1.2.2微生物的选择培养和计数课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

微生物的选择培养和计数 发酵工程 1 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢？ 事实1 稀释涂布平板法中出现的杂菌 新课导入 科学实例 寻找耐高温的DNA聚合酶 在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶。 美国黄石公园 相应的生存环境中寻找 耐寒微生物 耐热微生物 石油分解菌 选择培养基 实验室微生物筛选原理:人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH）等，同时抑制或阻止其他微生物生长。 纤维素分解菌 启示 选择培养基、微生物的选择培养和数量测定 一 探究•实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 二 目录 类型 条件 分离得到的菌种 改变培养条件 70～80℃的高温 添加某种化学物质 加入青霉素 高浓度食盐 特殊碳、氮源 石油是唯一碳源 营养缺陷 不加碳源 不加氮源 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 水生栖热菌 酵母菌、霉菌等真菌 金黄色葡萄球菌 能消除石油污染的微生物 自养型微生物 固氮菌 （一）选择培养基 5 尿素施入土壤后，会被某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。 事实2 结合材料思考 1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 3.怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照， 若对照培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 （细菌生长的氮源） 尿素 NH3 脲酶 尿素分解菌 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000mL 培养基一 KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4 ·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000mL 培养基二 1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是__________________；该类培养基的主要用途为___________________________。 2.从用途上来讲，____________属于选择培养基，目的是为了获得_____________________。 3.两种培养基共有的培养基成分有： 。 培养基一的主要碳源为 ，主要氮源为 ；培养基二的碳源为 ，氮源为 。 固体 添加了凝固剂琼脂 分离、鉴定、计数、保存 培养基二 能分解尿素的微生物 碳源、氮源、无机盐、水 牛肉膏、蛋白胨 牛肉膏、蛋白胨 葡萄糖 尿素 [现学现用] 【问题】1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 1.原理 分离：获得能分解尿素的细菌的纯培养物 计数：测定分解尿素的细菌的数量 稀释涂布平板法（分离和计数） × 以尿素作为唯一氮源的选择培养基 培养基类型： 方法： （二）微生物的选择培养 平板划线法 （分离） 梯度稀释 涂布平板 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 90mL无菌水 10g 在酒精灯旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。 2.稀释涂布平板法的操作过程： （二）微生物的选择培养 （1）梯度稀释 微量 移液器 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养。 各梯度分别涂布3个平板 1个不涂布作空白对照 2.稀释涂布平板法的操作过程： （二）微生物的选择培养 （2）涂布平板 梯度稀释 涂布平板 放入30~37℃恒温箱中培养1～2d 恒温培养箱 思考：根据实验结果，稀释涂布平板法能计算出细菌数目的原理是什么？ 3.培养与观察 （二）微生物的选择培养 4.结果 ①分离微生物 ②统计样品中活菌的数目 （三）微生物的数量测定 1.稀释涂布平板法 ② 计数原则： ① 原理： 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个______。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少______。 活菌 活菌 选择30-300个菌落的平板进行计数； 每个稀释度至少取3个平板取其平均值； 统计的结果一般用菌落数而不是活菌数； 统计的菌落往往比活菌的实际数目低； 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 M：代表稀释倍数； C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) 4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为________个 ③ 计算公式： 每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M 1.1×108 ——间接计数法 （三）微生物的数量测定 1.稀释涂布平板法 土壤是微生物的天然培养基，下面是有关土壤中分解尿素的细菌的分离和计数的实验过程，请根据下图回答相关问题。 （1）为分离出土壤中分解尿素的细菌，应该用　　　 　　　　　的选择培养基进行分离。 （2）若取土样5 g，应加入　　　 　 中配制成1×101倍稀释的土壤溶液。因土壤中细菌密度很大，需要不断加以稀释，配制成如上图所示的不同浓度的土壤溶液。取样稀释前，一定要　　　　　 　　　以减少误差。 稀释倍数 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 平均菌落数 >500 367 248 26 18 以尿素为唯一氮源 45 mL无菌水 摇匀（振荡、混匀） （3）从1×103~107倍稀释的稀释液中分别吸取0.1mL加到固体培养基上，用　　 将其分散，每个浓度稀释液至少接种　　个平板，以减少实验误差。 （4）将接种的培养皿　　　　在30-37℃的　　　 箱中培养1-2 d，观察并统计　 ，结果如上表所示。找出合适浓度，推测出每克土样中的菌落数为　 。 稀释倍数 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 平均菌落数 >500 367 248 26 18 3 倒置 恒温培养 菌落数 2.48×108 涂布器 常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 利用特定的____________或 ______________在________下观察、计数，然后再计算 __________的样品中微生物的数量； ①原理： 细菌计数板 血细胞计数板 显微镜 一定体积 ②优点： ③缺点： 快速、直观 ①不能区分死菌和活菌→偏大 ②不适于对运动细菌的计数。 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察。 台盼蓝染液染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。 ——直接计数法 （三）微生物的数量测定 2.显微镜直接计数法 对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 核心归纳 项目 直接计数法 间接计数法 原理 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 主要用具 显微镜、细菌计数板 培养基 计数数据 菌体本身 培养基上菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 缺点 死菌、活菌都计算在内 操作较复杂，有一定误差 核心归纳 平板划线法 稀释涂布平板法 主要步骤 接种工具 单菌落的获得 用途 培养结果 相同点 接种环在固体培养基表面连续划线 等比稀释操作和涂布平板操作 接种环 涂布器 从最后划线的区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种，获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征 两种纯培养方法比较 平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。 与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？ 