2026届高三生物二轮复习讲义定点突变---大引物PCR和重叠延伸PCR

PCR应用------定点突变 定点突变——1、重叠延伸PCR技术的应用 (1)重叠延伸PCR 重叠延伸PCR是发展最早的PCR定点突变技术。如图所示,该技术要使用四条引物。引物1和引物3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1和引物2，引物3和引物4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物1和引物3互补的碱基杂交在一起，它们再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物2和引物4进行扩增得到含有突变位点的 DNA片段。通过测序可以检测定点突变是否成功。 针对练习1：右图表示利用PCR技术进行定点突变的流程，相关叙述错误的是(　　)。 A.由于基因控制蛋白质的合成,因此要对蛋白质的结构进行设计改造,最终还必须通过改造或合成基因来完成 B.酶①应为耐高温的DNA聚合酶,引物X和Y应该为引物2和4 C.可以将引物1、引物2、引物3和引物4置于同一个反应系统中同时进行第一个阶段的反应,进而缩短实验时间 D.利用图示流程技术可以将两个不同的基因拼接到一起 利用重叠延伸PCR融合基因 1.流程：第一步（引物设计）：需要根据A片段和B片段需融合的部分分别设计引物2、3，引物2的末端与引物3的末端有部分序列互补。根据A片段和B片段非融合的部分分别设计常规引物1、4。 第二步：在两个体系中分别PCR扩增A和B片段，得到产物A’和B’。 第三步：用第一次PCR的产物A’和B’进行融合PCR，得到融合基因，此时A’和B’片段互为引物和模板。 第四步：以融合基因为模板，用引物1、引物4进行第三次PCR，扩增出大量融合基因。 2.目的：通过PCR技术将不同来源的任意DNA片段连接起来 3.应用场景：常用于基因工程领域，构建融合基因表达载体、进行基因定点突变、连接基因片段等等 针对训练2.重组 PCR技术是一项新的PCR技术，可将原来两个不相关的DNA连接起来,成为一个新的分子。实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB基因和ST1基因片段,用重组PCR技术构建了LTB-ST1融合基因，融合基因的制制备过程如图所示。下列相关分析正确的是（ ） A.PCR实验中,离心管、缓冲液和蒸馏水使用前要进行消毒 B.在设计引物时，P1,P2和P3的部分碱基都能互补配对 C.得到的多个杂交链都能作为模板用来延伸子链,以扩增融合基因 D.由杂交链延伸生成融合基因的过程中,不需要再另外添加引物 针对训练3.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是( ) A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和 引物b扩增的结果 B.引物c和引物b上均含有与模板链不能 互补的碱基 C.①过程需要先加热至90℃以上后再冷却至50℃左右 D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD 定点突变——2、大引物PCR技术的应用 需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段;第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段，再以此片段为模板，以常规上游引物进行扩增即得到一条双链都含有突变位点的DNA。该技术的流程如图所示: 例如：胰岛素基因改造方法——基因定点突变技术 针对练习4：下图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变,下列说法错误的是(　　) A.第一轮PCR中,至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板 B.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链 C.扩增的定点诱变产物通常需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译 D.为了使两轮PCR在同一支试管中进行,设计引物时应考虑不同的复性温度 学科网（北京）股份有限公司 $