾经给我国人民带来了深重的苦难。为生物技术的研究与应用敲响了永恒的警钟。下列相关叙述中，最能体现我国所倡导的生物安全伦理核心原则的是（    ） A．为确保研究成果的领先性，科学家有权对任何未知病原体进行功能增益研究 B．我国不允许进行任何生殖性克隆人实验，主张对治疗性克隆进行鼓励和支持 C．对于可能造成严重威胁的病原体，其研究必须在高等级生物安全实验室中进行 D．所有涉及人体的生物医学研究，都必须将受试者的权益和福祉置于科学利益之上 13．【工业酶工程】4-α糖基转移酶（4αGT）在工业生产中发挥重要作用。为实现产业化生产，研究人员利用双酶切法，从重组克隆载体（仅用于目的基因的复制和保存）中获取目的基因，连入表达载体，构建了高效表达4αGT的工程菌，流程如图1所示。回答下列问题： （1）为确保目的基因正常复制，重组克隆载体和重组表达载体均应含有的元件为________。为确保目的基因正常表达，相较于重组克隆载体，重组表达载体目的基因两端的元件除启动子外，还有________，作用为________。 （2）根据限制酶识别序列和切割位点，以及目的基因片段的黏性末端（图1），判断所使用的限制酶1是________，限制酶2是________。 （3）琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子大小与迁移速率成反比。为检验重组表达载体是否构建成功，用限制酶1和限制酶2切割后，进行电泳鉴定。构建成功的重组表达载体酶切产物的电泳结果如图2所示，条带________（填“a”或“b”）对应目的基因片段，理由是________。 （4）将重组表达载体导入受体细胞，获得的工程菌接入液体培养基中培养。定时检测培养液中4αGT的含量，结果如图3所示。阶段2中4αGT含量迅速升高的原因可能是________（答出一点即可）。 14．【抗肿瘤蛋白研发】豹蛙抗瘤酶（ONC）是一种RNA酶，对肿瘤细胞具有很强的杀伤力，但产量低、难溶、半衰期短。为解决上述问题，科研人员根据人血清白蛋白（HSA）对肿瘤组织具有高通透性、高滞留性的特性，通过重叠延伸PCR技术合成含有连接肽G4S的融合基因HSA-G4S-ONC，过程如下图1。请回答下列问题： （1）利用PCR技术扩增目的基因HSA-G4S-ONC时，反应体系中除了加入含Mg2+的缓冲液和图1中已有条件外，还需要加入________。合成HSA-G4S-ONC融合基因时，必须将引物A1、D2和引物D3、A4置于不同反应系统中，其原因是________________________________。 （2）图2是本实验中所用的表达载体，HSA和ONC基因两端不含限制酶识别序列。为确保基因HSA-G4S-ONC与载体在用E.coliDNA连接酶连接时连接的准确性和效率，在扩增基因HSA-G4S-ONC时可在引物A1、A4的________（填“5′”或“3′”）端分别添加限制酶________、________的识别序列。 图注： 5′AOX1：甲醇特异性诱导的强启动子 3′AOX1（TT）：终止子 Ampr：氨苄青霉素抗性基因 Kanr：卡那霉素抗性基因 3′AOX1：同源重组区段，便于载体整合到酵母染色体上限制酶的识别序列及切点 SnaBⅠ:5′TAC↓GTA3′ EcoRⅠ:5′G↓AATTC3′ BamHⅠ:5′G↓GATCC3′ BglⅡ:5′A↓GATCT3′ SacⅠ:5′GAGCT↓C3′ （3）将构建成功的HSA-G4S-ONC基因表达载体利用限制酶________处理，使表达载体线性化；用线性化表达载体转化处于________态的毕赤酵母，筛选转化成功的重组酵母菌株并置于含________的培养液中培养，诱导HSA-G4S-ONC融合蛋白表达，再进行分离、纯化。 （4）为评估HSA-G4S-ONC融合蛋白对癌细胞活性的影响，科研人员将不同浓度梯度的融合蛋白与大鼠肝癌细胞共同培养，一段时间后检测肝癌细胞的存活率，结果如图3。根据图3可得出的结论是________。科研人员进一步测定了细胞凋亡相关蛋白Caspas8、BAX蛋白的表达情况，结果如图4。据此推测HSA-G4S-ONC融合蛋白抑癌的分子机制是______________________________。 15．【细胞基础实验】细胞核是真核细胞特有的结构，在细胞的代谢、生长和分化中起着重要作用。如图所示为细胞核的模式图和电镜照片，回答下列相关问题： 资料1：有人用变形虫做实验，去掉细胞核的变形虫虽然还能存活几天，但不能取食，也不能生长，最终死亡。 资料2：动物精子形成过程中要经过变形，精子离开动物体后存活时间通常较短。 资料3：科学家用伞形帽伞藻和菊花形帽伞藻完成了伞藻的嫁接实验和核移植实验。 （1）图（b）中电镜下所示结构称为___________结构，其中的异染色质属于染色质的一种，它主要是由___________组成；细胞核的功能是___________。 （2）图（a）中的核孔是由蛋白质和核纤层紧密结合，形成核孔复合体；核孔复合体在核内外的大分子物质转运中起重要作用，请列举一例：___________；大分子出入细胞核不是简单的扩散，而是依据自身的核定位信号和与核孔复合体中受体蛋白结合而实现的“主动转运”，这说明核孔对于物质转运具有___________的特点。 （3）科学家用伞形帽伞藻和菊花形帽伞藻先完成嫁接实验后，再进行核移植实验，其目的是___________。 （4）结合资料1和资料2能得到的结论是：___________。 （5）体细胞克隆猴在我国已成功诞生，这是科学家首次成功克隆出非人灵长类动物，意义非凡。那么克隆人是否离我们也就不远了？你是否支持该技术实施，说出你的观点与理由：___________。 16．【基因编辑乳腺生物反应器】乳铁蛋白（LF）是猪初乳中富含的一种免疫活性蛋白，具有抗菌、抗病毒功能，但LF含量会随泌乳时间延长而显著下降。研究发现CS基因编码的酪蛋白在乳汁中持续高表达。研究人员利用CRISPR/Cas9技术将LF基因敲入CS基因获得基因编辑猪。 （1）如图1所示，CRISPR/Cas9系统中gRNA能与DNA特定碱基序列（靶点）结合，引导Cas9（核酸酶）定点切割，并通过同源重组修复，实现基因敲入。 ①修复时，DNA断裂处两侧与供体DNA的同源区段会发生_____________，实现供体DNA片段的插入。 ②本研究中未将gRNA靶点设计在CS基因中间序列，而设计在接近CS基因末端，紧邻终止密码子对应序列上游，实现在LF基因和CS基因共用同一启动子的同时，__________________。 （2）将构建好的gRNA、Cas9、LF基因表达载体共同转入猪胎儿成纤维细胞。