2026届高三生物一轮复习基因工程练习

**基本信息** 聚焦基因工程核心技术，以"工具-操作-应用"为主线，通过16个基础知识点+19道典型例题，系统构建从原理到实践的解题方法体系，强化科学思维与探究实践能力。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |工具与操作|5题（例1/2/7）|双酶切防环化/反向连接、同尾酶替换策略、Ca²⁺转化法步骤|从限制酶特性→载体构建→重组DNA技术，形成操作工具链逻辑| |目的基因获取与检测|6题（例3/5/9）|PCR扩增鉴定、启动子功能验证、荧光标记定位法|目的基因筛选→表达载体构建→分子水平检测的完整流程| |应用与实验设计|8题（例4/6/18）|基因敲除株构建、铁离子竞争实验设计、CAR-T细胞特异性验证|从基础技术→疾病防治→环境治理，体现生命观念与社会责任|

基因工程 相关背景知识 1.基因工程的操作水平为DNA分子水平，变异原理是基因重组 2.重组DNA技术的基本工具有限制酶、DNA连接酶和载体 3.限制酶主要来源为原核生物，其特点是能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 4.在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端 5.E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于T4 DNA连接酶 6.载体特点：有一个至多个限制酶切割位点，携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制 7.标记基因的作用是便于重组DNA分子的筛选 8.双酶切法的优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连 9.当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。 10.基因工程的基本操作程序：目的基因的筛选与获取；基因表达载体的构建（基因工程的核心）；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定 11.目的基因的获取方法有：①人工合成目的基因；PCR获取和扩增目的基因；通过构建基因文库来获取目的基因 12.启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA 13.目的基因导入植物细胞方法有：农杆菌转化法、花粉管通道法，其受体细胞是体细胞或受精卵 14.目的基因导入动物细胞方法有：显微注射法，其受体细胞是受精卵 15.目的基因导入微生物细胞的方法是：Ca2＋处理法，Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 16.农杆菌转化法中的两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞 例题1 （ 2025安徽 ）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题： (1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用____________(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是___________________________________________________。 (2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R－U和下游片段R－D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的____________。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落____________(填序号)，出现菌落④的可能原因是_______________________________________________________________________。 (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路：____________________________________________________________________________。 答案　(1)稀释涂布平板法　分离不同条件下生长的内生放线菌　(2)指数级扩增　②　重组质粒通过(单交换)同源重组整合到了内生放线菌的基因组中　(3)设置两组培养实验：对照组在低(或常规)铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测 解析　(1)从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是抑制其他杂菌的生长，分离不同条件下生长的内生放线菌。(2)PCR技术的核心原理是通过多次循环(变性、复性、延伸)，使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。 在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R－U (500 bp) ＋ R基因 (2 000 bp) ＋ R－D (500 bp) ＝3 000 (bp)。对应图2中的菌落①和③。 在成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因(2 000 bp)被替换，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R－U(500 bp) ＋ R－D(500 bp) ＝ 1 000 (bp)。对应图2中的菌落②。 菌落④的PCR产物大小约为7 000 bp。这个大小可以通过以下方式解释：发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒(大小为3 000 bp质粒骨架 ＋ 500 bp R－U ＋ 500 bp R－D ＝ 4 000 bp)整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3 000 bp)加上整个质粒的长度(4 000 bp)，即 3 000 ＋ 4 000 ＝ 7 000 (bp)。(3)设置两组培养实验：一组为对照组，在低(或常规)铁浓度的培养基上进行；另一组为实验组，在添加了足量铁离子的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况。预期结果与结论： 如果实验组(高铁培养基)中内生放线菌对稻瘟病致病菌的抑制作用明显减弱或消失，而对照组(低铁培养基)中抑制作用明显，则说明该内生放线菌是通过竞争铁离子来抑制稻瘟病致病菌生长的。 例题2 （2025年福建）为建立一种效率高、毒性小的基因敲除系统，将图1所示的质粒1和质粒2导入大肠杆菌，质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计，其转录的短链RNA通过与目的基因碱基互补配对，与Cas9蛋白共同作用，敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。 回答下列问题： （1）大肠杆菌LacZ基因的表达产物可催化X-gal生成蓝色物质从而使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将质粒1与含LacZ基因相应sgRNA基因的质粒2同时转化到大肠杆菌中，涂布到含抗生素_____的平板（含有X-gal）上进行培养。若长出的是_____色菌落则为LacZ基因被敲除的大肠杆菌。 （2）Cas9基因的表达量会影响敲除效率，但其过量表达会对大肠杆菌有毒。为评估毒性和敲除效率，用5种启动子（A、B、C、D和E）启动Cas9的转录，相应检测结果如图2所示。结果表明，启动子_____对细胞毒性最小；综合考量毒性和敲除效率，应选用启动子_____用于该系统。 （3）含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养，少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点，在成功敲除LacZ基因的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2，实验流程如图3所示。 ①培养12小时后，图3试管1中大部分的大肠杆菌_____（填选项）。 A．含质粒1和质粒2 B．只含质粒1 C．只含质粒2 D．无质粒1和质粒2 ②若要从图3平板上筛出质粒1和质粒2均被消除的大肠杆菌，简要写出实验思路和预期结果：_____。 【答案】（1）①. 卡那霉素和四环素 ②. 白 （2）①. C ②. A （3）①. B ②. 