2027届高考生物人教版一轮复习基因工程易错题01 限制酶的选择

易错点1 限制酶的选择

 

知识点一 限制酶选择原则

1.相关背景知识

（1）限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。一种限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

（2）当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。

（3）DNA连接酶的作用是：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

（4）E.coliDNA连接酶和E.coliDNA连接酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，但E.coliDNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。

（5）单酶切易出现目的基因与质粒的反向连接和自身环化，双酶切优点利于目的基因与质粒正确连接，避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接
（6）不同种限制性内切核酸酶识别序列各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端，则称为同尾酶。由同尾酶酶切产生的DNA片段，能够通过黏性末端的互补作用而彼此连接起来。一般情况下，同尾酶产生的黏性末端连接后不能再被原来的限制酶切割，这是因为同尾酶产生的黏性末端连接后原来的识别序列可能已不复存在。

2.限制酶的选用原则通常是：

①限制酶的切割位点应位于启动子和终止子之间；

②运载体上的复制原点、启动子、终止子不能有任何限制酶切割位点，必须保证完整；

③双抗性标记基因共存于运载体上时，需要选择性破坏其中一个。

④根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为Xba Ⅰ和Sac Ⅰ)。

例题1  THP9基因是野生玉米中控制高蛋白含量的优良基因，研究者利用基因工程技术将THP9基因转到玉米细胞内，从而获得转基因高蛋白玉米新品种。已知图中THP9基因转录的方向为从左往右。下列相关叙述正确的是（    ）

EcoRⅠ

BamHⅠ

KpnⅠ

MfeⅠ

HindⅢ

A．若采用PCR技术对一个THP9基因进行扩增，则第n代复制共需要引物2n-1个

B．构建基因表达载体时，用Mfe Ⅰ、Hind Ⅲ切割质粒，用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ切割目的基因

C．利用PCR技术获取THP9基因时应选择引物1和引物4

D．PCR过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg2+用于激活RNA聚合酶

答案 B

 

例题2 (2024·全国甲，38节选)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，构建重组质粒时，与 用 酶  a单 酶 切 相 比，  用 酶a和 酶b双 酶 切 的 优 点 体 现 在_______(答出两点即可):

答案：避免目的基因和质粒的反向连接、防止目的基因和质粒的自身环化

例题3 (2022-福建，13节选)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。用XhoI和SalI分别酶氨苄青霉素切CD₁4和图中载体连接，CD₁4接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶②对抗性基因CD14表达载体的连接方向进行鉴定,理由是：                                 

 

答案：正向连接的重组DNA有这两种酶的酶切位点，而反向连接会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点

 

例题4.(2025·河南卷，21节选)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题：

(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是__________________________________________________。

将培养后的菌液混匀并充分________，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。

(2)   为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1)，对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有________酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是_____________________________________________________。

限制酶的识别序列和切割位点如下：

(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要选用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是___________________________________________________________________

_____________________________________________________________________，

随后在含________和________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。

答案　(1)在富含卡拉胶的环境中，存在能够降解卡拉胶的微生物的可能性较大　稀释  (2)BamH Ⅰ　重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列　(3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　卡拉胶　四环素

 

例题5 Gata3蛋白由444个氨基酸构成，属于锌指转录因子家族成员的一部分。研究显示Gata3基因是大量肿瘤细胞的潜在突变位点。为研究Gata3蛋白在细胞中的定位，科研人员将GFP（绿色荧光蛋白）基因与Gata3基因融合，形成Gata3-GFP融合基因。为获得转入Gata3-GFP融合基因的纯合小鼠，科研人员将绿色荧光蛋白基因 （GFP）插入含Gata3基因的载体中，然后导入小鼠受精卵，获得能正常表达融合蛋白的杂合雌、雄小鼠各一只。利用荧光蛋白活体成像系统进行检测，显示两只小鼠均为Gata3-GFP融合基因阳性转入小鼠。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图甲所示，A、B、C、F、R为不同引物。