转入前需利用PCR扩增Y染色体特异区域（SRY）进行性别鉴定，应选择______________（填“有”或“无”）SRY条带的细胞。 （3）图2为LF基因敲入后CS基因部分结构。据图分析，要筛选正确转入LF基因的细胞，同时避免内源LF基因干扰，PCR时应选择的两对最佳引物组合为__________________。 （4）将成纤维细胞注入培养到______________时期且去核的卵母细胞中，使两细胞融合，培养至重构胚后，移植入代孕母猪中。移植前应对供体和受体进行同期发情处理，目的是______________。最终获得在乳汁中持续高表达LF基因的基因编辑猪。 （5）本研究中所用载体不含抗性基因等筛选标记，从生物安全的角度分析，可以减少_______________。 图表分析类 1．【异种移植 + 移植伦理安全】某团队在经过动物实验伦理批准后，采用基因编辑猪作为供体，将单个猪肾移植给猕猴，最终移植肾在猕猴体内存活184天，实现了我国异种移植技术的重大突破。如图是简化后的流程，下列分析错误的是（　　）    A．对猪的体细胞进行基因编辑的目的主要是抑制猪抗原基因在受体内的表达 B．①过程会分别用到电融合法和电刺激法，但是二者的实验目的不同 C．②（胚胎移植）和④（器官移植）都会产生免疫排斥反应，需要使用免疫抑制剂处理 D．以猕猴作为器官移植受体会给猕猴带来伤害，可能引发一系列伦理问题 2．【转基因食品安全评价】为评估某种转基因玉米的安全性，科研团队开展非人灵长类动物食蟹猴的长期喂养实验，部分实验数据如下表。下列叙述最合理的是（     ） 指标 组别 BMD(g/cm2) F-B12(mg/kg) F0代（亲代） F1代（1-6岁） F0代（亲代） F1代（1-6岁） 转基因玉米组 0.58±0.09 0.47±0.03 0.03 0.06 非转基因玉米组 0.57±0.09 0.48±0.04 0.03 0.02 常规饲料组 0.57±0.09 0.47±0.03 0.02 0.03 注：骨密度（BMD）和粪便中维生素B12的含量（F-B12）能分别反馈骨健康和肠道菌群功能是否正常。 A．预判人类健康风险时，食蟹猴实验数据比啮齿类动物更具参考优势 B．若长期食用该种转基因玉米，会导致食蟹猴的骨健康水平显著降低 C．实验数据表明该种转基因玉米会导致肠道损伤，造成营养吸收障碍 D．结果显示该转基因玉米安全性较高，无需对其加工产品进行专门标识 3．【绿色食品安全】在我国产自良好生态环境，无污染、安全、优质的食品，统称为绿色食品，下图中为绿色食品标志的是（　　） A． B． C． D． 4．【转基因植物基因污染检测】为评估外源基因Vgb在菊花中的稳定性以及对生态环境的影响，研究人员在种植转基因菊花的第二年，随机选取转基因菊花株系及周边非转基因菊花和各种杂草，提取DNA。根据Vgb设计特异性引物进行PCR扩增，电泳结果如图。下列说法不正确的是（    ） 注：CK表示质粒阳性对照，1为空白对照，2～10 为转基因株系， 11～15为不同种类杂草，16～20 为非转基因菊花 A．设置空白实验是为了排除实验操作、试剂污染等对结果的影响 B．结果表明2年内Vgb基因在菊花细胞中稳定，且未发生向周边植物的扩散 C．转基因植物与周边其他植物之间不可能通过花粉发生基因交流 D．将Vgb基因转入其他植物时同样要经过安全性评价 5．【修复工程菌生态安全防控】矿业生产和农田不当使用化肥会导致重金属镉（Cd）在土壤过度积累。通过基因工程，将酵母液泡镉转运蛋白（YCF1）定位在不育杨树株系的液泡膜上，可获得液泡中富集Cd的转基因杨树。再通过收集杨树的组织器官异地妥善储存等后续处理，可对Cd污染土壤进行修复。将长势一致的野生型和转基因杨树苗栽植在Cd污染土壤中，半年后测定数据如图所示。下列说法错误的是（    ） A．培育转基因不育株系可避免YCF1基因扩散造成基因污染 B．由图1可知转基因植株对Cd污染具有更强的耐受能力 C．对杨树的茎叶进行后续处理对于修复Cd污染土壤最为方便有效 D．YCF1向液泡内转运镉离子过程不需要消耗细胞代谢释放的能量 6．【工程酵母发酵生物安全】研究人员利用基因编辑技术将酿酒酵母E酶基因替换成D酶基因，培育出能合成菜油甾醇的酵母菌。筛选出高产菌株后，再利用含有葡萄糖的培养基进行发酵，并在发酵过程中不断补加半乳糖，得到如下结果。 以下分析错误的是（　　） A．转入D酶基因后改变了酵母菌的代谢途径 B．D酶基因上游需连接酵母菌可识别的启动子 C．分批补料可保证发酵液中碳源和氮源的供应 D．油菜甾醇的产量与酵母菌的数量呈正相关 7．【农杆菌转化转基因鉴定】研究人员利用农杆菌侵染水稻叶片，经组培、筛选最终获得了一株水稻突变体。利用不同的限制酶处理突变体的总DNA、电泳；并与野生型的处理结果对比，得到图所示放射性检测结果。（注：T-DNA上没有所用限制酶的酶切位点）对该实验的分析错误的是（    ） A．检测结果时使用了放射性标记的T-DNA片段做探针 B．该突变体产生的根本原因是由于T-DNA插入到水稻核DNA中 C．不同酶切显示的杂交带位置不同，说明T-DNA有不同的插入位置 D．若野生型也出现杂交带，则实验样本可能被污染，检测结果不准确 8．【限制酶载体构建基础】用XhoI和SalI两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（　　） A．如图中两种酶识别的核苷酸序列不同 B．如图中酶切产物可用于构建重组DNA C．泳道①中是用SalI处理得到的酶切产物 D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA 9．【蛋白质工程产品安全】干扰素是一种具有抗病毒、免疫调节等重要功能的蛋白质。科研人员为了提高干扰素的稳定性和活性，利用蛋白质工程对其进行改造。下表是改造前后干扰素的相关参数对比，据此分析，下列有关叙述错误的是（　　） 对比项目 改造前 改造后 热稳定性（在50℃下活性保留时间） 2小时 8小时 与受体的结合亲和力 相对较弱 相对较强 氨基酸数量 166个 166个 第17位氨基酸 半胱氨酸 丝氨酸 A．蛋白质工程可通过改变氨基酸的种类来改造蛋白质 B．第17位氨基酸的替换可能降低了干扰素对高温的敏感性 C．改造前后氨基酸数量不变，说明蛋白质工程未改变相关基因结构 D．改造后干扰素与受体的结合亲和力增强，这可能提高其生物学效应 10．【重组质粒构建与工程菌培育】某种能以甲醇为唯一碳源的酵母菌可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以图1所示质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因HBsAg（图2）的重组质粒，将重组质粒导入组氨酸缺陷型大肠杆菌（在缺失组氨酸的培养基中无法生存）中进行扩增，再导入并整合到酵母菌染色体DNA上。