2026届高三生物一轮复习易错点2 引物的设计 练习

**基本信息** 聚焦引物设计专项，构建"结构功能-题型分类-限制酶选择"三阶方法体系，通过典例系统整合PCR技术与基因工程逻辑。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |基础原理|背景知识+例题1|选择题直接根据模板链3'端写序列；大题需先判断运载体限制酶，再在引物5'端添加识别序列|引物5'端（限制酶识别）与3'端（延伸）功能→Taq酶结合位点作用→序列书写规则| |应用实践|例题2-13|双酶切避免自身环化，引物设计需保证阅读框正确（如添加碱基维持3倍数）|限制酶选择→引物序列设计→基因表达载体构建，体现科学思维与探究实践素养|

易错点2 引物的设计 1. 相关背景知识 (1)引物的5' 端需要添加有相应的限制酶识别序列，用以切割出相应末端，以便与运载体切割的相应末端进行连接。3' 端添加脱氧核苷酸用以延伸子链。 (2)引物的作用：提供Taq酶的结合位点，使Taq酶能从引物的3' 端延伸子链。 (3)选择题的考查：通常题干未给出任何限制酶信息，目的基因上也没有给出任何限制酶信息，此类问题的引物书写只需要根据模板链3' 端序列写出引物的相关序列即可。大题的考查：通常给出运载体上的全部限制酶相关切割位点，但是目的基因所在DNA上没有给出所需要使用的限制酶。此类题目需要先根据运载体的切割情况判断使用哪两种限制酶进行切割,进一步确定目的基因两侧所用的限制酶后，在引物5' 端额外添加限制酶识别序列. 例题1 如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析： 扩增X蛋白基因所需的引物序列是___________________； _______________________________________。 答案　5′－ATGCCGTAAGTCCTAC－3′；5′－TGATCTACGGCTTACA－3′ 例题2 .CRISPR-Cas12a系统是第二类用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas系统，该系统主要包含crRNA和Cas12a蛋白两部分，crRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas12a蛋白到相应位置剪切DNA。某科研团队基于CRISPR-Cas12a系统对宫颈癌细胞中的KIFC1基因进行敲除，来探讨KIFC1基因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。 （1）在CRISPR-Cas12a系统中，crRNA的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含______________种核苷酸；细菌细胞中的____________也能起到类似Cas12a蛋白的作用。若要将KIFCI基因从目标DNA上剪切下来，需要设计______________种crRNA。 （2）为保证目的基因与PX458质粒正确连接，在扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，其中P1的碱基序列为5′-___________-3′（写出前9个碱基）。采用PCR技术对一个DNA进行扩增时，第n次循环共需要引物______________个。 （3）在目的基因与PX458质粒连接时，可用______________（填“E．coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）进行连接。 答案：（1）8　　限制酶　　2 ；（2）CAGCTGCTC　　2n ；（3）T4DNA连接酶 例题3 基因工程可以赋予生物新的性状，科研人员利用基因工程技术以期待获得具备抗旱特性的小麦。请回答下列问题：(1)研究发现，某些植物的种子脱水数十年后复水仍能够恢复活性，原因是细胞中积累了海藻糖。科研人员拟将酵母菌的海藻糖合成酶基因（TPS）转入小麦中。下图标注了载体、TPS基因的酶切位点和预期的基因表达载体的结构，表格列举了限制酶的识别序列。    ①科研人员利用PCR技术获得大量的TPS基因。现将2种引物的一侧添加限制酶识别序列，这样TPS基因的PCR产物和载体用相同的限制酶切割后，可利用 酶将TPS基因拼接到载体的切口处，形成基因表达载体。 ②从图分析，在TPS基因两侧引入的是 限制酶的酶切位点。设计的引物序列为 。 答案：①DNA连接酶；②BamH1 Sac1 ③5’GGATCCGAATCGAACGATTAGCAACT 3’ 5’GAGCTCAGCCTAACGTACAAGTTCGT3’ 例题4 (2024·辽宁大连一模)为研究干旱胁迫基因LEA和VOC对甘蓝型油菜油脂的积累机制，科研人员构建了两个基因表达载体。其中基因LEA与荧光素酶基因(Lue)构建成基因表达载体甲，基因VOC和标记基因构建成基因表达载体乙，相关序列及酶切位点如图所示。箭头表示转录方向。 (1)利用PCR扩增LEA基因时，需要在引物的_______(填“3'端”或“5'端”)添加限制酶识别序列，添加序列对应的限制酶是_____________,若产物中除了目的基因外有其他DNA片段存在，从引物角度考虑，原因可能是__________ (2)为了构建基因表达载体甲，依据图中已知碱基序列，在PCR扩增仪中加入的引物的碱基序列为5′-_____ ____-3'和5'-__________-3'。