2026届高三生物二轮复习选择性必修三专题基因工程考点总结

**基本信息** 聚焦基因工程核心技术，以"知识解读+题型训练"构建方法体系，覆盖工具酶操作、PCR技术、基因编辑等9大专题，突出科学思维与探究实践能力培养。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |限制酶|11题|酶切位点选择、双酶切防环化、同尾酶应用|从基础工具到载体构建的逻辑链| |PCR技术|5题|荧光/重叠/点突变PCR操作流程|技术原理→拓展应用的递进关系| |基因编辑|3题|CRISPR/Cas9靶向切割机制|sgRNA定位与Cas9剪切的协同作用| |筛选系统|5题|标记基因插入失活、显色筛选|从分子筛选到个体鉴定的层次递进|

选择性必修三专题基因工程考点总结 目录 专题1 限制酶 2 考点解读 3 题型训练 4 答案 8 专题2 引物 9 知识解读 9 题型训练 9 答案 11 专题3 筛选---标记基因/基因表达产物 12 知识解读 12 题型训练 13 答案 15 专题4 PCR技术 15 知识解读 15 题型训练 16 答案 16 专题5 荧光PCR、重叠PCR、PCR点突变 17 知识解读 19 题型训练 20 答案 22 专题6基因编辑技术（CRISPR/Cas9技术） 26 知识解读 26 题型训练 27 答案 29 专题7 电泳图与遗传系谱图 29 知识解读 29 题型训练 29 答案 31 专题8 T5核酸外切酶无缝克隆技术构建融合基因 32 知识解读 32 题型训练 32 答案 34 专题9 原核真核生物基因结构+三类启动子+工程菌的调控机制 35 知识解读 37 题型训练 37 答案 42 专题1 限制酶 考点解读 1.酶切位点：在目的基因两侧和载体上必须都存在 ①构建基因表达载体时，所选限制酶的酶切位点应该在目的基因两侧。 ②在载体上同样需要有一致的酶切位点，使后续DNA连接能正常进行。 ③如果目的基因两侧无法形成相应序列，可在其两侧添加与载体上酶切位点相匹配的限制酶识别序列。 2.酶切不能破坏载体的复制原点、启动子及终止子等特殊序列 ①切割载体所选的限制酶不能切割载体的复制原点、启动子、终止子等序列。 ②当某种限制酶的切割位点不在上述序列中，但在载体上有两个或以上的切割位点时，也要谨慎选择，防止切割重组后重组载体丢失含有复制原点或启动子、终止子的序列，导致重组载体进入受体细胞后无法自主复制或无法正常表达。 3. 善用“双酶切”，注意方向性 在试题中，目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，即“双酶切法”。其优点和作用是: (1) 防止目的基因、载体自身环化;(2)避免目的基因与载体反向连接。 4 巧用“同尾酶 同尾酶，即能切割产生相同末端的限制酶。同尾酶产生的黏性末端连接后的产物往往失去原有的限制酶的切点。 ①数种同尾酶的识别序列具有包含关系时，如因为有部分相同的序列，选用识别序列短的限制酶会将识别序列更长的限制酶对应的位点一并切割，因此需依题意进行选择。 ②当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。 5 合理对标记基因进行酶切 (1)若载体上只有1个标记基因，一般不能破坏其结构，否则无法在导入重组载体后对重组DNA分子进行筛选或发挥相应作用。 (2)若载体上有两个及以上的标记基因，可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比1个标记基因更高的筛选成功率，防止只有1个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。 题型训练 1.某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（    ） A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇ B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶 2．用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　） A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 3．某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。        下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（    ） A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接 4．马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、 、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 步骤中起作用。 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的 （填“5'端”或“3'端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5'- -3'，切割载体时应选用的两种限制酶是 ，PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 5．为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为 。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加 （填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成 键。 6． 香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。    (1)如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 7． 种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 8.卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题： (2)为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有 酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是 。    9．大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是 。 (2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。 (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。 10.某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。 (2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在 （答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是 。 11.PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。 (1) 图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入 和 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用 （填“E．coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。 答案 1.B 2.D 3.C 4.(1) 4种脱氧核苷酸 延伸 (2) 5'端 AGATCT BamHⅠ、 EcoRⅠ 5.(1) 脱氧核苷酸 引物 复性 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。(2) SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ 磷酸二酯键 6.(1) Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 7.(1) 复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp 8.(2) BamHI 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列 9.(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸） (2) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接（反向链接） (3) 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段      PCR 10.(2) 避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 T4DNA连接酶 11. （1）EcoRI PvitⅡ T4DNA连接酶 专题2 引物 知识解读 1.转录方向的判断：（1）根据启动子和终止子确定转录方向5’→3’； （2）根据模板链的方向确定，模板链3’→5’，与转录方向相反； 2.引物延伸方向：5’→3’（与互补链方向相反），两种引物方向指向目的基因。 3.引物选择范围： （1）若只PCR扩增为了目的基因，引物在目的基因两侧，不包含其他原件； （2）若PCR扩增为了判断目的DNA片段（将目的基因或启动子）是否准确插入载体，引物要包含目的DNA片段以及两侧的部分序列。（排除反向连接或者内源基因的响） 题型训练 1．为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（    ） A． ①+③ B．①+④ C．③+② D．③+④ 2.非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： (1)制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物 对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为 bp。 3.陆地棉中 M基因编码的M蛋白具有良好的抗虫效果。科研小组利用基因工程技术培育出了高表达M蛋白的转基因棉花，图1表示 M 基因片段，图2表示农杆菌的Ti质粒及几种限制酶的酶切位点，其中 AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因。请回答下列问题： BamHI (2)若不清楚目的基因M 的全部序列，则可利用PCR 技术对其进行体外扩增，M基因转录的模板链为b链，则扩增M基因时应选择的引物是 。M基因两侧没有限制酶切位点，为了与图2 质粒构建基因表达载体，需要在引物两侧添加的酶是 。 4.科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 5.将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是 和 。 答案 1.B 2.P1和P3 782bp 3.引物2和3 MspI和HindIII 4.F2和R1 a链 5.F3和R3 专题3 筛选---标记基因/基因表达产物 知识解读 1.标记基因筛选 （1）氨苄青霉素培养基培养：只有导入质粒（空 / 重组）的细菌存活，长出全部菌落（图左：1~11 号全部菌落）；无质粒的细菌直接淘汰。 （2）影印转移：复制菌落原位到四环素培养基，用无菌绒布复刻所有菌落位置，转移至含四环素的平板。对比两块平板，筛选目标菌落，同时在两块平板都长出来的菌落：空质粒，四环素抗性完好；氨苄平板有、四环素平板空白：重组质粒，四环素基因被插入破坏，无法在四环素培养基生长； （3）挑取目的菌落：从氨苄青霉素平板上，对应四环素平板空白的原位，挑出重组菌。 2.标记基因显色筛选 Amp^R（氨苄青霉素抗性）：第一步筛选，淘汰未导入质粒的大肠杆菌； LacZ基因（显色标记）：区分空质粒与重组质粒，原理为插入失活显色。 显色机制LacZ基因编码 β- 半乳糖苷酶，该酶可分解培养基中的 X-gal，产生蓝色物质：空质粒（无目的基因插入）：LacZ完整，合成 β- 半乳糖苷酶 → 分解 X-gal → 蓝色菌落；重组质粒（目的基因插入 LacZ 内部）：LacZ被打断，无法合成功能酶 → 不能分解 X-gal → 白色菌落。 3.目的基因表达产物去筛选目标个体。 题型训练 1. 某一质粒载体如图所示，外源 DNA 插入AmpR或TetR中会导致相应的基因失活 (AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ 酶切后，与用BamHⅠ 酶切获得的目的基因混合，加入 DNA 连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题: (1) 如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，______________和__________的细胞也是不能区分的，其原因是___________________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有__________的固体培养基。 2.如图表示某种质粒，其中ori为复制必需的序列，amp为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，箭头表示不同限制性核酸内切酶的酶切位点。为了便于筛选，目的基因合适的插入位点是（     ） A．① B．② C．③ D．①和③ 3.用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的（　）  A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 4.质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（     ） A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 5.下图为pUC18质粒图谱，已知目的基因两侧的酶切位点为EcoRI和BamHI。现需将目的基因插入质粒的LacZ基因内，形成重组质粒并导入受体细胞。下列限制酶组合选择及后续处理最合适的是（     ） （注：图中amp8为氨苄青霉素抗性基因、Ori为复制原点，LacZ表达产物可使X-gal的培养基呈现蓝色） A．