1.2.2微生物的选择培养和计数课件-2026-2027学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件聚焦微生物的选择培养与计数，通过PCR技术案例导入筛选思路，结合环境实例构建选择培养基概念，再以“土壤中分解尿素的细菌分离”实验串联取样、稀释涂布等操作，形成从理论到实践的学习支架。 其亮点是以探究实践为主线，通过设计对照实验（如选择培养基与完全培养基对比）和数据处理（菌落计数公式应用）培养科学思维，结合尿素分解菌筛选、刚果红鉴别等实例，提升学生实验操作与问题解决能力，为教师提供完整实验方案与评价体系，助力高效教学。

二 微生物的选择培养和计数 微量移液器 新课导入 聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。 耐高温的酶 耐高温生物体 高温环境（热泉、火山口） 寻找 寻找 筛选思路： 1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶。 思考：若想筛选能分解尿素的细菌，应该到怎样的环境中去寻找？ 尿素含量丰富的土壤 ☆【启示】寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 新课导入 ☆【启示】寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 冰川冻土层 被石油污染的土壤 ①在冰川冻土层可以筛选 微生物 ②在被石油污染的土壤中可以筛选 微生物 ③以纤维素为唯一碳源培养基 分解石油 耐寒 纤维素分解菌 实验室筛选微生物原理： 人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。 选择培养基 一、选择培养基 1. 概念： 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 类型 条件 分离得到的菌种 2. 类型: 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 添加某种 化学物质 加入青霉素 高浓度食盐 营养缺陷 不加碳源 不加氮源 自养型微生物 固氮菌 改变培养条件 70～80℃的高温 水生栖热菌 特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 能消除石油污染的微生物 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 完全培养基 选择培养基 怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？ 探究·实践 选择培养基配方的设计 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。 讨论： 1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素 的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 以尿素作为唯一氮源 区别：只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。 (细菌生长的氮源) 尿素 NH3 脲酶 尿素分解菌 【典例】据培养基的配方表，回答下列问题： 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 培养基一 培养基二 1.从物理性质看，两种培养基属于哪类？依据是什么？培养基的主要用途是什么？ 主要用途：分离、鉴定、计数。 2.从用途上来讲，哪个属于选择培养基？将得到何种细菌？ 可获得能分解尿素的微生物。 3.两种培养基中共有哪些成分？ 碳源、氮源、水、无机盐 培养基二的碳源为_______，氮源为_______； 葡萄糖 尿素 都属于固体培养基。 依据是添加了凝固剂——琼脂 培养基二 1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 稀释涂布平板法——将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。 注意：稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 稀释涂布平板法 系列稀释（梯度稀释） 涂布平板 二、微生物的选择培养 平板划线法 稀释涂布平板法 2.样品的稀释（梯度稀释菌液） 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 90mL无菌水 10g ②将10 g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成稀释10倍的菌液。 分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，依次等比稀释，制成不同稀释倍数的菌液。 1.土壤取样 ①铲取土样，将样品装入纸袋中 微量 移液器 注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌 微量 移液器 3.涂布平板 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 注意：各梯度分别涂布3个平板,1个不涂布作空白对照。 4.培养与观察 恒温培养箱 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 细菌一般选用104、105、106 稀释倍数的菌液进行涂布培养。 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 接种效果图 相同点 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散 将菌液进行一系列的等比稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面 接种环 涂布器 从最后划线区挑取 稀释度合适的整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种，获得单菌落;不能计数 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数 ①都能分离纯化菌种 ②都在固体培养基上进行的 平板划线法 vs 稀释涂布平板法 1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，计算时，不要忽略； 2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证； 3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行； 4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。 特别提醒 ①稀释涂布平板法 ②显微镜直接计数法 血细胞/细菌计数板 107 106 103 102 104 1mL 1mL 1mL 1mL 9mL无菌水 1mL 105 三、微生物的数量测定 ——间接计数法（活菌计数法） ——直接计数法 1.间接（活菌）计数法—— 利用稀释涂布平板法 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 (1)原理： (2)注意事项： ①为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板计数，并且在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，并求平均值 ②统计结果往往比实际值少 原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 目的：排除偶然因素对实验结果的影响 (3)计算公式： 每克样品中的菌落数＝ (C÷V)×M M代表稀释倍数 C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) 例:据4号试管的数据计算，每克土壤中的活菌数约为 个。 1.1×108 【例】两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。（相差太大的不要） 【例】某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的细菌数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）。 A. 2.34×108 B. 2.34×109 每克（每ml）样品中的菌落数＝(C÷V)×M 血细胞计数板： 细菌计数板： 2.显微镜直接计数法 常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数 对细菌等较小的细胞进行观察和计数； 缺点： ①不能区分死菌和活菌→偏大 ②不适于对运动细菌的计数。 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察。 优点：快速、直观 使用台盼蓝，死细胞会被染成蓝色 （“染色排除法”） 每毫升所含细菌数=中方格细菌平均数×25（16）×104×稀释倍数 =小方格细菌平均菌数×400×104×稀释倍数 血细胞计数板 方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供计数用。 中方格 小方格 （双线分割） 大方格 边长为1mm，深度为0.1mm 1个计数室的体积为0.1mm3。 1个计数室有400个小方格。 每个小方格的体积是1/4000mm3。 说明：大方格体积=0.1mm3，每个大方格共分为25个中方格，共有25×16=400个小方格 ＝每小方格中细胞数量平均值×400 ×104×稀释倍数 1mL培养液中细胞数 25×16型 A1 A2 A3 A4 A5 16×25型 A1 A2 A3 A4 规格二（25×16）： 1 mL培养液中细胞个数＝中方格中酵母菌数量的平均值×25×104 ×稀释倍数 规格一（16×25）： 1 mL培养液中细胞个数＝中方格中酵母菌数量的平均值×16×104 ×稀释倍数 例1：某小组进行“探究培养液中酵母菌种群数量的变化”实验，利用血细胞计数板(16×25型)对酵母菌进行计数。取1 mL培养液加99 mL无菌水，若观察到所选4个中方格内共有酵母菌400个，则培养液中酵母菌的种群密度为 。 1.6×109个/mL 例2：将样液稀释100倍，采用血细胞计数板（规格为1mm×1mm×0.1mm）计数，观察到的计数室细胞分布见右图，则培养液中酵母菌细胞的密度是＿＿＿＿＿个/mL。 