2027届高考生物人教版一轮复习基因工程易错题01 限制酶的选择

**基本信息** 聚焦限制酶选择的系统性方法训练，融合原理推导与实践应用，构建"背景知识-选择原则-题型突破"的完整逻辑链。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |限制酶选择原则|7题（含5道高考真题）|双酶切防反向连接与自环化、同尾酶应用策略、功能元件保护法则|以酶切位点选择为核心，串联DNA连接酶特性、载体结构分析等知识，形成从分子机制到工程应用的科学思维链|

易错点1 限制酶的选择 知识点一 限制酶选择原则 1.相关背景知识 （1）限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。一种限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 （2）当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。 （3）DNA连接酶的作用是：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 （4）E.coliDNA连接酶和E.coliDNA连接酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，但E.coliDNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。 （5）单酶切易出现目的基因与质粒的反向连接和自身环化，双酶切优点利于目的基因与质粒正确连接，避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接 （6）不同种限制性内切核酸酶识别序列各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端，则称为同尾酶。由同尾酶酶切产生的DNA片段，能够通过黏性末端的互补作用而彼此连接起来。一般情况下，同尾酶产生的黏性末端连接后不能再被原来的限制酶切割，这是因为同尾酶产生的黏性末端连接后原来的识别序列可能已不复存在。 2.限制酶的选用原则通常是： ①限制酶的切割位点应位于启动子和终止子之间； ②运载体上的复制原点、启动子、终止子不能有任何限制酶切割位点，必须保证完整； ③双抗性标记基因共存于运载体上时，需要选择性破坏其中一个。 ④根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为Xba Ⅰ和Sac Ⅰ)。 例题1 THP9基因是野生玉米中控制高蛋白含量的优良基因，研究者利用基因工程技术将THP9基因转到玉米细胞内，从而获得转基因高蛋白玉米新品种。已知图中THP9基因转录的方向为从左往右。下列相关叙述正确的是（    ） EcoRⅠ BamHⅠ KpnⅠ MfeⅠ HindⅢ A．若采用PCR技术对一个THP9基因进行扩增，则第n代复制共需要引物2n-1个 B．构建基因表达载体时，用Mfe Ⅰ、Hind Ⅲ切割质粒，用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ切割目的基因 C．利用PCR技术获取THP9基因时应选择引物1和引物4 D．PCR过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg2+用于激活RNA聚合酶 答案 B 例题2 (2024·全国甲，38节选)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，构建重组质粒时，与 用 酶 a单 酶 切 相 比， 用 酶a和 酶b双 酶 切 的 优 点 体 现 在_______(答出两点即可): 答案：避免目的基因和质粒的反向连接、防止目的基因和质粒的自身环化 例题3 (2022-福建，13节选)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。用XhoI和SalI分别酶氨苄青霉素切CD₁4和图中载体连接，CD₁4接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶②对抗性基因CD14表达载体的连接方向进行鉴定,理由是： 答案：正向连接的重组DNA有这两种酶的酶切位点，而反向连接会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点 例题4.(2025·河南卷，21节选)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是__________________________________________________。 将培养后的菌液混匀并充分________，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2) 为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1)，对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有________酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是_____________________________________________________。 限制酶的识别序列和切割位点如下： (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要选用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是___________________________________________________________________ _____________________________________________________________________， 随后在含________和________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 答案　(1)在富含卡拉胶的环境中，存在能够降解卡拉胶的微生物的可能性较大　稀释 (2)BamH Ⅰ　重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列　(3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　卡拉胶　四环素 例题5 Gata3蛋白由444个氨基酸构成，属于锌指转录因子家族成员的一部分。