2026届高三生物二轮复习重组PCR技术构建融合基因 提升练

· 重组PCR技术构建融合基因 提升练-2025-2026学年人教版高中生物选择性必修三 · PCR技术应用（一） ——重组 PCR 技术构建融合基因（高考生物归纳总结） 目录 一、核心概念与本质 二、核心原理与关键条件 三、标准操作步骤（高考重点考查） 四、引物设计核心要点（高考高频考点） 五、与传统基因拼接方法的对比（高考辨析点） 六、典型应用与高考情境 七、高考易错点与答题技巧 八、针对性练习（标红的为相关考点训练） 一、核心概念与本质 1. 重组 PCR 技术（又称重叠延伸 PCR、融合 PCR）：是一种基于DNA 半保留复制原理的体外 DNA 重组技术，能将两个或多个不同来源的 DNA 片段（如基因 A 和基因 B）精确拼接成一个新的 DNA 分子（融合基因 A-B）。 2. 融合基因：由两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列（启动子、终止子等）控制之下，表达出具有原有基因功能或新功能的融合蛋白。 3. 技术本质：通过特殊引物设计创造 DNA 片段间的同源重叠区域，实现片段间的互补配对与延伸，无需依赖限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶的传统基因拼接方法。 二、核心原理与关键条件 1. 核心原理 （1）DNA半保留复制：PCR扩增的基础机制，子链DNA以母链为模板合成。 （2）同源序列互补配对：两个待融合DNA片段末端设计互补重叠序列（通常15-20个碱基），变性后可相互退火结合，形成完整模板链。 （3）DNA聚合酶延伸：热稳定DNA聚合酶（如Taq 酶）以互补结合的片段为模板，延伸合成完整融合基因。 2. 关键条件 条件 作用 高考常考点 模板 DNA 提供待融合的两个基因片段（基因 A、基因 B） 模板纯度与完整性影响扩增效率 4 种引物 P1（基因 A 上游）、P2（基因 A 下游，含基因 B 同源序列）、P3（基因 B 上游，含基因 A 同源序列）、P4（基因 B 下游） P2 与 P3 的互补设计是融合关键 dNTP DNA 合成原料 四种脱氧核苷酸缺一不可 热稳定 DNA 聚合酶 催化 DNA 链延伸，耐高温 Taq 酶无 3'→5' 外切酶活性，高保真需 Pfu 酶 缓冲液 维持酶活性与反应 pH 含 Mg²⁺（酶活性必需） PCR 仪 精确控制变性、退火、延伸温度循环 温度参数设置（变性 94℃，退火 55-65℃，延伸 72℃） 三、标准操作步骤（高考重点考查） 第一步：两段基因的分别扩增（PCR1 和 PCR2） PCR1 体系：模板（含基因 A）+ 引物 P1 + 引物 P2 → 扩增含基因 A 全序列及基因 B 同源序列的片段 A' PCR2 体系：模板（含基因 B）+ 引物 P3 + 引物 P4 → 扩增含基因 B 全序列及基因 A 同源序列的片段 B' 关键注意：PCR1 和 PCR2 必须分开进行（因 P2 与 P3 互补会相互结合，导致引物失效） 第二步：融合片段的获得（PCR3） 回收纯化片段 A' 和 B'，去除多余引物和 dNTP 混合 A' 和 B' 作为共同模板，不加引物进行若干循环： 变性：94℃使 DNA 双链解旋 退火：A' 的 3' 端与 B' 的 5' 端通过同源序列互补配对 延伸：DNA 聚合酶催化形成完整融合基因 A-B 加入外侧引物 P1 和 P4，进行常规 PCR 扩增，获得大量纯净融合基因 第三步：融合基因的后续操作（基因工程流程） 克隆：将融合基因插入表达载体（质粒、病毒等） 转化：导入受体细胞（大肠杆菌、酵母菌、动植物细胞等） 筛选：通过抗性标记、荧光标记等筛选阳性克隆 表达：在受体细胞中表达融合蛋白，进行功能研究 四、引物设计核心要点（高考高频考点） 引物长度：通常 18-25 个核苷酸，保证特异性与结合效率 P2 与 P3 设计： 5' 端添加互补序列：P2 的 5' 端含基因 B 的同源序列，P3 的 5' 端含基因 A 的同源序列 互补长度：15-20 个碱基，确保退火时稳定结合 GC 含量：40%-60%，避免引物二级结构 P1 与 P4 设计： 结合基因 A 上游和基因 B 下游的特异性序列 可在 5' 端添加限制酶识别序列或标签序列（如 His-tag、GFP），方便后续克隆与检测 五、与传统基因拼接方法的对比（高考辨析点） 对比项目 重组 PCR 技术 传统酶切连接法 核心工具 特殊设计引物、热稳定 DNA 聚合酶 限制酶、DNA 连接酶 拼接效率 高，无需酶切位点，直接融合 受酶切位点限制，可能存在连接效率低问题 灵活性 极高，可任意拼接不同基因片段 受限制酶识别序列分布限制 操作步骤 少，3 步 PCR 即可完成 多，需酶切、回收、连接、转化等 适用场景 构建融合基因、基因定点突变、DNA 片段修饰 常规基因克隆、载体构建 六、典型应用与高考情境 1. 融合蛋白表达：如将目的基因与 GFP（绿色荧光蛋白）基因融合，表达后通过荧光观察目的蛋白的亚细胞定位 2. 基因定点突变：通过引物设计引入突变位点，实现基因精确修饰 3. 多基因串联表达：将多个功能基因拼接成一个转录单元，实现协同表达 4. 病毒基因重组研究：模拟病毒基因重组过程，研究病毒变异机制 高考常见情境：以 LTB 与 ST1 基因融合、Y 基因与 GFP 基因融合等为背景，考查引物设计、PCR 步骤、融合原理等知识点 七、高考易错点与答题技巧 易错点 1：误认为重组 PCR 需要 DNA 连接酶 → 正确：通过引物互补和 DNA 聚合酶延伸实现融合，无需连接酶 易错点 2：PCR1 和 PCR2 可在同一体系进行 → 正确：必须分开，因 P2 与 P3 互补会相互结合，导致引物失效 易错点 3：融合基因表达的蛋白无原有功能 → 正确：融合基因通常保留原有基因的功能结构域，可表达具有双功能的融合蛋白 答题技巧： 涉及引物设计问题，重点答出P2 与 P3 的互补设计是融合关键 涉及 PCR 步骤，按 “两段分别扩增→混合退火延伸→外侧引物扩增” 的逻辑作答 涉及原理，紧扣DNA 半保留复制和同源序列互补配对两个核心机制 八、针对性练习 1．（22-23高三下·吉林白山·期中）重组PCR技术是一项新的PCR技术，通过重组PCR技术能将两个不同的DNA连接成为一个新DNA分子。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB和ST1两个基因片段，利用重组PCR技术构建了LTB—ST1融合基因，制备过程如下图所示。回答下列问题： (1)利用PCR技术扩增目的基因的过程中，向反应体系中加入的物质除了引物和模板链﹐还需要加入________。利用PCR技术扩增目的基因，依据的生物学原理是______。 (2)从P2，P3两种引物的角度分析，LTB和ST1基因能够融合的关键是______。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是_______。②过程不需要加入引物，原因是________。 (3)科研小组为了检测是否成功构建出融合基因，将反应后体系中的各种DNA分子进行电泳，结果如图所示。则融合基因最可能是________，判断依据是________。 