2027届高考生物一轮复习重点强化练96　基因工程的工具与操作过程

**基本信息** 聚焦基因工程工具与操作全流程，以实验操作与逻辑分析为核心，通过典例构建“工具特性-载体构建-检测鉴定”的递进式解题体系，强化科学思维与探究实践能力。 **综合设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |工具酶与操作技术|选择1-2、非选6(2)|限制酶特异性识别与切割位点分析；PCR/电泳实验操作要点|从酶的作用机理（磷酸二酯键）到实验技术（DNA提取/扩增）的原理应用| |表达载体构建与筛选|选择3-4、非选7(3)|双酶切定向连接策略；标记基因筛选（卡那霉素/X-gal）|载体结构（启动子/终止子/标记基因）与目的基因整合的逻辑关系| |实验设计与检测鉴定|选择5、非选6(4)-7(6)|分子水平检测（抗原-抗体杂交/分子杂交）；个体水平鉴定（病毒接种）|从基因导入到表达验证的完整检测层次，体现科学探究的严谨性|

重点强化练96　基因工程的工具与操作过程 (分值∶65分) (第1～5题，每题5分，共25分。) 一、选择题 1．(2026·吉安模拟)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作，下列叙述正确的是(　　) A．实验Ⅰ中，PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压蒸汽灭菌处理 B．实验Ⅰ中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源 C．实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA D．实验Ⅱ中，研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 2．(2026·天津五区联考)如表是几种限制酶的识别序列及切割位点。据表分析，下列叙述错误的是(　　) 限制酶 Hind Ⅱ Alu Ⅰ BamH Ⅰ Sau3A Ⅰ 识别序列及切割位点 5′－GTY↓ RAC－3′ 5′－AG↓ CT－3′ 5′－G↓ GATCC－3′ 5′－↓ GATC－3′ 注：Y表示C或T，R表示A或G。 A．限制酶作用于磷酸二酯键 B．一种限制酶可识别不止一种核苷酸序列 C．Alu Ⅰ切割后的DNA片段可用T4 DNA连接酶连接 D．将BamH Ⅰ和Sau3 A Ⅰ切割形成的片段连接后，一定能被这两种酶识别并切割 3．(2025·南通如皋一中月考)科研人员将四种酶的基因(EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR)与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接，构建多基因表达载体(载体中部分序列如图)，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是(　　) A．限制酶识别特定的序列具有专一性，DNA连接酶不具有专一性 B．在含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞未成功导入四种目的基因 C．OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板 D．利用PCR等技术检测OsGLO1基因是否转录时，需要的酶是Taq DNA聚合酶 4．(2026·湖北楚天协作体联考)如图是利用基因工程技术培育抗除草剂作物的部分过程，其中Pst Ⅰ、Sma Ⅰ、EcoR Ⅰ、Apa Ⅰ为四种限制酶，且切割DNA分子后形成的末端均不同。下列叙述正确的是(　　) A．图中质粒分子在Sma Ⅰ切割前后分别含有0或1个游离的磷酸基团 B．培育抗除草剂作物的核心是将含bar基因的表达载体导入受体细胞 C．可选用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ切割质粒和bar基因，确保目的基因正确插入 D．利用PCR技术可从分子水平检测bar基因是否翻译出抗除草剂蛋白 5．(2026·抚州阶段检测)如图表示培育转基因抗病毒农作物的过程，下列叙述正确的是(　　) A．过程a需要限制酶和DNA聚合酶的参与 B．过程b需要用CaCl2溶液处理，以提高农作物细胞壁的通透性 C．抗病毒基因一旦整合到农作物细胞的染色体上，就能正常表达 D．转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒进行鉴定 二、非选择题 6．(18分)(2026·河北示范高中联盟联考)如图是构建转基因大肠杆菌生产胰岛素所用的质粒和目的基因的结构。β-半乳糖苷酶在X-gal和IPTG存在的情况下，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。请据图完善下列操作步骤∶ (1)目的基因的筛选与获取：可以从__________(填“胰岛A细胞”或“胰岛B细胞”)中提取mRNA，逆转录获取cDNA，原因是______________________________________。 (2)基因表达载体的构建：为使目的基因与载体正确连接，最好选用限制酶________________切割质粒。为保证目的基因能和质粒连接，扩增目的基因时需在引物的________端添加相应序列，左侧引物上连接的序列是________________________________。 (3)将目的基因导入受体细胞：将重组DNA导入大肠杆菌细胞之前，需要用______处理大肠杆菌。 (4)目的基因的检测与鉴定：将目的基因导入受体细胞后，用选择培养基进行筛选，培养基中除大肠杆菌必需的营养物质外，还应加入______________________________。后续还需要进行分子水平的检测和个体水平的鉴定，其中检测目的基因是否完成表达的方法是_________。 (5)从基因改造角度分析，利用转基因技术生产胰岛素相比传统提取方法有哪些优点：________________________________________________________________________。 7．(22分)(2025·常州前黄高级中学月考)如图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程图。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源。该酵母菌体内无天然质粒，科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。已知当甲醇作为唯一碳源时，该酵母菌中AOX1基因受到诱导而表达，5′AOX1和3′AOX1(TT)分别是基因AOX1的启动子和终止子。请分析回答下列问题： (1)与大肠杆菌等原核生物相比，用巴斯德毕赤酵母作为基因工程的受体细胞，其优点是________________________________________________________________________。 (2)要获取HBsAg基因，可采取PCR技术进行大量扩增，其前提是_______________________。将HBsAg基因导入酵母菌前需完成基因表达载体的构建获取重组质粒，一是因为HBsAg基因片段小，在细胞中容易丢失；二是因为缺少____________，HBsAg基因在细胞中不能复制。 (3)为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该选择____________________酶切割质粒，并在HBsAg基因两侧的A和B位置接上________________________，确保定向连接。 (4)酶切获取HBsAg基因后，需用__________酶将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取________________。 (5)步骤3中应选用______________酶来切割重组质粒以获得重组DNA，然后再将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。 (6)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入______以便筛选，若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用______方法进行检测。转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入______以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。 重点强化练96　基因工程的工具与操作过程参考答案 (分值∶65分) (第1～5题，每题5分，共25分。) 一、选择题 1．(2026·吉安模拟)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作，下列叙述正确的是(　　) A．实验Ⅰ中，PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压蒸汽灭菌处理 B．实验Ⅰ中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源 C．实验Ⅱ中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA D．实验Ⅱ中，研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 答案　C 解析　PCR实验所需的移液器不能进行高压蒸汽灭菌(高温会损坏移液器)，枪头通常为一次性灭菌产品，A错误；凝胶电泳的正确操作是加样后再接通电源，若提前通电会导致电泳缓冲液受热或样品扩散，B错误；实验Ⅱ中，DNA在高盐溶液中溶解度高，加入等体积冷酒精(体积分数为95%)可降低DNA溶解度，使其析出，C正确；实验Ⅱ中，研磨液在4 ℃放置是为了沉淀蛋白质等杂质，应取上清液进行后续操作，若摇匀会重新混入杂质，D错误。 2．(2026·天津五区联考)如表是几种限制酶的识别序列及切割位点。据表分析，下列叙述错误的是(　　) 限制酶 Hind Ⅱ Alu Ⅰ BamH Ⅰ Sau3A Ⅰ 识别序列及切割位点 5′－GTY↓ RAC－3′ 5′－AG↓ CT－3′ 5′－G↓ GATCC－3′ 5′－↓ GATC－3′ 注：Y表示C或T，R表示A或G。 A．限制酶作用于磷酸二酯键 B．一种限制酶可识别不止一种核苷酸序列 C．Alu Ⅰ切割后的DNA片段可用T4 DNA连接酶连接 D．将BamH Ⅰ和Sau3 A Ⅰ切割形成的片段连接后，一定能被这两种酶识别并切割 答案　D 解析　Hind Ⅱ的识别序列为GTY↓RAC(Y为C或T，R为A或G)，可识别多种序列，B正确；Alu Ⅰ切割后产生平末端，T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端，C正确；BamH Ⅰ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组的，可能不包含BamH Ⅰ的完整识别位点，不能被BamH Ⅰ识别并切割，D错误。 3．(2025·南通如皋一中月考)科研人员将四种酶的基因(EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR)与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接，构建多基因表达载体(载体中部分序列如图)，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是(　　) A．限制酶识别特定的序列具有专一性，DNA连接酶不具有专一性 B．