2026届高三生物二轮复习讲义专题八　第18讲　基因工程与应用 考向2 基因工程的应用与蛋白质工程

该高中生物学高考复习讲义聚焦基因工程的应用与蛋白质工程核心考点，以基因工程药物实例分析为基础，通过与蛋白质工程的对比构建知识网络，涵盖考向梳理、真题精讲、方法总结等教学环节，帮助学生系统掌握基因工程操作流程及蛋白质工程原理。 讲义突出高考真题导向，通过“研考题-变式探究-识破陷阱”环节培养科学思维，如结合限制酶识别序列分析基因插入方向、PCR引物设计等探究实践活动，分层设置基础巩固与能力提升练习，助力学生高效突破考点，为教师把控复习节奏提供清晰路径。

考向2 基因工程的应用与蛋白质工程 【通考源·知识奠基】 一、基因工程药物实例分析 1.人胰岛素及类似物: 生产流程如图 在大肠杆菌内,质粒通过转录与翻译后,便产生胰岛素蛋白质。通过大肠杆菌的大量繁殖,便可大量生产胰岛素。需注意的是大肠杆菌产出的是多肽链,因为原核生物没有内质网、高尔基体等,不能进行多肽的折叠、修饰等,还需人为进行菌体外加工。 2.重组人干扰素: 通过基因工程生产的重组人干扰素与天然干扰素的化学结构不完全相同,天然干扰素是一种糖蛋白,通过基因工程由大肠杆菌生产的重组人干扰素是没有糖链的,氨基酸序列与天然干扰素也不完全相同,这种改变增加了稳定性及活性。 二、蛋白质工程与基因工程的比较 【提醒】蛋白质工程的2项应用 (1)蛋白质工程可以改造现有的蛋白质,或者生产自然界中没有的蛋白质。 (2)蛋白质工程通过改造基因的遗传信息实现对蛋白质结构和功能的改造,而不是对蛋白质直接操作。 【研考题·方法领悟】 1.(2025·河北高考)为治理水体中对生物有毒害的镉污染,研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体,转入单细胞衣藻,实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁,以吸附水体中的镉离子。回答下列问题: (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中,随着PCR反应进行,分子数量逐渐减少的是____________和________。模板与引物在PCR反应的________阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,其原因为 ________________________________________________________________。  【解析】(1)在PCR反应中,原料是脱氧核苷酸,随着反应进行不断被消耗,分子数量逐渐减少;引物在PCR过程中会结合到模板DNA上参与子链合成,也会逐渐减少,所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。模板与引物在PCR的复性阶段开始结合。在复性过程中,温度降低,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,是因为PCR反应需要在高温条件下进行变性步骤(90~95 ℃使双链DNA解旋为单链),普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活,而耐高温的DNA聚合酶能在高温环境中保持活性,保证PCR反应的正常进行。 答案:(1)脱氧核苷酸　引物　复性　PCR反应需要在高温条件下进行变性步骤(90~95 ℃使双链DNA解旋为单链),普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活,而耐高温的DNA聚合酶能在高温环境中保持活性,保证PCR反应的正常进行 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时,为避免错误连接,需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列,其中GP1两端应添加__________________(填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时,可催化载体和目的基因之间形成__________键。  【解析】(2)观察图1,要避免错误连接,GP1两端应添加SmaⅠ和EcoRⅠ的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时,使用这两种限制酶切割可以产生不同的末端,能保证目的基因准确插入载体。又因为NbeⅠ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同,所以这两种限制酶只能选一个,按照连接的顺序在将GP1连接到载体时应该用SmaⅠ和EcoRⅠ。DNA连接酶连接时,可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键,从而将载体和目的基因连接起来。 