2027届高考生物人教版一轮复习核心素养测评 第十单元 第52讲　基因工程

**基本信息** 以基因工程核心技术为主线，通过工具酶应用、载体构建、转化筛选等模块，系统整合操作流程与应用拓展，突出科学思维与探究实践。 **综合设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |基础工具|3题（如酶切位点分析）|限制酶识别序列与黏性末端匹配，DNA连接酶作用位点判断|从酶的特异性到重组DNA构建原理| |操作流程|7题（如农杆菌转化、PCR）|双酶切避免自身环化，标记基因筛选转化细胞，引物设计与电泳结果分析|载体构建→导入→筛选的逻辑链条| |应用拓展|5题（如蛋白质工程、生物反应器）|蛋白质结构设计→基因改造，转基因生物性状鉴定|从基因工程到蛋白质工程的技术延伸|

核心素养测评 第十单元 第52讲　基因工程 (30分钟　45分) 一、选择题:本题共7小题,每小题3分,共21分。每小题只有一个选项符合题目要求。 1.如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是(　　) A.甲、乙、丙都属于黏性末端 B.甲、乙片段可形成重组DNA分子,但甲、丙不能 C.DNA连接酶的作用位点在图乙中b处 D.切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子 【解析】选C。甲、乙的黏性末端相同,因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子,但甲、丙的黏性末端不同,它们之间不能形成重组DNA分子,A、B正确;DNA连接酶将两个DNA片段连接为一个DNA分子,作用部位是磷酸二酯键,即图乙中a处,C错误;切割甲的限制酶的识别序列为GAATTC∥CTTAAG,而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为GAATTG∥CTTAAC,因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子,D正确。 2.科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜,培育出转基因抗病毒番木瓜,Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.农杆菌的T-DNA与番木瓜基因发生重组 B.构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶 C.含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性 D.转基因抗病毒番木瓜具有卡那霉素抗性 【解析】选A。基因工程基本原理为基因重组,番木瓜基因插入农杆菌T—DNA发生了基因重组,A正确;构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶,B错误;抗病毒蛋白基因C的插入位点位于四环素抗性基因内部,插入抗病毒蛋白基因C后,重组Ti质粒的四环素抗性基因被破坏,含重组Ti质粒的农杆菌不具有四环素抗性,C错误;Ti质粒含有卡那霉素抗性基因,但并未转化到番木瓜中,故转基因抗病毒番木瓜不具有卡那霉素抗性,D错误。 3.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述,正确的是(　　) A.选用植物细胞提取DNA时需研磨破碎细胞 B.鉴定DNA时,应将丝状物直接加入二苯胺试剂中进行沸水浴 C.微量离心管、蒸馏水和移液器在使用前均需进行高压蒸汽灭菌处理 D.DNA向着与其所带电荷相同的电极移动,迁移速率与凝胶浓度、DNA的大小和构象等有关 【解析】选A。利用植物组织提取DNA时,须先破碎细胞,破碎细胞时需添加研磨液进行研磨来瓦解细胞膜,A正确;鉴定DNA时,将丝状物溶于2 mol/L的NaCl溶液后加入二苯胺试剂,在沸水浴条件下,DNA遇二苯胺会被染成蓝色,B错误;PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理,移液器不需要进行高压蒸汽灭菌处理,C错误;一定pH下DNA分子可带上正或负电荷,在电场作用下,向着与其所带电荷相反的电极移动,迁移速率与凝胶浓度、DNA的大小和构象等有关,D错误。 4.为提高大豆对磷元素的吸收能力,研究人员利用农杆菌转化法将水稻的耐低磷基因OsPTF转移到大豆植株中,如图为重组Ti质粒上T-DNA的序列结构示意图。下列相关叙述错误的是(　　) A.以水稻RNA为模板通过逆转录及PCR扩增可获得大量OsPTF基因 B.RNA聚合酶与启动子1识别并结合后,启动抗除草剂基因的转录 C.可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因的大豆愈伤组织 D.用EcoRⅠ、BamHⅠ酶同时切重组Ti质粒后,经电泳分离至少得到两条不同长度的带 【解析】选B。