用BamHI酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含氨苄青霉素的培养基 B．用EcoRI酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含氨苄青霉素和X-gal的培养基 C．用EcoRI和BamHI酶切质粒和目的基因，将细胞涂布于含X-gal的培养基 D．用EcoRI和BamHI酶切质粒和目的基因、将细胞涂布于含氨苄青霉素和X-gal的培养基 答案 1. 质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒的 二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长 四环素 2-5 B D C D 专题4 PCR技术 知识解读 1. DNA 分子磷酸骨架带负电，电泳时从负极（上样孔）向正极泳动，迁移快慢由 3 个因素决定： 琼脂糖凝胶浓度： 高浓度凝胶：孔径小，适合分离短片段小分子 DNA； 低浓度凝胶：孔径大，适合分离长片段大分子 DNA。 DNA 分子大小：片段越短，阻力越小，迁移速度越快，条带越靠下；片段越长跑得越慢，条带靠近上样孔。 DNA 构象（空间形态）：相同碱基长度下，超螺旋环状质粒 > 线性 DNA > 开环松弛质粒，迁移速度依次变慢。 2.两种染料的区别 （1）荧光染料 作用：可视化 DNA 条带，嵌入 DNA 双链，结合后在紫外光激发下发出荧光； 检测条件：波长 300 nm 紫外灯照射，才能看到发光条带； 注意：该染料有强致癌性，操作全程戴手套，废液需专门处理。 （2）溴酚蓝（上样缓冲液指示剂） 作用：指示电泳进程，肉眼实时观察，不标记 DNA； 特点：分子极小，迁移速率远快于绝大多数 DNA 片段； 使用判断：当溴酚蓝指示剂跑到凝胶底部时，即可停止电泳，防止小分子 DNA 跑出凝胶丢 3. 电泳条带解读方法 条带数量：对应 DNA 被限制酶切割后的片段数量 环状质粒：n 个酶切位点 → 产生 n 条条带； 线性 DNA（PCR 产物 / 染色体片段）：n 个酶切位点 → 产生 n+1 条条带。 条带位置：越靠下，DNA 分子量越小、片段越短； 条带亮度：亮度越高，对应 DNA 片段含量越多 题型训练 1. 从重组大肠杆菌 DH 5α 中提取质粒，用 EcoRⅠ处理一定时间后进行电泳鉴定。得到 图 2 所示电泳图谱。经测序后发现条带甲、乙序列和长度相同，但条带位置和形状却有差 异，可能的原因是______。为便于观察与检测，电泳时需要利用不同的染料或指示剂。如 制备琼脂糖凝胶时需加入荧光染料，上样时在加样孔中需要加入溴酚蓝染料，其中能和 DNA 分子特异性结合的是______。溴酚蓝染料的作用是______。 答案 甲条带的 DNA 分子与乙条带的 DNA 分子构象不同 荧光染料 条带迁移出凝胶 专题5 荧光PCR、重叠PCR、PCR点突变 1.荧光PCR 2.重叠PCR 3.PCR点突变 知识解读 1.荧光PCR 目的：通过检测荧光强度显示PCR的进程。 （1） 探针一端连接荧光基团 R，另一端连接淬灭基团 Q。探针完整未断裂时：R 与 Q 距离很近，荧光基团发出的光能被淬灭基团吸收，无荧光信号；探针被切断后：R、Q 分离，淬灭作用消失，释放荧光，仪器可检测荧光强度。 二、三步完整反应流程（对应图中 1、2、3） 热变性（90~95℃） 高温使双链模板 DNA 解旋，变为两条单链；引物、游离探针均呈单链状态，无杂交结合。此时探针完整，无荧光。 引物复性 + 探针杂交（55~60℃） 温度降低，两种物质与模板单链互补配对： 1. 引物结合模板 3' 端，作为 DNA 合成起点； （2）TaqMan 探针结合在引物下游、目的片段内部的特异性序列；此时探针依然完整，R、Q紧邻，依旧检测不到荧光；DNA 聚合酶结合到引物末端，准备延伸。 延伸反应（72℃，Taq 酶最适温度） Taq DNA 聚合酶沿模板延伸子链，该酶自带5'→3' 外切酶活性；聚合酶前进碰到结合在模板上的探针，会将探针逐个水解切断；探针断裂后，荧光基团 R 和淬灭基团 Q 相互分离，淬灭效应解除；每扩增一条 DNA 新链，就会切断一条探针，释放一份荧光；荧光信号强度与扩增出的目的 DNA 总量成正比。 2.重叠PCR 目的：将2个基因融合。 步骤 1：两轮独立 PCR，制备带互补重叠区的基因片段 PCR1 扩增基因 M 模板：基因 M 双链引物：引物 1（正向，结合 M下链 5' 端）、引物 2（反向，结合 M 上链 3' 端）设计关键：引物 2 的 5' 端额外添加一段与基因 N 上游互补的重叠序列，扩增出的 M' 片段末端携带灰色重叠互补区。DNA 聚合酶沿 5'→3' 延伸，得到两端带重叠序列的 M' 片段。 PCR2 扩增基因 N 模板：基因 N 双链引物：引物 3（正向）、引物 4（反向）设计关键：引物 3 的 5' 端序列和引物 2 的重叠序列完全互补，扩增出的 N' 片段前端携带灰色互补重叠区。 步骤 2：M' 与 N' 片段混合、变性、复性 1. 高温变性：M'、N' 全部解旋为单链； 2. 低温复性：M' 单链 3' 端的重叠区 与 N' 单链 5' 端的互补重叠区碱基配对，形成杂交中间体；此时无需额外引物，两条单链互为对方延伸模板。 步骤 3：Taq 酶延伸，生成完整融合基因 M+N DNA 聚合酶从杂交配对的 3' 端分别延伸补齐两条链，一次性合成完整的融合基因双链（M 序列 + N 序列无缝相连）。 步骤 4：第三轮 PCR 大量扩增融合基因 以刚合成的 M+N 双链为模板，使用外侧引物引物 1 + 引物 4进行常规 PCR，大量扩增完整融合基因 M+N，得到足量产物用于载体构建。 3.PCR点突变 目的：实现位点的突变 步骤 1：分段 PCR 扩增，得到两段携带突变位点的基因片段PCR1（引物1+引物 2） 以原始野生基因为模板，引物 2 携带突变碱基，扩增出左侧片段①②；片段末端携带突变序列，无完整全长基因。PCR2（引物3+引物4）同一野生模板，引物 3 与引物 2 互补、携带相同突变，扩增出右侧片段③④；片段前端携带互补突变序列。 步骤 2：两段突变片段混合变性、复性（核心拼接步骤）高温变性：两段产物全部解旋为单链①②③④；低温复性： 方案一（错误，打 ×）：片段①和④依靠突变区互补配对，但两条单链均无游离 3'-OH 延伸起点，Taq 酶无法延伸，不能合成完整全长突变基因； 方案二（正确，打√）：单链②（左侧片段正向链）、单链③（右侧片段反向链）依靠互补突变区退火配对，两条链都存在游离 3' 端，可作为 Taq 酶延伸模板。 步骤 3：Taq DNA 聚合酶延伸，合成全长突变基因Taq 酶分别从②的 3' 端向右延伸、③的 3' 端向左延伸，补齐整条双链，得到完整携带定点突变的全长基因模板。 步骤 4：全长扩增 再加入外侧引物 1、引物 4 进行完整 PCR，大量扩增突变后的完整基因，完成定点突变。 题型训练 1.磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体过程如图所示，请回答下列问题。 （1）无缝克隆时，T5核酸外切酶沿___的方向水解DNA，其目的是形成___。T5核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是降低酶活性，___。 （2）过程②两个片段退火后存在“缺口”的原因是___，过程③所需的酶有___。 （3）与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有___。 A. 不受限制酶切位点的限制 B. 不会引入多余碱基 C. 操作时间短，成功率高 D. 有利于多个小片段（小于50bp） （4）PCR扩增PABD基因时需依据___设计引物R1。