在含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞未成功导入四种目的基因 C．OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板 D．利用PCR等技术检测OsGLO1基因是否转录时，需要的酶是Taq DNA聚合酶 答案　C 解析　限制酶识别特定的序列具有专一性，而DNA连接酶能连接任意两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段，但仍具有专一性，A错误；含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞可能未成功导入表达载体，但不能确定未成功导入四种目的基因，B错误；转录时RNA聚合酶和模板链的3′端结合，沿子链5′→3′延伸，而图中OsGLO1基因和EcCAT基因的启动子结合部位是相反的，所以OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板，C正确；利用 PCR 等技术检测OsGLO1 基因是否转录时，检测的是RNA，需要的酶是逆转录酶，D错误。 4．(2026·湖北楚天协作体联考)如图是利用基因工程技术培育抗除草剂作物的部分过程，其中Pst Ⅰ、Sma Ⅰ、EcoR Ⅰ、Apa Ⅰ为四种限制酶，且切割DNA分子后形成的末端均不同。下列叙述正确的是(　　) A．图中质粒分子在Sma Ⅰ切割前后分别含有0或1个游离的磷酸基团 B．培育抗除草剂作物的核心是将含bar基因的表达载体导入受体细胞 C．可选用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ切割质粒和bar基因，确保目的基因正确插入 D．利用PCR技术可从分子水平检测bar基因是否翻译出抗除草剂蛋白 答案　C 解析　质粒为环状DNA，Sma Ⅰ切割后形成线性DNA，含2个游离的磷酸基团，A错误；基因工程的核心是构建基因表达载体，B错误；Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ切割可避免质粒自身环化和目的基因反向连接，C正确；PCR检测目的基因是否导入或转录，抗原－抗体杂交检测目的基因是否翻译出蛋白质，D错误。 5．(2026·抚州阶段检测)如图表示培育转基因抗病毒农作物的过程，下列叙述正确的是(　　) A．过程a需要限制酶和DNA聚合酶的参与 B．过程b需要用CaCl2溶液处理，以提高农作物细胞壁的通透性 C．抗病毒基因一旦整合到农作物细胞的染色体上，就能正常表达 D．转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒进行鉴定 答案　D 解析　图中过程a为构建基因的表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，A错误；CaCl2溶液处理能提高农杆菌细胞细胞壁的通透性，B错误；抗病毒基因整合到农作物细胞的染色体上，不一定就能正常表达，因为基因表达受到多种因素的调控，C错误；转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒进行鉴定，观察农作物是否被感染，D正确。 二、非选择题 6．(18分)(2026·河北示范高中联盟联考)如图是构建转基因大肠杆菌生产胰岛素所用的质粒和目的基因的结构。β-半乳糖苷酶在X-gal和IPTG存在的情况下，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。请据图完善下列操作步骤∶ (1)目的基因的筛选与获取：可以从__________(填“胰岛A细胞”或“胰岛B细胞”)中提取mRNA，逆转录获取cDNA，原因是______________________________________。 (2)基因表达载体的构建：为使目的基因与载体正确连接，最好选用限制酶________________切割质粒。为保证目的基因能和质粒连接，扩增目的基因时需在引物的________端添加相应序列，左侧引物上连接的序列是________________________________。 (3)将目的基因导入受体细胞：将重组DNA导入大肠杆菌细胞之前，需要用______处理大肠杆菌。 (4)目的基因的检测与鉴定：将目的基因导入受体细胞后，用选择培养基进行筛选，培养基中除大肠杆菌必需的营养物质外，还应加入______________________________。后续还需要进行分子水平的检测和个体水平的鉴定，其中检测目的基因是否完成表达的方法是_________。 (5)从基因改造角度分析，利用转基因技术生产胰岛素相比传统提取方法有哪些优点：________________________________________________________________________。 答案　(1)胰岛B细胞　因为基因的选择性表达，只有胰岛B细胞中的胰岛素合成基因才会转录出mRNA　(2)XhoⅠ和 MunⅠ　5′　5′－CTCGAG－3′　(3)Ca2＋　(4)X-gal、IPTG、氨苄青霉素　抗原—抗体杂交　(5)能大规模培养，持续、高效地生产胰岛素；可降低生产成本；能保证胰岛素的纯度和质量 解析　(1)只有胰岛B细胞能表达胰岛素基因(基因选择性表达，其他细胞中胰岛素基因不转录)，因此从胰岛B细胞中提取mRNA，经逆转录获取cDNA。(2)基因表达载体的构建：为使目的基因与载体正确连接，不能选择Sal Ⅰ和Nhe Ⅰ，因为该限制酶会破坏胰岛素基因；不能选择限制酶EcoR Ⅰ，会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此只能选择Xho Ⅰ和 Mun Ⅰ来切割质粒。因为DNA复制从5′端向 3′端延伸，因此需在引物的5′端添加限制酶识别序列。为保证目的基因能和质粒连接，左侧引物需匹配质粒的Xho Ⅰ位点，故添加序列为5′－CTCGAG－3′。