以水稻RNA为模板通过逆转录可以合成cDNA,再以cDNA为模板利用PCR扩增可获得大量OsPTF基因,A正确;启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点,用于驱动基因的转录,据图分析,抗除草剂基因位于启动子2的后面,故RNA聚合酶与启动子2识别并结合后,启动抗除草剂基因的转录,B错误;由于图中T-DNA的序列中含有目的基因和抗除草剂基因,故可通过含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因的大豆愈伤组织,C正确;分析题图可知,用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切重组Ti质粒后,可得到含耐低磷基因OsPTF的片段、含有除草剂基因的片段和启动子1左侧的片段等,因此经电泳分离至少得到两条带,D正确。 5.(2025·新课标全国卷)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析,样品1~4的电泳结果如图所示(“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙,甲只有限制酶R的一个酶切位点,样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是(　　) A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液 B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷 C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同 D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物 【解析】选D。配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液,可维持电泳过程中体系的pH稳定,保证核酸分子正常泳动,A正确。电泳时,样品向阳极移动,说明在该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷,符合核酸分子在电泳中的带电特性,B正确。电泳中,DNA分子的迁移速率与分子大小、电荷的多少等多种因素有关。甲、乙电泳条带位置虽然相同,但影响DNA分子的迁移速率的因素很多,所以碱基对的数量可能不同,C正确。甲只有限制酶R的一个酶切位点,若被酶R完全酶切,只会得到2种DNA片段(2个条带),这两个条带的碱基数量比甲要少,电泳跑的距离要比甲更远,所以据图推测样品4才是甲被酶R完全酶切后的产物,D错误。 6.(2026·佛山联考)基因工程是一种通过人工手段改造生物遗传物质的技术。下图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述正确的是(　　) A.基因工程的操作程序中核心步骤是目的基因的筛选与获取 B.③侵染植物细胞后,重组Ti质粒整合到④的染色体上 C.农杆菌转化法是指上图中的②→③的过程 D.基因工程的原理是基因重组,其变异为定向变异 【解析】选D。基因工程操作程序中核心步骤是基因表达载体的构建,而不是目的基因的筛选与获取,A 错误;③侵染植物细胞后,将重组 Ti 质粒上的 T-DNA 整合到④的染色体上,B 错误;农杆菌转化法是指将目的基因插入 Ti 质粒的 T-DNA 上,通过农杆菌的转化作用,使目的基因进入植物细胞并整合到植物细胞染色体的 DNA 上,应该是图中的①→②→③→④的过程,C 错误;基因工程是将一种生物的基因转移到另一种生物体内,原理是基因重组,能按照人们的意愿定向改造生物的性状,其变异为定向变异,D 正确。 7.(2026·佛山模拟)为解决跨物种器官移植出现的免疫排斥反应,研究者提出了如下思路:剔除猪的某些基因,用猪的器官作为供体。借助CRISPR-Cas9基因编辑技术可以剔除猪的相关基因,下图为Cas9蛋白依据sgRNA片段切割DNA的示意图(设计特定的sgRNA可以识别需剔除的DNA序列)。下列相关叙述错误的是(　　) A.上述需要剔除的基因可能是标明猪细胞身份的标签蛋白基因 B.上述基因编辑过程还需细胞内的限制酶及DNA连接酶参与 C.上述基因编辑技术能定点切除的目标基因取决于sgRNA D.可以利用显微注射技术将Cas9-sgRNA复合体导入猪的受精卵 【解析】选B。免疫排斥主要与标明身份的标签的蛋白质相关,所以为解决跨物种器官移植出现的免疫排斥反应,上述需要剔除的基因可能是标明猪细胞身份的标签蛋白基因,A正确;由题图可知,使用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑时,sgRNA分子的碱基序列与基因组DNA中特定碱基序列根据碱基互补配对原则结合在一起,该过程不需要酶催化,然后由Cas9催化磷酸二酯键水解,不需要细胞内的限制酶参与,B错误;Cas9—sgRNA复合体能够精准识别某核苷酸序列的原因可能是单链sgRNA可与特定核苷酸序列碱基互补配对,所以上述基因编辑技术能定点切除的目标基因取决于sgRNA,C正确;基因工程中常选用受精卵作为外源基因的受体细胞,可以利用显微注射技术将Cas9-sgRNA复合体导入猪的受精卵,D正确。 