基因表达载体中启动子的作用是 ____ (3)常用农杆菌转化法将目的基因导入油菜受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插人Ti质粒的______上，经过转化作用，进入油菜细胞，并将其插入____________,从而使其得以维持稳定和表达。 (4)乙酰-CoA羧化酶基因(AC)是油脂合成过程的关键酶基因，甘油三酯酯酶基因(ATGL)是油脂分解过程的关键酶基因。将基因表达载体甲、乙分别导人植物细胞培养成转基因植物A、B,在干旱胁迫的环境下培养两种转基因植物和正常植物，分别检测植物体内AC和ATGL基因的表达水平，结果如下图。 ①在分子水平上，用 方法检测AC酶和ATGL酶的含量可得到上述表格结果。 ②基于以上研究，干旱胁迫基因LEA和VOC在甘蓝型油菜油脂积累中的机制是 答案：(1)5′端EcoRV和XbaI引物特异性差；复性温度较低，引物与模板结合随意性大 (2)GATATCATGGGC TCTAGACTAGTG 启动和调控基因的转录 (3)T-DNA染色体DNA (4)抗原-抗体杂交LEA通过促进AC的表达使植物油脂增加；VOC通过抑制ATGL的表达从而减弱油脂的降低 例题5 (2024·河北邢台二模)透明质酸(HA)又称玻尿酸，是重要的医学材料和化妆品添加原料。枯草芽孢杆菌无透明质酸合成酶(HAS),但含有HA代谢的其他途径，而链球菌含有HAS的基因(H基因)。研究者通过基因工程来改变枯草芽孢杆菌代谢通路，以实现枯草芽孢杆菌生产HA。 (1)目的基因的获取和扩增：从链球菌获取H基因，为通过外源添加诱导剂来控制H基因的表达，研究者选择含木糖诱导型启动子的p质粒作为H基因的运载体，其中EcoRV识别序列为5′一GATATC-3',XbaI识别序列为5'—TCTAGA-3',H基因以a链作为转录模板链，据此推测H基因的转录从其___ (填“左侧”或“右侧”)开始。利用PCR扩增H基因时，需依据图中已知碱基序列及以上信息，设计的两种引物碱基序列为_____和 (写出5'端的10个碱基)。 (2)基因表达载体的构建：用Xbal酶和EcoRV酶处理目的基因和p质粒，然后加入_ 酶催化重组质粒形成。 (3)目的基因的导入与筛选：将构建好的重组质粒转人经______处理的枯草芽孢杆菌，在含_的培养基上筛选，得到枯草芽孢杆菌A。 (4)菌种扩大培养与发酵：用发酵工程对转基因枯草芽孢杆菌进行大规模培养，该工程的中心环节是 。扩大培养的枯草芽孢杆菌A接种一定时间后添加______,诱导合成HA。HA对枯草芽孢杆菌来说属于____(填“初生”或“次生”)代谢产物。 答案：(1)右侧5′-GATATCCTAG—3′ 5′—TCTAGAATGG—3' (2) DNA连接 (3) Ca²+四环素 (4) 发酵罐内发酵 木糖 次生 例题6 人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）是胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，近年研究发现，结肠癌等多种恶性肿瘤细胞的hCGβ基因也有表达，hCGβ与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图为其制备的基本方案。回答下列问题： 注：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔；AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；各种限制酶对应的线条所指为其识别序列。 (1) 图示hCGβ基因是人工合成的目的基因，在设计引物对其扩增时，为防止目的基因与质粒的自身环化并保证连接的方向性，可在其两端添加 限制酶的识别序列。经实验得知该基因扩增引物长度为10个核苷酸时特异性强、效率高，已知目的基因①处的碱基序列为CCTTTCAGCTCA—， 则设计该端对应引物的序列是5＇ -3＇。 (2)从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是 。 答案：（1）Xho1 、Mum 1；CTCGAGCCTTTCAGCT (2) 可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来控制hCGβ生产 例题7 根据科学研究发现，乳酸链球菌通过细胞壁上的蛋白酶将牛奶蛋白(如酪蛋白)降解为寡肽，这些寡肽随后被细胞通过特定的寡肽渗透酶(OppA)系统内化，用于细胞生长。为增加OppA基因表达量，研究人员利用质粒和外源片段、强启动子构建了可以高表达OppA 的乳酸链球菌菌株。质粒、限制酶识别序列及酶切位点、OppA基因如图所示。请回答下列问题： （1） 结合图示分析，构建OppA基因高表达载体时，应该选择 _酶对质粒进行切割，理由是 （2） 用PCR技术扩增OppA目的基因时，应选用引物 (填序号)。本研究载体使用了乳酸链球菌的复制原点，其目的是 (3)已知OppA基因的甲链为编码链(与转录模板链互补的DNA链),甲链的碱基序列为5′-TTACAGCGCTCC-3',强启动子的碱基序列为5'-CATGC-3'。为便于与质粒连接，请写出OppA基因上游引物的15个碱基序列：5'- -3'。OppA基因的转录方向是 (填“从左往右”或“从右往左”)。 (4) 为了筛选出正确串联了强启动子、OppA基因的重组质粒菌落，研究人员用下表所示含有不同抗生素的平板进行筛选，表中平板类型d加人的抗生素应该是 ,得到的M、N、O三类菌落，其生长状况如表中所示(“+”表示生长，“一”表示不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是 。 答案： （1）BamH I 、Sal ；用这些酶不会破环全部标记基因； （2）②③；保证载体能在乳酸链球菌细胞中正常复制； （3）GGATCCCATGCTTAC;从左往右； （4）卡那霉素和氨苄青霉素；O 例题8科研人员根据获得的红花转录因子基因(CtWRI1)的cDNA序列设计引物，通过PCR获得CtWRI1编码序列，并通过烟草遗传转化对其功能进行研究。图甲为实验过程中使用的Ti质粒图谱及T－DNA结构，其中Rifr代表利福平抗性基因，bar代表除草剂抗性基因，LB和RB分别代表T－DNA的左边界和右边界。图乙为不同限制酶的识别序列及切割位点和CtWRI1的结构及转录方向。回答下列问题： (1)为了将CtWRI1编码序列与图甲中的Ti质粒正确连接，构建引物F和引物R时应在________端分别添加________的识别序列，通过酶切和连接后可获得连接产物。 (2)CtWRI1转录的模板链的序列为：5′－TTAGCCT……TACCGACAT－3′，请写出引物R的前10位碱基序列：5′－________________________－3′。 (3)通过________法将CtWRI1编码序列导入烟草细胞，利用含________的培养基对烟草细胞进行初步筛选，再通过________技术获得转基因烟草。可以通过________等技术从分子水平上检测烟草细胞的染色体DNA上是否插入了CtWRI1编码序列。 (4)科研人员测定野生型烟草(WT)和转基因烟草中CtWRI1的相对表达量、脂肪酸合成基因的相对表达量和种子含油量，结果见图丙。据图丙分析，转基因烟草种子含油量增加的可能原因是 ________________________________________________________________________。 答案　(1) 5′　Sac Ⅰ和Pst Ⅰ　(2)CTGCAGTTAG　(3)农杆菌转化　除草剂　植物组织培养　PCR　(4)CtWRI1的过量表达促进了脂肪酸合成相关基因的表达，进而促进了油脂的合成 例题9水稻胚乳可作为生物反应器用于开发功能性产品。从猪瘟病毒抗原蛋白的预期功能出发，研究小组设计其预期的结构，推测应有的氨基酸序列，合成新的基因X。利用PCR技术对其进行扩增并连接启动子1，形成Z片段。把Z片段插入Ti质粒的T-DNA中，将构建好的基因表达载体导入水稻细胞完成转化，在胚乳中获得相应蛋白，最终将蛋白进一步加工为植物源猪瘟疫苗。相关信息如图所示。 回答下列问题。 （1）研究小组通过PCR扩增Z片段，延伸过程中，____（填原料）在____催化作用下合成新的DNA链。酶切时，限制酶识别序列的重叠会降低切割效率。为构建基因表达载体，选择限制酶HindⅢ和____进行切割，可使Z片段插入T-DNA的效率最高。为使基因能够正常表达，质粒上的N和J应都为____。 （2）为获得含蛋白X的水稻材料，首先诱导水稻种子脱分化形成____，然后通过____的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化，再将其转接到含特定激素的培养基上，诱导其____形成具有根、茎、叶的完整植株。 （3）为验证水稻中目的基因X是否表达（转录和翻译），分子水平上的检测方法有____。 答案：（1）（4种 ）dNTP（脱氧核苷酸）　　耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）　　EcoR Ⅰ　　终止子 （2）愈伤组织　　农杆菌　　再分化 （3）PCR技术（分子杂交技术）；抗原—抗体杂交检测 例题10 研究表明，抗除草剂基因X有利于水稻的生长，同时还可以以杀灭田间杂草草。某科研小组利用农杆菌转化法将TI质粒上的T-DNA随机整合到水稻的基因组中，筛选到抗除草剂基因的纯合突变株。请回答下列问题。 (1) 农杆菌在自然条件下侵染_______植物，Ti质粒上启动子的作用是_ (2) 为获取正向连接的重组质粒，进行如下操作： ①选用图1中的Smal对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择Smal和___对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是____________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。 ②经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶_________ 进行完全酶切并电泳检测，如图2所示。发现既有正向连接的重组质粒，又有反向连接的重组质粒，其中一定为正向连接的重组质粒是_____(选“①”“②”或“①和②”)。 答案：(1)双子叶植物和裸子； RNA聚合酶识别并结合的位点，同时启动基因转录 （2）EcoR I DNA聚合酶 Sma I、Spe I ② 例题11水稻是一种盐敏感型作物，土壤的盐碱化严重制约了水稻的产量和品质。研究人员克隆出了抗盐的S基因(图甲),利用农杆菌转化法将S基因和运载体(图乙)重组构建的基因表达载体导入水稻愈伤组织，培养出耐盐的水稻株系。