(3)要将目的基因导入大肠杆菌，需用 Ca2＋(或 CaCl2)处理大肠杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。(4)将目的基因导入受体细胞后，用选择培养基进行筛选，培养基中除大肠杆菌必需的营养物质外，还需加入氨苄青霉素(筛选含抗性基因的细胞)、X-gal 和 IPTG(利用 β-半乳糖苷酶特性：重组质粒插入目的基因会破坏LacZ，菌落呈白色；未插入则LacZ正常，菌落呈蓝色)。 检测表达(蛋白质水平)的方法是用抗原—抗体杂交法。(5)与传统 “从动物胰腺提取胰岛素” 相比，转基因技术能大规模培养，持续、高效地生产胰岛素；可降低生产成本；能保证胰岛素的纯度和质量。 7．(22分)(2025·常州前黄高级中学月考)如图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程图。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源。该酵母菌体内无天然质粒，科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。已知当甲醇作为唯一碳源时，该酵母菌中AOX1基因受到诱导而表达，5′AOX1和3′AOX1(TT)分别是基因AOX1的启动子和终止子。请分析回答下列问题： (1)与大肠杆菌等原核生物相比，用巴斯德毕赤酵母作为基因工程的受体细胞，其优点是________________________________________________________________________。 (2)要获取HBsAg基因，可采取PCR技术进行大量扩增，其前提是_______________________。将HBsAg基因导入酵母菌前需完成基因表达载体的构建获取重组质粒，一是因为HBsAg基因片段小，在细胞中容易丢失；二是因为缺少____________，HBsAg基因在细胞中不能复制。 (3)为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该选择____________________酶切割质粒，并在HBsAg基因两侧的A和B位置接上________________________，确保定向连接。 (4)酶切获取HBsAg基因后，需用__________酶将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取________________。 (5)步骤3中应选用______________酶来切割重组质粒以获得重组DNA，然后再将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。 (6)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入______以便筛选，若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用______方法进行检测。转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入______以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。 答案　(1)蛋白质合成后，酵母细胞可以在内质网和高尔基体中对其进行加工和修饰并分泌到细胞外，便于提取　(2)有一段已知的HBsAg基因的核苷酸序列来合成引物　复制原点　(3)SnaBⅠ和AvrⅡ　SnaBⅠ、AvrⅡ限制酶识别序列　(4)DNA连接　大量重组质粒　(5)BglⅡ　(6)卡那霉素　分子杂交 /PCR/RT－PCR　甲醇 解析　(1)巴斯德毕赤酵母菌为真核细胞，蛋白质合成后，酵母菌细胞可以在内质网和高尔基体中对其进行加工和修饰并分泌到细胞外，便于提取，与大肠杆菌等原核生物相比，这是用巴斯德毕赤酵母菌作为基因工程的受体细胞的优点。(2)要获取HBsAg基因，可采取PCR技术进行大量扩增，其前提是有一段已知的HBsAg基因的核苷酸序列来合成引物。将HBsAg基因导入酵母菌前需完成基因表达载体的构建获取重组质粒，一是因为HBsAg基因片段小，在细胞中容易丢失；二是因为缺少复制原点，HBsAg基因在细胞中不能复制。(3)图中质粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ和SacⅠ限制酶切割位点，其中SacⅠ位于启动子上，BglⅡ位于终止子上。如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割质粒，所以应在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaBⅠ、AvrⅡ限制酶识别序列。这两种酶切割产生的黏性末端不同，这样可以避免质粒和目的基因自身环化，还可以防止目的基因和质粒反向连接，确保定向连接。(4)获取目的基因后，需要用DNA连接酶将目的基因和载体连接形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取大量重组质粒。(5)步骤3是要获取含有5′AOX1－3′AOX1段基因，对应重组质粒中限制酶切割位点，可知应选用限制酶BglⅡ来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。(6)5′AOX1－3′AOX1段基因含有卡那霉素抗性基因，因此在培养基中加入卡那霉素以便筛选导入重组DNA的目的菌。若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用分子杂交方法进行检测。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，同时甲醇能诱导AOX1基因表达，因此转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。 . 学科网（北京）股份有限公司 $