【答案】(1) 耐高温DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸 DNA双链复制 (2) 这两种引物的部分区域能进行碱基互补配对 P2和P3能结合，会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程 两条母链可作为合成子链的引物 (3) 3 融合基因包含2个不同的基因，其分子量较大，3表示的DNA分子量最大（或1和2与M中碱基对数为1000bp和2500bp的对照基因的电泳结果相同，3的碱基对数大约是1和2的碱基对数之和） 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】（1）PCR体系中需要加入的物质有引物，模板链、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸等。PCR是一项体外扩增DNA的技术，利用PCR技术扩增目的基因，依据的生物学原理是DNA双链复制。 （2）LTB和ST1基因能够融合的关键是P2和P3两种引物的部分区域能发生碱基互补配对，碱基互补配对区域的碱基之间能够重合在一起，从而将两个基因融合在一起；由于P2和P3两种引物能结合，因此PCR1和PCR2不能在同一个体系中进行，理由是引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响PCR过程；②过程不需要加入引物，两条母链的起始段位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3端。 （3）PCR体系中存在融合和未融合的DNA分子，融合的DNA包括了2个DNA分子片段，其分子量较大。根据电泳图可知，3号DNA分子的分子量最大，因此3号DNA分子最可能是融合基因。 12．（24-25高二下·福建福州·阶段练习）重组PCR技术是一项新的PCR技术，可将原来两个不相关的DNA连接起来，组成一个新的分子。实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB基因和ST1基因片段，用重组PCR技术构建了LTB-ST1融合基因。融合基因的制备过程如图所示。回答下列问题： (1)PCR实验中，子链延伸需要在______催化作用下，该酶需要被______（填离子）激活后才能发挥作用。 (2)设计引物时，引物P1与引物P2的碱基序列______（填“能”或“不能”）互补；引物P2与引物P3的碱基序列_______（填“能”或“不能”）部分互补，原因是____________。 (3)DNA子链是从5'端向3'端延伸。为了使杂交链顺利延伸子链，至少需要经过2次循环才能得到用于杂交的目的链L、S，则第2次循环的目的是______________。 (4)杂交链延伸生成LTB-ST1融合基因的过程中，______（填“需要”或“不需要”）加入引物。在图中标出杂交链两条母链的3'端和5'端，______。 【答案】(1) 耐高温的DNA聚合 Mg2＋ (2) 不能 能 LTB基因和ST1基因能融合 (3)为杂交链延伸子链起始部位提供3'端 (4) 不需要 【分析】PCR 是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与 DNA 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 【详解】（1）在PCR过程中，子链延伸时温度需上升到72℃，在耐高温DNA聚合酶的催化下进行，且该耐高温的DNA聚合酶需要被Mg2＋激活后发挥作用。 （2）为防止引物的碱基配对影响扩增结果，引物P1与引物P2的碱基序列不能互补。LTB基因和ST1基因能融合的关键是引物P2和引物P3部分碱基能互补配对，从而将两个基因融合在一起。 （3）第一步：在扩增 LTB 基因时，第一次循环使用引物 P2，DNA 子链是从5'端向3'端延伸。 第二步：为了使杂交链能顺利延伸子链，需要引物P2的碱基末端提供3'端，这就需要进行第二次循环。第二次循环使用引物 P2和引物P1，得到的子链能为杂交链延伸子链起始部位提供3'端，ST1基因的扩增过程类似。 （4）杂交链延伸生成LTB-ST1融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的起始位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3'端，杂交链两条母链的3'端和5'端标注如图： 3．（2023·福建龙岩·三模）重组PCR技术是一项新的PCR技术，通过重组PCR技术能将两个不同的DNA连接成为一个新DNA分子。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB和ST1两个基因片段，利用重组PCR 技术构建了LTB—ST1融合基因，制备过程如下图1所示。回答下列问题： (1)利用PCR技术扩增目的基因的过程中，向反应体系中加入的物质除了引物和模板链外，还需要加入_________。利用PCR技术扩增目的基因，依据的生物学原理是_________。 (2)从P2，P3两种引物的角度分析，LTB和ST1基因能够融合的关键是PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是_________。 (3)②过程___________（填“需要”或“不需要”）加入引物，原因是_________。 (4)科研小组为了检测是否成功构建出融合基因，将反应后体系中的各种DNA分子进行电泳，结果如图2所示。则融合基因最可能是_________。 【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸（Taq酶和dNTP） DNA双链复制 (2) 引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响PCR过程 (3) 不需要 两条母链的起始段位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3'端 (4) 3号DNA分子 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端至3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链。 【详解】（1）PCR体系中需要加入的物质有引物、模板链、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）和dNTP等，PCR是一项体外扩增DNA的技术，利用PCR技术扩增目的基因，依据的生物学原理是DNA双链复制。 （2）由于P2和P3两种引物能结合，因此PCR1和PCR2不能在同一个体系中进行，理由是引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响PCR过程。 （3）②过程不需要加入引物，两条母链的起始段位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3'端。 （4）PCR体系中存在融合和未融合的DNA分子，融合的DNA包括了2个DNA分子片段，其分子量较大。根据电泳图可知，3号DNA分子的分子量最大，因此3号DNA分子最可能是融合基因。 【点睛】本题考查PCR扩增技术，意在考查考生对所学知识要点的理解，把握知识间内在联系，运用所学知识，准确判断问题的能力。 4．（2026·安徽蚌埠·模拟预测）某自花传粉植物的药物P的合成依次受染色体上显性基因A、B、D控制。研究人员通过基因工程构建含“质粒-A-B-D”的大肠杆菌生产药物P，下图为基因表达载体的构建过程，其中TetR表示四环素抗性基因，AmpR代表氨苄青霉素抗性基因。引物1序列为，引物2序列为。限制酶的识别序列及切割位点（从左向右均为）分别为KpnⅠ（）、XbaⅠ（）、BamHⅠ（）、NcoⅠ（）。基因B和D转录的模板分别是a链和c链。根据所学知识回答下列问题： (1)PCR通过变性、复性、延伸三步，反复循环，可实现基因片段的指数式扩增；常采用________来鉴定PCR的产物。 (2)据图判断A基因转录的模板链应该是________。一个A基因经过5轮循环后，得到的子代DNA分子中，同时含有2种引物的DNA分子所占的比例为________。为保证A基因正确连接到质粒上，需利用PCR1对A基因进行改造，所用引物1和引物2上分别含有的限制酶识别序列应为________。 A．KpnⅠ、NcoⅠ    B．KpnⅠ、BamHⅠ    C．XbaⅠ、BamHⅠ    D．XbaⅠ、NcoⅠ (3)为实现图中B基因和D基因的重叠延伸，PCR2和PCR3过程中需要分别在引物________的5’端添加互补序列。过程②复性过程中会形成多种杂交双链，其中能延伸得到B-D融合基因的为图中________（填字母）杂交形成的DNA． (4)为保证“B-D融合基因”与“质粒-A”按图中方式连接，需要在引物3和引物6中分别添加限制酶________的识别序列。 【答案】(1) 电泳/琼脂糖凝胶电泳 (2) n 15/16 D (3) 4和5 b＇、c＇ (4) NcoⅠ、BamHⅠ 【详解】（1）PCR产物的鉴定常采用琼脂糖凝胶电泳或电泳。 （2）基因转录的起点是启动子，XbaⅠ识别序列靠近启动子，而NcoⅠ识别序列靠近终止子，转录的方向是从模板链的3'末端开始延伸，结合引物的序列方向，说明A基因转录的模板链可能是n。A基因在第一轮循环的时候，产生的两个DNA分子均是一条链含有引物，一条链不含引物，第二次循环时，以不含引物的DNA单链为模板扩增的DNA只有一种引物，以含一种引物的DNA单链为模板进行扩增的DNA含有两种引物，经过5轮循环，共产生32个DNA分子，其中有30个含有两种引物，2个含有一种引物，含有2种引物的DNA分子所占的比例为15/16。据图可知，A基因扩增选择引物1和引物2，结合引物和限制酶识别序列可知，引物1序列为5＇-GGTCTAGACCTAGG-3＇，对应限制酶XbaⅠ识别序列，引物2序列为 5'-GGCCATGGGGTTC-3'，对应限制酶NcoⅠ识别序列，D正确。 （3）基因B和D转录的模板分别是a链和c链，要将B基因和D基因重叠延伸，且保证B、D基因的正常表达，需要模板链在DNA的同一条链上，结合图示B基因和D基因的引物，和基因B和D转录的模板分别是a链和c链，PCR2和PCR3过程中需要分别在引物4和5的5 ′端添加互补序列。引物5与c相同，引物4和b相同，引物4和引物5的末端互补配对形成杂交双链，因此能延伸得到B-D融合基因的为图中b'、c'杂交形成的DNA。 （4）利用XbaⅠ和NcoⅠ限制酶获得质粒-A，为了使B、D基因表达，B、D基因也必须连接在启动子和终止子之间，若选择XbaⅠ，则基因A会被切割破坏，结合转录方向可知，需要在引物3和引物6中分别添加限制酶NcoⅠ、BamHⅠ的识别序列。 5．（2026·重庆·模拟预测）白桦是我国重要的绿化树种，BpMYB5基因是调控白桦耐盐性的关键基因，为验证该基因的耐盐功能，研究人员利用无缝克隆技术，将BpMYB5基因与绿色荧光蛋白（eGFP）基因融合，构建了pBI121-BpMYB5-eGFP过表达载体，开展相关实验研究。回答下列问题： 注：KanR为卡那霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因。 (1)过程①是利用PCR技术将质粒线性化，传统方法是利用限制酶在对应酶切位点进行切割，与限制酶切方法相比，过程①的优点是______，该过程中引物应选择______。 (2)为确保BpMYB5基因与eGFP基因融合后能成功构建融合基因，并表达出完整的融合蛋白，在引物设计时，应去除BpMYB5基因中编码终止密码子的序列。已知相关基因的编码链（与模板链互补的DNA链）的部分序列如下表（AUG为起始密码子，UAG、UAA、UGA为终止密码子）。为实现二者的无缝克隆且保证融合蛋白的正常表达，图中引物R1的碱基序列应为5'-_______-3'（写出15个碱基）。融合基因必须插入到T-DNA内部的原因是______。 BpMYB5基因序列 5'-AATGCCTAGT……GTGTTTTAGCAT-3' eGFP基因序列 5'-CATGTCCAGC……AACCCATAACCA-3' (3)实验人员对农杆菌感染后的白桦愈伤组织进行筛选，应该在培养基中添加的抗生素为______，将筛选得到的转基因愈伤组织经培养可获得转基因白桦植株，通过观察______以了解BpMYB5基因的表达水平和表达部位。 【答案】(1) 不受酶切位点序列的限制，可以在质粒任意位点进行开环；避免限制酶破坏质粒上功能区域；在对质粒线性化的同时可以进行大量扩增 引物2和引物3 (2) GCTGGACATAAACAC T-DNA可携带融合基因转移到受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA上 (3) 卡那霉素 绿色荧光强度和分布 【详解】（1）传统限制酶切割质粒只能在限制酶特定的识别序列（酶切位点）处切开，而PCR技术线性化质粒不受酶切位点序列的限制，可以在质粒任意位点进行开环；避免限制酶破坏质粒上功能区域；在对质粒线性化的同时可以进行大量扩增。 PCR扩增的延伸方向为5'→3'，过程①需要将环状质粒从目标断开位点打开，得到全长的线性化质粒，因此需要选择分别结合在断开位点两侧、延伸方向覆盖整个质粒的引物2和引物3，才能扩增得到符合要求的线性化载体。 （2） BpMYB5编码链末端为5'-…GTGTTTTAGCAT-3'，其中TAG（对应终止密码子UAG）及其后CAT需去除；R1是BpMYB5的反向引物，延伸方向为5'→3'，需要与BpMYB5去除TAGCAT后的末端、eGFP的开头序列互补，实现两基因无缝连接，所以引物R1的15个碱基序列为GCTGGACATAAACAC。 农杆菌转化植物的原理是：农杆菌Ti质粒上T-DNA可携带融合基因转移到受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA上，因此融合基因必须插入T-DNA内部才能稳定转化和表达。 （3）重组质粒的T-DNA区域携带卡那霉素抗性基因（KanR），只有成功转入重组质粒的愈伤细胞能在含卡那霉素的培养基上存活，因此培养基中添加卡那霉素进行筛选。 