下列说法错误的是（     ） A．构建HBsAg基因表达载体时，可选用SmaⅠ酶、BamHⅠ酶切割质粒 B．利用PCR扩增HBsAg基因时，选用的引物M的碱基序列与a链相同 C．应在含有组氨酸和氨苄青霉素的培养基中筛选成功导入重组质粒的大肠杆菌 D．培养转化的酵母菌时，培养中加入甲醇的作用是提供碳源并诱导HBsAg基因表达 11．【转基因水产育种生态安全】学习以下材料，回答（1）～（4）题。 中国渔业育种的“双星” “中国克隆之父”童第周先生，上个世纪60年代在我国开创了鱼类的细胞核移植研究。鱼类的受精卵分裂过程，可在低倍镜下直接观察。童先生的实验过程如下图。    中国科学院院士——朱作言先生，在参与童先生的研究中发现，细胞质通过影响细胞核来改变生物性状的作用比较有限。因此，他提出将一种生物细胞核中的遗传物质提取出来，注射到另外一种生物的受精卵中，实现生物性状的改变。 1984年，朱先生的团队培育出世界上首例转基因鲤鱼，早于美国3年。上世纪80年代末期，该团队克隆出草鱼与生长有关的基因和鲤鱼肌动蛋白基因（能表达出肌肉组织中的重要蛋白质）的启动子序列，将两者进行重组，注射到鲤鱼受精卵中，得到快速生长的基因改良鲤鱼，经过6代选育，培育了“冠鲤”品系。该品系生长迅速，生活周期缩短，食物转换效率高。一般鲤鱼在长江中下游需要两年的养殖周期，冠鲤养殖仅需一年。 为进行安全评估，朱先生的团队专门构建了100亩的人工池塘，持续实验5年时间。自然演化过程中的5年很短，但实验表明，“冠鲤”在野外环境中的生存力、繁殖力和竞争力较差，在自然选择中，冠鲤处于弱势。即便是这样，研究团队也没有将其释放到野外自然水体，而是等待我国政府监管部门审批。 水产养殖业是农业的重要组分，它的繁荣发展直接影响食品安全和人民生活水平。一路走来，我国科学家致力于渔业育种的研究从未止步，对世界的贡献有目共睹。 （1）童第周先生和朱作言先生的育种研究，从生命层次的角度看，分别属于___________水平。 （2）文中图示过程获得的杂交鱼更接近于________鱼的性状，该过程不包括__________。 a．有丝分裂b．减数分裂c．细胞分化d．细胞凋亡e．胚胎移植 （3）获得“冠鲤”时，使用鲤鱼肌动蛋白基因的启动子序列，目的是_________。 （4）请从消费者的角度，表明对“冠鲤”上市持有的观点，并利用生物学原理或文中信息阐述支持该观点的依据，请按照下图结构填写在相应的序号位置______________。    12．【多基因载体构建】传统的多基因载体构建需经历多轮次酶切、纯化与连接，操作繁琐。金门克隆技术利用Bsa I酶和DNA连接酶在同一个反应管中进行“一锅法”反应，即可实现多个片段的精准定向顺序组装。我国科学家利用此技术，成功将番茄红素（红色）合成通路中的三个关键目的基因（crtE、crtB、crtI）一次性定向组装至大肠杆菌表达载体中，实现了番茄红素的高效工业化生产。图1和图2为相关基因与序列示意图，回答下列问题。 （1）据图1分析，Bsa I酶催化断裂的化学键是_________。图2中该空载体经Bsa I酶完全切割后，在启动子P一侧产生的单链黏性末端序列为5′-_________-3′。从识别序列与切割位点位置关系的角度分析，Bsa I酶相较于EcoR I酶最显著的特点是_________。 （2）为了使“一锅法”反应能持续自发地向生成目标重组质粒的方向移动（即让反应产物不再被切开），利用PCR技术在目的基因两端引入Bsa I识别序列时，其识别序列应设计在切割位点的_________（填“内侧”或“外侧”，目的基因两端为外侧）；结合金门克隆的自发推进机制分析，若三个目的基因按图2顺序完全组装正确，最终获得的目标重组质粒中应含有_________个Bsa I酶的识别序列。 （3）构造基因表达载体时，模板crtE基因无Bsa I酶的识别序列，为了将crtE基因组装至上述载体切口处，需利用PCR技术扩增crtE基因。结合（1）中推导出的载体末端序列，设计扩增crtE基因的上游引物时，其5′端的特殊设计序列应为5′-_________-3′。（写出11个碱基即可）。若PCR过程中每条链都能充分延伸，理论上该反应中扩增n轮能获得_________个符合要求的目的基因。 （4）若要筛选番茄红素成功表达的目标菌，培养目标菌时可选用的筛选培养基为_________，筛选指标为_________。 13．【真菌基因工程环境安全】平沙绿僵菌是一种昆虫病原真菌，通过分生孢子侵染蚊子，对蚊子致死率高，但引诱能力弱。利用松树长叶烯合酶基因（Tps）改造平沙绿僵菌，增强其引诱能力，据此研发“诱杀一体”的灭蚊剂。回答下列问题。 注：质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽略不计；kb：千碱基对。 （1）为提高Tps基因在平沙绿僵菌中的表达效率，重新设计了长叶烯合酶编码序列，该序列与天然基因序列存在较大差异，但编码的氨基酸序列不变，获取该目的基因的方法是________。 实验如上图，用限制酶EcoRV切割pPK2质粒，然后与Tps基因连接，用________（填“E．coli”或“T4”）DNA连接酶可获得更高的连接效率。 经卡那霉素筛选得到的农杆菌中，除含有目的基因的重组质粒外，还可能存在________。为鉴定重组质粒是否正确连接，利用限制酶切割并电泳检测，下列限制酶组合和片段大小，属于正确连接的是________和________。 A．BamHI/EcoRI、0.7kb＋6.1kb    B．BamHI/EcoRI、1.1kb＋5.7kb C．HindIII/EcoRI、0.7kb＋6.1kb    D．HindIII/EcoRI、1.1kb＋5.7kb 农杆菌转化后，重组质粒上的T-DNA会转移并整合到平沙绿僵菌的________上。 为筛选工程化平沙绿僵菌，用PCR技术进行鉴定。Tps基因的转录模板链部分序列为：5′-ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC-3′，下列引物对可用于扩增该片段的是________。 A．5′-ATGTC…-3′、5′-CCTCG…-3′    B．5′-ATGTC…-3′、5′-GGAGC…-3′ C．5′-TACAG…-3′、5′-CCTCG…-3′    D．