研究显示Gata3基因是大量肿瘤细胞的潜在突变位点。为研究Gata3蛋白在细胞中的定位，科研人员将GFP（绿色荧光蛋白）基因与Gata3基因融合，形成Gata3-GFP融合基因。为获得转入Gata3-GFP融合基因的纯合小鼠，科研人员将绿色荧光蛋白基因 （GFP）插入含Gata3基因的载体中，然后导入小鼠受精卵，获得能正常表达融合蛋白的杂合雌、雄小鼠各一只。利用荧光蛋白活体成像系统进行检测，显示两只小鼠均为Gata3-GFP融合基因阳性转入小鼠。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图甲所示，A、B、C、F、R为不同引物。 （1）在PCR反应溶液中常添加Mg2+，其作用是___________。在利用PCR扩增GFP编码区序列的过程中，需要设计引物F和R，在两个引物的（填“3'”或“5'”）___________端需分别插入 ___________的限制酶识别序列，以使GFP基因能正确插入载体中。 （2）在GFP基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要的酶有___________。 （3）将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠 （P）进行杂交获得F1若干，研究人员从这些小鼠中提取Gata3基因相关DNA片段，设计引物A和C用于PCR扩增，扩增产物电泳结果如图乙所示，则___________小鼠是Gata3—GFP基因纯合子小鼠；若用引物A和B进行PCR扩增，___________（填“能”或“不能”）通过条带数目区分GFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子，原因是___________。 （4）DNA分子原位杂交也是基因定位的常用技术，分子杂交需使用特定序列的单链DNA（ss—DNA）作为分子探针，为制备大量单链DNA片段，研究人员常采用不对称PCR技术。其基本原理是采用不等量的一对引物，经若干次循环后，低浓度的引物（限制性引物）被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物（非限制性引物）的延伸产物，结果可获得大量ss—DNA．若反应体系中原有100个模板DNA，最初10个循环后限制性引物耗尽，再进行20个循环，理论上可制备ss—DNA ___________个（不考虑长度差异，可用科学计数法表示），在PCR的其他条件均适宜，引物总量一定的前提下，30个循环后最终中 ss——DNA的产生量主要受___________的影响。 答案：（1）激活DNA聚合酶的活性 5' SalⅠ、EcoRⅠ （2）TaqDNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶）、DNA连接酶、限制酶 （3）1和5 不能 两种阳性小鼠提取的相关DNA片段扩增产物的电泳结果均只有一条条带 （4）2.048×106 限制性引物和非限制性引物的比例 例题6 利用基因工程技术培育出油脂高产的四尾栅藻，是获取生物柴油的新途径。科学家欲从紫苏中提取DGAT1 基因（催化油脂合成的关键酶基因），导入到四尾栅藻细胞，获得转基因油脂高产的四尾栅藻，质粒pCAMBIA与PCR扩增出的DGATI酶切位点如图所示。现有BamHⅠ、BgIⅡ、EcoRⅠ三种限制酶，它们识别并切割的碱基序列如图，分析回答： （1）从紫苏组织细胞中提取总RNA时，需要加入RNA酶抑制剂，目的是_________。过程①需要_________酶的催化，过程②通过PCR技术实现，进行PCR时，需要在两种引物的_________端（填5’或3’）添加限制酶 BgIⅡ的识别序列。 （2）启动子往往具有物种特异性，在载体pCAMBIA质粒中插入紫苏DGAT1基因，其上游启动子应选择_________（填“紫苏”、“大肠杆菌”或“四尾栅藻”）启动子。 （3）用限制酶 BglⅡ切割 DGAT1，用限制酶_________切割 pCAMBlA，将充分酶切后的产物混合，加入 DNA连接酶进行连接。若只考虑DNA片段的两两连接，可得到_________种大小不同的连接产物。利用连接产物对大肠杆菌实施转化和筛选，筛选出的重组质粒不一定符合要求，原因是____________________. （4）为进一步筛选出符合要求的重组质粒，选用限制酶EcoRⅠ对不同的重组质粒进行酶切处理，得到的电泳结果如图所示，其中_________组重组质粒为所需质粒。（已知质粒pCAMBIA中EcoRI的酶切位点与BamHⅠ 的酶切位点间的最短距离为600bp） 答案：（1）防止RNA酶降解RNA；　　逆转录；　　5' ； （2）四尾栅藻； （3）BamH I；　　3；　　重组质粒有正向连接和反向连接两种情况； （4）A 例题7 为响应国家“藏粮于地、藏粮于技”战略，中国农科院利用野生耐盐水稻中的耐盐基因 T、盐生植物碱蓬中的耐盐基因X，培育出的“海稻86”可在6‰甚至8‰的盐度下生长，远超普通水稻3‰的耐盐极限。回答下列问题： （1）科学家常常利用PCR 技术快速获取耐盐基因。PCR 反应体系配方中需要加入扩增缓冲液、4种脱氧核苷酸、水、模板DNA、______和______。PCR通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，该过程利用的原理是______。 （2）将耐盐基因X转入已连接基因T 的 Ti质粒p1300-T（如图甲（上，构建表达载体p1300-TX，该表达载体中的启动子1位于基因T的上游，启动子是______识别和结合的部位。为使基因 X（如图乙，箭头所指为相关限制酶的切割位点（正确、高效插入质粒 p1300-T的适宜位点，可选择限制酶______同时处理基因X 和p1300-T。 （3）将基因表达载体p1300—TX导入农杆菌，选出携带重组质粒的农杆菌转化水稻愈伤组织。农杆菌侵染水稻细胞时，外源基因可以进入水稻细胞内并维持稳定，原因是______。 （4）目的基因进入受体细胞后，可通过______技术，检测基因是否成功翻译出对应蛋白。若要通过对照实验在个体生物学水平鉴定转基因耐盐水稻是否培育成功，实验思路是______。 答案：（1） ①. Taq 酶（热稳定 DNA 聚合酶 ） ②. 引物 ③. DNA 的热变性（高温解旋，低温复性 ） （2） ①. RNA 聚合酶 ②. Hind Ⅲ 和 BamH Ⅰ （3）农杆菌的 Ti 质粒上的 T - DNA 可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的 DNA 上 （4） ①. 抗原 — 抗体杂交： ②. 将转基因水稻和普通水稻分别种植在高盐环境（6‰ - 8‰盐度 ）中，观察生长状况 1 学科网（北京）股份有限公司 $