据图分析扩增目的片段的引物F1和R2对应于下表中的___。 1 5'-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3' 2 5'-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3' 3 5'-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3' 4 5'-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3' （5）利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子（T1）进行表面消毒，均匀铺在含有___的MS培养基上进行筛选和鉴定。T1代自交获得的T2代幼苗的抗性表现和比例为___，说明T1为单位点插入的转基因株系。 （6）通过观测转基因拟南芥根尖细胞中___，了解PA的动态变化。 2.研究人员对大肠杆菌的营养代谢途径进行改造，使改造后的大肠杆菌工程菌能表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白，该融合蛋白能分解甲酰胺产生氨作为氮源，分解亚磷酸盐成为磷酸盐作为磷源。下图为构建表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的大肠杆菌的过程。回答下列问题： （1）PCR体系①和PCR体系②必须分开进行，其原因是________。将PCR体系①的产物与体系②的产物混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到50℃左右时，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有________种结合的可能，其中能进行进一步延伸的有________种。有关基因序列如下，引物b、c应在下列选项中选用________。 for基因序列：5’ATGGTGAGCAAGGGC——GACGAGCTGTACAAG3’ ptx基因序列：5’CATGTCCAGCTGCAG——CCAAAACCACAACCA3’ A.ATGGTG——CAACCA B.TGGTTG——CACCAT C.GACGAG——CTGCAG D.CTGCAG——CTCGTC （2）用限制酶_______切割质粒PGEX，再将酶切得到的融合基因for-ptx与质粒相连，构建pGEX—for—ptx重组质粒。转化大肠杆菌DH 5α后，可在添加______的培养基中，挑选DH5α转化阳性的重组菌株。 （3）从重组大肠杆菌DH 5α中提取质粒，用EcoRⅠ处理一定时间后进行电泳鉴定。得到图2所示电泳图谱。经测序后发现条带甲、乙序列和长度相同，但条带位置和形状却有差异，可能的原因是______。为便于观察与检测，电泳时需要利用不同的染料或指示剂。如制备琼脂糖凝胶时需加入荧光染料，上样时在加样孔中需要加入溴酚蓝染料，其中能和DNA分子特异性结合的是______。溴酚蓝染料的作用是______。 （4）将提取到的重组质粒导入大肠杆菌表达菌株BL21中，得到重组表达菌株BL21，收集菌体并加入到含有______的培养基中，继续培养得到重组大肠杆菌。此种方法培养大肠杆菌可以有效抑制杂菌的生长，其原理是______。 3.实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高、特异性好，是检测微小残留病变的常用方法。将荧光标记的Tagman探针与待测样本DNA混合，当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因:结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，在特定光激发下R发出的荧光可被检测到(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。下列相关叙述错误的是( ) A.每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团 B.在反应过程中，无需ATP为新链的合成提供能量 C.做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成引物和Tagman探针 D.荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小 答案 1. （1）①. 引物b和引物c存在碱基互补配对片段，置于同一反应体系会导致引物失效 ②. 4 ③. 1 ④. CD （2）①. BamHⅠ和EcoRⅠ ②. 氨苄青霉素 （3）①. 甲条带的DNA分子与乙条带的DNA分子构象不同 ②. 荧光染料 ③. 条带迁移出凝胶 （4）①.甲酰胺和亚磷酸盐 ②. 添加甲酰胺和亚磷酸盐，重组大肠杆菌对其具有分解功能，获得充足的营养成分而成为优势菌；而杂菌不具备分解功能，会因缺乏氮源和磷源而受到抑制 【解析】 【分析】1、PCR原理：在高温条件作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法等；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法（感受态细胞法）。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因PCR技术；②检测目的基因是否转录出PCR技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【小问1详解】 根据题意，构建for-ptx融合基因的过程中，b引物序列与c引物序列需要通过碱基互补配对连接成局部双链结构，再通过PCR过程以图中链甲和链乙互为模板进行延伸，因此PCR体系①和PCR体系②必须分开进行的原因是引物b和引物c存在碱基互补配对片段，置于同一反应体系会导致引物失效； 将PCR体系①的产物与体系②的产物混合后，继续进行下一次PCR反应，因为PCR体系①得到ab片段（引物a、引物b延伸后得到等长的片段）、PCR体系②得到cd片段，继续进行下一次PCR反应时，该PCR反应体系经过高温变性后，会形成四种单链（a、b、c、d），当温度下降到50℃左右时，能够互补配对的DNA链相互结合，即a与b、a与d、c与d、c与b结合，即理论上有4种结合的可能，但由于子链延伸的方向只能是5'→3'，因此只有a和d互补后可继续延伸子链形成最终改造后的基因，即能进行进一步延伸的有1种； 综上所述，引物b与引物c需要碱基互补，引物b为for基因的右引物，应与图示序列互补链的右侧序列互补配对，引物c为ptx基因的左引物，应与图示序列左侧序列互补配对，如图所示，故应选CD。 【小问2详解】 在构建基因表达载体时，应选用相同的限制酶或同尾酶切割目的基因和质粒，以便产生相同的黏性末端，为避免目的基因与质粒的自身环化和任意连接，通常选用双酶切法，由图可知，可用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切pGEX-2T表达质粒，再将酶切得到的融合基因for-Linker-ptx放到切口处，在DNA连接酶的作用下构建pGEX-2T-for-Linker-ptx重组质粒。构建的重组质粒中具有完整的氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，因此可在添加氨苄青霉素的培养基中转化大肠杆菌DH5α，挑选DH5α转化阳性表达重组菌株。 