2026届高三生物二轮复习讲义易错点3 PCR

该高中生物学高考复习讲义聚焦PCR技术核心考点，涵盖原理、条件、过程、产物鉴定及引物计算等内容，按“基础原理—定量计算—技术应用”逻辑架构知识体系，通过易错点梳理、方法指导（如引物数量模型构建）、真题训练（29道例题覆盖选择与填空），帮助学生系统突破基因工程中的PCR难点。 讲义突出科学思维与探究实践，设计引物计算模型分析子代DNA类型，对比反向PCR、实时荧光PCR等技术原理，设置基础（产物鉴定）、综合（融合基因构建）分层练习，培养学生实验分析与逻辑推理能力，助力教师精准把控复习节奏，提升学生高考应考效率。

易错点3 PCR 相关背景知识 1.PCR的含义与原理:PCR是聚合酶链式反应的缩写,根据DNA半保留复制的原理,在体外快速扩增目的基因 2.PCR 条件:DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶、缓冲液(含Mg +) 3.引物本质:是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 4.PCR过程:变性(超过90 ) 复性(50 左右) 延伸(72 左右) 5.产物鉴定:琼脂糖凝胶电泳,其原理是:DNA可带电荷,在电场中会向相反的电极移动;DNA迁移速率:与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关 6.引物的数量计算: (1)如图:一个DNA分子n次扩增,则: ①子代DNA分子中双链不等长的DNA分子数为2n个; ②子代DNA分子中双链等长的DNA分子数为2n-2n个; ③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为2个; ④子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子数为2n-1个; ⑤复制过程中共需引物2n+1-2个; ⑥第n次复制需要引物2n个。 (2)已知引物1及引物2之间的序列为目的序列,若引物与DNA的结合位点如图所示,在第2轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。 7. 复性温度高,扩增特异性强;复性温度低,扩增效率高。引物长度越长,越容易形成氢键,为避免出现错配,需要适当提高复性温度;引物GC含量越高,容易出现非特异性结合,需要适当提高复性温度。 例题1 (2024 黑吉辽,7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是( ) A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 答案 A 例题2 为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。如图所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是_。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是_。 答案 乙和丙 目的基因反向连接 例题3 利用PCR获得目的基因后,用限制酶EcoR 同时处理目的基因与质粒,拼接后可得到重组基因表达载体,其部分DNA片段如下图所示。下列有关引物的分析正确的是( ) A. 通过PCR进行目的基因的扩增时,所选的引物可为引物1和引物5 B. 检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时,应选引物2和引物4 C. 若设计的引物与模板不完全配对时,可以适当提高PCR复性的温度 D. DNA聚合酶能够与引物结合,并从引物的5’端依次连接脱氧核苷酸 答案 B 例题4 科学家采用了下图所示流程,将除草剂抗性基因G导入到玉米细胞中,以期获得抗除草剂性状的转基因玉米,回答下列问题: (1)基因表达载体除了含目的基因、特定限制酶切割位点、复制原点外,还必须有_ _,以确保导入的基因正常表达及后续的筛选。 (2)图中采用_法将目的基因转移到玉米细胞中,除草剂抗性基因G必须插入Ti质粒的T-DNA中,原因是_ _。 (3)科学家设法将目的基因整合到受体细胞的叶绿体基因组中,目的是_ _ _。 (4)构建重组表达载体后,为了确定除草剂抗性基因G是否连接到改造后的载体中且插入方向正确(下图示为除草剂抗性基因G以正确的方向插入到载体中的情况),需进行PCR和凝胶电泳来检测和判断,若仅用一对引物,应选择图中的引物①③或_(填序号)。该PCR反应体系中需加入_以提高DNA聚合酶活性。 答案 (1)启动子、终止子、标记基因 (2)农杆菌转化 只有T-DNA可转移并整合到玉米细胞的染色体DNA上 (3)防止转基因作物的目的基因通过花粉转移到自然界中的其他植物中,造成环境污染(答案合理即可) (4)②④ Mg2+ 例题 5 某植物基因D位于6号染色体上,基因d由基因D突变产生,仅含基因d时会造成花粉不育。将一个基因D插人基因型为Dd的植株9号染色体上,让该植株自交得子一代,对子一什基因D和d进行PCR扩增及电泳鉴定,所用引物和扩增产物的电泳结果如图所示。下列分析错误的是( ) A.基因D插入植株9号染色体属于基因重组 B.应选择引物S1和R2、T2和W1对子一代进行PCR扩增 C.若只看基因D和d,该植株产生的可育花粉中不含基因d的占比为1/2 D.