8.我国科研人员将番木瓜环斑病毒(PRSV,一种单链RNA病毒)的复制酶基因转入番木瓜,培育出抗PRSV的番木瓜“华农一号”。“华农一号”能产生与PRSV的RNA形成局部双链的RNA,阻止PRSV的复制。下列分析错误的是(　　) A.培育抗PRSV番木瓜“华农一号”需要用到植物组织培养技术 B.培育“华农一号”时,可以用不同的限制酶切割质粒和目的基因 C.PCR扩增复制酶基因时,反应体系中需加入逆转录酶和Taq DNA 聚合酶 D.“华农一号”通过表达出复制酶使番木瓜获得对PRSV的抗性 【解析】选D。培育抗病毒番木瓜“华农一号”需要用到植物组织培养技术,将含有目的基因的番木瓜细胞培育成完整植株,A正确;培育“华农一号”时,用不同的限制酶切割质粒和目的基因,能有效避免质粒和目的基因自身环化和反向连接,B正确;据题意可知,该复制酶基因为一段单链RNA,需逆转录后才能进行PCR,PCR扩增时需加入耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA酶)完成子链的延伸,故PCR扩增复制酶基因时,反应体系中需加入逆转录酶和Taq DNA 聚合酶,C正确;“华农一号”通过转录出相应的RNA与PRSV的复制酶基因(RNA)互补配对,从而抑制其翻译过程,进而不能表达出复制酶,阻止病毒的复制,使番木瓜获得对PRSV的抗性,D错误。 9.如图是将人的生长激素基因导入细菌B的细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌B的细胞内不含质粒A,也不含质粒A上的基因。判断下列说法正确的是(　　) A.将重组质粒导入细菌B常用的方法是用Ca2+处理细菌 B.将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上,能生长的只有导入了质粒A的细菌 C.目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有四环素的培养基上生长 D.工程菌产生的生长激素可以直接使用,效果良好 【解析】选A。将重组质粒导入细菌B常用的方法是Ca2+处理法(CaCl2溶液),使细菌处于易于吸收外源DNA的状态,A正确;因为目的基因插入了氨苄青霉素抗性基因,而四环素抗性基因正常,因此导入了重组质粒的细菌能在含有四环素的培养基上生长,但导入空白质粒的细菌也能在此培养基上生长,B错误;目的基因成功表达的标志是合成人的生长激素,而不是在含有四环素的培养基上生长,C错误;由于细菌无内质网和高尔基体,对合成的生长激素不能加工、修饰,故工程菌产生的生长激素不能直接使用,D错误。 10.下列有关利用乳腺生物反应器与微生物生产药物的叙述,错误的是(　　) A.前者可在乳汁中提取药物,后者可在细胞中提取 B.两者都是基因工程在医药卫生领域的应用 C.前者合成的蛋白质可加工成熟,后者合成的蛋白质一般不能加工成熟 D.动物和微生物的基因结构与人体的基因结构均相同 【解析】选D。前者在动物乳汁中提取药物,后者在微生物细胞或其培养液中提取,A正确;前者是转基因动物的应用,后者是转基因微生物的应用,两者都是基因工程在医药卫生领域的应用,B正确;前者细胞有内质网、高尔基体,合成的蛋白质可经内质网、高尔基体加工成熟,后者一般用原核生物,细胞没有内质网、高尔基体,合成的蛋白质不能加工成熟,C正确;动物和人均为真核生物,基因编码区有内含子和外显子之分,而微生物中的原核生物,基因编码区没有内含子和外显子之分,基因结构与真核生物的不同,D错误。 11.研究人员将编码甜菜红素合成酶的四个基因BvCYP、BvDOD、cDOPA和ADH与绿色荧光蛋白基因eGFP连接,搭载到农杆菌Ti质粒的T-DNA片段上构建多基因表达载体,利用农杆菌转化法使其在烟草细胞中表达,并能观察到甜菜红素的合成与绿色荧光。下列说法错误的是(　　) A.构建多基因表达载体时需用到限制酶和DNA连接酶 B.可用PCR技术检测五个基因是否成功导入烟草细胞 C.图中五个基因转录时均以DNA的同一条单链为模板 D.应选用含潮霉素的培养基筛选转化成功的烟草细胞 【解析】选C。构建多基因表达载体时需用到多种限制酶和DNA连接酶,将多个基因与载体结合,A正确;检测目的基因是否成功导入受体细胞的方法是DNA分子杂交技术和PCR扩增技术,B正确;BvCYP启动子启动转录的方向与其他的基因不同,所以五个基因转录时的模板不是同一条DNA单链,C错误;卡那霉素抗性基因不位于T-DNA中,不能表达,而潮霉素抗性基因位于T-DNA中,能表达,应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞,D正确。 12.下列关于蛋白质工程的说法正确的是(　　) A.蛋白质工程无须构建基因表达载体 B.蛋白质工程需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶 C.对蛋白质的改造是通过直接改造相应的mRNA来实现的 D.蛋白质工程的流程和天然蛋白质合成的过程是相同的 【解析】选B。