【小问3详解】 琼脂糖凝胶电泳过程中，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，根据题意，凝胶浓度、甲、乙条带序列和长度都相同，但条带位置和形状有差异，原因可能是DNA的构象不同；凝胶中的DNA分子通过荧光染料染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，电泳时需将待测样品与.上样缓冲液混合后加入加样孔，缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂，通过该指示剂可显示溴 酚蓝在凝胶中的扩散速率,而溴酚蓝在凝胶中的扩散速率比DNA的扩散速率快，故可以防止条带迁移出凝胶。 【小问4详解】 从重组大肠杆菌DH5α中提取重组质粒pGEX-for-Linker-ptx，并将重组质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21中，得到重组表达菌株BL21，为检测菌株BL21是否具有分解甲酰胺和亚磷酸盐的功能，需要进行个体生物水平的检测，即收集菌体并接种到含有甲酰胺和亚磷酸盐的培养基中，继续培养得到重组大肠杆菌。含有甲酰胺和亚磷酸盐的培养基属于选择培养基，此种方法培养大肠杆菌可以有效抑制杂菌的生长，其原理是添加甲酰胺和亚磷酸盐，重组大肠杆菌对其具有分解功能，获得充足的营养成分而成为优势菌，而杂菌不具备分解功能，会因缺乏氮源和磷源而受到抑制。 2. （1）①. 5'→3' ②. 黏性末端 ③. 防止过度水解DNA （2）①. 过程①形成的黏性末端长度不同 ②. DNA 聚合酶和DNA连接酶 （3）ABC （4）①. PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列 ②. 1、4 （5）①. 草胺膦 ②. 抗草胺膦：不抗草胺膦= 3：1 （6）绿色荧光点的分布 【解析】【分析】PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3、延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。 【小问1详解】 由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA，以形成黏性末端。温度能影响酶活性，T5核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是降低酶活性，其目的是降低酶活性，防止过度水解DNA。 【小问2详解】 过程②在退火的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端长度不同，因此在过程②退火后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA 聚合酶（DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到子链3′-OH末端）和DNA连接酶（将两个DNA片段进行连接）。 【小问3详解】 传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒是不受限制酶切位点的限制；不会引入多余碱基；操作时间短，成功率高，但不利于多个小片段（小于50bp）连接，ABC正确。 故选ABC。 【小问4详解】 用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因（PABD基因）的核苷酸序列来设计的，由图可知，PABD基因（目的基因）需要用载体进行连接，因此PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列引物R1。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于下表中的1。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于下表中的4。 【小问5详解】 由图可知，bar（草胺膦抗性基因）为标记基因，位于T-DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子（T1）进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。若T1为单位点插入的转基因株系，假设抗性基因用A表示，非抗性为a，则T1的基因型为Aa，T1代自交获得的T2代幼苗的基因型及比例为A_:aa= 3：1，因此抗草胺膦：不抗草胺膦= 3：1。 【小问6详解】 由题意“将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。 3.D 专题6基因编辑技术（CRISPR/Cas9技术） 知识解读 1. sgRNA（向导 RNA、短链 RNA） 作用：定位向导 原理：sgRNA 自带一段特异性碱基序列，依靠碱基互补配对原则，精准结合基因组中需要编辑的目标 DNA 序列； 特异性关键：更换不同 sgRNA，就能靶向切割不同的目的 DNA，这是 CRISPR 可灵活编辑任意基因的核心。 2. Cas9 蛋白（源自细菌的核酸内切酶，等同于人工限制酶） 作用：DNA 剪刀 原理：Cas9 会和 sgRNA 结合形成复合物；sgRNA 找到目标 DNA 后，Cas9 发挥酶活性，切断 DNA 双链的磷酸二酯键，造成 DNA 双链断裂。 3.具体步骤： 复合物组装：Cas9 蛋白与向导 RNA（sgRNA）结合； 靶向识别：向导 RNA 和基因组上BCL11A基因区域的 DNA 互补配对，锚定目标点； 切割断裂：Cas9 切割该位点 DNA，破坏图中BCL11A基因的增强子序列； 编辑效果：增强子是调控基因表达的顺式作用元件，破坏后 BCL11A 基因表达下调，临床用于镰刀型贫血症的基因治疗。 题型训练 1. 图为借助CRISPR/Cas9基因编辑技术插入外源基因的过程图，其中PAM序列是一个短DNA序列，单链向导RNA可引导Cas9内切酶到特定的基因位点进行切割。下列叙述错误的是(　 　) A．Cas9内切酶能将脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开 B．细菌细胞中的限制酶也能起到类似Cas9内切酶的作用 C．Cas9内切酶定点切割与向导RNA和目标DNA结合无关 D．双链DNA的断裂修复过程需要DNA聚合酶的催化 2.CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。回答下列问题： (1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶_____。 (2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是_____________。 (3)过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是______________。随后，Cas9蛋白可切割______________________序列。 (4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是__________________，基因敲除成功的判断依据是________________。 (5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程： 。 3.CRISPR/Cas12a 系统是由 crRNA 和 Cas12a 蛋白形成的复合体。