子一代中电泳结果为类型 的植株占比为1/3 例题6某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图1所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图2所示。下列叙述不正确的是( ) A.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白 B.Gata3基因的启动子可同时控制GFP基因的表达 C.若用引物1和引物3进行PCR,不利于区分杂合子和纯合子 D.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 答案:D 例题7 血清白蛋白()是血浆蛋白的主要成分,具有维持血浆渗透压和进行物质运输的功能。科学家利用转基因技术获得转基因的大肠杆菌,通过发酵工程,实现的大量生产,下图表示基因。下列叙述错误的( ) A.过程每次循环分为3步,其中温度最低的一步是第二步 B.扩增出基因并用于表达载体的构建,应选择引物 和引物 C.在反应缓冲液中加入的作用是激活耐高温的聚合酶 D.用方法检测大肠杆菌是否导入基因,预变性过程可促进模板边解旋边复制 答案:D 例题8 如图是PCR技术扩增中,引物对与模板结合的示意图,则由一个该模板DNA片段扩增n次后,可获得2n个子代DNA片段。下列有关叙述正确的是( ) A.该过程需要的原料是核糖核苷酸 B.该过程中至少需要引物的数量是2n-2 C.该过程需要解旋酶和热稳定DNA聚合酶 D.两条链等长的子代DNA数量是2n-2n 答案:D 例题 9 PCR引物的3’端为结合模板DNA的关键碱基,5’端无严格限制,可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是( ) A.该图表示PCR循环中的变性环节 B.PCR第四次循环要消耗15对引物 C.TaqDNA聚合酶催化相邻的两个游离dNTP之间形成磷酸二酯键 D.用图中引物扩增两个循环后即可获得添加限制酶切点的产物 答案 D 例题10 如图为利用重叠延伸PCR的方法在蛋白a基因中部引入定点突变(A/T碱基对变为G/C)的过程。该过程需设计四种引物,其中引物A、D与蛋白a基因的两端完全配对,引物B、C虽与蛋白a基因中部配对,但在欲引入突变的位置替换为突变后的碱基。通过多次独立的PCR达到目的。回答下列问题: (1)PCR1所用引物应为_。PCR1和PCR2必须分开进行的原因是_。得到图中由c、d链构成的完整DNA分子至少需要PCR2进行_次循环。 (2)将PCR1、2的产物混合后,继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应中经过高温变性后,当温度下降到55 ,能够互补配对的DNA链相互结合,理论上有_种结合的可能,其中能进行进一步延伸的有_种。 (3)PCR3_(填“需要”或“不需要”)额外加入引物,PCR4的作用是大量扩增突变基因,该过程所用引物是_。 答案 (1)引物A和B 引物B和引物C存在碱基互补配对片段,置于同一反应体系会发生碱基互补配对导致引物失效 2 (2)4 1 (3)不需要 引物A和D 例题 11 重组PCR技术是一项新的PCR技术,通过重组PCR技术能将两个不同的DNA连接成为一个新DNA分子,某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB和ST1两个基因片段,利用重组PCR技术构建了LTB—ST1融合基因,制备过程如下图所示.回答下列问题: 利用PCR技术扩增目的基因的过程中,向反应体系中加入的物质除了引物和模板链,还需要加 ; 从P2,P3两种引物的角度分析,LTB和ST1基因能够融合的关键是 ;PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行,原因是 .②过程不需要加入引物,原因是_ 科研小组为了检测是否成功构建出融合基因,将反应后体系中的各种DNA分子进行电泳,结果如图所示.则融合基因最可能是_ 判断依据是_ 答案:耐高温的DNA聚合酶和脱氧核苷酸;这两种引物的部分区域能进行碱基互补配对;P2和P3能结合,会干扰引物和模板的结合,影响P过程;两条母链可作为合成子链的引物 3;融合基因包含两个不同的基因,其分子量较大,3表示的DNA分子量最大 例题 12 融合PCR技术是采用具有互补末端的引物,将不同来源的扩增片段连接起来的方法,其过程如图1所示。图2是中间载体1和中间载体2(利用融合PCR技术构建成)构建成叶绿体定点整合表达载体示意图(限制酶酶切位点标注于载体外侧),叶绿体定点整合表达载体通过与叶绿体基因的同源重组,将目的基因整合于叶绿体DNA上的特定位点上。请据图回答下列问题: (1)图1第二阶段中引物2与引物3部分碱基的_关系使得两条DNA链能成功“搭桥”连接起来。 (2)若通过融合PCR技术将启动子、标记基因、目的基因、终止子拼接起来,需要设计_种引物,其中能够起着“搭桥”作用的引物有_种。 (3)图2中需使用_(填限制酶)和DNA连接酶将两中间载体构建成定点整合表达载体,途中定点整合表达载体上未标出的结构是_。 答案 (1)互补配对 (2)8 6 (3)Spe 、Sal 复制原点 例题 13如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如图(以EcoR 酶切为例)。