将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养，两者均不生长则为筛出的大肠杆菌 【解析】（1）质粒2中含有与LacZ基因对应的sgRNA基因，其转录出来的短链RNA与目的基因（LacZ基因）发生碱基互补配对，使其不能表达，因而不能使X-gal分解产生蓝色物质，将质粒1和质粒2导入大肠杆菌，因此在含四环素和卡那霉素且含X-gal的培养基中，筛选白色的菌落即为LacZ基因成功敲除的菌落。 （2）Cas9的表达量过高对大肠杆菌产生毒性，使其数量减少，结合图示可知，启动子C对应的菌落数最高，因此启动子C对细胞毒性最小。结合菌落数和敲除率可知，启动子A的菌落数和敲除率均较高，因此综合考虑，应选择启动子A作用于该系统。 （3）①质粒2为温度敏感型质粒，在37℃下不能进行复制，培养12小时后，试管1中大部分大肠杆菌为只有质粒1，B正确，ACD错误。 故选B。 ②试管2加入蔗糖，质粒1中的SacB基因表达的SacB蛋白能将蔗糖转化为有毒化合物，抑制大肠杆菌的生长繁殖，因此试管2含质粒2的大肠杆菌较少，为进一步筛选质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌，实验设计思路和预测实验结果为：将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养，在无抗生素平板上可以生长，在含抗生素平板上均不生长的则为筛出的大肠杆菌。 例题3 （2025 甘肃）21. 水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如下图）。回答下列问题。 （1）CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过__________（方法）将该质粒转入植物细胞，并将__________整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加__________。 （2）实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为__________，对其消毒时需依次使用酒精和__________处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是__________。 （3）为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用__________技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较__________来验证抗病性。 （4）在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为__________。 【答案】（1）农杆菌转化法　　Ti质粒上的T - DNA　　潮霉素 （2）外植体　　次氯酸钠　　生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素 （3）PCR - 测序　　病斑的大小（或病斑面积、发病情况等合理答案） （4）对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻。 【解析】（1）将重组Ti质粒转入植物细胞常用农杆菌转化法。因为农杆菌中的Ti质粒上的T - DNA（可转移DNA）能够整合到植物细胞的染色体DNA上。利用农杆菌侵染植物细胞，从而将重组Ti质粒导入植物细胞。为了筛选出转化成功的细胞，由于重组Ti质粒上含有潮霉素抗性基因（HygR），所以需要在植物组织培养的培养基中添加潮霉素，只有成功导入重组Ti质粒的细胞才能在含有潮霉素的培养基上存活。 （2）在植物组织培养中，离体的植物器官、组织或细胞被称为外植体，所以实验中用到的水稻幼胚被称为外植体。 对水稻幼胚消毒时需依次使用酒精、次氯酸钠处理。 在植物组织培养诱导形成再生植株的过程中，生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。不同浓度的生长素和细胞分裂素的配比可以调控细胞的分裂和分化方向，从而诱导形成根和芽等不同的器官，最终形成再生植株。 （3）为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用PCR - 测序技术检测目标基因的启动子区是否编辑成功。通过PCR扩增目标基因的启动子区片段，然后进行测序，与编辑前的序列进行对比，看是否发生了预期的改变。 在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较病斑的大小（或病斑面积、发病情况等）来验证抗病性。如果基因编辑后的水稻病斑明显小于野生型水稻，说明其抗病性增强。 （4）在该研究中，基因编辑成功后水稻可以抗白叶枯病的原因为：对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻，从而使水稻获得了抗病性。 例题4 （2025广东）21．(11分)大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白，测试质粒功能。回答下列问题： (1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C－末端带SsrA 短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及________检测，筛选获得重组菌株W1。 (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有________________________(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是________________________________________。培养结果(图b)表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是___________________________________________________。 (3)研究者选用启动子Px 、X基因(编码阻遏蛋白X，阻遏Px开启转录)，重新构建质粒②(图a)，导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为___________________________________________。 (4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：___________________。 答案　(1)荧光(强度)　(2)显微镜直接计数法　作为检测mKate2蛋白荧光强度的对照　PGeo停止转录，mKate2蛋白合成停止，但特异性降解持续(分解) 　(3)快速生长期荧光强度低，进入生长稳定期迅速增强　(4)先敲除野生型菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2替换为酶A基因，将两个质粒导入敲除酶B基因的菌株中 解析　(1)利用PCR技术可检测目的基因导入是否成功，依据是否出现红色荧光、红色荧光强度可检测目的基因是否成功表达及其表达量。(2)定时取样检测培养液中细胞密度常用显微镜直接计数法。该实验需要检测菌体的荧光强度，因此需要在实验前检测液体培养基荧光强度，以便与之后检测菌体的荧光强度作对照。在W1快速生长期，PGeo驱动mKate2-SsrA基因转录，可合成C－末端带SsrA短肽的mKate2，使菌体发出红色荧光；进入生长稳定期后，PGeo停止驱动mKate2-SsrA基因的转录，荧光蛋白不能合成，且因mKate2的C－末端带有SsrA短肽，被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并降解，导致W1进入生长稳定期后荧光强度逐渐下降。(3)在W2快速生长期，PGeo启动子驱动X-SsrA基因转录，X-SsrA基因编码的C－末端带有SsrA短肽的阻遏蛋白X阻遏了PX开启转录，mKate2基因无法表达，故细胞快速生长期荧光强度低；进入生长稳定期后，PGeo启动子停止驱动X-SsrA基因转录，且C－末端带有SsrA短肽的阻遏蛋白X被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，逐渐解除对PX的抑制作用，PX开启mKate2基因的转录，可合成mKate2，培养基荧光强度逐渐增强。(4)先敲除野生型菌株中的酶B基因，再向野生型菌株中导入2个质粒，如图： 处于快速生长期时，质粒①合成C－末端带SsrA短肽的酶B，质粒②酶A基因的表达被抑制(避免合成过多酶A造成物质和能量浪费)，质粒①合成的酶B和野生型菌株自身的酶A基因表达的酶A共同合成细胞生长必需物，满足菌株快速生长的需求；进入生长稳定期后，C－末端带SsrA短肽的酶B和阻遏蛋白X被降解，质粒②酶A基因表达，合成酶A，与菌株原有酶A基因表达的酶A，共同快速合成莽草酸，以改进酶A活性弱造成的莽草酸合成速率慢的问题。此外，生长稳定期酶B因不能合成且被降解而缺失，莽草酸难以转化为细胞生长必需物，可实现在生长稳定期的细胞内莽草酸的大量积累。 例题5 （2025广西）21. CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： （1）构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是______。 （2）将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是______。 （3）将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有______，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有______（至少写出2点）。 （4）研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及______。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是______，②是______，③是______，④是______。 【答案】（1）EcoR Ⅰ、Not Ⅰ （2）便于含有质粒大肠杆菌形成单菌落 （3）肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养　　肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等 （4）减少CAR-T细胞表面PD-1的表达　　抑制PD-1基因表达的基因序列　　终止子　　溶解酶基因序列　　多种酶基因序列 【解析】（1）构建含CAR基因的重组质粒，为了避免质粒和目的基因自连、目的基因反向插入，常采用双酶切法；目的基因CAR基因需要插入质粒的启动子和终止子区域，而限制酶Cla  Ⅰ和Hind Ⅲ位于启动子和终止子区域之外，且CAR基因片段中间含有BamH Ⅰ识别序列，故应该选用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ分别切割CAR基因和质粒。 （2）固体培养基通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。在固体培养基上，人们可以清楚地观察到在培养基表面由单个细胞生长繁殖成的菌落，质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养的目的是便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落，方便后续筛选出重组质粒。 （3）研究目的是探究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，自变量为是否含有CAR基因的T细胞，而因变量抗肿瘤效果，即肿瘤细胞凋亡率的检测指标为肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等；实验组为CAR-T与肿瘤细胞共同培养，对照组为肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养。 （4）肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制，为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合，使用PD-1抗体、PD-L1抗体分别与PD-1、PD-L1的结合，或减少CAR-T细胞表面PD-1的表达；根据题干信息：与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子，且需要减弱原有PD-1启动的抑制通路，可知新的重组质粒中①是抑制PD-1基因表达的基因序列；溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率，且P启动子是双向启动子，可知②是终止子，③是溶解酶基因序列，④是多种酶基因序列。 例题6 （2025 贵州）18. 番茄细胞中线粒体形态与其自身功能密切相关，并影响番茄果实的成熟过程。研究者将决定蛋白质在细胞内定位的特定肽链“嫁接”到绿色荧光蛋白（GFP）上，控制GFP在番茄细胞内的分布，从而在显微镜下观察线粒体的形态变化。回答下列问题： （1）根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的______拼接在一起完成“嫁接”，细胞色素c氧化酶Ⅳ（COXⅣ）参与有氧呼吸生成水的过程。COXⅣ的一段肽链序列X决定了COXⅣ在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由是______。 （2）拼接好的序列应插入下图中农杆菌T-DNA的______（填下图字母）处。理由是______。 （3）选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为______。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的______中，番茄组织培养过程中，芽诱导期需在培养基中添加的植物激素是______。 【答案】（1）DNA序列　　COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X能引导GFP 定位到线粒体，从而通过GFP来观察线粒体的形态变化 （2）B　　B位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B点才可能转录 （3）外植体　　染色体DNA　　生长素和细胞分裂素 【解析】（1）根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的DNA序列拼接在一起完成 “嫁接”（蛋白质工程是通过改造基因来改造蛋白质）。COXⅣ 的一段肽链序列X决定了 COXⅣ 在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X能引导GFP 定位到线粒体，从而通过GFP的荧光来观察线粒体的形态变化（利用X的定位功能，使GFP标记线粒体）。 （2）拼接好的序列应插入农杆菌 Ti - DNA 的B处。B位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B点才可能转录。 （3）选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为外植体（外植体是植物组织培养中用于培养的离体器官、组织或细胞）。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的染色体DNA中（农杆菌的 T - DNA 会整合到植物细胞的染色体 DNA 上）。番茄组织培养过程中，诱导期需在培养基中添加的植物激素是生长素和细胞分裂素（植物组织培养中，生长素和细胞分裂素的比例会影响细胞的脱分化和再分化过程，芽诱导期需要这两种激素来启动细胞的分裂和分化）。 例题7 （2025河北）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是__________和__________。模板与引物在PCR反应的__________阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为____________________________。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GP1两端应添加__________(填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成__________键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为__________，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量__________，则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是__________。240 μmol·L－1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是__________。 注：镉离子对渗透压的影响忽略不计。 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是__________和__________(填标号)。 ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖 ②衣藻生长速率受镉离子浓度影响　③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质　④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 答案　(1)脱氧核苷酸　引物　复性　PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤(温度超过90 ℃时，双链DNA解旋为单链)，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的DNA聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行　(2)SmaⅠ和EcoRⅠ　磷酸二酯键　(3)细胞表面发出黄色荧光　高　(4)转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用　镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用　(5)①　③ 解析　(1)在PCR反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在PCR过程中会结合到模板DNA上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。