5′-TACAG…-3′、5′-GGAGC…-3′ （2）研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程菌培养物对蚊子的诱杀效果，如下表。 相关指标培养物 访问次数 （次/小时） 停留时间 （分钟/小时） 2小时感染率 （%） LT50 （天） 第7天死亡率 （%） 平沙绿僵菌 0.9 1.1 100 5.84 62.4 工程菌 2.4 5.9 100 4.04 84.3 注：感染率：感染孢子的蚊子比例；LT50（半数致死时间）；导致50%蚊子死亡所需的平均时间。 已知孢子附着量决定蚊子死亡速度，结合表中数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显著缩短且第7天死亡率更高的原因是________。 （3）该工程菌制剂在推广前，需经过严格的________评价，符合标准后方可推广。 14．【转基因小麦食品生态安全】普通小麦籽粒为白色，不合成花青素。玉米中ZmC1和ZmR基因编码的蛋白形成复合体，可激活花青素合成通路。科研人员利用农杆菌转化法将ZmC1基因和ZmR基因导入普通小麦，获得了紫色籽粒的转基因小麦。 回答下列问题： （1）利用PCR技术扩增ZmC1基因和ZmR基因，在PCR的反应体系中，DNA聚合酶需要________激活，引物的作用是________________________________。 （2）为使目的基因能定向插入T-DNA中，需在基因两端添加限制酶识别序列，由图可知，目的基因A、B端分别添加的限制酶是________、________。 （3）研究发现，ZmC1-ZmR复合体需结合靶基因启动子区的MRE（花青素响应元件，序列为5'-CCTACC-3'）才能激活转录。若将MRE突变为5'-CCTGCC-3'，复合体结合力下降50%；若突变为5'-CCTACG-3'，结合力下降90%。据此推测，复合体与MRE的作用特点是________。若某小麦品种启动子区天然存在5'-CCTGCC-3'序列，直接导入ZmC1和ZmR后籽粒颜色较浅，为获得紫色籽粒，改良方案是__________________________。若ZmR基因发生突变导致其编码的蛋白无法进入细胞核，则转基因小麦籽粒颜色可能表现为________（填“紫色”或“白色”）。 （4）若要将该紫色小麦品种进行商业化推广，除产量和花青素含量外，还需研究的问题有________________________________（答出1点）。 15．【工程菌代谢产物生物安全】葡萄糖二酸（GA）可作为原料应用于食品、能源和医药等领域，已知M酶和U酶是合成GA途径中的两个关键酶，科研人员尝试设计2种重组质粒导入不同的大肠杆菌分别实现对GA的工业化生产和检测。重组质粒、目的基因的构建及相互关系如图。 回答下列问题： （1）据图分析，断开的质粒与目的基因连接起来形成的重组质粒，其化学本质是_____，组成结构的基本骨架是_____，含有游离的磷酸基团数量是_____个。 （2）若培养液中存在GA，则说明在含重组质粒1的大肠杆菌中，目的基因已成功表达，表达的过程包括_____，发生场所是在______。 （3）已知激活后的GFP基因能合成绿色荧光蛋白，试述含有重组质粒2的大肠杆菌检测GA的原理：____。 实验探究类 1．【质粒构建与工程菌安全】大肠杆菌的R1质粒上含有基因hok和基因sok，其中hok基因编码的毒蛋白会导致大肠杆菌自身裂解死亡，sok基因转录产生的sokmRNA能与hokmRNA结合，这两种mRNA结合形成的产物能被酶降解，从而阻止细胞死亡。实验小组以质粒pACYC184为载体，分别将hok/sok基因和突变基因hok/sok（m），插入到载体的Tc抗性基因的内部，构建了重组质粒，如图1所示（Cm-氯霉素抗性基因，Tc-四环素抗性基因，SpnⅠ和SmaHⅠ为限制酶酶切位点）。并通过对构建的重组菌进行连续传代培养和对不同代次的重组质粒进行酶切，探究了重组菌传代时质粒丢失情况，结果如图2所示。回答下列问题：    （1）在PCR扩增hok/sok基因时，反应体系中除模板DNA、引物、TaqDNA聚合酶、镁离子外，还需加入______。若PCR扩增产物电泳结果出现多条条带，可能的原因是______（答出1点即可）。 （2）为了鉴定某大肠杆菌是否导入了重组质粒，可将转化处理后的菌液充分稀释，并接种到普通培养基上，在无菌培养箱内培养适宜时间，再将获得的大肠杆菌单菌落分别编号，然后将同一编号的单菌落分别接种到含四环素的培养基和含氯霉素的培养基上，若实验现象为______，则证明该编号的菌株成功导入了重组质粒。若要判断hok/sok基因是否按照正确的方向导入质粒，最好选择限制酶______切割质粒，并对产物进行电泳。 （3）与野生型基因比较发现，突变基因hok/sok（m）的中sok基因的第274位上的碱基T缺失。根据实验结果可知，导入______基因的重组菌传代时质粒丢失情况更严重，试从hok和sok基因的调节机制的角度分析，其原因是______。 2．【CRISPR 编辑动物安全】斑马鱼是一种热带观赏鱼，个体小，繁殖能力强，与人类基因同源性达87%，早期发育快且通体透明，便于科学研究。图1是对斑马鱼进行基因编辑技术的作用原理，据图回答下列问题： （1）斑马鱼常被用作研究人类疾病的模式生物，主要原因是________。 （2）据图1分析，Cas9内切酶能够精确切割基因组DNA的机理是向导RNA和Cas9内切酶形成复合物与PAM序列的识别，________，Cas9的核酸酶活性被激活对目标双链DNA切割。 （3）将供体DNA分子成功插入受体基因组DNA的前提条件是供体DNA分子两端应含有_______。 （4）利用PCR技术选择______引物组合获得的PCR产物，可以准确鉴定出供体DNA分子已成功插入，并获得图2所示结果，请说明理由________。 3．【转基因油葵生态安全】近年来，盐碱地光伏产业发展迅速，为“双碳”目标的实现提供了重要支撑，各地在光伏板间隙种植农作物，以积极探索“农光互补”模式，耐盐能力较强的油葵（油用向日葵）成了“香饽饽”。图为探究不同遮荫处理对油葵生理指标的影响结果。 注：CK为无遮荫处理，S30、S60、S90分别为30%、60%、90%遮荫处理；羧化酶是固定过程中的关键酶：柱形图上方的不同字母表示数据间差异显著。 （1）油葵中叶绿素a含量的测定方法是______。 A．层析法 B．显微计数法 C．分光光度法 D．颜色反应 （2）结合图和已学知识分析，以下有利于油葵应对遮荫环境的是______。 A．施用氮肥可能会增加油葵的蛋白质含量 B．遮荫后的油葵更粗壮，更有利于光合作用的进行 C．叶绿素a含量均显著增加，以提高光能的转化效率 D．