crRNA 能特异性识别并结合特定的 DNA 序列，引导 Cas12a 蛋白到相应位置剪切 DNA。下图是其工作原理示意图。请回答下列问题。 (1)在该系统中，crRNA 序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含 种核苷酸。该系统中的 能独立发挥引导功能，切割 DNA 后形成的是 （“黏性”或“平”）末端。 (2)某科研团队利用 CRISPR/Cas12a 系统对宫颈癌细胞中的 KIFC1 基因进行敲除，来研究KIFC1基因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈癌 HeLa 细胞增殖的影响。利用 crRNA 对应基因序列和PX458质粒（如图2）构建 crRNA/Cas12a 重组质粒，导入至 HeLa 细胞进行相关研究。 ①为保证crRNA对应的基因序列与 PX458 质粒正确连接，应在扩增该基因的一对引物的 5'端分别添加 两种限制酶的识别序列。其中 P1 的碱基序列为 5' 3'（写出前9个碱基）。PX458 质粒中利用 U6、CMV 两个启动子，而不共用同一个启动子的目的是 。 ②将 crRNA/Cas12a 重组质粒成功导入至 HeLa 细胞。与对照组相比，实验组中 KIFC1蛋白表达量、细胞数目的变化如图3所示，图中的 现象证明HeLa细胞中KIFC1基因敲除成功；实验组细胞数目显著低于对照组，表明 。 答案 1.CD 2.（1）DNA连接酶 （2）Ca2＋处理法 （3）碱基互补配对原则 目标DNA特定的核苷酸 （4）DNA分子杂交技术 不出现杂交带 （5）CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，在特定位点上切割基因组DNA，然后将该蛋白酶基因插入到基因组DNA中 3. (1) 8 crRNA 黏性 (2) vitII、EcoRI CAGCTGCTC- 实现两种基因的独立表达，有利于crRNA、Cas12a各自发挥作用 实验组的KIFC1蛋白表达量明显低于对照组（实验组几乎不表达KIFC1蛋白，而对照组大量表达） KIFC1基因具有促进HeLa细胞增殖的作用（KIFC1基因的敲除使HeLa细胞的增殖受到抑制） 专题7 电泳图与遗传系谱图 知识解读 目的：结合遗传系谱图和电泳图谱判断遗传方式，推断个体基因型，计算相关概率。 联系必修二遗传概率计算+基因工程电泳图的知识解读题目。 【方法总结】 第一步：根据遗传系谱图对遗传方式的判断（一般先判断显隐性，再判断基因的位置） 第二步：结合电泳图判断基因所在位置及个体基因型(相关基因用A和a表示) 1.通常一条电泳带的个体为纯合子，两条电泳带为杂合子，杂合子个体对应的表型为显性。 2.若男性个体有两条电泳带（杂合子），则该基因不可能在X染色体上，而是常染色体遗传。 题型训练 1.亨廷顿舞蹈症是单基因遗传病（相关基因A/a位于4号染色体）。某家族系谱图及各成员对应的相关基因电泳结果如下图所示。其中Ⅱ₃含有3条4号染色体。下列叙述正确的是（    ） A．该病的遗传方式是常染色体隐性遗传 B．图中1280bp的基因片段代表正常基因 C．Ⅱ1与正常女性婚配生下正常女儿的概率是1/4 D．对三体男性Ⅱ₃分析可知产生异常生殖细胞的一定是I1 2．釉质发育不全（AI）是一种牙釉质发育异常的单基因遗传病。图a为该病患者的家族系谱图，该家族部分成员相关基因电泳结果及基因序列分别如图b、图c（不考虑转录后mRNA的剪切、修饰）所示。已知起始密码子为AUG，终止密码子为UAA、UGA、UAG，相关基因不位于X、Y染色体同源区段。下列叙述正确的是（　　） A．AI的遗传方式最可能是伴X染色体显性遗传 B．Ⅲ-8与Ⅲ-9的相关基因型相同的概率为1/2 C．Ⅲ-2与正常女性婚配后生正常男孩的概率为1/2 D．该基因突变后导致终止密码子提前，翻译异常 3.甲、乙遗传病分别由等位基因A/a和B/b控制，且人群中甲病的发病率约为1/2500。图1是某家系的遗传系谱图（其中I-2不携带乙病致病基因），图2为该家系部分成员与上述两病有关基因的电泳结果。下列分析正确的是（不考虑基因突变和染色体变异的发生）（　　）    A．甲病为常染色体遗传病，调查其发病率应在家系中调查 B．Ⅱ-1的基因型为aaXBXb的概率是1/2 C．条带①和条带③依次代表基因A和b D．Ⅱ-3与人群中正常男性婚配，子代患甲病的概率为1/153 答案 1.C 2.D 3.D 专题8 T5核酸外切酶无缝克隆技术构建融合基因 知识解读 目的：利用T5核酸外切酶形成黏性末端，通过互补配对将不同黏性末端连接起来，实现融合基因。 步骤 1：T5 核酸外切酶处理，产生互补黏性末端 酶：T5 核酸外切酶，特性：50℃条件下，特异性降解 DNA 链的5' 端脱氧核苷酸，降解到同源臂区域就停止。 作用结果：载体上游、目的基因两端、载体下游的 5' 端被切短，暴露出3' 突出的单链黏性末端。 步骤 2：同源单链黏性末端互补配对。依靠 A-T、C-G 氢键结合，形成中间存在缺口的杂交 DNA 双链。 步骤 3：DNA 修复系统补齐缺口、连接磷酸二酯键。细胞内 DNA 聚合酶补齐配对后单链之间缺失的脱氧核苷酸，DNA 连接酶闭合骨架的磷酸二酯键；最终得到无多余碱基、完全连续的融合重组质粒，实现 “无缝” 拼接。 题型训练 1.叶用莴苣（如生菜）是大众喜爱蔬菜，夏季高温极易引起先期抽苔造成减产，泛素连接酶（LsE3）是研究人员在莴苣高温抽苔植株中筛选得到的。LsE3基因受温度调控，影响莴苣抽苔，但是LsE3基因作用机制尚不清楚。研究人员用无缝克隆技术构建莴苣LsE3基因的表达载体用于研究其分子机理。无缝克隆技术是构建表达载体的一种技术如图2。 （1）目的基因获取，在_____条件下，提取先期抽苔莴苣细胞中_____，经_____获得cDNA，再以cDNA为模板，利用PCR技术扩增LsE3基因。PCR扩增除了图1标出的物质以外，还需加入_____（至少写两种）。LsE3基因两端序列如图1所示，PCR中需要两种引物F（左侧）、R（右侧）选用_____（选项中为引物部分序列，方向为5'→3'）。 A. GATTAG------TGTTGGB. CCAACA------CTAATCC. TAGGTG------AGACCT D. AGGTCT------CACCTA （2）表达载体构建，近年来新一代无缝克隆技术发展迅猛，基于T4 DNA聚合酶和T5核酸外切酶成为目前研究的热点。早在1990年，Aslanidis等便提出基于T4 DNA聚合酶( LIC)技术（如图2）。 T4 DNA 聚合酶在反应体系中没有添加dNTP情况下具有 3'→5'外切酶活性；在反应体系中添加dNTP情况下具有5'→3'聚合酶活性；在反应体系中仅添加某种特定的dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP时，外切酶活性和聚合酶活性同时发挥作用，从而竞争性终止反应，产生指定长度的单链黏性末端。请结合图1和图2回答下列问题： ①LIC技术构建表达载体，图1中利用PCR扩增LsE3基因，反应液中加入T4 DNA聚合酶和_____处理。用EcoRⅤ酶（GAT↓ATC）切割图1所示质粒获得_____末端，后加T4 DNA聚合酶和_____处理质粒。处理后将两者混合、退火并导入细胞内完成重组克隆。 ②LIC技术依赖特定同源序列，2007年Li等建立了不依赖特定序列的克隆( SLIC) 技术，后经过多次改进，Qi等建立了RQ-SLIC技术，用EcoRⅤ酶切割质粒后与LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶处理适当时间，将混合物加热到72℃，目的是_____，缓慢降温（退火）后移入细胞内转化修复形成完整重组质粒，细胞内转化修复过程中用到_____酶。 （3）导入受体细胞，取叶用莴苣幼芽经_____（过程）形成愈伤组织备用，用_____处理农杆菌后导入重组质粒，再感染叶用莴苣愈伤组织，将感染后的愈伤组织置于加入_____植物组织培养基中培养，筛选出成功导入质粒的植物细胞。 答案 1.（1）①. 高温 ②. 总RNA（或“总mRNA”或“RNA”） ③. 逆转录 ④. Taq酶、缓冲液、dNTP、Mg2+ ⑤. AC （2）①. dGTP ②. 平 ③. dCTP ④. 终止T4 DNA聚合酶活性 ⑤. DNA聚合酶和DNA连接 （3）①. 脱分化 ②. 氯化钙（或Ca2+） ③. 潮霉素 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定： （1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。 （2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【小问1详解】 目的基因获取，在高温条件下，提取先期抽苔莴苣细胞中总RNA，经逆转录获得cDNA，再以cDNA为模板，利用PCR技术扩增LsE3基因。PCR扩增的条件有模板、引物、Taq酶、dNTP、能量等，除了图1标出的物质以外，还需加入Taq酶、缓冲液、dNTP、Mg2+。LsE3基因两端序列如图1所示，PCR中引物需要结合在模板链的3'，子链的延伸方向是沿引物的5'进行，结合图1和碱基互补配对原则，引物F（左侧）选用A、R（右侧）选用C。 【小问2详解】 ①由题干信息可知，在反应体系中仅添加某种特定dNTP原料（如dATP），T4 DNA聚合酶也具有 3'→5'外切酶活性，且外切到dATP时，外切酶活性和聚合酶活性同时发挥作用，从而竞争性终止反应，产生指定长度的单链黏性末端，所以图1中利用PCR扩增LsE3基因，反应液中加入T4 DNA聚合酶和dGTP处理。用EcoR Ⅴ酶（GAT↓ATC）切割图1所示质粒获得平末端，后加T4 DNA聚合酶和dCTP处理质粒。 ②LIC技术依赖特定同源序列，2007年Li等建立了不依赖特定序列的克隆( SLIC) 技术，后经过多次改进，Qi等建立了RQ-SLIC技术，用EcoR Ⅴ酶切割质粒后与LsE3基因混合，加入T4 DNA聚合酶处理适当时间，将混合物加热到72℃，目的是终止T4 DNA聚合酶活性，缓慢降温（退火）后移入细胞内转化修复形成完整重组质粒，细胞内转化修复过程中用到DNA聚合酶和DNA连接酶。 【小问3详解】 导入受体细胞，取叶用莴苣幼芽经脱分化形成愈伤组织备用，用氯化钙（或Ca2+）处理农杆菌后导入重组质粒，再感染叶用莴苣愈伤组织，将感染后的愈伤组织置于加入潮霉素植物组织培养基中培养，原因是重组质粒中含有潮霉素抗性基因，然后筛选出成功导入质粒的植物细胞。 专题9 原核真核生物基因结构+三类启动子+工程菌的调控机制 1.原核生物与真核生物的基因结构 非编码区：不转录，不编码蛋白质含有能调控遗传信息表达的DNA序列。 启动子：①本质：是一段有特殊序列结构的DNA片段； ②位置：位于基因上游； ③作用：RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA。 终止子：①本质：也是一段有特殊序列结构的DNA片段； ②位置：位于基因下游； ③作用：终止转录 编码区：间隔的，不连续的 有外显子，内含子之分 数量关系：外显子=内含子+1 外显子：能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。 内含子：能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列。 2.三类启动子 （1）组织特异性启动子 组织特异性或者发育时期的特异性，如某些奢侈基因的启动子(乳腺中特异表达的基因的启动子)。 （2）组成型启动子 在多数或全部组织中保持持续的活性，如管家基因的启动子。 （3）诱导型的启动子 ①受外界化学诱导物或物理信号调控的启动子，可控性高，如E.coli的乳糖操纵子。 ②当诱导物存在或诱导信息存在时，可以激活或抑制目的基因的表达；调控基因表达的程度，减少物质和能量的浪费。 3.工程菌的调节机制 调节基因Ⅰ：独立转录翻译，编码阻遏蛋白，属于调控序列；不受下游操纵区控制，持续表达。 启动子P：RNA 聚合酶识别、结合的 DNA 位点，是诱导型启动子的核心区域。 操纵基因O：位于启动子下游，可结合阻遏蛋白，阻挡 RNA 聚合酶向下移动；是乳糖响应的开关位点。 结构基因 lacZ、lacY、lacA 编码分解乳糖的三种功能蛋白：lacZ：β- 半乳糖苷酶（水解乳糖），lacY：通透酶（转运乳糖进入细胞），lacA：乙酰转移酶（辅助代谢）。三者共用一条mRNAⅡ，原核生物多顺反子特征。 （1）工程菌调节过程 ①调节基因Ⅰ转录出mRNAⅠ，翻译合成阻遏蛋白。 ②阻遏蛋白空间结构适配操纵基因O，特异性结合在O序列上。 ③RNA 聚合酶虽然结合在启动子P，但阻遏蛋白物理阻挡其向下游移动。 ④结构基因 lacZ/Y/A 无法启动转录，无 mRNAⅡ、无乳糖分解酶合成；细胞不合成分解乳糖的蛋白，节省物质能量。 （2）环境存在乳糖（诱导物存在，基因开启）——诱导启动子 乳糖作为诱导物，进入细胞后与阻遏蛋白特异性结合；阻遏蛋白空间构象发生改变，失去与操纵基因O结合的能力，从 DNA 上脱落；操纵基因O位点空出，RNA 聚合酶可以顺利沿 DNA 滑动，通读全部结构基因；转录产生 mRNAⅡ，翻译出 β-半乳糖苷酶、通透酶等三种蛋白；酶催化乳糖转运、水解，供细胞利用；乳糖消耗完毕后，游离阻遏蛋白重新结合O，转录再次关闭。 知识解读 解读3.大肠杆菌乳糖操纵子包括lacZ、lacY、lacA三个结构基因（编码参与乳糖代谢的酶，其中酶a能够水解乳糖），以及操纵基因、启动子和调节基因。培养基中无乳糖存在时，调节基因表达的阻遏蛋白和操纵基因结合，导致RNA聚合酶不能与启动子结合，使结构基因无法转录；乳糖存在时，结构基因才能正常表达。 题型训练 1.水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器(下图)，为环境污染治理提供新方法。 回答下列问题： (1)Pc和Ps启动子可被 酶识别并结合后驱动基因的模板链沿3′→5′方向转录出mRNA。分析图上图可知，当环境中存在水杨酸时， 可激活PS启动子，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。 (2)研究人员改造重组质粒，选择激活能力更强的蛋白的基因nahR1替代nahR，实现在相同浓度的水杨酸条件下荧光强度扩大为原来的2倍，提高传感器的灵敏度。该改造过程需要用到的工具酶是 。请提出另一种改造重组质粒以提高传感器灵敏度的思路： 。 (3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的动态检测和清除。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接，应选择如图中的引物组合是 。 (4)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdB分别插入下图中的 、 位点。 2.大肠杆菌是一种常见的工程菌。然而，实验后工程菌的安全处理仍存在挑战。传统上常利用抗生素杀死实验动物体内的大肠杆菌，但在实验过程中大肠杆菌可能变异并随着宿主粪便排出而逃逸，造成环境污染。研究人员利用CRISPR/Cas9系统设计出通过响应化合物aTc来清除工程菌的单调控防护系统，如图1所示。 