答案:(2)SmaⅠ和EcoRⅠ　磷酸二酯 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为______________,初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后,若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量________,则表明融合蛋白能结合镉离子。  【解析】(3)若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光,初步表明融合蛋白表达成功,因为融合蛋白中有黄色荧光蛋白YFP,其表达后会发出黄色荧光。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后,若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高,则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中的CADR可吸附水体中的镉离子,且融合蛋白定位于细胞壁上。 答案:(3)细胞表面发出黄色荧光　高 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后,检测细胞密度,结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是______________________________________。  240μmol·L-1镉离子浓度下,转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是____________________________________________________________。  注:镉离子对渗透压的影响忽略不计。 【解析】(4)转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子,降低了镉离子对衣藻的毒害作用。240 μmol·L-1镉离子浓度下,转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高,超出了融合蛋白的吸附能力,对衣藻产生了严重的毒害作用。 答案:(4)转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子,降低了镉离子对衣藻的毒害作用　镉离子浓度过高,超出了融合蛋白的吸附能力,对衣藻产生了严重的毒害作用 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理,与施加化学药物法相比,能体现出其环境治理优势的两个特性是________和________。(填标号)  ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖 ②衣藻生长速率受镉离子浓度影响 ③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质 ④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 【解析】(5)转基因衣藻可用于水体铜污染治理,与施加化学药物相比,能体现出其环境治理优势的两个特性是①和③。①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖,能够持续发挥作用;③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质,避免水华的产生。②衣藻生长速率受镉离子浓度影响,不能体现出其环境治理优势。④会造成生物富集现象,不属于优势。 答案:(5)①　③ [高考变式探究] (1)PCR过程中变性时因高温导致TaqDNA聚合酶活性降低,但复性时其活性重新恢复,从结构角度分析,原因可能是______________________________________。  【解析】(1)短暂的高温变性,酶的活性通常是可以恢复的。因为Taq DNA聚合酶在高温下只是部分变性,其空间结构没有被完全破坏,当温度降低到适宜的范围,酶的活性可以重新恢复。 答案:(1)短暂高温空间结构没有被完全破坏,当温度降低到适宜的范围,酶的活性可以重新恢复 (2)诱导型启动子是指外界诱导(温度、化学物质等)才启动转录,具有时空可控性。为了使转基因衣藻能检测和除去水体中的镉离子,图1中拟构建载体中需要的改变是____________________。  【解析】(2)诱导型启动子经外界诱导(温度、化学物质等)才启动转录,因此可以设计一种镉离子诱导型启动子,并将其接入图1中拟构建载体中,实现转基因衣藻能检测和除去水体中的镉离子的功能。 答案:(2)将图中的启动子改换为镉离子诱导型启动子 2.