图中限制酶的识别序列为Pst I(5'-CTGCA⬇G-3')、HindⅢ(5'-A⬇AGCTT-3')、SmaI(5′-CCC⬇GGG-3')、XbaI(5'-T⬇CTAGA-3')。回答下列问题： (1)运载体除了具有图示中的结构外，还应该具有复制原点，其作用是_____。若需通过PCR使S基因两端具有SmaI酶切位点，需要在引物的5′添加的序列为5'-___-3'。 (2)构建S基因表达载体时，科研人员利用限制酶Sma I对运载体进行切割得到平末端，选择限制酶___对运载体进行切割，得到的黏性末端是5′突出末端(单链片段最末端为5')。利用DNA聚合酶将该5′突出末端补平为平末端后，再与S基因进行拼接得到重组质粒。将重组质粒导入农杆菌后，利用______筛选纯化后再用限制酶__进行酶切并电泳检测，若电泳结果呈现2条带且有一条的长度约为_____(填“780 bp”“310 bp”或“1090 bp”),则该重组质粒中S基因连接正确。 (3)用S基因正确连接的农杆菌侵染水稻愈伤组织时，S基因被整合到___,需使用含_____的选择培养基进行筛选，筛选后愈伤组织经_____过程形成芽、根，继续培育可获得耐盐的水稻植株。 (4)经检测，科研人员发现转基因水稻中的基因S表达的mRNA量不足，以致于耐盐能力较弱。请结合所学知识，提出一条提高该转基因水稻耐盐能力的改进思路______。 答案：(1)保证质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制 CCCGGG (2)HindⅢ 氨苄青霉素； Sma I和Xba I； 780 bp； (3)水稻愈伤组织的染色体DNA上； 高浓度盐；再分化； (4)为基因S组装在水稻细胞中高表达基因的启动子；组装强启动子；改造S基因使其更加适合于在水稻细胞内表达等(2分) 例题12 随着土壤盐渍化(主要是Na+引起)不断加剧，提高耐盐性已成为研究和改良作物的重要方向。从高盐环境中吸收K+可维持细胞内K+Na稳态，从而提高植物的耐盐性。H是细胞膜上的一种K+转运蛋白，B蛋白可以增强H的功能。为探究作用机理，研究人员构建了两个分别含有CFP-B和YFP-H融合基因的表达载体。CFP和YFP分别是青色荧光蛋白基因和黄色荧光蛋白基因。为了获得含CFP-B的表达载体，选择了已经包含CFP的载体p1300-CFP。相关信息如图所示。请回答下列问题： (1)为将B基因连入CFP基因，需使用两端带有酶切位点序列的引物扩增B基因，优先选择的酶切位点是________________，理由是_________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________。 (2)据此，研究人员使用的两条引物序列分别为5′－XXXXXXNNATGGCCGGC－3′和5′－YYYYYYCTACTCAGA－3′。X和Y分别代表(1)选择的酶切位点，N代表任意碱基的核苷酸。第一条引物中NN的作用是______________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________。 第二条引物与图中B基因末端序列不相同的原因是____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________。 用同样的方法获得了含YFP－H融合基因的表达载体。 答案：(1)BamH Ⅰ和Pst Ⅰ　BsrG Ⅰ在CFP基因中存在，不能使用；双酶切可避免目的基因和载体自身环化和反向连接　(2)使得CFP与B基因之间的碱基个数为3的倍数，翻译时B基因不发生移码　第一条引物与模板链配对，序列与图示B基因序列相同，第二条引物与非模板链配对，序列应与图示B基因序列互补 例题13(2022·山东，25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。 ①为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是__________________________________________________________ ________________________________________________________________________， 为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。 ②PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图分析，出现该问题的原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 修改扩增P基因时使用的带有EcoR Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案：(1)①能与P基因模板链3′端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸　5′端　②P基因编码链的第一个碱基与EcoR Ⅰ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取　在引物中的EcoR Ⅰ识别序列3′端添加1个碱基 1 学科网（北京）股份有限公司 $