羧化酶的活性显著增强，光合作用碳反应显著增强，以产生更多的有机物 对不同处理组油葵各器官生物量积累量和各器官生物量比进行分析，结果如图所示。 （3）结合图和已学知识分析，下列说法不正确的是______。 A．油葵籽粒中含量最多的物质是脂肪 B．比较四组籽粒，S60组的生物量积累量最高 C．遮荫后改变了油葵各器官的生物量的分配方向 D．处理组与对照组相比，各器官生物量积累均显著下降 （4）油葵种子在萌发过程中，其有机物总量______（增加减少），有机物种类______（增加/减少）。为促进油葵种子萌发、生长，可以施用______。（编号选填） ①生长素    ②细胞分裂素    ③赤霉素    ④乙烯    ⑤脱落酸 （5）油葵育种过程中会涉及到很多技术方法，找出以下技术方法所对应的主要原理并进行连线______。盐碱地的油葵很容易受到棉铃虫侵袭，为快速获得抗虫油葵新品种并实现大规模种植，请选择相应技术方法并排序：______。（编号选填） 4．【病毒载体疫苗伦理】新型冠状病毒肺炎（COVID-19），简称“新冠肺炎”，世界卫生组织命名为“2019冠状病毒病”。人类对付传染病主要从预防与治疗两方面入手。接种疫苗是预防最好途径之一，获取相应抗体是治疗传染病的最佳方案之一。陈薇院士团队研发的腺病毒载体重组新冠病毒疫苗，早已二期临床试验，同时，陈薇院士团队还发现了首个靶向新冠病毒棘突蛋白N端结构域的高效中和单克隆抗体。下图是腺病毒载体新冠疫苗（Ad5-nCoV）工作机理示意图。 请回答下列问题： （1）新冠病毒S蛋白基因表达的产物S蛋白在人体内属于________ ， 腺病毒载体新冠疫苗（Ad5-nCoV）的制备技术属于__________________。 （2）Ad5腺病毒载体是较为成熟的平台，是将腺病毒中负责__________的基因片段用_________剪切掉，被称作复制缺陷型腺病毒载体。用复制缺陷型腺病毒作为载体的原因是__________________。 （3）群体免疫，是指人群或牲畜群体对传染病的抵抗力。2020年3月13日，英国政府首席科学顾问帕特里克·瓦兰斯表示，将需要大约60%的英国人感染新冠病毒以获得“群体免疫力”，对此引发不少争议。你认为这样可行吗?对于建立群体免疫你的建议是__________________。 （4）请写出制备高效中和新冠病毒的单克隆抗体的思路：__________________。 5．【融合蛋白表达载体构建】研究显示Gata3基因是大量肿瘤细胞的潜在突变位点。为研究Gata3蛋白在细胞中的定位，科研人员将GFP（绿色荧光蛋白）基因与Gata3基因融合，形成Gata3-GFP（融合蛋白）基因。图甲为构建重组载体的过程及相关限制酶识别序列和作用位点，A、B、C、F、R为不同引物。请回答下列问题： （1）在PCR扩增GFP编码区序列的过程中，除图示条件外还需添加_________和含Mg2+的缓冲液，其中Mg2+的作用是_________。为使GFP基因能正确插入载体中，在设计引物时，F和R的_________端需分别添加限制酶_________的识别序列。 （2）图乙为构建后的重组载体，图中启动子是_________的部位，能驱动转录进行。重组质粒的外侧链为α链，内侧链为β链，据图判断，基因GFP转录的模板链属于_________链的片段。 （3）如果要在活体小鼠中观察Gata3的表达情况，定位体内癌变位点，需制备转基因小鼠。科研人员将重组载体导入小鼠的_________中，对出生的小鼠进行筛选，获得能正常表达出_________的杂合小鼠。 （4）对于定位研究，荧光信号越强，结果越可靠，纯合小鼠能提供更强的荧光信号。为获得转入Gata3-GFP融合基因的纯合小鼠。科研人员将两只雌、雄杂合小鼠进行杂交获得F1若干，从F1小鼠中选取5只，提取它们的Gata3基因相关DNA片段扩增后电泳，结果如图丙。据图甲、丙判断，扩增时所选引物应是_________，其中小鼠_________（填编号）是Gata3-GFP基因纯合小鼠。 （5）除该技术外，通过荧光标记的_________也能精准定位诊断肿瘤，原因是该物质能准确地识别抗原的细微差异。 6．【胰岛素蛋白工程安全】天然胰岛素制剂易形成多聚体，需解离为单体方可起效。研究发现，胰岛素B链的第20～29位氨基酸是胰岛素分子相互作用形成多聚体的关键区域。研究人员希望对胰岛素进行改造降低其聚合作用，研究思路和部分DNA序列如图所示。 （1）蛋白质工程构建目标胰岛素是根据人们对目标胰岛素功能的特定需求，对目标胰岛素的______________进行设计改造，最终需借助__________技术来实现。 （2）研究人员拟利用PCR技术对胰岛素基因进行精准改造，将胰岛素B链第28位的脯氨酸与第29位的赖氨酸互换，进而获得目标胰岛素基因（INS）。获取目标胰岛素基因时，为减少非特异性条带的产生，可适当_________（填“提高”或“降低”）PCR中复性过程的温度。据图分析，突变引物R1和F2对应的序列分别为_________（填序号）。 ①5'-GGGTGGGCTTTGTGT-3'    ②5'-CCCAGAACCCACACA-3' ③5'-ACACAAAGCCCACCC-3'    ④5'-TGTGTGGGTTCTGGG-3' （3）对胰岛素基因进行改造时，首先以天然胰岛素基因为模板，设计了“PCR体系1”和“PCR体系2”，分别进行PCR扩增，获得含突变序列的两种DNA片段。上述两个反应体系必须分开进行的原因是___________。然后，取适量且等量的含突变序列的上述两种DNA片段，利用“PCR体系3”获得全长INS。最后利用引物F1和R2进行PCR获得大量INS基因。为保证反应顺利进行，上述“PCR体系3”中除加入含Mg2+的缓冲液和4种脱氧核苷酸外，体系中还必需添加__________。 7．【转基因植物生态安全】河南省伏牛山地区分布着多种耐旱植物，柽柳是其中重要的生态修复物种。研究发现，柽柳基因的表达产物可显著增强植物对干旱和高盐胁迫的耐受性。某科研团队利用下图所示质粒构建基因表达载体，然后通过农杆菌转化法将基因导入伏牛山濒危植物太行花中，以提高其抗逆性。回答下列问题。 （1）启动子①应与基因链的________（填“3'”或“5'”）端相连。 （2）为验证转化后的农杆菌是否携带重组质粒，该科研团队采用多重技术（一种在单次反应中通过多对引物同时扩增多个目标序列的技术）进行检测。具体方法为：将下表所示的3对引物加入同一体系中，对转化后的农杆菌进行扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离检测。 