(2025·陕晋青宁高考)马铃薯作为重要农作物,提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现,野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关,将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 限制酶 识别序列及切割位点 BglⅡ 5'-A↓GATCT-3' 3'-TCTAG↑A-5' NdeⅠ 5'-CA↓TATG-3' 3'-GTAT↑AC-5' XhoⅠ 5'-C↓TCGAG-3' 3'-GAGCT↑C-5' EcoRⅠ 5'-G↓AATTC-3' 3'-CTTAA↑G-5' BamHⅠ 5'-G↓GATCC-3' 3'-CCTAG↑G-5' Sal Ⅰ 5'-G↓TCGAC-3' 3'-CAGCT↑G-5' XbaⅠ 5'-T↓CTAGA-3' 3'-AGATC↑T-5' (1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、______________、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的__________步骤中起作用。  【解析】(1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步,其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。 答案:(1)4种脱氧核苷酸　延伸 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的__________(填“5'端”或“3'端”)添加限制酶识别序列,结合上表分析,上游引物应添加的碱基序列是5'-__________-3',切割载体时应选用的两种限制酶是__________,PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后,经纯化和连接,获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。  【解析】(2)为了使目的基因能够被限制酶切割,扩增目的基因时,需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。结合图表分析,在载体的启动子和终止子之间有BamHⅠ、EcoRⅠ和XbaⅠ的识别序列,而S基因内部含有XbaⅠ、NdeⅠ和BamHⅠ的识别序列,要用BamHⅠ、EcoRⅠ或XbaⅠ切割载体,又不能用XbaⅠ、NdeⅠ或BamHⅠ切割S基因,再根据各种限制酶的识别序列及切割位点和S基因的转录方向可知,需要在S基因上游添加BamHⅠ的同尾酶BglⅡ的酶切位点,下游添加EcoRⅠ的酶切位点,再用BamHⅠ、EcoRⅠ切割载体,用BglⅡ和EcoRⅠ切割S基因,故PCR扩增S基因时,上游引物需添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'。 答案:(2)5'端　AGATCT　BamHⅠ、EcoRⅠ (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到________________________,抗性基因__________可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经__________形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。  【解析】(3)T-DNA属于可转移DNA,用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上,抗性基因2位于T-DNA内部,可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 答案:(3)栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上　2　再分化 [识破命题陷阱] 难点 第(2)小题 命题 陷阱 命题人提供引物“5'端”或“3'端”两个干扰。命题人设置的本小题的第二个空和第三个空解答时应该先解答第三个空才能解答第二个空;限制酶选择需要考虑多个条件的整合 答题 攻略 PCR扩增S基因时,若在引物的3'端添加限制酶识别序列,一是干扰引物和模板结合,二是载体和S基因经酶切后连接时,S基因会被破坏。 判断切割载体选择两种限制酶及S基因两侧应添加的限制酶时,需要考虑:载体的启动子和终止子之间有BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ的识别序列(切割载体时从这三种中选);S基因内部含有Xba Ⅰ、Nde Ⅰ和BamH Ⅰ的识别序列(S基因两侧不能添加这三种限制酶);S基因正确接入质粒中(根据图中信息,图示S基因的上边链的3'要靠近启动子接入);需要在S基因上游添加同尾酶Bgl Ⅱ的识别位点。 