BpMYB5与绿色荧光蛋白基因（eGFP）融合表达，绿色荧光的强度反映BpMYB5的表达水平，绿色荧光的分布反映BpMYB5的表达部位，因此可通过观察绿色荧光强度和分布了解目的基因的表达情况。 6．（2026·广西·一模）将红色荧光蛋白(dsred2)基因与某功能蛋白基因首尾相连，并置于同一套调控序列(包括启动子、终止子等)控制之下，构成融合基因，通过对红色荧光蛋白的跟踪观察，可以研究功能基因的表达、定位和动态变化。围绕下列两种构建dsred2-amy融合基因(红色荧光蛋白基因-α-淀粉酶基因融合基因)的方法，回答下列问题： (1)方法1(如图1所示)： 注：I～IV各表示一种引物，X、H、S分别表示一种限制酶识别序列。 ①限制酶的识别序列要添加在引物的___________端。为了保证两个基因能够正确连接，限制酶S的识别序列位于pMG36e-dsred2质粒的___________(填“a”或“b”)处。“？”表示的处理主要是用限制酶___________(填“H和X”或“X和S”或“S和H”)分别处理图1中上下两种重组质粒，再用DNA连接酶连接。 ②引物Ⅰ与引物Ⅳ的碱基序列___________(填“是”或“不是”)完全互补的，原因是___________。 (2)方法2(如图2所示，其中引物Ⅵ和引物Ⅶ中的部分序列，即黑色区域，可互补配对)： ①利用PCR技术扩增dsred2基因或amy基因时，不需要解旋酶来打开DNA双链，原因是___________。 ②dsred2基因和amy基因混合后可得到2种类型的杂交链，其中只有图2所示的杂交链能扩增得到融合基因，另一种杂交链不能。图2中杂交链合成延伸得到dsred2-amy融合基因的过程需要___________的参与。另一种杂交链不能合成延伸得到dsred2-amy融合基因，原因是___________。 【答案】(1) 5’ a X和S 不是 引物Ⅰ是扩增dsred2基因的上游引物，引物Ⅳ是扩增amy基因的上游引物。由于dsred2和amy是两个不同的基因，它们的DNA序列不同，因此对应的引物序列也不同，自然不是互补的。 (2) PCR过程中通过高温变性使DNA双链解开，无需解旋酶 Taq DNA聚合酶/耐高温DNA聚合酶 另一种杂交链的3’端没有与模板互补的序列，无法被DNA聚合酶延伸 【分析】本题图像展示两种构建dsred2-amy融合基因的方法。图1为传统克隆法：通过PCR扩增dsred2和amy基因，分别插入质粒，再用限制酶切割后连接。图2为重叠延伸PCR法：设计引物使两基因产物末端互补，混合退火后由DNA聚合酶延伸形成融合基因。 【详解】（1）①PCR引物的延伸方向是5'→3'，因此外源酶切位点序列必须加在引物的5'端，这样扩增出的产物两端才会有这些位点；为保证dsred2基因与amy基因首尾相连，限制酶S的识别序列应位于pMG36e-dsred2质粒的a处；因为X是两个片段的连接位点，S是保证amy定向插入质粒的位点，H只存在于dsred2一侧，无法作为共同酶，故主要是用限制酶X和S分别处理图1中上下两种重组质粒，再用DNA连接酶连接。 ②引物Ⅰ是扩增dsred2基因的上游引物，引物Ⅳ是扩增amy基因的上游引物。由于dsred2和amy是两个不同的基因，它们的DNA序列不同，因此对应的引物序列也不同，自然不是互补的。 （2）①PCR技术利用高温使DNA双链间的氢键断裂，实现变性解旋，无需解旋酶参与。 ②图2中杂交链合成延伸得到dsred2-amy融合基因的过程需要Taq DNA聚合酶（或耐高温DNA聚合酶）‍的参与。DNA聚合酶只能沿着模板链的3'→5'方向，从引物的3'端延伸子链。图2中所示的正确杂交链，其单链部分有3'端伸出，可以作为引物结合位点进行延伸。而另一种杂交链（未画出的反向连接），其单链末端可能没有合适的3'端结构，或者延伸方向与基因序列不符，导致DNA聚合酶无法结合或无法正确延伸，从而不能形成融合基因。 7．（2026·湖南衡阳·模拟预测）大豆中转录调控因子Y蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达。研究人员通过逆转录PCR获得Y基因并与改造后的Ti质粒上的绿色荧光蛋白基因(GFP)进行拼接获得融合基因。成功表达的Y—GFP融合蛋白可用于Y蛋白调控机理的研究，请回答下列问题： (1)利用逆转录PCR获得Y基因所需的酶有___________，逆转录得到的Y基因中___________(填“含有”或“不含有”)启动子和终止子序列。 (2)为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y—GFP融合蛋白，PCR扩增Y基因时应通过设计引物去除___________对应的序列。请写出扩增Y基因的下游引物：___________(写10个碱基即可)。 (3)PCR扩增目的基因时，复性温度主要取决于___________(答2点)，因参与合成反应，不断消耗而浓度下降的组分有___________。 (4)将初步构建的Y—GFP基因表达载体导入大豆细胞后，对经___________筛选得到的三个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图2所示。其中细胞系___________最可能成功表达出Y—GFP融合蛋白。 【答案】(1) 逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶 不含有 (2) 终止密码子 5'-GGATCCATGT-3' (3) 引物的长度和GC含量 四种脱氧核苷酸(dNTP)和2种引物 (4) 潮霉素 1 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）利用逆转录PCR获得Y基因所需的酶有逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶。逆转录的模板是mRNA，而mRNA是经过转录后加工的产物，仅包含编码区序列(外显子)，不包含DNA中的启动子(转录起始调控序列)和终止子(转录终止调控序列)。 （2）为实现定向插入，需选择两种不同的限制酶，且Ti质粒中启动子下游的EcoR Ⅰ(识别序列GAATTC)和Sau3A Ⅰ(识别序列GATC)位点适合。则Y基因上游含有黏性末端AATT，下游含有黏性末端GATC，避免载体自连并保证方向正确。去除终止密码子：Y基因编码链末端含TAG(对应mRNA的UAG，终止密码子)，若保留会导致融合蛋白翻译提前终止，因此需通过引物设计去除该终止密码子对应的序列。EcoR Ⅰ会破坏Y基因则不能用EcoR Ⅰ切割Y基因，则需要用同尾酶，即Mun Ⅰ加入引物的5′端，Sau3A Ⅰ会识别Bcl Ⅰ的识别序列，则不能用Sau3A Ⅰ切割，需要引入同尾酶，即BamH Ⅰ识别序列，所以上游引物需含Mun Ⅰ位点(CAATTG)，引物序列为5′-CAATTGATGC3′。下游引物需含BamH Ⅰ位点(GGATCC)且去除最末端TAG对应的终止密码子，所以下游引物序列为5′-GGATCCATGT-3′。 （3）PCR扩增目的基因时，复性温度主要取决于引物的长度和GC含量。因参与合成反应，不断消耗而浓度下降的组分有四种脱氧核苷酸(dNTP)和2种引物。 （4）Ti质粒含潮霉素抗性基因(Hyg)，因此需用潮霉素筛选成功导入载体的大豆细胞。融合蛋白检测，Y—GFP融合蛋白可被Y蛋白抗体和GFP抗体同时识别。