模板与引物在PCR的复性阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，是因为PCR反应需要在高温条件下进行变性步骤(温度超过90 ℃时，双链DNA解旋为单链)，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的DNA聚合酶能在高温环境中保持活性，保证PCR反应的正常进行。(2)根据题意可知，要将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体，又因为NbeⅠ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同，同时使用这两种酶会出现目的基因与载体反向连接等现象，因此这两种限制酶只能选一个，则按照连接的顺序，在NbeⅠ(或XbaⅠ)与SmaⅠ之间插入CADR，在SmaⅠ和EcoRⅠ之间插入GP1，在EcoRⅠ和EcoRⅤ之间插入YFP，从而逐步构建出融合基因。DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。(3)若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有黄色荧光蛋白YFP，其表达后会发出黄色荧光。 将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高，则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中GP1能定位于细胞壁，融合蛋白中CADR能结合镉离子。(4)转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用。 240 μmol·L－1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用。(5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是：①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖，能够持续发挥作用；③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质。 例题8 (2025·河南，21)(11分)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是_________________________。 将培养后的菌液混匀并充分______，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。 (2)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1)，对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有______酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是_____________________________________________。 限制酶的识别序列和切割位点如下： (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是____________________________________________________________，随后在含________和________的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。 (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键)，如图2所示。根据分析结果，选择第______位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是______________________________________________________________。 答案　(1)海藻和海泥中富含卡拉胶，在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大　稀释　(2)BamHⅠ　重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列 (3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　卡拉胶　四环素　(4)44　该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小 解析　(2)转录过程沿模板链的3′端到5′端进行，所以转录模板链的5′端为靠近终止子的一端，由于E.coliDNA连接酶连接平末端的效率低，因此不选用EcoR V和SmaⅠ酶切，XbaⅠ与SpeⅠ切割产生的黏性末端相同，容易自连或反向连接，切割质粒时XbaⅠ酶与SpeⅠ酶只能选择一个，另一端需要选择BamHⅠ酶切，所以cg基因转录模板链的5′端最好含有BamHⅠ的酶切位点。T4 DNA连接酶可以连接黏性末端和平末端。选择不同的双酶切组合后，若重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列，会导致重组质粒无法使用构建表达载体的双酶切组合进行切割。(3)用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，可以使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。为筛选出成功导入表达载体的大肠杆菌，应在培养基中添加卡拉胶和四环素，培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈来判断。(4)空间上相近的半胱氨酸容易形成二硫键，提升蛋白质的耐热性，第44位赖氨酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键提升蛋白质的耐热性，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小。 例题9 香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题： (1)可从____________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入____________和____________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用____________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)(有问题)进一步筛选构建的质粒，以1～4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有____________的污染。初步判断实验组____________(从“1～4”中选填)的质粒中成功插入了基因N，理由是__________________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有____________。 a：5′－…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…－3′ b：5′－…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…－3′ c：5′－…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…－3′ d：5′－…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…－3′ (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的____________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 答案　(1)序列数据库　Xho Ⅰ　Xba Ⅰ DNA 连接酶　(2)试剂　1　目的基因N大小约2.3 kb　(3)GCC　(4)香树脂醇 解析　(1)保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故基因N不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与Spe Ⅰ具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即基因N两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；引物1和2扩增方向(箭头所指方向)均为5′→3′，所以a链的5′端在左，b链的5′端在右，则扩增后a链的5′端含有引物1序列，而b链的5′端含有引物2序列，基因N以a链为转录模板链，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2的5′端添加Xba Ⅰ、引物1的 5′端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒。(2)在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有试剂污染。构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2 kb，可知目的基因N大小约为2.3 kb，分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。(3)编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图b、c、d序列可知，c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，根据a引物5′端GCA为第240位，则c引物5′端GCC为第243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。(4)本题研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇，所以进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 例题10 (13分)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： (1)制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和______等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物________对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为________bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是________________(答出两点即可)。 (2)制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有____________(答出一种即可)。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和________，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 答案　(1)①终止子(或复制原点)　P1和P3　782　②重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外(或转速过高使蛋白A发生沉淀或蛋白A亲水性较差发生沉淀或蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解)　(2)PEG融合法(或电融合法或灭活病毒诱导法)　抗体检测 解析　(1)①PCR时选用的两种引物应该方向相反，分析题图，P3是唯一一个与P1和P2方向相反的引物，故必选P3；PCR的目的是确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，P3和P2分别与基因A两端互补配对，若选该对引物进行扩增，无论基因A插入质粒方向是否正确都可以扩增出片段(基因A)，不符合要求；P1与质粒一段序列互补配对，P3与基因A的一端互补配对，选P1和P3为引物，扩增时，若基因A未插入质粒，则不能扩增出相应片段；若基因A插入质粒的方向错误，也不能扩增出相应片段，故应选P1和P3对待测质粒进行PCR扩增。预期扩增的片段包括质粒的一段序列(200 bp)和基因A(582 bp)，故扩增片段大小为200＋582＝782(bp)。②上清液中检测到蛋白A的条件：重组菌将蛋白A正常表达；蛋白A不被重组菌中的酶降解；重组菌裂解或将蛋白A分泌到细胞外；蛋白A易溶于发酵液；离心时转速合适，既能将重组菌和大的颗粒沉淀，又不会将蛋白A沉降下来。 例题11 川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题： (1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有__________。川金丝猴的警戒行为依赖环境中获取的信息，信息类型有_______________。 川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺______________________获得更多机会。 (2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成____________关系。 (3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如表。请完成表格。 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取①__________，加入乙醇 ②________ 在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③____________、引物、样本DNA、含有Mg2＋缓冲液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR (4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbeL基因的保守序列的碱基____________。用引物F和R对4种植物样本甲～丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是____________。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有____________。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用____________的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。 注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基；“……”表示省略200个碱基。 (5)依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有____________(填字母)。 a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流 b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物 c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量 d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量 答案　(1)种间关系和种内关系　物理信息、化学信息、行为信息　食物、空间、配偶等　(2)互利共生　(3)①上清液　②溶解DNA　③4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶　(4)互补配对　植物丁　丙、丁　叶绿体基因组其他DNA片段　(5)ab 解析　(1)捕食者与川金丝猴是种间捕食关系，川金丝猴和同种个体之间是种内竞争关系。生态系统中信息的种类有物理信息、化学信息和行为信息。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺食物、空间、配偶等获得更多机会。(2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物从川金丝猴胃内获取营养物质，又能为川金丝猴分解纤维素，两者构成互利共生关系。(3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下：释放DNA：在去杂后的样本中加入裂解液，细胞裂解，内容物释放→析出DNA：DNA呈溶解状态，离心后取上清液，再加入乙醇，DNA不溶于酒精→在沉淀物中加入纯水，再次溶解DNA→扩增DNA：PCR扩增DNA，需要将4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg2＋缓冲液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR。(4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbeL基因的保守序列的碱基互补配对，从而在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸子链。用引物F和R对4种植物样本甲～丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，由图中结果可知，植物甲、乙、丙的条带一样长，植物丁的短，故能检出的样本是丁。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，说明摄食的植物有三种，甲和乙的序列相同，不能确定，故据此可确定川金丝猴摄食的植物有丙和丁。选用叶绿体基因组其他DNA片段序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析，能更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物。(5)建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流，能够保护川金丝猴遗传多样性和物种多样性，a正确；保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物，能够保护川金丝猴，b正确；川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，不能用标记重捕法定期重捕，c错误；保护川金丝猴主要依赖就地保护，d错误。 例题12 种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T－DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为____________________。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和__________对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是__________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶__________进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为__________bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T－DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T－DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为__________(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且T－DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段__________，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为____________________(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，________(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。 答案　(1)复制原点　XbaⅠ　 DNA聚合酶　SpeⅠ、SmaⅠ　550　(2)4　连接成环(或环化)　测序和序列比对　(3)不能 解析　(1)质粒含有复制原点，使其在农杆菌细胞中能进行自我复制。质粒上含有的酶切位点有XbaⅠ、PstⅠ、SmaⅠ 和BamH Ⅰ，抗除草剂基因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamH Ⅰ，因为该限制酶会破坏终止子。根据SmaⅠ限制酶识别序列可知，该酶切形成的是平末端，由于抗除草剂基因X使用SmaⅠ对其进行完全酶切，两端均为平末端，若质粒仅用SmaⅠ酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，应选择SmaⅠ和XbaⅠ(或SmaⅠ和PstⅠ)对 Ti 质粒进行完全酶切。又由于抗除草剂基因X使用SmaⅠ对其进行完全酶切，两端均为平末端，为构建基因表达载体，Ti 质粒被XbaⅠ或PstⅠ酶切产生的黏性末端需要被补平，XbaⅠ和PstⅠ酶切产生的黏性末端分别为、。由于 DNA聚合酶催化脱氧核苷酸链的延伸方向只能由 5′→3′，只有XbaⅠ 酶切产生的黏性末端能被补平，故应选择 XbaⅠ和SmaⅠ对Ti 质粒进行完全酶切。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T－DNA片段上就只含有一个SmaⅠ酶切位点和一个SpeⅠ酶切位点，可以选择用SmaⅠ和SpeⅠ进行酶切，转录的方向是从模板的3′→5′，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后，电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550 bp(如图)，若反向连接，较短的条带长度近似为200 bp(如图)。 (2)实验目的为证明这两个突变体是由 T－DNA 插入小麦基因组中同一基因导致的。实验步骤：提取基因组 DNA，经酶切后产生含有 T－DNA 的基因组片段，由于后续 PCR 难以扩增大片段 DNA，所以最好选择识别序列为 4个碱基对的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR 扩增。分析图乙，因为引物 P1 和 P2 向外侧延伸，利用引物 P1 和 P2 扩增未知序列，应先将该 DNA 片段环化，PCR 扩增出未知序列后，为了确定未知序列是否属于同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此操作为测序和序列比对。琼脂糖凝胶电泳只可判断 2 条片段未知序列的大小，不能确定两者的碱基排列顺序。(3)通过农杆菌转化法将构建的含野生型基因的表达载体转入突变植株，即使能在突变植株内检测到野生型基因，但由于不知道该突变是否为显性突变，故不能确定该植株的表型是否为野生型。 例题13 马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题： (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、____________、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的____________________________步骤中起作用。 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的____________(填“5′端”或“3′端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5′－____________－3′，切割载体时应选用的两种限制酶是____________，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T－DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到____________，抗性基因____________可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经____________形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 答案　(1)4种脱氧核苷酸　延伸　(2)5′端　AGATCT　BamHⅠ、EcoRⅠ　(3)栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体DNA上　2　再分化 解析　(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。(2)为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5′端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ的识别序列，而S基因内部含有Xba Ⅰ、Nde Ⅰ和BamH Ⅰ的识别序列，要用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ或Xba Ⅰ切割载体，又不能用Xba Ⅰ、Nde Ⅰ或BamH Ⅰ切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知需要用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ切割载体，用BamH Ⅰ的同尾酶Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5′－AGATCT－3′。