请回答下列问题: (1)如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤 选用的引物必须是_(从表格引物①②③④中选择,填编号)。 名称 DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知序列 5′-AACTATGCGCTCATGA-GCAATGCGTAGCCTCT-3′ 3′-TTGATACGCGAGTACT-CGTTACGCATCGGAGA-5′ 引物 ①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′ ②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′ ③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′ ④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′ (2)对产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是_。 A.5′-AACTATGCG-AGCCCTT-3′ B.5′-AATTCCATG-CTGAATT-3′ C.5′-GCAATGCGT-TCGGGAA-3′ D.5′-TTGATACGC-CGAGTAC-3′ 答案 (1)②④ (2)B 例题14反向PCR是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图。下列叙述错误的是( ) A. 过程①可用同种限制酶切割磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键 B. 过程②需用DNA连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增 C.过程③需添加方向相对的引物1和3以便DNA聚合酶从其3′端延伸子链 D.过程③中将温度调至72 的目的是使引物与模板链通过碱基互补配对结合 答案:D 例题15 反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列(图中L、R)进行扩增的技术,其过程如图所示。下列相关叙述不正确的是( ) A.过程①用同一种限制酶对未知序列两端进行切割 B.过程②需要使用DNA连接酶,形成磷酸二酯键 C.过程③PCR体系需要添加耐高温的DNA聚合酶和解旋酶 D.该技术可检测T-DNA整合到植物染色体DNA的位置 答案 C 例题16 水稻穗粒数可影响水稻产量。农杆菌Ti质粒的T-DNA可以转移并随机插入野生型水稻基因组中(可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点),导致被插入的基因功能丧失,从而得到一系列水稻突变体。研究者从中筛选得到一株穗粒数异常突变体,为确定T-DNA插入植物细胞的染色体位置,可根据T-DNA序列,扩增其两侧未知序列比对,从而确定插入的染色体。 (1)图1所示序列使用限制酶酶切后,将所得DNA使用_酶连成环状(如图2),再设计引物进行PCR扩增,其中复性过程的作用是_。 (2)请根据图1的T-DNA的一条链的碱基序列,选出PCR中使用的引物序列是_和_(填序号)。 T-DNA序列 引物序列 5′-AACTATGCGC……CGTAGCCTAT-3′ ①5′-GCGCATAGTT-3′ ②5′-ATAGGCTACG-3′ ③5′-CGTAGCCTAT-3′ ④5′-AACTATGCGC-3′ (3)由图2中环状DNA至少经过_轮循环才能得到图示链状PCR产物(如图3)。 (4)经过与野生型水稻基因组序列比对,确定T-DNA插入2号染色体上的B基因中。研究发现,该突变体产量明显低于野生型,据此推测B基因可_(填“促进”或“抑制”)水稻穗粒的形成,从而控制高产性状。 答案 (1)DNA连接 使引物通过碱基互补配对结合到模板链上 (2)① ③ (3)3 (4)促进 例题17 基因定点突变的目的是通过定向改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得,第一轮加诱变引物和侧翼引物,第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物,过程如图所示。下列叙述错误的是( ) A.第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度 B.PCR扩增的定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译 C.第一轮PCR的产物的两条DNA链作为第二轮PCR所用的引物 D.将某蛋白质的第21位组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC),属于蛋白质工程 答案 C 例题18 巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应,使用两组不同的引物实现对目标DNA片段的扩增。第一组外引物大小为25 bp,复性温度较高(68 ),扩增后得到中间产物;第二组内引物大小为17 bp,复性温度较低(46 ),内引物的结合部位在中间产物内部。具体过程如图一所示,回答下列问题: (1)巢式PCR反应体系中除模板、引物、Mg2+外,还应加入_(答出两点即可)等。 (2)巢式PCR时,复性温度与引物长度呈_(填“正相关”或“负相关”)。若使用外引物进行第一次PCR扩增时产生了错误片段,则使用内引物进行第二次PCR扩增时,完成配对并扩增的概率会_。由此可知,巢式PCR相较于常规PCR具有的优点是_。 (3)家畜胚胎的性别鉴定技术对畜牧业的发展具有重要意义。科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增奶牛Y染色体上的雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1),进行早期胚胎性别鉴定和胚胎移植,获得高产奶牛。 实验目的 方法步骤要点 囊胚样品DNA提取 选取滋养层细胞提取DNA PCR引物的设计和合成 根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计并合成a._对引物 PCR扩增 预变性 变性 复性 延伸 鉴定分析 采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定,确定胚胎性别 b._ 对受体奶牛注射前列腺素 胚胎移植 将符合要求的胚胎移植到受体奶牛的子宫内 ①请将表格内容补充完整:a是_;b是_。 ②巢式PCR产物鉴定结果如图二所示,1~5号为取自不同胚胎的DNA样品,其中符合要求的胚胎是_。 答案 (1)缓冲液、耐高温的DNA聚合酶(或TaqDNA聚合酶)、4种脱氧核苷酸(或dNTP) (2)正相关 下降 特异性强、灵敏度高 (3)①4 同期发情 ②1、2、4 例题19 东方果蝇繁殖力强,雌蝇产卵于果皮下, 幼虫孵化后钻入果肉中取食,造成水果腐烂失去商品价值。研究发现,东方果蝇中dsx基因转录出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制,仅雌果蝇的dsx基因转录出的前体RNA中内含子转录序列会被剪切掉。蓖麻毒素A链蛋白(RTA)可通过破坏核糖体导致细胞死亡。研究人员欲利用以上信息研发雌性特异性致死基因系统来控制雌蝇的危害,请回答下列问题: (1)研究者获得如图1所示的融合基因1,进而得到转基因果蝇。 ①首先,用PCR技术扩增dsx内含子,应选择图1中的引物_(选填字母)。 获得PCR产物后需要进行琼脂糖凝胶电泳实验,以便进行相关基因测序。制作凝胶时,将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具,并插入合适大小的梳子,目的是_。 ②然后将扩增的dsx内含子序列插入RTA基因的内部,再连接_序列,构建含融合基因1的表达载体。 ③最后将含融合基因1的表达载体导入东方果蝇的_(填受体细胞名称)中进一步获得转基因果蝇。据图2判断,转基因雌蝇中的成熟mRNA为图中的_(填字母序号)。 (2)研究发现,RTA蛋白第212位氨基酸——甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感(cs)效应, 即当温度由29 变为18 时,可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。 ①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白,先要推测对应的_,再经定点突变获得融合基因2(如图3所示)。请在方框中画出可继续延伸的复性结果,要求标明每条链的5′端和3′端。 ②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作: i:在29 条件下收集雄性果蝇(G0)。 ii:让G0与野生型果蝇杂交,筛选出转基因受精卵(G1)。 iii:将每对亲本的受精卵(G1)均分为两组,分别在18 和29 条件下孵化培养,统计两组中雄性个体所占比例,若_,则说明G1具有RTAcs蛋白。 iv:在_ 条件下继续培养具有RTAcs蛋白的G1果蝇,并使其连续多代相互交配, 得到转基因纯合子。 答案 (1)①a、d 形成加样孔 ②雌性特异性剪切识别 ③受精卵 C (2)①基因碱基序列 ②18 条件下的雄性个体所占比例小于29 条件下的 18 例题20 猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患病,临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。 (1)首先,从样本中提取病毒RNA,经_酶作用生成cDNA;然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增,测定样品中病毒核酸量。 (2)通过实时荧光PCR扩增目的基因,需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA,可与目的基因中部分序列特异性结合)。当探针完整时,不产生荧光。在PCR过程中,与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解,R与Q分离后,R发出的荧光可被检测到(如图1)。 ①当样本中有目的基因时,引物和探针与目的基因复性时,通过_原则而特异性结合。 ②在PCR循环的延伸阶段,TaqDNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈_(填“正相关”或“负相关”)。 (3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时,检测到的荧光强度变化如图2所示。 ①与指数增长期相比,线性增长期目的基因数量的增长率下降,原因可能有_。 ②Ct值的含义:在PCR扩增过程中,每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此,当样本中初始模板越多时,Ct值就_。 ③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明,Ct≤37判定为阳性,Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为_。 (4)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染,可能产生假阴性的因素有_(多选)。 a.取样太早,样本中病毒量少,达不到实时荧光PCR检测阈值 b.样本被污染,RNA酶将病毒RNA降解 c.病毒发生变异 答案 (1)逆转录 (2)①碱基互补配对 ②正相关 (3)①TaqDNA聚合酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降 ②越小 ③阳性 (4)abc 例题21 荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量,用于病毒检测。其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时,加入与某条模板链互补的荧光探针。当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针,使荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增一次,就有一个荧光分子生成(如图)。通过实时检测荧光信号强度,可得Ct值(荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数)。下列相关叙述错误的是( ) A.PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延伸3个阶段 B.耐高温的DNA聚合酶在该反应中的作用是形成磷酸二酯键和水解磷酸二酯键 C.最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本DNA的含量呈正相关 D.Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多,患者危险性更高 答案 D 例题 22 实时荧光定量PCR可用于对样品中特定DNA序列进行定量分析。将荧光标记的Taqman探针与待测样本DNA混合,当探针完整时,不产生荧光。在PCR过程中,与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解,R与Q分离后,在特定光的激发下R发出荧光,随着循环次数的增加,荧光信号强度增加,通过实时检测荧光信号强度,可得Ct值(达到荧光阈值所经历的循环次数)。下列相关叙述正确的是( ) A.荧光基因R连接在探针的3’端 B.该反应体系中并未加入ATP,所以新链的合成不需要消耗能量 C.TaqDNA聚合酶在该反应中的作用只有形成磷酸二酯键 D.Ct值越小,说明样品中特定DNA序列的含量越多 例题 23 不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法,如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物,含量较多的被称为非限制性引物,两者的比例通常为1∶100。PCR反应最初的若干次循环中,其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA),但当限制性引物消耗完后,就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的是( ) A.用不对称PCR方法扩增目的基因时,不需要知道基因的全部序列 B.进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量 C.最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列一致 D.因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同,可通过电泳方法将其分离 答案 C 例题 24 Gata3蛋白由444个氨基酸构成,属于锌指转录因子家族成员的一部分。研究显示Gata3基因是大量肿瘤细胞的潜在突变位点。为研究Gata3蛋白在细胞中的定位,科研人员将GFP(绿色荧光蛋白)基因与Gata3基因融合,形成Gata3-GFP融合基因。为获得转入Gata3-GFP融合基因的纯合小鼠,科研人员将绿色荧光蛋白基因 (GFP)插入含Gata3基因的载体中,然后导入小鼠受精卵,获得能正常表达融合蛋白的杂合雌、雄小鼠各一只。利用荧光蛋白活体成像系统进行检测,显示两只小鼠均为Gata3-GFP融合基因阳性转入小鼠。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图甲所示,A、B、C、F、R为不同引物。 (1)在PCR反应溶液中常添加Mg2+,其作用是_。在利用PCR扩增GFP编码区序列的过程中,需要设计引物F和R,在两个引物的(填“3'”或“5'”)_端需分别插入 _的限制酶识别序列,以使GFP基因能正确插入载体中。 (2)在GFP基因的扩增及重组载体的构建过程中,需要的酶有_。 (3)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠 (P)进行杂交获得F1若干,研究人员从这些小鼠中提取Gata3基因相关DNA片段,设计引物A和C用于PCR扩增,扩增产物电泳结果如图乙所示,则_小鼠是Gata3—GFP基因纯合子小鼠;若用引物A和B进行PCR扩增,_(填“能”或“不能”)通过条带数目区分GFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子,原因是_。 (4)DNA分子原位杂交也是基因定位的常用技术,分子杂交需使用特定序列的单链DNA(ss—DNA)作为分子探针,为制备大量单链DNA片段,研究人员常采用不对称PCR技术。其基本原理是采用不等量的一对引物,经若干次循环后,低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽,以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物,结果可获得大量ss—DNA.若反应体系中原有100个模板DNA,最初10个循环后限制性引物耗尽,再进行20个循环,理论上可制备ss—DNA _个(不考虑长度差异,可用科学计数法表示),在PCR的其他条件均适宜,引物总量一定的前提下,30个循环后最终中 ss——DNA的产生量主要受_的影响。 答案 :(1)激活DNA聚合酶的活性 5' Sal 、EcoR (2分) (2)TaqDNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶)、DNA连接酶、限制酶(2分) (3)1和5 不能 两种阳性小鼠提取的相关DNA片段扩增产物的电泳结果均只有一条条带(2分) (4)2.048 106 限制性引物和非限制性引物的比例(2分) 例题25 为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题: (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有_,扩增程序中最主要的不同是_。 (2)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有_ _。 (3)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有_。 A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D.抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化 (4)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板、用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图2。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有_。 (5)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是_ _。 答案 (1)模板、引物 引物的设计 (2)限制酶、DNA连接酶 (3)ABC (4)P3、P4 (5)电泳只能检测DNA分子的大小(长度),无法确定待检测DNA分子的碱基序列 例题26 为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因(基因序列如图1)融合表达,运用重组酶技术构建质粒,重组酶通过识别两个DNA片段上的特定相同序列,将不同DNA片段连接,从而实现DNA重组,如下图2所示。构建好的的环化质粒再导入大肠杆菌中并利用抗生素筛选。之后为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1-P4的扩增产物电泳结果如图3。根据下图回答下列小题。 【小题1】分别进行PCR扩增片段F1与F2时,配制的两个反应体系中需加入的不同物质是() A.酶和原料 B.引物和酶 C.引物和模板 D.原料和模板 【小题2】引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用 ①5'ATGGTG–CAACCA3'②5'TGGTTG-–—CACCAT3'③5'GACGAG—CTGCACG3'④5'CTGCAG——CTCGTC3' A.①③ B.②③ C.②④ D.③④ 【小题3】根据图3中结果判断,可以舍弃的质粒有() A.P1和P3 B.P2和P4 C.P3和P4 D.P1和P2 答案:C ;D;C 例题27 细菌中的蛋白激酶Y感受外界刺激后,利用ATP将特异性底物A蛋白磷酸化,改变A蛋白的活性从而应答外界刺激,调控细菌的生长。研究者将Y基因(编码蛋白激酶Y)与GFP基因(编码绿色荧光蛋白)拼接成Y-GFP融合基因(Y-GFP基因),导入载体,并表达出融合蛋白(Y-GFP蛋白),以分析蛋白激酶Y的功能,实验过程如图所示。 