从图2电泳结果看，只有细胞系1同时在相同大小的位置出现了Y蛋白抗体和GFP抗体的阳性条带，说明该细胞系最有可能成功表达出Y—GFP融合蛋白(因为Y—GFP融合蛋白既有Y蛋白的部分又有GFP蛋白的部分，能同时与两种抗体反应)。 8．（2026·福建厦门·二模）研究人员构建了一种由近红外光激活的大肠杆菌工程菌，该菌能表达并分泌Noxa蛋白(一种促凋亡蛋白)诱导肿瘤细胞凋亡。图1为PCR扩增ClyA-Noxa融合基因的流程，图2为温度敏感型载体的工作原理，Tcl基因编码的cI857蛋白形成的二聚体，与pR-pL基因启动子结合，42℃时cI857蛋白变性失活。 请回答： (1)大肠杆菌的ClyA基因编码的蛋白分布于细胞外。研究人员将ClyA基因片段与Noxa基因片段融合，推测其目的是___________。扩增融合基因时，引物R1和P2实现了两种基因片段的拼接，则R1和P2分别是___________(从下列引物中选填)。 引物a：5'-GCCTTAAGCCATGGC……-3' 引物b：5'-GGTGATGGCATGCGC……-3' 引物c：5'-GCGCATGCCATCACC……-3' 引物d：5'-CGGAATTCGGTACCG……-3' (2)将构建好的表达载体导入大肠杆菌需先用___________处理大肠杆菌细胞，以提高转化效率。为鉴定ClyA-Noxa融合基因进入大肠杆菌后是否转录和翻译，在分子水平进行检测的方法是___________。 (3)将构建好的工程菌与肿瘤细胞在37℃下共培养，与对照组相比，肿瘤细胞存活率无明显差异；若温度升高至42℃，肿瘤细胞存活率显著下降。结合图2分析，42℃时工程菌使肿瘤细胞死亡的机制是___________。 (4)工程菌植入肿瘤部位会破坏肿瘤组织的血管，肿瘤组织颜色变暗对近红外光的吸收值增大，肿瘤组织部位温度升高。通过近红外光照射肿瘤部位，可达到杀死肿瘤的目的。肿瘤细胞死亡的因素包括___________(多选)。 ①营养和氧气供应障碍    ②高温导致细胞热损伤和坏死 ③肿瘤细胞快速表达Noxa蛋白    ④Noxa蛋白诱导肿瘤细胞凋亡 【答案】(1) 使Noxa蛋白分泌到细胞外 b、c(或c、b) (2) Ca2+ PCR等技术、抗原—抗体杂交 (3)42℃时cI857蛋白变性失活，解除对pR-pL启动子的抑制，促进ClyA-Noxa融合基因表达，Noxa蛋白被分泌到细胞外，诱导肿瘤细胞凋亡 (4)①②④ 【详解】（1）大肠杆菌的ClyA基因编码的蛋白分布于细胞外。研究人员将ClyA基因片段与Noxa基因片段融合，据此推测其目的是利用ClyA蛋白天然的分泌功能，将融合表达的Noxa蛋白分泌到细胞外，从而作用于肿瘤细胞，实现靶向诱导凋亡。PCR 拼接融合基因时，需要设计互补的重叠引物，使两个基因片段通过重叠延伸连接。引物 c（5'-GCGCATGCCATCACC……-3'）与引物 b（5'-GGTGATGGCATGCGC……-3'）序列反向互补，可作为重叠引物，实现 ClyA 基因片段与 Noxa 基因片段的拼接；引物 a、d 为酶切位点引物，用于后续载体连接，不用于片段拼接，故选b、c。 （2）将构建好的表达载体导入大肠杆菌需先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中，以提高转化效率。鉴定ClyA-Noxa融合基因进入大肠杆菌后是否转录可通过PCR等技术检测ClyA-Noxa融合基因进入大肠杆菌或检测ClyA-Noxa融合基因是否转录出了mRNA；从大肠杆菌中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，检测ClyA-Noxa融合基因是否翻译成Noxa蛋白等。 （3）据题干信息和图2信息可知，37℃时 cI857 蛋白形成二聚体，结合 pR-pL 启动子，抑制融合基因表达；42℃时 cI857 蛋白变性，抑制解除，融合基因高效表达，Noxa 蛋白大量分泌，诱导肿瘤细胞死亡。故42℃时工程菌使肿瘤细胞死亡的机制是42℃时cI857蛋白变性失活，解除对pR-pL启动子的抑制，促进ClyA-Noxa融合基因表达，Noxa蛋白被分泌到细胞外，诱导肿瘤细胞凋亡。 （4）①工程菌破坏肿瘤组织血管，导致肿瘤细胞营养、氧气供应不足，①正确； ②近红外光照射使肿瘤部位温度升高，高温导致细胞热损伤和坏死，②正确； ③Noxa 蛋白由工程菌表达，并非肿瘤细胞自身表达，③错误； ④工程菌分泌的 Noxa 蛋白可诱导肿瘤细胞凋亡，④正确。 9．（25-26高三上·山东烟台·期末）为了快速简便检测口蹄疫病毒（FMDV），科研人员采用重叠延伸PCR技术将抗FMDV纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞（cRBC）纳米抗体NbRBC48的基因片段连接，制备双特异纳米抗体Nb205-48，相关过程、所用引物及质粒等如图1所示。 (1)图1中由杂交链获得融合基因的②过程，________（填“需要”或“不需要”）添加引物，其原因是________。引物P2中linker的碱基序列是5'-________-3'。 (2)对Nb205-linker-NbRBC48融合基因扩增时需要的引物是________。若利用PCR技术扩增1个融合基因时，共消耗了126个引物分子，则该过程扩增了________次。利用图1中质、粒构建基因表达载体时，为使融合基因正确插入质粒，需用限制酶________对该质粒进行酶切。 (3)将基因表达载体导入大肠杆菌时，大肠杆菌需用________处理。目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞维持稳定和表达的过程称为________。 (4)科研人员将抗FMDV纳米抗体Nb205、抗cRBC纳米抗体NbRBC48及获得的双特异纳米抗体Nb205-48进行亲和免疫反应性能检测，结果如图2。检测结果显示________，说明双特异纳米抗体Nb205-48构建成功。 【答案】(1) 不需要 可以分别以目的链1和目的链2为引物进行延伸 5'-GACCCCAGCTCCAAAGCT-3' (2) P1和P4 6 BclI、NotI (3) Ca2+ 转化 (4)Nb205-48可同时与FMDV及cRBC反应，且反应性能与Nb205和NbRBC48无明显差异 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）重叠延伸PCR的核心是两个基因片段存在互补的重叠区域，经变性、退火后形成的杂交链，两条单链分别具有互补的重叠末端，能互相作为模板引导 DNA 聚合酶进行链的延伸，因此②过程不需要额外引物。结合图示可知，先分别用(P1、P2)与(P3、P4)扩增得到目的链1和目的链2，再仅使用P1、P4进行第二轮PCR即能获得融合基因；引物需要与模板的3'端结合，据图可知，引物P2中决定linker的碱基序列是5′-GACCCCAGCTCCAAAGCT-3′，这段序列编码了连接肽的氨基酸序列，确保两个基因片段能够正确连接。 （2）融合基因的两端序列分别对应Nb205的上游（匹配引物P1）和NbRBC48的下游（匹配引物P4），重叠延伸 PCR的扩增阶段，仅需这一对外侧引物即可特异性扩增出完整的融合基因。