引物 扩增片段 扩增基因 扩增基因 扩增基因 转化成功的农杆菌电泳结果应显示________个条带；如果用同样的方法检测转化成功的太行花植株，结果仅显示2个条带，原因是________。 （3）已知组成型启动子可以持续、高效地启动基因的表达，干旱诱导型启动子仅在干旱胁迫下启动基因表达。若将启动子①设计为干旱诱导型启动子，则启动子②应设计为________（填“组成”或“干旱诱导”）型启动子，这样导入太行花组织细胞的结果是________。 （4）科研团队对转基因太行花进行________水平验证，结果显示转基因太行花的抗逆性并未达到预期。为提升蛋白的生物活性，科研团队计划通过蛋白质工程对其进行改造。以下是相关步骤（含2个干扰项），请按正确顺序排列：________。 ①通过射线衍射技术分析原始蛋白的盐碱敏感区域空间结构 ②利用计算机优化原始蛋白三维构象 ③采用定点突变技术修改基因的脱氧核苷酸序列 ④通过技术随机诱变基因序列 ⑤推导出耐盐碱功能所需的关键氨基酸替换位点 ⑥将改造后的基因导入受体细胞并检测其耐盐碱能力 ⑦推测出序列并人工合成新的氨基酸链 拔高·限时模拟 一、选择题：本题共15小题，每小题3分，共45分。 1．一种双链DNA分子被两种不同的限制酶进行三种切割，切割产物通过电泳分离，用大小已知的DNA片段的电泳结果作为相对分子质量大小标记（如图左边一列）。关于该双链DNA，下列说法错误的是（    ）    A．呈环状结构 B．相对分子质量大小为10kb C．有一个Not I切割位点和两个EcoR I切割位点1 D．其Not I切割位点与EcoR I切割位点的最短距离为2kb 2．下列研究方法与研究内容相匹配的是（　　） 　 研究方法 研究内容 A 在固体培养基表面划线并培养 计数某种微生物的菌落数目 B 诱变剂处理愈伤组织细胞并观察其分裂 特定基因在减数分裂过程中的分配 C 标记重捕法进行调查 非本地鸟类种群的年龄结构 D 标记抗体与抗原特异性结合 转入的目的基因是否成功表达 A．A B．B C．C D．D 3．DNA琼脂糖凝胶电泳是一种分离、纯化DNA片段的技术。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子构象等有关。超螺旋DNA以超螺旋形式存在，分子体积小；线性DNA分子伸展，在凝胶中移动时受到的摩擦力较大；开环DNA是由环状DNA双链中的一条链发生断裂形成，分子更松散。下列说法正确的是（    ） A．电泳缓冲液在电泳过程中能维持合适的pH，并具有一定的导电性 B．DNA分子在电场作用下，会朝着与它们所带电荷相同的电极移动 C．电泳时电泳指示剂加在凝胶中，核酸染料与PCR产物混合加入加样孔 D．三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率一定不同 4．下列关于生物工程相关知识的叙述，正确的有（　　） ①在基因工程操作中为了获得重组质粒，可以用不同的限制性内切酶切割质粒和目的基因，但露出的黏性末端必须相同 ②只要B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，就能产生单克隆抗体 ③蛋白质工程的目标是通过基因重组，合成生物体本来没有的蛋白质 ④生态农业使废物资源化，提高能量的传递效率，减少了环境污染 ⑤诱导细胞融合之前，需将抗原反复注射给实验小鼠，目的是获得产生单一抗体的浆细胞。 A．① B．①⑤ C．①④⑤ D．①②④⑤ 5．研究者从嗜热菌中提取了耐高温淀粉酶，开展相关实验，结果如图所示。（残余酶活性是指将酶在不同温度下保温足够长时间，然后在最适温度下测得的酶活性）。据图判断，下列叙述正确的是（    ）    A．曲线②代表相对酶活性 B．该酶可在低温下保存 C．该酶最适合在80℃左右条件下使用 D．该酶耐高温可用于PCR技术和发酵工程 6．研究人员采用 PCR技术扩增 M、N基因，然后用限制酶 Smal （识别序列为一 GGG↓CCC—）切割，再用 DNA连接酶将其连接成融合基因，最后构建出基因表达载体，如下图所示。 下列叙述错误的是（    ） A．引物 2和引物 4的 5'端均应添加限制酶 SmaI的识别序列 B．引物 1 和引物 3的 5'端应分别添加 KpnI和 XhoI的识别序列 C．建议用 T4DNA 连接酶将切割后的 M、N基因连接成融合基因 D．用PCR鉴定目的基因是否导入受体细胞应选择引物 2和引物3 7．限制酶是基因工程中必需的工具之一，下表是几种限制酶的识别序列和切割位点，图表示限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列说法正确的是（    ） 限制酶 识别序列和切割位点 BamHI 5'-G↓GATCC-3' Sau3AI 5'-↓GATC-3' BglⅡ 5’-A↓GATCT-3' A．利用BamHⅠ和BglⅡ切割产生的片段，经DNA连接酶连接后能被BamHⅠ切割 B．分别用Sau3AⅠ和BamHⅠ切割果蝇基因组DNA，前者得到的片段往往多于后者 C．用DNA连接酶连接①②两个片段形成的DNA序列是 D．可利用DNA聚合酶将①②两个片段的黏性末端补平 8．果蝇红眼（A）对白眼（a）为显性，基因位于 X 染色体上。研究人员将红眼雄蝇与白眼雌蝇杂交，子代中出现一例白眼雌蝇（记为 M）。关于 M 出现的原因，提出两种假说： 假说 1：亲代红眼雄蝇减数分裂时发生基因突变，产生含 a 基因的精子； 假说 2：亲代白眼雌蝇产生含两条 X 染色体的卵细胞，导致 M 的性染色体组成为 XXY（可育） 已知几种性染色体异常果蝇的性别如表所示 染色体组成 XXY XO、XYY YY、YO、XXX 性别 雌性 雄性 死亡 下列实验方案及结果分析中，能区分上述两种假说的是（    ） A．将 M 与正常红眼雄蝇杂交，统计子代表型及比例 B．将 M 与正常白眼雄蝇杂交，观察子代的雌雄比例 C．显微镜观察 M 的染色体形态 D．提取 M 的 DNA 进行 PCR 扩增，检测是否含 a 基因 9．在基因工程中，标记基因有助于重组DNA的筛选，但可能存在安全性问题。某研究小组将抗虫基因与有两个T-DNA的Ti质粒连接后，导入小麦细胞以获得不含标记基因的转基因抗虫小麦（不考虑减数分裂时发生互换），实验过程如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．质粒上常用抗生素合成基因作为标记基因以便筛选重组DNA分子 B．P中T-DNA1和T-DNA2在一对同源染色体上所对应的是类型甲 C．P中T-DNA1和T-DNA2在同一条染色体上的植株所对应的是类型丙 D．