蛋白质工程是以基因工程为基础的,蛋白质工程需要限制性内切核酸酶(切割目的基因和载体)和DNA连接酶(连接切割后的目的基因和载体),构建基因表达载体,A错误,B正确;对蛋白质的改造是通过直接改造相应的基因来实现的,C错误;蛋白质工程是从预期的蛋白质功能出发,设计预期的蛋白质结构,推测应有的氨基酸序列,找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因),获得所需要的蛋白质,故蛋白质工程的流程和天然蛋白质合成的过程是不完全相同的,D错误。 13.(2026·汕头联考)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白,在临床上被广泛用于治疗病毒感染,但天然干扰素结构不稳定,体外保存相当困难。下图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图,以下相关叙述不合理的是(　　) A.蛋白质工程是在分子层面对蛋白质进行直接操控 B.通过蛋白质工程可得到自然界中不存在的蛋白质 C.通过对X射线衍射图谱的分析可获取关于蛋白质的空间结构的信息 D.图中的新干扰素基因必须插入表达载体的启动子与终止子之间才能表达 【解析】选A。蛋白质工程是第二代基因工程,是在基因层面进行的操控,A错误;蛋白质工程是通过改造或合成基因来改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质,即通过蛋白质工程可得到自然界中不存在的蛋白质,B正确;结合图示可知,对干扰素进行X射线衍射后能得到其高级结构,进而进行分子设计,据此推测通过对X射线衍射图谱的分析可获取关于蛋白质的空间结构的信息,C正确;启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点,从而驱动转录,而终止子提供转录终止的信号,故新的干扰素基因必须插入质粒上的启动子和终止子之间才能表达,D正确。 14.(2025·揭阳模拟)科学家利用人工智能(AI)模型成功改造了一种溶菌酶。通过AI预测合成的溶菌酶与已知的天然溶菌酶结构不同,但其功效却和天然溶菌酶一样,甚至更优越。下列推测错误的是(　　) A.AI预测合成的溶菌酶的氨基酸种类与天然溶菌酶的可能存在差异 B.AI预测合成的溶菌酶与天然溶菌酶在空间结构上可能存在差异 C.组成AI预测合成的溶菌酶的氨基酸的连接方式与天然溶菌酶的可能不同 D.该技术可能用于治疗人类某些由蛋白质结构改变引起的疾病 【解析】选C。题意显示,通过AI预测合成的溶菌酶与已知的天然溶菌酶结构不同,但其功效却和天然溶菌酶一样,甚至更优越,据此推测,AI预测合成的溶菌酶的氨基酸种类与天然溶菌酶的可能存在差异,A正确;据题意AI预测合成的溶菌酶与已知的天然溶菌酶结构不同可知,AI预测合成的溶菌酶与天然溶菌酶在空间结构上可能存在差异,B正确;组成AI预测合成的溶菌酶的氨基酸的连接方式与天然溶菌酶的相同,均是通过肽键连接的,合成过程都经过了脱水缩合反应,C错误;题意显示,通过AI预测合成的溶菌酶与已知的天然溶菌酶结构不同,但其功效却和天然溶菌酶一样,甚至更优越,因此该技术可能用于治疗人类某些由蛋白质结构改变引起的疾病,D正确。 15.如图是利用猪唾液腺生产大量高纯度人神经生长因子(hNGF)的流程图,相关说法错误的是(　　) A.人hNGF基因可以在猪唾液腺细胞中表达 B.转基因猪D的遗传性状由猪成纤维细胞A和代孕猪C的遗传物质决定 C.可通过电融合法使猪成纤维细胞A和去核猪卵细胞B融合 D.培育转基因猪D涉及基因工程、动物细胞培养、核移植、胚胎移植等操作 【解析】选B。由流程图可知,可以从收集的唾液中提取hNGF,说明人hNGF 基因可以在猪唾液腺细胞中表达,A 正确;转基因猪D 是经基因工程(将人的hNGF基因导入猪成纤维细胞A)、动物细胞培养、核移植(去核猪卵细胞B与转基因猪的成纤维细胞A融合)、胚胎移植(将重构胚移植到代孕猪C体内)等过程培育,因此转基因猪D 的遗传性状由猪成纤维细胞A 和猪卵细胞B 的遗传物质(和人hNGF 基因)决定,B 错误、D 正确;为使猪成纤维细胞A和去核猪卵细胞B 融合,可采用物理方法,如电融合法,C 正确。 二、非选择题 16.(12分)核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)是植物固定CO2的关键酶。某研究小组通过导入相关基因在大肠杆菌中搭建图1所示的代谢通路,以筛选结合CO2能力更强的Rubisco。 回答下列问题。 (1)为将Rubisco基因导入大肠杆菌,研究小组使用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切以构建重组质粒。图2表达载体中,片段2为___启动子__(填“启动子”或“终止子”),其作用是__ RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA __。  【解析】(1)转录过程中,mRNA延伸的方向是5'→3',因此根据模板链的位置可知Rubisco基因转录的方向是从右向左,即EcoRⅠ连接启动子,BamHⅠ连接终止子,即片段2为启动子,片段1是终止子;启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合位点,驱动基因转录。 (2)为检测转化的菌落是否携带含有Rubisco基因的重组质粒,将P1、P2和P3引物(引物位置如图2所示,→表示引物5'→3'方向)共同加入反应体系后,分别以3个菌落的DNA为模板进行PCR扩增。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示,菌落__3__(填“1”或“2”或“3”)携带正确的重组质粒。  【解析】(2)将P1、P2和P3引物共同加入反应体系,根据引物的位置可知,引物P1、P2可扩增普通质粒和重组质粒,扩增普通质粒时扩增出的DNA片段较小,扩增重组质粒时扩增出的DNA片段较大;引物P1、P3只能扩增重组质粒,不能扩增普通质粒,因此若未导入质粒则无扩增DNA片段,若导入普通质粒,则有一种DNA片段,若导入重组质粒,则有两种DNA片段。根据受体菌中的质粒,可将受体菌分成三种,①未导入质粒,则无法扩增,对应菌落2;②导入普通质粒,能扩增出DNA片段,能扩增出1种片段,且片段较小,对应菌落1;③导入重组质粒,引物P1、P2和引物P1、P3都能扩增出DNA片段,且最后扩增出两种DNA片段,对应菌落3。 (3)通过单独或共同转化prkA基因、Rubisco基因获得三种大肠杆菌,涂布在同一平板的不同区域(区域①涂布未携带目的基因的大肠杆菌),一段时间后,菌落分布及生长状况如图4所示,推测区域②、④内菌落携带的目的基因分别是__ prkA基因__、__ prkA基因和Rubisco基因__。现有多种Rubisco突变基因,应用该共同转化体系可筛选出高活性Rubisco的依据是__携带高活性Rubisco基因的菌落生长状况更好__。  【解析】(3)未导入prkA基因、Rubisco基因时,大肠杆菌可正常代谢,若只导入prkA基因,则大肠杆菌产生的核酮糖-1,5-二磷酸会抑制大肠杆菌的生长,即②区域;若同时导入prkA基因、Rubisco基因,则在Rubisco的作用下,核酮糖-1,5-二磷酸和CO2结合形成3-磷酸甘油酸,参与大肠杆菌正常代谢,可缓解核酮糖-1,5-二磷酸对大肠杆菌的抑制作用,对应区域④;若只导入Rubisco基因,由于不含核酮糖-1,5-二磷酸,Rubisco无法起作用,与对照组相同,即③区域。Rubisco可缓解核酮糖-1,5-二磷酸对大肠杆菌的抑制作用,因此Rubisco活性越高,大肠杆菌菌落生长状况越好,即携带高活性Rubisco基因的菌落生长状况更好。 (4)Rubisco的活性与植物有机物的积累密切相关。现已筛选出携带高活性Rubisco编码基因的重组质粒(无法转化植物),研究小组拟使用农杆菌转化法培育高产量大豆品种,简要写出实验思路。 __将重组质粒导入农杆菌,用农杆菌感染大豆愈伤组织,通过植物组织培养培育出大豆植株,筛选高产量大豆品种__ 【解析】(4)因重组质粒无法转化植物,可先将重组质粒导入农杆菌,再用农杆菌感染大豆愈伤组织,通过植物组织培养培育出大豆植株,筛选高产量大豆品种。 17.(12分)★★(2021·山东高考)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示: (1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是__ SalⅠ__,在R末端添加的序列所对应的限制酶是___ EcoRⅠ___。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需___6___种酶。  【解析】(1)据题意可知,需要将扩增后的产物定向插入载体并指导荧光蛋白基因的表达,则含有启动子P的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致,故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶MunⅠ识别序列端结合,才能保证扩增后的产物定向插入载体并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入,需要引物末端两端添加限制酶的识别序列,且被限制酶识别并切割后,两端的黏性末端不能相同;而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和XhoⅠ的识别位点,故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和XhoⅠ所识别,故应该选用添加限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列,据图中对限制酶的注释可知,限制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoRⅠ识别并切割后的黏性末端相同,故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ;荧光蛋白基因中含有限制酶EcoRⅠ的识别位点,故对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割。