PCR扩增时，第n轮扩增消耗的引物总数为2n+1−2。设扩增次数为n，则2n+1−2=126，计算得2n+1=128，即n+1=7，因此n=6。要使融合基因正确插入质粒，需保证酶切后质粒和融合基因的黏性末端匹配。图1中融合基因右端应与启动子接近，融合基因的两端应携带与质粒上BclI、NotI酶切位点对应的末端，选用这两种限制酶可防止质粒自身环化和融合基因反向插入。 （3）将基因表达载体导入大肠杆菌时，需用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于感受态，利于吸收周围环境中的DNA 分子；目的基因进入受体细胞并在其中稳定存在和表达的过程，定义为转化。 （4）双特异纳米抗体的功能是同时结合两种靶标物质。检测结果中，Nb205仅结合FMDV、NbRBC48仅结合 cRBC，而 Nb205-48可同时与FMDV及cRBC反应，且反应性能与Nb205和NbRBC48无明显差异，说明双特异纳米抗体Nb205-48构建成功。 10．（2026·河南信阳·模拟预测）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员利用重叠延伸PCR（重叠链相互搭桥、互为模板而延伸，最终将不同来源的DNA片段拼接起来）将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。利用重叠延伸PCR获取融合基因的基本过程如图1所示，所用的Ti质粒如图2所示，请回答下列问题： 注：Nco Ⅰ、BamH Ⅰ、Sac Ⅰ、Sal Ⅰ为限制酶酶切位点。启动子1、2属于真核细胞表达系统，Sm+是链霉素抗性基因，Amp+是氨苄青霉素抗性基因，GUS基因编码的酶能将无色物质X-Gluc分解，使植物细胞呈蓝色。 (1)PCR反应体系中需加入______（答两点）、4种脱氧核苷酸、引物、Mg2+、缓冲液等。PCR反应中的每次循环一般分为变性、______、延伸三步。 (2)图1中的PCR1和PCR2不能置于一个PCR体系中同时进行，原因是______。为了重叠链顺利延伸，杂交的两条链分别为______（从字母“a”“b”“c”“d”中选）。获得融合基因后，用引物1和4继续进行PCR大量扩增该序列。 (3)根据图2中Ti质粒的结构及后续筛选的需要分析，在设计引物1和4时需分别加入限制酶______的识别序列。经过相应酶切处理后，将融合基因与该质粒在DNA连接酶作用下形成重组质粒。为了提高重组质粒导入农杆菌的效率，一般要用______处理农杆菌。 (4)用农杆菌侵染拟南芥后，为了将被侵染的拟南芥细胞进行脱菌处理以及筛选含有融合基因的拟南芥细胞，培养基上需要添加______。然后，通过______技术可培育出完整的转基因拟南芥植株。 (5)通过观测转基因拟南芥根尖细胞中______，了解PA的分布和含量。 【答案】(1) 模板、耐高温的DNA聚合酶（或TaqDNA聚合酶） 复性 (2) 引物2和引物3中存在互补配对的片段，置于同一反应体系时，它们会发生结合而失去作用 a、d (3) Nco Ⅰ、BamH Ⅰ Ca2+ (4) 链霉素、X-Gluc 植物组织培养 (5) 绿色荧光点的分布与含量 【详解】（1）PCR反应需要的成分包括：模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、热稳定Taq酶、Mg²⁺、缓冲液等，题目要求答两点，填模板DNA和Taq酶即可；PCR的循环步骤为变性→复性（退火）→延伸。 （2）PCR1的引物2和PCR2的引物3设计了互补的重叠序列，若放在同一PCR体系中，引物2和3会相互结合，无法正常扩增出PABD基因和GFP基因；a链和d链都是5′→3′正向链，3′端有互补重叠序列，能配对搭桥并被酶延伸；其他链方向或末端不匹配，无法重叠延伸。 （3）融合基因需插入启动子2与终止子之间的T-DNA 区，且要破坏GUS基因便于筛选，因此只能选用Nco Ⅰ 和BamH Ⅰ，因此引物两端需要分别添加这两种酶的识别序列；将重组质粒导入农杆菌时，需要用氯化钙（Ca²⁺）处理农杆菌，使其成为感受态细胞，提高转化效率。 （4）农杆菌侵染后，脱菌需要添加抗生素（链霉素）杀死农杆菌；融合基因插入替换了GUS基因，含融合基因的细胞不能表达GUS，结合题目信息，添加X-Gluc可筛选出含目的基因的细胞；植物细胞具有全能性，通过植物组织培养技术可将转基因细胞培育为完整植株。 （5）PA结合蛋白与GFP融合表达，PA分布在哪里，探针就结合在哪里，PA含量越高，绿色荧光强度越强，因此通过观察绿色荧光的分布和强度，即可了解PA的分布和含量。 试卷第20页，共24页 试卷第1页，共24页 学科网（北京）股份有限公司 $ · 重组PCR技术构建融合基因 提升练-2025-2026学年人教版高中生物选择性必修三 · PCR技术应用（一） ——重组 PCR 技术构建融合基因（高考生物归纳总结） 目录 一、核心概念与本质 二、核心原理与关键条件 三、标准操作步骤（高考重点考查） 四、引物设计核心要点（高考高频考点） 五、与传统基因拼接方法的对比（高考辨析点） 六、典型应用与高考情境 七、高考易错点与答题技巧 八、针对性练习（标红的为相关考点训练） 一、核心概念与本质 1. 重组 PCR 技术（又称重叠延伸 PCR、融合 PCR）：是一种基于DNA 半保留复制原理的体外 DNA 重组技术，能将两个或多个不同来源的 DNA 片段（如基因 A 和基因 B）精确拼接成一个新的 DNA 分子（融合基因 A-B）。 2. 融合基因：由两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列（启动子、终止子等）控制之下，表达出具有原有基因功能或新功能的融合蛋白。 3. 技术本质：通过特殊引物设计创造 DNA 片段间的同源重叠区域，实现片段间的互补配对与延伸，无需依赖限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶的传统基因拼接方法。 二、核心原理与关键条件 1. 核心原理 （1）DNA半保留复制：PCR扩增的基础机制，子链DNA以母链为模板合成。 （2）同源序列互补配对：两个待融合DNA片段末端设计互补重叠序列（通常15-20个碱基），变性后可相互退火结合，形成完整模板链。 （3）DNA聚合酶延伸：热稳定DNA聚合酶（如Taq 酶）以互补结合的片段为模板，延伸合成完整融合基因。 2. 