P中T-DNA1和T-DNA2在两对非同源染色体上所对应的是类型乙 10．荧光定量PCR可以对特定基因进行检测。某兴趣小组利用该方法检测市面上的牛肉制品中是否含其他肉类（如鸡肉、鸭肉），设计了不同探针分别与牛肉、鸡肉、鸭肉特定基因片段互补配对，将不同探针与待测牛肉制品中的DNA混合后进行PCR（如下图）。探针同时含荧光基团与淬灭基团时不发荧光，当探针被水解，荧光基团脱离后发出荧光。荧光强度达设定阈值所需的循环数为Ct值。下表是等量牛肉制品的检测结果。下列叙述正确的是（　　） A．过程3中，DNA聚合酶可催化子链延伸和探针水解 B．在设计探针时，荧光基团应该连接在探针的3'端 C．待测牛肉制品中能与探针结合的特定基因越多，荧光亮度越低 D．由表中数据可知，上述牛肉制品中红柳牛肉串的牛肉含量最高 11．科研人员为研究M蛋白，构建了编码M蛋白的M基因与编码荧光蛋白的G基因融合表达的重组质粒，该质粒的部分结构如图1。为确定融合基因是否正确表达，科研人员提取了发荧光的受体细胞中的总蛋白，分成两组进行相关实验，并分别用抗M蛋白抗体和抗荧光蛋白抗体检测相应蛋白的表达情况，结果如图2和图3（抗体与相应蛋白结合后会显示出条带，条带位置与蛋白质大小有关）。下列叙述错误的是（    ） A．用PCR检测重组质粒中是否插入完整的G-M融合基因时，应选择引物2和引物3 B．G-M融合基因在受体细胞内转录时，以a链作为模板 C．条带1检出的蛋白为受体细胞表达的G-M融合蛋白 D．条带2检出的蛋白可能是受体细胞自身的M基因控制合成的M蛋白 12．研究者利用某种RNA聚合酶（T7RNAP）、通用型启动子PBAD（被工程菌RNA聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）来构建酪氨酸酶（催化黑色素形成）的光控表达载体（含大观霉素抗性基因），将其转入驹形杆菌筛选后大量培养，实现蓝光照射下形成由黑色素呈现的特定图形或文字，相关原理如图。下列分析错误的是（    ） 注：N端为该蛋白的氨基端，C端为羧基端。基因1编码酪氨酸酶，基因2编码T7RNAPN端-nMag，基因3编码pMag-T7RNAPC端。 A．T7RNAP可识别结合PT7驱动基因转录 B．可使用含大观霉素的培养基大量培养新型菌株 C．启动子①②③分别为PBAD、PBAD和PT7 D．只有在蓝光照射下基因1才可以转录 13．双脱氧终止法常用来对DNA进行测序。其原理如图，在4支试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）和1种双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）；ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。在4支试管中DNA链将会分别在A、C、G及T位置中止，并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被电泳分开并显示出来。相关叙述错误的是（　　） A．这种测序方法需要引物和耐高温的DNA聚合酶 B．电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以胞嘧啶结尾 C．测得未知DNA的序列为5′—TCAGCTCGAATC—3′ D．ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3′末端 14．人工智能（AI）在多个生物技术领域开展应用研究，AI技术通过大数据分析、深度学习解析蛋白质序列与三维结构的关系，可实现从头设计全新蛋白质的结构或对蛋白质进行改造的目的。下列叙述错误的是（　　） A．AI技术在设计全新蛋白质时，需先预期该蛋白质的功能 B．AI技术设计的某种蛋白质的氨基酸序列对应的基因序列可能有多种 C．AI技术改造蛋白质可用PCR技术进行定点突变来进行基因的碱基替换 D．可利用蛋白质工程直接对X蛋白的氨基酸序列进行改造，增强其稳定性 15．南通某中学学生以新鲜花菜为实验材料开展了DNA的粗提取与鉴定实验，部分过程如下图。相关叙述错误的是（    ）    A．过程①中的研磨液具有瓦解细胞膜、使蛋白质变性的作用 B．过程②中应用定性滤纸进行过滤以提高滤液中DNA的含量 C．过程③依据的原理是蛋白质等杂质能溶于酒精，而DNA不溶 D．过程④沸水浴后，试管a、b中溶液颜色分别为无色、蓝色 二、非选择题：本题共5题，共55分。 16．（除标注外，每空1分，共10分）凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶，它能水解多肽链中苯丙氨酸和甲硫氨酸之间的肽键以促使牛奶凝结来生产奶酪；提取凝乳酶的传统方法是从未断奶小牛的胃黏膜里提取．此方法产量低且昂贵。如今科学家运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中，实现了牛凝乳酶的批量生产。图1和图2表示质粒和凝乳酶基因的结构示意图，如表为不同限制酶识别的碱基序列及切割位点。回答下列相关问题：    限制酶 PvitⅡ K pnⅠ EcoRⅠ PstⅠ Bam HⅠ Sau3AⅠ 识别序列 CAG↓CTG G↓GTACC G↓AATTC CTGC↓AG G↓GATCC ↓GATC （1）获取小牛胃黏膜的单细胞需要将剪碎的小牛胃黏膜用____处理；对获得的单细胞进行培养时需要定期更换培养液，目的是____。从培养的牛胃黏膜细胞中提取____，再逆转录形成DNA，再以此DNA为模板利用PCR技术获得凝乳酶基因。 （2）将图2中的凝乳酶基因与图1质粒构建基因表达载体时，最好选择____切割目的基因和质粒，并利用____（只写1种）连接酶进行连接。若将该基因表达载体导入受体细胞后，凝乳酶基因能稳定存在但不能表达，原因可能是____。 （3）可用非转基因牛凝乳酶作为对照检验由酵母菌发酵工程生产的凝乳酶的活性。已知凝乳酶能催化乳汁凝固，将一定量的凝乳酶与一定量的乳汁混合，控制____（写出2点）等条件适宜，观察凝乳需要的时间越____（填“长”或“短”），说明凝乳酶的活性越高。 17．（除标注外，每空1分，共10分）研究者设计基因编辑系统X，将其导入某大肠杆菌菌株中，可以实现对多个基因的同步激活与抑制，以提高该菌抗肿瘤化合物Z的产量。 （1）系统X中dCas蛋白和P蛋白相连，gRNA可以与dCas自动组装到一起。系统X中可以含有多种序列不同的gRNA，gRNA依据_______原则与目标序列特异性结合，引导dCas结合到DNA上，P蛋白是转录激活因子。 （2）研究者检测了系统X对基因的激活效果，当gRNA靶向R基因（核糖体生物合成相关基因）时，Z产量提升约2.9倍。推测当gRNA与R基因的特定区域结合，P蛋白可募集_______启动R基因转录，有利于Z的合成。 （3）研究者检测了系统X对基因的抑制效果，设计了能靶向结合F基因（与细胞分裂相关）不同区域Q1和Q2的gRNA1、gRNA2，分别转入不同的大肠杆菌中，细胞数量相对值如图1。 实验表明：_____________________________。 （4）研究者以绿色和红色荧光蛋白（分别记为GFP和RFP）的荧光强度为检测指标，验证系统X对不同基因的同步激活与抑制功能，系统X中gRNA3、gRNA4的最佳结合区域分别为_______（从Q3～Q8中选择填入）。 若结果显示：_______，可证实系统X在同一细胞中能同时实现激活与抑制。 （5）实验室条件下，利用系统X促进R基因表达且抑制F基因表达时，Z含量最高。但在工厂扩大培养时，外界条件均适宜，系统X能正常运转，Z产量并未达到最大值。请结合发酵工程的基本环节，写出对系统X表达载体的进一步改进措施。_______________________。 18．（每空2分，共10分）胰蛋白酶广泛用于工业、科学研究中。胰蛋白酶存在明显的自切（自己分解自己）现象，影响了其稳定和水解效率。有研究人员将链霉菌胰蛋白酶基因经过改造后转入毕赤酵母GS115生产新型的高产、高活性、抗自切重组胰蛋白酶的过程如图。请回答： （1）据图1所示，借助组氨酸脱氢酶基因间的同源属性，含有胰蛋白酶基因的重组质粒片段可重组到毕赤酵母G115的染色体库，与保持环状独立质粒的方案相比，这样做的好处是______。选用的受体菌毕赤酵母通常为单倍体而非二倍体，这样做的便利之处有______    （2）经重组后的毕赤酵母在发酵罐中先经阶段Ⅰ|培养，待碳源基本耗尽后进入阶段Ⅱ培养。据图2、图3可知，甲醇在实验中的作用是______，本实验的研究目的是______。 阶段1培养基成分（g．L-1）：甘油40；OH 4.13；MgSO4.7H20 14.9：H3PO427mL；CaSO4 0.948；微量元素离子液4.4mL；121℃灭菌15min．    （3）为达成重组胰蛋白酶的高分泌、高活性、抗自切的目的，研究人员对决定胰蛋白酶中的部分氨基酸的碱基序列进行改造，这利用了遗传学中的______（原理）。在关于抗自切的改造中，将原胰蛋白酶基因（mt）的几个关键易自切的位点进行改造，然后再分别获取①-⑦组等量的胰蛋白酶进行活性对比，结果如图4，得出的实验结论是：______。    19．（除标注外，每1分，共13分）豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTT）来自豇豆的可食用部分，其具有抗虫谱广、昆虫不易对其产生耐受性且对人畜无副作用的特点，cpti基因已经被转到烟草、水稻等多种作物中。某研究团队欲以cpti基因转化大麦，获得转基因植株。回答下列问题： （1）大麦是严格自交的二倍体农作物，自然条件下大麦大多是纯合子，主要原因有：①自花传粉，可避免________________；②偶有杂种，经连续自交，______________。 （2）将酶切后的cpti基因和质粒拼接构建的基因表达载体转入大麦细胞后，进一步培养筛选共获得9株待测个体。现对筛选出的个体进行DNA水平的检测。请填写表格，完成实验： 组别 植株编号1-9 对照组1 对照组2 模板 1-9植株DNA ①____ 普通大麦DNA PCR体系中其他物质 缓冲液（添加Mg2+）、水、②____、4种dNTP的等量混合液、Taq DNA聚合酶 电泳结果 编号1、2、4、5、9植株无条带；编号3、6、7、8植株有条带 有条带 ③____ （3）进一步做抗虫的效果鉴定，该团队获得了三个抗虫大麦品系甲、乙、丙。将三个抗虫品系分别与普通品系大麦杂交，F1均表现为抗虫，且F1自交所得F2的表型及比例为抗虫：不抗虫=3:1．又将上述过程获得的甲、乙、丙三个品系相互杂交，得到的结果如下： 甲×乙→F1抗虫→F2抗虫：不抗虫=15:1：乙×丙→F1抗虫→F2抗虫：不抗虫=15:1： 丙×甲→F1抗虫→F2抗虫：不抗虫=99:1 ①若依次用Ala、B/b、D/d表示甲、乙、丙三个品系染色体上与抗虫性状相关的基因，可由杂交实验结果判断甲、乙、丙三个品系中cpti基因所在的染色体的位置关系，请在如 图细胞中画出甲丙杂交所得F1中相关基因在染色体上的位置_____________。 ②甲与丙杂交，F2出现不抗虫植株，这最有可能与F1减数分裂中_____________有关。 甲、乙杂交的F1与乙、丙杂交的F1杂交，所得F2的表型及比例为____________。 （4）目前有较多的药物具有良好的杀虫效果，但研制蛋白酶抑制剂这类的新型药物仍有重要的意义，其理由是________________（说出2点）。 20．高粱是重要的粮食和经济作物。为加速其遗传改良进程，科研人员进行了一系列研究。 （1）目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内__________________________的过程称为转化。已有研究发现，过表达植物发育调节因子（WUS、BBM、GRF、GIF等）可有效提高转化效率。 （2）科研人员欲利用上述四种调节因子加速高粱的遗传改良，构建了如图所示的三种基因表达载体，其中LB和RB分别是T-DNA的左右边界，DsRed和NPTH作为_______________用于筛选转化成功的受体细胞。GIF是GRF的辅助因子，从蛋白质结构和功能角度推测GRF-GIF以融合基因的形式插入的意义是____________________________________________________。 （3）将三种载体分别导入高粱胚中，统计结果如表。 组别 载体 胚 愈伤组织 存活率（%） 带芽的愈伤组织 转化效率（%） 1 对照载体 121 56 46.28 8 6.61 2 WUS+BBM 98 55 56.12 21 21.43 3 GRF-GIF 96 46 47.92 25 26.04 ①转化效率的计算公式为___________________________。 ②结果显示WUS+BBM的存活率高而转化效率低，GRF-GIF则相反。对此合理的解释是______________。 ③观察3月龄植物生长状况，发现WUS+BBM会造成叶片扭曲、生育能力降低等生长缺陷，而GRF-GIF与对照组相比没有明显差异，说明____________________________________。 第1页，共2页 学科网（北京）股份有限公司 $