综上可推知,需要用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ切割载体,用BamH Ⅰ的同尾酶Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ切割S基因,故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3' 【练考向·素养提升】 1.(2025·青岛二模)为能快速找到特定抗原的高亲和力抗体,研究者构建抗体文库。从免疫后动物的特定细胞中提取总mRNA,反转录成cDNA,经PCR扩增后,构建重组载体,再把重组载体转化到宿主细胞,形成含不同抗体基因的细胞集合,即抗体文库。下列说法错误的是(　　) A.“特定细胞”是B淋巴细胞 B.反转录出的cDNA全部是抗体基因 C.基因需要定向插入启动子和终止子中间才能表达 D.抗体分布在宿主细胞表面有利于进行抗体筛选 【解析】选B。抗体是由浆细胞(效应B细胞)产生的,而浆细胞是由B淋巴细胞分化而来,从免疫后动物中提取能产生抗体相关mRNA的“特定细胞”是B淋巴细胞,A正确;从B淋巴细胞中提取的总mRNA包含了该细胞内多种基因转录形成的mRNA,反转录出的cDNA不全部是抗体基因,还有其他基因对应的cDNA,B错误;启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录,终止子终止转录,基因需要定向插入启动子和终止子中间才能正常表达,C正确;如果抗体分布在宿主细胞表面,就可以利用抗原-抗体特异性结合的原理,方便进行抗体筛选,D正确。 2.(2025·沈阳模拟)肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是存在于肿瘤组织中的免疫细胞,具有识别和杀死肿瘤细胞的能力。TIL疗法是一种新型治疗癌症的免疫疗法,治疗过程如图所示。其中新抗原是指肿瘤细胞由于基因突变产生的独特蛋白质片段。下列叙述错误的是(　　) A.TIL疗法增强了患者体内的细胞免疫 B.TIL细胞发挥类似细胞毒性T细胞的功能 C.TIL取自患者自身的肿瘤组织,一般不存在免疫排斥反应 D.SEL-TIL经过基因工程的改造后才能重新输入患者体内 【解析】选D。TIL疗法是将经过筛选的能特异性识别肿瘤新抗原的SEL-TIL细胞激活,然后输入患者体内,因此增强了患者体内的细胞免疫,A正确;TIL具有识别和杀死肿瘤细胞的能力,其功能类似细胞毒性T细胞,B正确;由于TIL取自患者自身的肿瘤组织,因此输入患者体内一般不存在免疫排斥反应,C正确;由图示可知,SEL-TIL不需要经过基因工程的改造,D错误。 3.人胰岛素的第20~29位氨基酸序列容易引发胰岛素分子聚合。为抑制该现象,研究人员对人胰岛素进行了改造,下列相关叙述错误的是(　　) A.X射线衍射技术能为确定胰岛素空间结构提供依据 B.可以通过基因的定点突变来实现氨基酸的替换 C.改造后胰岛素的空间结构发生了变化 D.改造胰岛素时利用的原理是基因重组 【解析】选D。X射线衍射技术能为确定胰岛素空间结构提供依据,A正确;可以通过基因的定点突变来实现氨基酸的替换,属于蛋白质工程,B正确;由于胰岛素中氨基酸结构改变,所以胰岛素空间结构发生了变化,C正确;对人胰岛素进行改造利用的是蛋白质工程的原理,蛋白质工程是通过基因修饰或基因合成对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质,其原理不是基因重组,基因重组一般应用于基因工程等,D错误。 4.(2025·广州模拟)淀粉经淀粉酶催化水解后的产物是重要的工业原料,但工业化生产常需要在高温条件下进行,而现有的淀粉酶耐热性不强。科研人员发现将淀粉酶(AmyS1)第27位的亮氨酸替换为天冬氨酸后,能产生耐热性高的淀粉酶(AmyS2)。科研人员利用蛋白质工程设计并人工合成了AmyS2基因,将其导入芽孢杆菌,过程如图1所示。最终结果表明,与导入质粒B相比,导入质粒C的芽孢杆菌的培养液中更易获得并提纯AmyS2。回答下列问题: (1)科研人员利用蛋白质工程对淀粉酶(AmyS2)进行了如下改造:预期AmyS2的功能→设计AmyS2的结构→设计AmyS2的__________________→人工合成AmyS2基因的__________________序列→将获得的AmyS2基因导入芽孢杆菌生产AmyS2。  【解析】(1)蛋白质工程是根据人们对蛋白质功能的特殊要求,对蛋白质的结构进行分子设计,最终通过基因完成,故基本流程是:预期蛋白质功能→蛋白质分子结构设计→推测氨基酸序列多肽链→据核苷酸序列推出脱氧核苷酸序列→DNA合成。本实验利用蛋白质工程对淀粉酶(AmyS2)进行了如下改造:预期AmyS2的功能→设计AmyS2的结构→设计AmyS2的氨基酸序列→人工合成AmyS2基因的脱氧核苷酸序列→将获得的AmyS2基因导入芽孢杆菌生产AmyS2。 答案:(1)氨基酸序列　脱氧核苷酸 (2)根据图2分析,利用PCR技术扩增AmyS2基因时,应选择甲、乙、丙、丁4种引物中的__________。若将该基因扩增过程中至少经过______次循环,可获得32个符合要求的目的基因。  【解析】(2)PCR扩增目的基因时,DNA聚合酶从引物3'端开始延伸子链。据图分析可知,扩增AmyS2基因时,应选择引物乙、丙;设至少经过n次循环可获得32个符合要求的目的基因。