关键条件 条件 作用 高考常考点 模板 DNA 提供待融合的两个基因片段（基因 A、基因 B） 模板纯度与完整性影响扩增效率 4 种引物 P1（基因 A 上游）、P2（基因 A 下游，含基因 B 同源序列）、P3（基因 B 上游，含基因 A 同源序列）、P4（基因 B 下游） P2 与 P3 的互补设计是融合关键 dNTP DNA 合成原料 四种脱氧核苷酸缺一不可 热稳定 DNA 聚合酶 催化 DNA 链延伸，耐高温 Taq 酶无 3'→5' 外切酶活性，高保真需 Pfu 酶 缓冲液 维持酶活性与反应 pH 含 Mg²⁺（酶活性必需） PCR 仪 精确控制变性、退火、延伸温度循环 温度参数设置（变性 94℃，退火 55-65℃，延伸 72℃） 三、标准操作步骤（高考重点考查） 第一步：两段基因的分别扩增（PCR1 和 PCR2） PCR1 体系：模板（含基因 A）+ 引物 P1 + 引物 P2 → 扩增含基因 A 全序列及基因 B 同源序列的片段 A' PCR2 体系：模板（含基因 B）+ 引物 P3 + 引物 P4 → 扩增含基因 B 全序列及基因 A 同源序列的片段 B' 关键注意：PCR1 和 PCR2 必须分开进行（因 P2 与 P3 互补会相互结合，导致引物失效） 第二步：融合片段的获得（PCR3） 回收纯化片段 A' 和 B'，去除多余引物和 dNTP 混合 A' 和 B' 作为共同模板，不加引物进行若干循环： 变性：94℃使 DNA 双链解旋 退火：A' 的 3' 端与 B' 的 5' 端通过同源序列互补配对 延伸：DNA 聚合酶催化形成完整融合基因 A-B 加入外侧引物 P1 和 P4，进行常规 PCR 扩增，获得大量纯净融合基因 第三步：融合基因的后续操作（基因工程流程） 克隆：将融合基因插入表达载体（质粒、病毒等） 转化：导入受体细胞（大肠杆菌、酵母菌、动植物细胞等） 筛选：通过抗性标记、荧光标记等筛选阳性克隆 表达：在受体细胞中表达融合蛋白，进行功能研究 四、引物设计核心要点（高考高频考点） 引物长度：通常 18-25 个核苷酸，保证特异性与结合效率 P2 与 P3 设计： 5' 端添加互补序列：P2 的 5' 端含基因 B 的同源序列，P3 的 5' 端含基因 A 的同源序列 互补长度：15-20 个碱基，确保退火时稳定结合 GC 含量：40%-60%，避免引物二级结构 P1 与 P4 设计： 结合基因 A 上游和基因 B 下游的特异性序列 可在 5' 端添加限制酶识别序列或标签序列（如 His-tag、GFP），方便后续克隆与检测 五、与传统基因拼接方法的对比（高考辨析点） 对比项目 重组 PCR 技术 传统酶切连接法 核心工具 特殊设计引物、热稳定 DNA 聚合酶 限制酶、DNA 连接酶 拼接效率 高，无需酶切位点，直接融合 受酶切位点限制，可能存在连接效率低问题 灵活性 极高，可任意拼接不同基因片段 受限制酶识别序列分布限制 操作步骤 少，3 步 PCR 即可完成 多，需酶切、回收、连接、转化等 适用场景 构建融合基因、基因定点突变、DNA 片段修饰 常规基因克隆、载体构建 六、典型应用与高考情境 1. 融合蛋白表达：如将目的基因与 GFP（绿色荧光蛋白）基因融合，表达后通过荧光观察目的蛋白的亚细胞定位 2. 基因定点突变：通过引物设计引入突变位点，实现基因精确修饰 3. 多基因串联表达：将多个功能基因拼接成一个转录单元，实现协同表达 4. 病毒基因重组研究：模拟病毒基因重组过程，研究病毒变异机制 高考常见情境：以 LTB 与 ST1 基因融合、Y 基因与 GFP 基因融合等为背景，考查引物设计、PCR 步骤、融合原理等知识点 七、高考易错点与答题技巧 易错点 1：误认为重组 PCR 需要 DNA 连接酶 → 正确：通过引物互补和 DNA 聚合酶延伸实现融合，无需连接酶 易错点 2：PCR1 和 PCR2 可在同一体系进行 → 正确：必须分开，因 P2 与 P3 互补会相互结合，导致引物失效 易错点 3：融合基因表达的蛋白无原有功能 → 正确：融合基因通常保留原有基因的功能结构域，可表达具有双功能的融合蛋白 答题技巧： 涉及引物设计问题，重点答出P2 与 P3 的互补设计是融合关键 涉及 PCR 步骤，按 “两段分别扩增→混合退火延伸→外侧引物扩增” 的逻辑作答 涉及原理，紧扣DNA 半保留复制和同源序列互补配对两个核心机制 八、针对性练习 1．（22-23高三下·吉林白山·期中）重组PCR技术是一项新的PCR技术，通过重组PCR技术能将两个不同的DNA连接成为一个新DNA分子。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB和ST1两个基因片段，利用重组PCR技术构建了LTB—ST1融合基因，制备过程如下图所示。回答下列问题： (1)利用PCR技术扩增目的基因的过程中，向反应体系中加入的物质除了引物和模板链﹐还需要加入________。利用PCR技术扩增目的基因，依据的生物学原理是______。 (2)从P2，P3两种引物的角度分析，LTB和ST1基因能够融合的关键是______。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是_______。②过程不需要加入引物，原因是________。 (3)科研小组为了检测是否成功构建出融合基因，将反应后体系中的各种DNA分子进行电泳，结果如图所示。则融合基因最可能是________，判断依据是________。 2．（24-25高二下·福建福州·阶段练习）重组PCR技术是一项新的PCR技术，可将原来两个不相关的DNA连接起来，组成一个新的分子。实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB基因和ST1基因片段，用重组PCR技术构建了LTB-ST1融合基因。融合基因的制备过程如图所示。回答下列问题： (1)PCR实验中，子链延伸需要在______催化作用下，该酶需要被______（填离子）激活后才能发挥作用。 (2)设计引物时，引物P1与引物P2的碱基序列______（填“能”或“不能”）互补；引物P2与引物P3的碱基序列_______（填“能”或“不能”）部分互补，原因是____________。 (3)DNA子链是从5'端向3'端延伸。为了使杂交链顺利延伸子链，至少需要经过2次循环才能得到用于杂交的目的链L、S，则第2次循环的目的是______________。 (4)杂交链延伸生成LTB-ST1融合基因的过程中，______（填“需要”或“不需要”）加入引物。在图中标出杂交链两条母链的3'端和5'端，______。 3．（2023·福建龙岩·三模）重组PCR技术是一项新的PCR技术，通过重组PCR技术能将两个不同的DNA连接成为一个新DNA分子。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB和ST1两个基因片段，利用重组PCR 技术构建了LTB—ST1融合基因，制备过程如下图1所示。回答下列问题： (1)利用PCR技术扩增目的基因的过程中，向反应体系中加入的物质除了引物和模板链外，还需要加入_________。利用PCR技术扩增目的基因，依据的生物学原理是_________。 (2)从P2，P3两种引物的角度分析，LTB和ST1基因能够融合的关键是PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是_________。 (3)②过程___________（填“需要”或“不需要”）加入引物，原因是_________。 (4)科研小组为了检测是否成功构建出融合基因，将反应后体系中的各种DNA分子进行电泳，结果如图2所示。则融合基因最可能是_________。 4．（2026·安徽蚌埠·模拟预测）某自花传粉植物的药物P的合成依次受染色体上显性基因A、B、D控制。研究人员通过基因工程构建含“质粒-A-B-D”的大肠杆菌生产药物P，下图为基因表达载体的构建过程，其中TetR表示四环素抗性基因，AmpR代表氨苄青霉素抗性基因。引物1序列为，引物2序列为。