回答下列问题: (1)Cas9 和 gRNA 形成的复合物中对杀伤大肠杆菌 DNA 起选择作用的物质是 。可向该系统中引入多种 gRNA 基因，从而实现 ，确保杀死大肠杆菌。 (2)启动子有三种类型，组成型启动子可持续发挥作用，诱导型启动子需要特殊因素诱导才能发挥作用，组织特异性启动子调控基因在特定组织或器官中表达。据图 1分析，P1是 型启动子。该系统发挥作用时，需将实验动物的饮用水更换为含 aTc 的水，原因是 。 (3)研究人员在 tetR 基因上游加入受温度调节的反馈机制，改造后的双调控系统如图2所示。分别对转化不同系统的大肠杆菌进行测试，结果如图3所示。    ①据图分析，该温度调节反馈机制启动时，图 2 方框中“?”应是 （填“大于”“小于”或“等于”）33℃，理由是 。 ②综合上述研究，分析改造后的双调控系统的应用意义: 。 训练3：（2024·广东·高考真题）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 回答下列问题： (1)研究者优化了培养基的 （答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。 (2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。 (3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 （答两点）。 (4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。 (5) 有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路 。 4. 温度是影响微生物生长的重要因素，科研人员应用基因工程以实现通过温度控制工程菌合成所需物质。 （1）大肠杆菌是一种常见的微生物，常被改造为基因工程菌，其原因包括____________（写出2点）。 （2）为实现温度控制工程菌合成所需物质，科研人员设计了以下方案，构建表达载体（见图1），将其导入大肠杆菌，获得转基因工程菌。大肠杆菌在30℃和37℃均可生长和繁殖，当培养温度为30℃时，C基因编码的C蛋白形成二聚体___________，因而大肠杆菌表达_____________荧光蛋白。 （3）为检测该方案，科研人员将该方案中的工程菌稀释涂布在固体培养基上，形成单菌落，培养温度周期控制见图2。依据方案，每个菌落生长2天后可出现4个不同的荧光环带（环带4形成时间为34-48h，环带3形成时间为24-48h，环带2形成时间为10-48h，环带1形成时间为0-48h）。请预测图3所示菌落每个环带的工程菌中荧光蛋白表达情况，在下面表格中按时间顺序，依次写出所表达荧光蛋白的颜色。 菌落环带 1 2 3 4 所表达荧光蛋白的颜色 ____________ 绿、红、绿 ____________ ____________ （4）聚羟基脂肪酸酯（PHA）常用于制备可降解的塑料包装材料。PHA是一种生物大分子，可由单体分子3HB和4HB随机聚合，或通过分段聚合形成嵌段共聚物（图4），其中嵌段共聚物性能更优。共聚物的合成过程如图4。请完善以下表格，通过改造上述方案以实现应用工程菌大规模生产优质PHA（不考虑各种酶在不同温度下的活性差异）。 答案 1.(1) RNA聚合酶 水杨酸-调控蛋白复合物 (2) 限制酶和DNA连接酶 ①选择灵敏度更高的启动子替代PS；②在mrfp基因前插入提高表达效率的DNA序列 (3)引物1和3 (4) E(或F) B(或C) 2.(1) gRNA 破坏大肠杆菌 DNA 的多个部位 (2) 组成 解除 tetR 蛋白对P2启动子的抑制作用，诱导其表达 Cas9 和 gRNA，从而破坏 DNA，杀死大肠杆菌 (3) 小于 在不加入 aTc、温度37℃时大肠杆菌正常存活，30℃时数量显著减少，表明温度降低至 33℃以下会启动该调控系统 当 aTc 诱导途径未能杀死动物体内的大肠杆菌时，随粪便逃逸的大肠杆菌可被温度调控机制杀死，避免对环境造成污染 3.(1)碳源、氮源、无机盐 (2) PT7、PBAD 和PBAD 启动子②和③选用 PBAD可以使工程菌无论有、无蓝光 照射都可表达无活性的T7RNAP，在蓝光照射后，无活性的 T7RNAP 转变为有活性的T7RNAP，与特异性启动子P7识别结合并转录基因1，即可用蓝光控制酪氨酸酶的表达 (3)杀死不含光控表达载体的杂菌，避免杂菌污染；筛选出含光控表达载体的工程菌 (4)蓝光诱导酪氨酸酶基因的表达，酪氨酸酶催化酪氨酸转化为黑色素，蓝光照射不到的部位酪氨酸酶不表达 (5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白) 4. （1）遗传背景清晰、转基因操作简单、繁殖速度快、易于培养等 （2）①. 抑制启动子R，F蛋白不表达，解除F蛋白对启动子N的抑制 ②. 绿色 （3）①. 红、绿、红、绿 ②. 红、绿 ③.绿 （4）①. 将GFP基因替换为A、B酶基因，RFP基因替换为D、E酶基因 ②. X酶 ③. 葡萄糖 ④. 25% 【解析】 【分析】据图1分析可知，当培养温度为30°C时，C基因编码的C蛋白形成二聚体，抑制启动子R，使F基因无法表达出F蛋白，进而解除F蛋白对启动子N的抑制，使其发生转录促进GFP基因编码绿色荧光蛋白。 据图2分析可知，将工程菌稀释涂布在固体培养基上， 形成单菌落，培养温度周期控制为37℃培养10小时，随后切换至30℃发酵14小时， 每个菌落生长2天后可出现4个不同的荧光环带。 据图4分析获知，4HB由D酶、E酶催化合成，3HB由A酶、B酶催化合成，再经X酶催化合成嵌段共聚物，要想发酵48小时， 获得3HB比例为25%的嵌段共聚物。 【小问1详解】 大肠杆菌是一种常见菌种，其结构简单，生理生化和遗传背景清晰，尤其是其基因表达调控机制有了清楚的了解；大肠杆菌质粒又是最常用的质粒，基因克隆表达系统成熟完善，转基因操作简单；大肠杆菌繁殖速度快，易于大规模培养等。 【小问2详解】 据图1分析可知，当培养温度为30°C时，C基因编码的C蛋白形成二聚体，抑制启动子R，使F基因无法表达出F蛋白，进而解除F蛋白对启动子N的抑制，使其发生转录促进GFP基因编码绿色荧光蛋白。 【小问3详解】 据图2分析可知，将工程菌稀释涂布在固体培养基上， 形成单菌落，培养温度周期控制为37℃培养10小时，随后切换至30℃发酵14小时， 每个菌落生长2天后可出现4个不同荧光环带。培养温度为37℃时，C基因编码的C蛋白没有形成二聚体，启动子R正常启动转录，F基因表达出F蛋白对启动子N的抑制，使L蛋白基因、GFP基因表达受抑制，同时RFP基因表达出红色荧光蛋白，培养温度为30℃时，培养温度为30°C时，C基因编码的C蛋白形成二聚体，抑制启动子R，使F基因无法表达出F蛋白，进而解除F蛋白对启动子N的抑制，使其发生转录促进GFP基因编码绿色荧光蛋白，所以菌落生长2天后出现4个不同的荧光环带颜色为：环带1：红、绿、红、绿，环带2：绿、红、绿，环带3：红、绿，环带4：绿。 【小问4详解】 据图4分析获知，4HB由D酶、E酶催化合成，3HB由A酶、B酶催化合成，再经X酶催化合成嵌段共聚物，要想发酵48小时， 获得3HB比例为25%的嵌段共聚物。对方案表达载体的改造为：将GFP基因替换为A、B酶基因，RFP基因替换为D、E酶基因，加入持续表达启动子连接的X酶基因构建表达载体并导入大肠杆菌， 获得工程菌，以葡萄糖为原料配置培养基，灭菌后加入获得的工程菌，将接种后的培养基在30℃发酵12小时，随后切换至37℃发酵36小时， 获得3HB 比例为25%的嵌段共聚物，即为所需产物。 学科网（北京）股份有限公司 $