PCR扩增时,1个DNA分子经过n次循环后得到2n个DNA分子。由于第一次循环得到的2个DNA分子只有1条链是新合成的(含引物),从第二次循环开始,每次新合成的DNA分子都含引物,且符合要求的目的基因两端都含引物。经过n次循环后,含引物的DNA链数为2n+1-2,要获得32个符合要求的目的基因(即32个双链DNA),则含引物的DNA链数为64,所以2n+1-2=64,即2n+1=66,因为26=64,27=128,所以n至少为6。 答案:(2)乙、丙　6 (3)将AmyS2基因与原始质粒A构建成质粒B,应选择的限制酶是____________;将质粒B与信号肽基因构建成质粒C,应选择的限制酶是____________。在工业生产中,使用导入质粒C的工程菌生产α-淀粉酶时,更容易从培养液中获取并提纯目标蛋白质,据此推测,信号肽的功能可能是_____________________________。  【解析】(3)目的基因上只有BamHⅠ、NdeⅠ和EcoRⅠ识别序列,若用BamHⅠ进行切割,会破坏AmyS2基因,因此选择NdeⅠ和EcoRⅠ进行切割;根据质粒C的结构以及信号肽基因上的酶切位点可知,将质粒B与信号肽基因构建成质粒C,应选择的限制酶是MluⅠ和Eco52Ⅰ;在工业生产中,使用导入质粒C的工程菌生产α-淀粉酶时,更容易从培养液中获取并提纯目标蛋白质,据此推测,信号肽的功能可能是引导目标蛋白质分泌到细胞外。 答案:(3)NdeⅠ和EcoRⅠ　MluⅠ和Eco52Ⅰ　引导目标蛋白质分泌到细胞外 【加固训练】 农杆菌Ti质粒的T-DNA可以转移并随机插入野生型水稻基因组中,导致被插入的基因功能丧失成为突变体。草甘膦是一种除草剂,但会影响水稻产量。研究人员拟采用农杆菌转化法对水稻高产基因进行定位,培育抗草甘膦高产水稻新品种。操作如下: (1)获得突变体:用农杆菌处理水稻,筛选出含有单一位点插入T-DNA的突变体,如下图。 研究发现,该突变体产量明显低于野生型,据此推测,插入位点所在的B基因可____________(填“促进”或“抑制”)水稻穗粒的形成。  【解析】(1)已知突变体产量明显低于野生型,且突变体是因为T-DNA插入导致B基因功能丧失,所以可推测插入位点所在的B基因可促进水稻穗粒的形成。 答案:(1)促进 (2)基因定位:用基因工程的操作基本工具——________________处理突变体DNA,从而获得环状模板并进行PCR扩增。  ①T-DNA碱基序列为5'-AACTATGCGC……CGTAGCCTAT-3',则PCR所需的引物是:5'-____________-3'(写出10碱基)和:5'-____________-3'(写出10碱基)。  ②为避免外源DNA等因素的污染,微量离心管、枪头和蒸馏水等在PCR前需进行____________处理;扩增缓冲液中需要加入Mg2+,作用是____________;所有组分加入后,PCR前需对微量离心管进行________操作。  ③PCR产物常采用____________方法进行鉴定;长度不同的DNA片段在凝胶中的____________不同,最终导致分布于不同位置。  ④经过与野生型水稻基因组序列比对,确定B基因位于2号染色体上。 【解析】(2)基因工程操作中获取目的基因时,用限制酶和DNA连接酶处理突变体DNA,从而获得环状模板进行PCR扩增。 ①已知T-DNA碱基序列为5'-AACTATGCGC……CGTAGCCTAT-3',需扩增T-DNA两侧的未知序列,子链由T-DNA分别向未知序列延伸,根据PCR扩增的原理,引物与模板链的5'端结合进行扩增,所以PCR所需引物为:5'-GCGCATAGTT-3'、5'-CGTAGCCTAT-3'。 ②为避免外源DNA等因素的污染,微量离心管、枪头和蒸馏水等在PCR前需进行高压蒸汽灭菌处理;扩增缓冲液中加入Mg2+,是因为Mg2+可激活耐高温的DNA聚合酶;所有组分加入后,PCR前需对微量离心管进行离心操作,使反应体系集中在管底。 ③PCR产物鉴定常用琼脂糖凝胶电泳方法;长度不同的DNA片段在凝胶中的迁移速率不同,最终导致分布于不同位置。 答案:(2)限制酶和DNA连接酶　GCGCATAGTT　CGTAGCCTAT　高压(蒸汽)灭菌　激活耐高温的DNA聚合酶　离心　琼脂糖凝胶电泳　迁移速率 (3)抗草甘膦高产水稻培育:构建如图所示的Ti表达载体,采用农杆菌转化法将抗草甘膦基因R和基因B转入野生型水稻中,培育稳定遗传的抗草甘膦高产水稻新品种。 根据基因表达载体的结构组成分析,CaMV35S是启动子,Ti表达载体中,B基因和R基因转录的方向________(填“相同”或“相反”)。转基因后的水稻植株可在个体水平上,对____________进行鉴定。  【解析】(3)CaMV35S为启动子,控制下游基因转录。若B基因与R基因共用同一启动子,需反向插入以避免干扰(如示意图中两基因转录方向相反)。抗性检测:将转基因水稻种植于含草甘膦的土壤中,植株存活,表明R基因成功表达。产量检测:同时测定水稻产量,验证B基因功能恢复(高产性状)。 答案:(3)相反　含草甘膦的土壤种植,并检测水稻产量 - 14 - 学科网（北京）股份有限公司 $