(3)T－DNA属于可转移DNA，用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T－DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体DNA上，抗性基因1位于T－DNA外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2位于T－DNA内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 例题14 杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA～lrcF)导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如图。回答下列问题： 注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5′－3′方向。②密码子对应的氨基酸：AAA－赖氨酸；AUG－甲硫氨酸(起始)；UUC－苯丙氨酸；ACA－苏氨酸；UCG－丝氨酸。 (1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA～lrcF目的基因时，应选用________引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是________________________________________。 (2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生________条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是______________________________。 (3)由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带____________(填氨基酸名称)的tRNA进入结合位点，导致______________________________________________________，最终引起细菌死亡。 (4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是________________________。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有________________________(答出1点即可)。 答案　(1)F2、F4　保证载体能在链霉菌中正常复制　(2)2　检测重组质粒是否构建成功　(3)苯丙氨酸　翻译过程无法正常进行，细菌无法合成蛋白质　(4)目的基因发生突变(或目的基因表达受到抑制等)　发酵的最佳条件(或提高发酵产物产量的方法、产物的分离和纯化方法等) 解析　(1)引物需要结合到模板的3′端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5′→3′，因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA～lrcF目的基因时，应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点，是为了保证载体在链霉菌细胞中能正常复制，使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共2条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功，若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带，说明酶切成功，重组质粒构建可能成功。但是还需要进一步的鉴定。(3)观察拉索西丁的作用机制图，结合所给密码子信息，可知拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点。因为位点2对应的密码子是UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点，会导致翻译过程无法正常进行，进而使细菌无法合成蛋白质，最终引起细菌死亡。(4)重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生突变，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性；也可能是目的基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题：发酵的最佳条件，如温度、pH、溶氧量等；如何提高发酵产物的产量；产物的分离和纯化方法等。 例题 15 丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题： (1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是______________________________________________________________________________。 (2)使用BamH Ⅰ和SalⅠ限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上(如图)。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是__________________________________________________________________________。 (3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的____________________，引起发酵液pH下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100 g·L－1和15 g·L－1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉(90 g·L－1、100 g·L－1、110 g·L－1)和酵母粉(12 g·L－1、15 g·L－1、18 g·L－1)筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置__________(填数字)组实验(重复组不计算在内)。 (4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是______________________。 (5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经______________，最终获得发酵产品。 答案　(1)在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Taq DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性　(2)在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落是由导入目的基因的菌株形成的　(3)乳酸或酒精和CO2　9　(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量　(5)提取、分离、纯化 解析　(2)据图可知，使用BamHⅠ和SalⅠ限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是目的菌株。(3)碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢，这会导致碳源氧化不彻底，形成较多的乳酸或酒精和CO2，进而使发酵液的pH下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3＝9(组)实验。(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。 例题 16研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 LB/RB：T－DNA的边界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；Ampr氨苄青霉素抗性基因。 甲　载体信息 乙　目标基因L部分序列 丙　限制酶识别序列、切割位点及电泳结果 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越________(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′－________－3′和5′－________－3′。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是________，其中纯合的突变植株是________(填序号)。 