福建省福清第一中学2025-2026学年高三上学期生物校本15基因工程练习

**基本信息** 聚焦基因工程载体构建的酶切策略与检测方法，系统整合单酶切正反接的PCR/电泳鉴定及同尾酶应用，形成“原理-操作-检测”完整逻辑链。 **综合设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |单酶切正反接检测|选择2题、非选3题|PCR用特定引物对扩增产物长度差异鉴定；电泳用双酶切条带差异区分|从限制酶作用原理到单酶切自连问题，推导正反接检测的PCR引物设计与电泳酶切位点选择逻辑| |双酶切与同尾酶应用|非选2题|同尾酶黏性末端互补连接后原酶切位点消失，可被短识别序列酶切割|基于酶切位点序列特征，构建“识别序列-黏性末端-连接后位点变化”的工具酶特性认知链| |载体构建与表达验证|非选6题|启动子选择匹配受体细胞，标记基因用于筛选，抗体杂交检测表达|遵循“载体元件功能-构建策略-导入筛选-表达验证”的基因工程操作流程，体现结构与功能观|

福清一中2025-2026高三上生物校本15 基因工程 　单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测 1.γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如下图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是(　　) A.图中表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B.E.coliB发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能 C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ－氨基丁酸 D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 2.荧光定量PCR技术是在常规PCR的基础上，加入与模板DNA某条链互补的荧光探针(一类两端经过特殊基团修饰的单链DNA片段)，当子链延伸至探针处时DNA聚合酶会水解掉探针一端并生成荧光分子，使荧光监测系统接收到荧光信号，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成，原理如图所示。下列有关叙述正确的是(　　) A.该项技术可用来直接检测样本中流感病毒核酸的含量 B.1个双链DNA分子经过3轮循环一共会生成8个荧光分子 C.1个双链DNA分子经过5轮循环一共需要消耗15对引物 D.该PCR技术中DNA聚合酶既催化形成磷酸二酯键又催化断裂磷酸二酯键 1.利用单酶切法和双酶切法构建基因表达载体 提醒　关于同尾酶及切割连接 不同种限制性内切核酸酶识别序列各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端，则称为同尾酶。如BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ、XhoⅡ为一组同尾酶，它们的识别序列和切割位点依次分别是5′­G↓GATCC­3′、5′­T↓GATCA­3′、5′­A↓GATCT­3′、5′­↓GATC­3′、5′­R↓GATCY－3′，它们切割DNA后都形成由GATC组成的黏性末端。 由同尾酶酶切产生的DNA片段，能够通过黏性末端的互补作用而彼此连接起来。一般情况下，同尾酶产生的黏性末端连接后不能再被原来的限制酶切割，这是因为同尾酶产生的黏性末端连接后原来的酶切位点将不复存在，故不能被原来的限制酶切割，但可以被识别序列短的限制酶切割，如被上述Sau3A Ⅰ识别并切割。 2.单酶切法中正向连接与反向连接的检测 (1)利用PCR进行检测 方法：用特定的引物对正向连接和反向连接的重组质粒进行PCR扩增，二者得到的扩增产物长度不同。如图中，选用引物a、b可扩增出1 100 bp长度的产物，用引物a、c无法扩增出产物，则为正向连接；选用引物a、b无法扩增出产物，用引物a、c可扩增出1 000 bp长度的产物，则为反向连接。 (2)利用电泳进行检测 方法：用特定的限制酶对正向连接和反向连接的重组质粒进行切割，对产物进行电泳，二者得到的条带存在差异。如图中，用BglⅡ和Hind Ⅰ进行双酶切，电泳后若出现1 100 bp条带，则为正向连接；电泳后若出现1 000 bp条带，则为反向连接。 1.科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有______________________________________ _______________________(答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 2.GDNF是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体(如图1所示)，并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答： (1)在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是_________________________ ______________。 (2)构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的____________限制酶进行酶切。 (3)经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有3种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接(如图1所示)。为鉴定这3种连接方式，选择HpaⅠ酶和BamHⅠ酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第________泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。 (4)将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的________与提取的蛋白质杂交。当培养的神经干细胞达到一定密度时，需进行________培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。 3.如图是构建基因表达载体的示意图，回答下列问题： (1)基因工程操作中的核心步骤是______________。重组质粒载体的核心部件有目的基因、启动子、________、________、复制原点等。 (2)引物是一小段能与________碱基互补配对的单链DNA。图中合成引物时，在引物5′端添加限制酶识别序列的原因是_________________________ _________________________________________。 (3)PCR扩增目的基因需在一定的缓冲溶液中进行，反应体系中需添加模板DNA、引物、耐高温的DNA聚合酶和________等。PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋，以激活________。PCR反应完成后，常采用____________________技术来鉴定PCR的产物。 (4)构建基因表达载体时，选用双酶切切割质粒载体和目的基因的目的有__________________________ _________________________________(写出两点)， 图中的T4 DNA连接酶能使目的基因片段和质粒载体片段之间形成____________键。 4. PCR可用于扩增并检测DNA，但存在交叉污染或偏差等问题，而新研发的基于CRISPR/Cas12a系统的检测方法，可在低浓度样本中更灵敏，快速识别靶标DNA。该系统利用gRNA介导Cas12a蛋白能准确切割靶标DNA。同时切割荧光底物使其发出荧光，通过检测荧光强度确定靶标DNA含量，利用Cas12a检测靶标DNA的过程如图所示。回答： (1)根据图中信息可推测Cas12a作用于靶标DNA时，具有类似________酶和________酶的功能；gRNA识别靶标DNA，遵循的是__________原则。 (2)在构建表达Cas12a蛋白的载体时，通常是将Cas12a基因插入到LacZ基因内，使LacZ基因失活，从而失去催化无色底物显色的能力，AmpR为氨苄青霉素抗性基因。理论上通过含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基培养，不能筛选到含有Cas12a基因表达载体的工程菌，判断的依据是 ____________________________________________ _____________________________________________ _______________________________________。 (3)荧光检测时，60分钟后三组荧光信号强度达到一致，原因是_________________________________ ________________________________________。 (4)实验研究时，增加NTC组作对照的作用是______________________________________________________________________________________； g－3＋g－7组可更快检测出靶标DNA，原因是______________________________________________________________________________________。 5.研究人员利用水稻细胞培育能产生人HIV抗体2G12的水稻胚乳细胞生物反应器，其基本流程包括基因表达载体的构建、农杆菌转化、水稻细胞转化、转基因植株的筛选等。 (1)为成功构建基因表达载体，需在人工合成的人HIV抗体2G12基因首端添加启动子，你的选择是________(填字母)，依据是_______________。 A.人B细胞启动子 B.HIV启动子 C.水稻胚乳细胞启动子 D.农杆菌启动子 (2)潮霉素对原核细胞和真核细胞的生长都有抑制作用。据此分析，如图所示重组T－DNA片段中潮霉素抗性基因为基因表达载体中的________，其作用是________________________________。 (3)目的基因插入染色体的具体位置通常具有不确定性，可采用反向PCR技术检测。如图是利用这一技术分析人HIV抗体2G12基因插入染色体位置的流程图。 欲得到图中环状DNA，过程Ⅰ酶切时_______(填“能”或“不能”)利用不同限制酶。由图中环状DNA至少经过_____轮循环才能得到图示链状产物。 (4)与其他工程技术相比，利用水稻生产人HIV抗体2G12的优势有___________________________ _____________________________(答两点即可)。 6.研究人员欲比较大肠杆菌YT1和芽孢杆菌YP1两类细菌降解塑料中聚乙烯(PE)的能力，并通过基因工程拼接黄粉虫肠道内菌株WZ降解塑料中聚氯乙烯(PVC)的胞外酶基因A，培育降解塑料的“超级菌”。请回答下列问题： (1)菌株的筛选。配置固体培养基，接种菌株后表层覆盖0.1 mm厚度的PE塑料，分组实验，结果如图所示： 培养基及 接种菌株 培养基1 培养基2 培养基3 单独培养并接种YT1 单独培养并接种YP1 混合培养YT1和YP1后，选取YP1接种 降解圈直径R1/cm 1.22 1.55 1.43 菌落R2/cm 0.35 0.55 0.43 R1/R2 3.5 2.8 3.3 从功能上讲，该培养基属于________培养基。培养基3中接种混合培养后的YP1，与单独培养并接种YP1比较，降解PE的能力________，其原因可能是_________________________________。 (2)培育“超级菌”。对菌株WZ的A基因测序可知，如果在其调节功能区增加一个碱基对A/T，则可以大大增强其基因表达能力。通过经典的大引物PCR定点诱变技术在体外改造A基因，操作过程如图1。改造A基因与图2所示的质粒构建表达载体，培育“超级菌”。 ①通过PCR1构建大引物：需要两步，先后使用的引物分别是________。PCR中引物的作用是_________________________________________。 ②通过PCR2获得完整的改良的A基因。 ③构建改良基因表达载体：为实现质粒和改良基因的准确连接，应选用的限制酶是________。 ④将表达载体导入受体菌株。 ⑤检测和鉴定：在含氨苄青霉素和β－半乳糖苷的平板上培养一段时间后，其中含有重组质粒，判断的依据是_______________________________ _________________________________________。 答案 热点1 深研真题·领悟考法 1.A　 2.D 解题觉醒·融会贯通 1.(1)RNA聚合酶　复制原点、标记基因、限制酶切割位点 (2)F1和R2或者F2和R1　a链 (3)J－V5融合蛋白　不是 2.(1)使细胞分散开　(2)XhoⅠ　(3)②　(4)抗体　传代 3.(1)构建基因表达载体　终止子　标记基因 (2)目的基因(或DNA母链)　使扩增的目的基因含有限制酶的识别序列，便于切割后与载体连接并且不影响目的基因的复制　(3)4种脱氧核苷酸　DNA聚合酶　琼脂糖凝胶电泳　(4)保证目的基因片段插入的方向正确、防止质粒载体或目的基因的自连　磷酸二酯 4.(1)限制　解旋　碱基互补配对　　 (2)使用的培养基中不含无色底物，所以在含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基上长出的菌落，无论Cas12a基因是否成功导入都不会出现显色反应 (3)Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光的物质含量相同 (4)排除其他物质介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光　g－3＋g－7组在介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光方面具有协同作用 5. (1)C　水稻胚乳细胞启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录 (2)标记基因　鉴别和筛选成功导入人HIV抗体2G12基因的农杆菌和水稻细胞 (3)能　3 (4)产量高；成本低；不受性别限制；不需要专业培养设备 6.(1)选择　增大/增强　YP1和YT1混合培养过程中，YP1菌株整合了YT1的对PE塑料高分解力的基因，发生了转化　(2)①诱变引物和引物1　使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　③XmaⅠ和BglⅡ　⑤含有改良基因A的重组质粒不含有完整的LacZ基因，受体菌不能合成分解β－半乳糖苷而使培养基变蓝的酶 学科网（北京）股份有限公司 $