2026届高考生物学人教版一轮复习《第3.1节 重组基因技术的基本工具》分层练

第3章 基因工程 第3.1节 重组基因技术的基本工具 Ⅰ.必备知识，紧扣教材 1.根据你所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗? 2.DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ 3.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 ( ) A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D，只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 4.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是 ( ) A. 大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C.A段的黏末端 D.用来识别特定基因的DNA探针 5.结合你所学知识，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子? 6.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶制酶的识别序列和切割位点如下。 HindⅢ、XhoI、EcoRV和XbaI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 Spel 5'-ACTAGT-3' Hind Ⅲ 5'-AAGCTT- 3' 3'-TGATCA-5' 3'-TTCGAA-5 XhoI 5'-CTCGAG-3' EcoRV 5'-GATATC-3' XbaI 5'-TCTAGA- 3' 3'-GAGCTC-5' 3'-CTATAG-5' 3'-AGATCT-5 (1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接?为什么? (2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义? Ⅱ、真题演练，提升能力 1.（2024·湖南）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 2.（多选·2025·江苏）图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（    ） A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 3.（2025·山东）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 Ⅲ.自主作业，个性发展 1.根据你的理解，绘制本节内容的概念图。 2.可以从近5年全国各地真题卷中寻找一道你认为最经典的与本节内容相关的题，尝试分析考查的必备知识是什么？ 参考答案 第3章 基因工程 第3.1节 重组基因技术的基本工具 Ⅰ.必备知识，紧扣教材 1.答：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一套防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。 2.答：不是一回事。虽然DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化磷酸二酯键形成的酶，但两者存在显著的区别。 (1)DNA聚合能催化单个核苷酸加到已有的核酸片段3'末端的羟基上，形成磷酸二酯键;而DNA连接酶是催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是催化单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二段之间形成磷酸二酯键。 (2)DNA聚合酶以一条DNA链为模板，催化形成与模板链互补的DNA链;而DNA连接酶催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，它不需要模板。 此外，两者虽然都是蛋白质，但它们的组成和性质各不相同。 3.C 4.A 5.答：细菌中的限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌含有某种限制酶，它自身的DNA也不会被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。6.(1)XbaI。 因为Xbal与Spe切割产生了相同的黏性末端。 (2)答：提示识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断;这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。 Ⅱ、真题演练，提升能力 1.【答案】B 【分析】酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数是蛋白质，少部分是RNA，酶具有特异性、高效性、易受环境因素影响等特点。限制酶特异性识别并切割DNA上的特定位点。 【详解】A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确； B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误； C、质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确； D、质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。故选B。 2.【答案】BD 【分析】“分子手术刀”——限制酶：（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，即黏性末端和平末端。 【详解】A.对比 A 基因和 a 基因的序列，A 基因中 “AAGCTT” 变为 a 基因中 “AAGCTG” ，是碱基替换（T→G），并非碱基增添，A 错误；B.HindⅢ 切割产生黏性末端，AluⅠ 切割后产生的是平末端，二者末端类型不相同，B正确；C.a基因中有2个Hind Ⅲ切割位点，切割后产生3个片段，有3个Alu Ⅰ切割位点，切割后产生4个片段，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致，C错误；D.因为正常基因A和致病基因a的 HindⅢ 切割位点数量不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用 HindⅢ 限制酶开展酶切鉴定，D正确。故选BD。 3.【答案】(1)复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp (2) 4 环化 测序和序列比对 (3)不能 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。 （2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。 （3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 Ⅲ.自主作业，个性发展 第 1 页 共 6 页 学科网（北京）股份有限公司 $