答案　(1)低　256(或44)　GTTT　CAAT(或CAAT　GTTT)　(2)卡那霉素　SacⅠ　④　 解析　(1)单链突出序列NNNN为黏性末端，N代表任意碱基，所以，用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上能得到256种黏性末端。载体上有2个BsaⅠ酶切位点，最后两个空序列为GTTT和CAAT，方向均从5′到3′。(2)导入大豆细胞中的T－DNA片段中含有卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条，根据图丙结果可知，只有④为纯合的突变植株。 例题17驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。 回答下列问题： (1)研究者优化了培养基的________________(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。 (2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b)。构建载体时，选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为__________，理由是________________________ ________________________________________________________________________。 (3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为____________________________(答两点)。 (4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是___________________________。 (5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：__________________________________________。 答案　(1)碳源、氮源　(2)PT7、PBAD和PBAD　基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达　(3)抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株　(4)该处细胞中T7RNAP被激活，酪氨酸酶基因表达并形成黑色素　(5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白) 解析　(1)微生物生长需要的主要营养物质包括碳源、氮源、水、无机盐，培养不同微生物需要的水是相同的，无机盐基本相似，但是碳源、氮源会存在差异，所以可以优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌。(2)根据图二a分析，蓝光调控的基因表达载体的光控原理是，在蓝光的作用下，细胞中无活性的T7RNAP被激活，变成有活性的T7RNAP，该RNA聚合酶会特异性地与图中启动子PT7结合，从而调控目的基因的表达，根据图二b分析可知，基因1编码的是酪氨酸酶，属于图a中的目的基因，应该在蓝光的调控下才表达，基因2和3编码的是T7RNAP的两个部分，其正常表达的产物是无活性的T7RNAP，所以启动子②和③为通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)，在蓝光的作用下，两者表达的无活性的T7RNAP被激活，再启动基因1表达，所以启动子①是特异型启动子PT7，仅被有活性的T7RNAP识别。(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因，其表达的产物对大观霉素具有抗性，可以作为表达载体的标记基因，因此，长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其他微生物由于不具有抗性，生长被抑制，此外，丢失质粒的菌株也不具有抗性被淘汰，从而筛选出具有目的基因的菌株。(4)根据第(2)问分析可知，用蓝光照射已长出的BC菌膜，细胞中T7RNAP被激活，会调控酪氨酸酶基因表达合成酪氨酸酶，随后将其转至含有酪氨酸的染色池处理，只有经蓝光照射的区域，酪氨酸酶会催化酪氨酸形成黑色素，被染成黑色。(5)按照上述菌株的构建模式，要生产其他颜色图案的BC膜，可以构建其他颜色的蓝光表达载体，将原来表达产物酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶，或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白。 例题18．苏云金芽孢杆菌产生的Bt毒蛋白，被棉铃虫吞食后活化，再与肠道细胞表面受体结合，形成复合体插入细胞膜中，直接导致细胞膜穿孔，细胞内含物流出，直至细胞死亡。科学家将编码Bt毒蛋白的基因转入棉花植株，获得的转基因棉花能有效防控棉铃虫的危害。回答下列问题： (1)Bt毒蛋白引起的细胞死亡属于__________(填“细胞坏死”或“细胞凋亡”)。 (2)如果转基因棉花植株中Bt毒蛋白含量偏低，取食后的棉铃虫可通过激活肠干细胞分裂和________产生新的肠道细胞，修复损伤的肠道，由此导致杀虫效果下降。请据此提出一项可提高转基因棉花杀虫效果的改进思路：_______________________________________。 (3)在Bt毒蛋白的长期选择作用下，种群中具有抗性的棉铃虫存活的可能原因是肠道细胞表面受体蛋白的________或________发生变化，导致棉铃虫对Bt毒蛋白产生抗性。 (4)将Bt毒蛋白转基因棉花与非转基因棉花混种，可以延缓棉铃虫对转基因棉花产生抗性，原因是_____________________________________________________________________。 答案　(1)细胞坏死　(2)分化　在基因表达载体中加入人工构建的诱导型启动子(或强启动子)激活Bt毒蛋白基因的表达(使其表达量增多)　(3)组成　空间结构　(4)减缓棉铃虫种群抗毒蛋白基因频率的增加速度 解析　(1)细胞坏死指的是在种种不利因素影响下，由细胞正常代谢活动受损或中断引起的细胞损伤和死亡，Bt毒蛋白作为损害因子，导致该细胞的死亡，属于细胞坏死。 例题19 百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： (1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用__________________去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用____________________(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。 (2)单倍体育种。常用________________的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是_______________________________________________________________________。 (3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用______________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中______________的诱导作用最强。 ②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路：____________________________________________________________________________。 答案　(1)纤维素酶和果胶酶　生长素和细胞分裂素　(2)花药离体培养　利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目　(3)①HindⅢ、BamHⅠ　交链格孢　②利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL 解析　(1)因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理，得到原生质体后使其融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。(2)获得单倍体植株的常用方法是花药(花粉)离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株即为单倍体植株。(3)根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得启动子pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL。 学科网（北京）股份有限公司 $