平板划线法 稀释涂布平板法 两种纯培养方法比较 跟踪训练 1.(2023·广东，10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是 A.a点时取样、尿素氮源培养基 B.b点时取样、角蛋白氮源培养基 C.b点时取样、蛋白胨氮源培养基 D.c点时取样、角蛋白氮源培养基 √ 选择培养基、微生物的选择培养和数量测定 一 探究•实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 二 目录 1.提出问题： （1）土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？ （2）每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？ 利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以分离。 2.做出假设： 3.实验原理： 土壤 取样 制备 培养基 样品稀释 与取样涂布 微生物的 培养与观察 菌落计数 4.实验步骤： 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 探究•实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 探究•实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 （三）实验过程 土壤取样 制备培养基 样品稀释 与取样涂布 微生物的 培养与观察 菌落计数 ①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。 ②取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层。 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 探究•实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 （三）实验过程 土壤取样 制备培养基 样品稀释 与取样涂布 微生物的 培养与观察 菌落计数 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。 制备牛肉膏蛋白胨培养基 ①提供无机盐 ②调节pH、渗透压 ①碳源 ②提供能量 对照作用， 判断选择培养基是否具有选择作用 测土壤中细菌数量，一般选用1x104 、1x105 和1x106倍的稀释液进行平板培养。 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300、适于计数的平板。 测细菌数：一般用104、105、106稀释液 测放线菌：一般用103、104、105稀释液 测真菌数：一般用102、103、104稀释液 （三）实验过程 土壤取样 制备培养基 样品稀释 与取样涂布 微生物的 培养与观察 菌落计数 测土壤中细菌数量，一般选用1x104 、1x105 和1x106倍的稀释液进行平板培养。 在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数 （三）实验过程 土壤取样 制备培养基 样品稀释 与取样涂布 微生物的 培养与观察 菌落计数 ①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基 若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目，则说明选择培养基具有筛选作用。 （三）实验过程 土壤取样 制备培养基 样品稀释 与取样涂布 微生物的 培养与观察 菌落计数 ②如何验证培养基中是否含有杂菌？ 设置2个平板作为对照： 不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。 若对照的培养基中无菌落生长，则说明未被杂菌污染。 （三）实验过程 土壤取样 制备培养基 样品稀释 与取样涂布 微生物的 培养与观察 菌落计数 ①培养： ②观察： 根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。 a．观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏部分菌落。 b．记录菌落的特征： 包括菌落的形状、大小和颜色等。 （三）实验过程 土壤取样 制备培养基 样品稀释 与取样涂布 微生物的 培养与观察 菌落计数 一般来说，在相同的培养条件下， 同种微生物表现出稳定的菌落特征 探究•实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 （四）结果与评价 目的 现象 结论 是否有杂菌污染的判断 ____________________________ 未被杂菌污染 培养物中菌落形态多样，菌落数偏高 培养物中混入其他杂菌 选择培养基是否起筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目______选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用 对照组的培养基中无菌落生长 大于 思考：得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？ 不一定；因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3 脲酶 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性 ①液体培养基可以直接看液体的变色情况； ②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 鉴定培养基 土壤中分解尿素的细菌的鉴定 呈碱性，遇酚红指示剂呈 色。 红 鉴定培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。 伊红-亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌 刚果红培养基鉴别纤维素分解菌 出现带金属光泽的深紫色菌落 纤维素被分解后出现透明圈 一、概念检测 1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ） （3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ） √ √ √ 34 一、概念检测 2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ） A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 D 35 二、拓展应用 1.反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡。 ①用“尿素为唯一氮源”的选择培养基进行培养； ②创造无氧环境进行培养。 36 二、拓展应用 2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精， 用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料， 它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物， 但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反 应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时， 刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤 维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中 会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。 请回答下列问题。 37 二、拓展应用 2.（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ （3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段 时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。 请你评价这一做法。 纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中， 采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林 中多年落叶形成的腐殖土等。 这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 38 课堂小结 本堂课你学到了哪些知识？画出概念图进行总结 $