限制酶名称 EcoR BamH Xho Mun 识别序列 5′G AATTC3′ 5′G GATCC3′ 5′C TCGAG3 5′C AATTG3′ (1)据图分析,为获得Y-GFP融合基因,在设计引物时, 引物F2和F3序列应该分别选择( ) A.5′TCACTGCTAGCG3′ B.5′TTACGACTAGCG3′ C.5′CGCTAGTCGTAA3′ D.5′CGCTAGCAGTGA3′ (2)构建基因表达载体时,因融合基因两端不含酶切位点,根据题中所提供的限制酶,应当在引物F1和F4中分别添加_限制酶识别序列,若用EcoR 和BamH 切割(完全酶切)构建成功的表达载体,能够得到_个片段。 (3)常用_法将基因表达载体导入大肠杆菌,在检测融合基因表达情况时发现,能够检测到融合基因的mRNA,但表达的蛋白质只有蛋白激酶Y,原因是_ _。 (4)A蛋白磷酸化水平一定程度上代表了细菌对外界刺激的反应程度,在导入基因表达载体的大肠杆菌中,可通过直接观察_来反应这一情况。 答案 (1)BC (2)Mun 和Xho 两 (3)Ca2+处理 Y基因中编码终止密码子的序列未去除,翻译到终止密码子处停止翻译 (4)绿色荧光强度 例题28 血管新生在肿瘤发生和发展中起关键作用,为了研究血管生成素(Ang)是否能促进血管生成及作用原理,科学家构建了绿色荧光蛋白(GFP)基因和血管生成素融合基因,将其导入大肠杆菌来生产GFP -Ang融合蛋白,过程如图,字母a~h代表引物,序号①~⑤表示过程。 (1)Ang的cDNA可在细胞中提取mRNA后经_获得。为了过程②形成正确的GFP-Ang融合基因,在进行过程①(PCR)时需选择正确的引物并在引物_(填字母)的5'端添加BamH 限制酶识别序列,且添加的识别序列位于CFP基因中终止密码子编码序列的_(“内侧”或“外侧”)。 (2)过程③的目的是_。此时,为了使融合基因定向插入载体,要选用_两种限制酶切割融合基因和载体。生产中需要大肠杆菌在某些特定诱导物作用下表达GFP-Ang融合蛋白,则要在载体上构建_。 (3)以大肠杆菌作为受体细胞的优点有_(答出两点)。经过程④后的大肠杆菌需培养在含有_的培养液中,破碎大肠杆菌并提取到发绿色荧光的物质就是GFP-Ang融合蛋白。 (4)鉴定GFP-Ang融合蛋白与天然Ang作用效果差异,科学家取鸡胚分别用缓冲液、缓冲液溶解的天然Ang、缓冲液溶解的CFP-Ang融合蛋白处理,统计鸡胚毛细血管生成情况,结果如下表。 统计结果说明了_。若进一步观察到绿色荧光分布于毛细血管表面,则说明,Ang发挥作用的方式可能是与细胞表面的_相结合来实现的。 答案 (1)逆转录 c、g 内侧 (2)让目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用 EcoR 、Sal 诱导型启动子 (3)生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、容易进行遗传操作 氨苄青霉素 (4)GFP-Ang融合蛋白可以明显地促进血管生成,效果略低于天然Ang Ang受体 例题29 提高光合速率是提高作物产量的重要手段。Rubisco是催化光合作用CO2固定过程的关键酶,RCA是一种核基因编码的叶绿体蛋白,对Rubisco作用的发挥有影响。研究人员通过反义RNA技术有针对性地使水稻中rca基因沉默,以研究RCA与Rubisco间的调控关系。 (1)反义RNA分子能够依据_原则与特定序列相结合。推测反义mRNA使基因沉默的原理可能是_。 (2)得到反义RNA的关键是把原DNA序列反方向插入到表达载体中合适的启动子和终止子之间。反义rca基因表达载体构建过程示意图如图1。图中过程①用限制酶_和DNA连接酶处理,将rca基因连接到载体 上,经筛选获得如图所示结果,使rca两端引入与表达载体 相匹配的酶切位点;过程②中,用限制酶_和DNA连接酶处理,获得重组基因表达载体。为鉴定该基因表达载体中rca基因的插入方向,选用限制酶EcoRI对上述表达载体进行切割,若切下片段为_(选填“rca和终止子”或“仅终止子”),则为反义RCA基因表达载体。 (3)采用电激法将反义rca基因表达载体导入_中,再将其与水稻愈伤组织共培养成T0代幼苗。拟通过PCR筛选出转基因成功的T0代水稻幼苗。某同学提出应针对rca基因的特定序列设计引物,你认为该想法是否可行?请说明理由_。 (4)T0代幼苗移栽后45d内16株苗相继死亡,最终成活的突变体仅仅3株,株高都明显低于野生型水稻,为探究其原因,科研人员对转基因水稻和野生型水稻光合速率进行测定,结果如图2,分析结果可知rca基因能够水稻的光合速率。进一步对细胞中相关指标进行测定,结果如表所示。综合以上实验结果推测,rca基因影响水稻株高性状的机制是_ 答案:(1)碱基互补配对 反义RNA与正义RNA结合,抑制核糖体与其结合,阻断翻译过程进而抑制基因表达(或反义RNA与正义RNA结合,引发正义RNA降解,抑制翻译过程进而抑制基因表达;反义RNA与前体mRNA结合,抑制前体RNA的加工,抑制翻译过程进而抑制基因表达;反义RNA与DNA上相关基因的启动子结合,抑制该基因的正常转录,进而抑制基因表达)(写出其中一种即可) (2)EcoRI BamHI rca和终止子 (3)农杆菌 不可行,无论是否转入反义 rca基因,植物体内都有内源的rca基因 (4)提高rca基因提升Rubisco活力,促进CO2固定,提高光合速率,进而增加有机物积累量,促进植株生长 学科网(北京)股份有限公司 $