1×108 【现学现用】 内容 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法 主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 计数依据 细菌个数 培养基上菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 计算公式 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×104×稀释倍数 每克样品中的菌株数=(C÷V)×M 　 缺点 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 结果 比实际值偏大 比实际值偏小 三、微生物的数量测定 【拓展】 细菌计数板 细菌计数板：计数室的高度是0.02 mm。 故细菌计数板计数室的体积是： 细菌细胞个数/mL= 每个小方格平均细胞数×400 2×10-5 ×稀释倍数 0.02mm3=0.02×10-3cm3=2×10-5mL 1.提出问题 土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？ 每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？ 利用以“尿素作为唯一氮源”的选择培养基，可以分离。 2.做出假设 3.实验设计 探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 ①提供无机盐 ②调节pH （1）培养基的制备 制备选择培养基（尿素为唯一氮源） 制备牛肉膏蛋白胨培养基 探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 4.进行实验 ①碳源 ②提供能量 牛肉膏蛋白胨培养基（完全培养基）作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。 实验步骤 制备 培养基 土壤 取样 样品稀释 与取样涂布 微生物的 培养与观察 A 取样地：酸碱度接近中性的潮湿土壤中。 B 取样：铲去表层土（一般3cm左右）。 细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。 4.进行实验 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 注意 （2）土壤取样 探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 可通过液体培养基选择（扩大）培养， 目的：增加目标菌的浓度，以确保能从样品中分离所需微生物。 4.进行实验 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300、适于计数的平板。 测细菌数：一般用104、105、106稀释液 测放线菌：一般用103、104、105稀释液 测真菌数：一般用102、103、104稀释液 在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数 （3）样品的稀释与涂布平板 探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 设置未接种的选择培养基和完全培养基,验证培养基中是否含有杂菌。 ①每个浓度至少涂布4个平板 3个选择培养基（平行重复） 1个完全培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。 ②如何验证培养基中是否含有杂菌？ 探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 （3）样品的稀释与涂布平板 （4）微生物的培养与观察 探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 4.进行实验 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。 观察：每隔 统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果。防止 。 结果：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 因培养时间不足而导致菌落数目遗漏 24h 菌落数目稳定 鉴定菌种的重要依据 11213 (1) - 注意事项： 1.涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。 2.取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 3.实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在皿底标记培养皿时应该注明组别、培养日期和稀释度等。 探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 1.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。 ⑤结果分析与评价 探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 对照组 作用 现象 结论 未接种培养基 有无杂菌的污染判断 未接种的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染 接种的完全培养基 选择培养基筛选作用的判断 完全培养基上的菌落数远多于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用 2.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30-300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？ 3.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？ 探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。 如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。 4.利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？并说明理由。 不一定；因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。 本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌, 对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。 探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 如何鉴定分解尿素的细菌？ 5.进一步探究 探究·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 方法：在培养基中加入酚红指示剂 呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。 ——鉴别培养基 ①液体培养基可以直接看液体的变色情况； ②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带。红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 鉴别培养基——在成分中加入能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找到目的菌菌落的培养基。 是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红—亚甲蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现深紫色带有金属光泽，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。 到社会中去 测定饮水中大肠杆菌数量的方法 伊红和亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌 求真 / 求善 / 求美 实在 / 实干 / 实效 (1)筛选分解尿素的细菌的培养基以尿素为唯一氮源，且为液体培养基。( ) 解析：选择培养基一般为固体培养基。 (2)能分解尿素的细菌之所以能分解尿素，是因为其能产生脲酶。( ) (3)稀释涂布平板法能分离细菌，也能计数( ) (4)平板划线法不仅能纯化细菌，也能计数( ) (5）可利用以石油为唯一碳源的培养基筛选能分解石油的细菌（ ） × √ √ × √ 【基础过关】 平板划线法能对细菌分离纯化但不能计数，通常将被石油污染过的土壤浸出液稀释后，采用稀释涂布平板法分离分解石油的细菌菌种，并对菌种进行计数，A错误，C正确；筛选能分解石油的细菌只能利用以石油为唯一碳源的选择培养基，B正确；称取土壤和稀释土壤溶液过程中的每一步都要在酒精灯火焰旁操作，D正确。 37 1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ） （3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ） √ √ √ 概念检测 练习 2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ） A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 D 概念检测 二、拓展应用 1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡。 练习与应用（P20） ①用“尿素为唯一氮源”的选择培养基进行培养 ②创造无氧环境进行培养 2. 已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。 几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈 土壤取样 → 富含纤维素的环境 → 以纤维素为唯一碳源，增加目的菌浓度 （选择培养基） → 制备系列稀释液 筛选产生透明圈的菌落 选择培养 涂布平板 → 将样品涂布到含刚果红的培养基上（鉴别培养基） 梯度稀释 挑选 （1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。 练习与应用P20） （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ （3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。 纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等 这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境, 腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 透明带带直径与菌落直径比值越大 分解纤维素的能力越强 （2）纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 Lavf58.51.100 $