综上所述,对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割,对扩增后的产物用限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ切割,然后在DNA连接酶的催化作用下,连接形成重组载体;产物扩增中需要使用Taq DNA聚合酶催化,合成更多的产物,故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶,分别是Taq DNA聚合酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA连接酶。 (2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是__ F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达___。  【解析】(2)受体细胞中已经除去BCL11A基因,故扩增产物中的BCL11A蛋白结合位点,不会抑制荧光蛋白基因的表达;基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合,才能完成荧光蛋白基因的转录过程;含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光,则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达。 (3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而F5~F6与R扩增的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于__引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上___,  理由是___根据有无荧光情况判断,F1~F4与R扩增产物上均有结合位点,因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);F5~F6与R扩增产物上均无结合位点,可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上___。  【解析】(3)向培养液中添加适量的雌激素,此时重组载体上的BCL11A基因表达,产生BCL11A蛋白,BCL11A蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后,导致荧光蛋白基因被抑制;含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,则说明BCL11A蛋白与结合位点在引物F4与引物R之间的序列上;含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光,则说明BCL11A蛋白结合位点在引物F5的上游序列,故据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。 18.(12分)腈水合酶(NHase)是一种金属酶,能催化腈类物质转化为相应的酰胺类物质,广泛应用于酰胺类化合物的生产。但由于NHase的稳定性较差,在催化反应过程中易受到温度等影响而逐渐失活,这严重影响了NHase的工业化应用。回答下列问题: (1)研究人员拟通过蛋白质工程改造酶分子的结构,以提高NHase的稳定性,其基本思路是(设改造前的酶为NHase1,改造后的酶为NHase2):预期NHase2的功能→__设计预期的蛋白质结构__→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得NHase2。  【解析】(1)结构决定功能,功能反映结构,根据预期NHase2的功能,可以设计出预期的蛋白质结构。 (2)根据NHase2的氨基酸序列推测mRNA的碱基序列__不是__(填“是”或“不是”)唯一的,理由是__密码子的简并,多个密码子可能对应同一种氨基酸__。  【解析】(2)由于mRNA上的密码子的简并,即多个密码子对应一种氨基酸,因此根据NHase2的氨基酸序列推测mRNA的碱基序列不是唯一的。 (3)设计改造获得的NHase2最终还必须通过改造或合成__相应的基因__来完成,原因是__蛋白质由基因控制合成__。  【解析】(3)蛋白质是基因控制合成的,设计改造获得的NHase2最终还必须通过改造或合成相应的基因来完成。 (4)若要比较蛋白质工程改造后的NHase2与NHase1在50 ℃下的稳定性差异,请简要写出实验思路:__ NHase2与NHase1在50 ℃下保温一段时间,再比较等量酶相同时间内催化底物量的多少__。  【解析】(4)腈水合酶(NHase)是一种金属酶,能催化腈类物质转化为相应的酰胺类物质,若要比较蛋白质工程改造后的NHase2与NHase1在50 ℃下的稳定性差异,可使其在50 ℃下保温一段时间,再比较等量酶相同时间内催化底物量的多少。 - 11 - 学科网（北京）股份有限公司 $