限制酶的识别序列及切割位点（从左向右均为）分别为KpnⅠ（）、XbaⅠ（）、BamHⅠ（）、NcoⅠ（）。基因B和D转录的模板分别是a链和c链。根据所学知识回答下列问题： (1)PCR通过变性、复性、延伸三步，反复循环，可实现基因片段的指数式扩增；常采用________来鉴定PCR的产物。 (2)据图判断A基因转录的模板链应该是________。一个A基因经过5轮循环后，得到的子代DNA分子中，同时含有2种引物的DNA分子所占的比例为________。为保证A基因正确连接到质粒上，需利用PCR1对A基因进行改造，所用引物1和引物2上分别含有的限制酶识别序列应为________。 A．KpnⅠ、NcoⅠ    B．KpnⅠ、BamHⅠ    C．XbaⅠ、BamHⅠ    D．XbaⅠ、NcoⅠ (3)为实现图中B基因和D基因的重叠延伸，PCR2和PCR3过程中需要分别在引物________的5’端添加互补序列。过程②复性过程中会形成多种杂交双链，其中能延伸得到B-D融合基因的为图中________（填字母）杂交形成的DNA． (4)为保证“B-D融合基因”与“质粒-A”按图中方式连接，需要在引物3和引物6中分别添加限制酶________的识别序列。 5．（2026·重庆·模拟预测）白桦是我国重要的绿化树种，BpMYB5基因是调控白桦耐盐性的关键基因，为验证该基因的耐盐功能，研究人员利用无缝克隆技术，将BpMYB5基因与绿色荧光蛋白（eGFP）基因融合，构建了pBI121-BpMYB5-eGFP过表达载体，开展相关实验研究。回答下列问题： 注：KanR为卡那霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因。 (1)过程①是利用PCR技术将质粒线性化，传统方法是利用限制酶在对应酶切位点进行切割，与限制酶切方法相比，过程①的优点是______，该过程中引物应选择______。 (2)为确保BpMYB5基因与eGFP基因融合后能成功构建融合基因，并表达出完整的融合蛋白，在引物设计时，应去除BpMYB5基因中编码终止密码子的序列。已知相关基因的编码链（与模板链互补的DNA链）的部分序列如下表（AUG为起始密码子，UAG、UAA、UGA为终止密码子）。为实现二者的无缝克隆且保证融合蛋白的正常表达，图中引物R1的碱基序列应为5'-_______-3'（写出15个碱基）。融合基因必须插入到T-DNA内部的原因是______。 BpMYB5基因序列 5'-AATGCCTAGT……GTGTTTTAGCAT-3' eGFP基因序列 5'-CATGTCCAGC……AACCCATAACCA-3' (3)实验人员对农杆菌感染后的白桦愈伤组织进行筛选，应该在培养基中添加的抗生素为______，将筛选得到的转基因愈伤组织经培养可获得转基因白桦植株，通过观察______以了解BpMYB5基因的表达水平和表达部位。 6．（2026·广西·一模）将红色荧光蛋白(dsred2)基因与某功能蛋白基因首尾相连，并置于同一套调控序列(包括启动子、终止子等)控制之下，构成融合基因，通过对红色荧光蛋白的跟踪观察，可以研究功能基因的表达、定位和动态变化。围绕下列两种构建dsred2-amy融合基因(红色荧光蛋白基因-α-淀粉酶基因融合基因)的方法，回答下列问题： (1)方法1(如图1所示)： 注：I～IV各表示一种引物，X、H、S分别表示一种限制酶识别序列。 ①限制酶的识别序列要添加在引物的___________端。为了保证两个基因能够正确连接，限制酶S的识别序列位于pMG36e-dsred2质粒的___________(填“a”或“b”)处。“？”表示的处理主要是用限制酶___________(填“H和X”或“X和S”或“S和H”)分别处理图1中上下两种重组质粒，再用DNA连接酶连接。 ②引物Ⅰ与引物Ⅳ的碱基序列___________(填“是”或“不是”)完全互补的，原因是___________。 (2)方法2(如图2所示，其中引物Ⅵ和引物Ⅶ中的部分序列，即黑色区域，可互补配对)： ①利用PCR技术扩增dsred2基因或amy基因时，不需要解旋酶来打开DNA双链，原因是___________。 ②dsred2基因和amy基因混合后可得到2种类型的杂交链，其中只有图2所示的杂交链能扩增得到融合基因，另一种杂交链不能。图2中杂交链合成延伸得到dsred2-amy融合基因的过程需要___________的参与。另一种杂交链不能合成延伸得到dsred2-amy融合基因，原因是___________。 7．（2026·湖南衡阳·模拟预测）大豆中转录调控因子Y蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达。研究人员通过逆转录PCR获得Y基因并与改造后的Ti质粒上的绿色荧光蛋白基因(GFP)进行拼接获得融合基因。成功表达的Y—GFP融合蛋白可用于Y蛋白调控机理的研究，请回答下列问题： (1)利用逆转录PCR获得Y基因所需的酶有___________，逆转录得到的Y基因中___________(填“含有”或“不含有”)启动子和终止子序列。 (2)为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y—GFP融合蛋白，PCR扩增Y基因时应通过设计引物去除___________对应的序列。请写出扩增Y基因的下游引物：___________(写10个碱基即可)。 (3)PCR扩增目的基因时，复性温度主要取决于___________(答2点)，因参与合成反应，不断消耗而浓度下降的组分有___________。 (4)将初步构建的Y—GFP基因表达载体导入大豆细胞后，对经___________筛选得到的三个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图2所示。其中细胞系___________最可能成功表达出Y—GFP融合蛋白。 8．（2026·福建厦门·二模）研究人员构建了一种由近红外光激活的大肠杆菌工程菌，该菌能表达并分泌Noxa蛋白(一种促凋亡蛋白)诱导肿瘤细胞凋亡。图1为PCR扩增ClyA-Noxa融合基因的流程，图2为温度敏感型载体的工作原理，Tcl基因编码的cI857蛋白形成的二聚体，与pR-pL基因启动子结合，42℃时cI857蛋白变性失活。 请回答： (1)大肠杆菌的ClyA基因编码的蛋白分布于细胞外。研究人员将ClyA基因片段与Noxa基因片段融合，推测其目的是___________。扩增融合基因时，引物R1和P2实现了两种基因片段的拼接，则R1和P2分别是___________(从下列引物中选填)。 引物a：5'-GCCTTAAGCCATGGC……-3' 引物b：5'-GGTGATGGCATGCGC……-3' 引物c：5'-GCGCATGCCATCACC……-3' 引物d：5'-CGGAATTCGGTACCG……-3' (2)将构建好的表达载体导入大肠杆菌需先用___________处理大肠杆菌细胞，以提高转化效率。为鉴定ClyA-Noxa融合基因进入大肠杆菌后是否转录和翻译，在分子水平进行检测的方法是___________。 (3)将构建好的工程菌与肿瘤细胞在37℃下共培养，与对照组相比，肿瘤细胞存活率无明显差异；若温度升高至42℃，肿瘤细胞存活率显著下降。结合图2分析，42℃时工程菌使肿瘤细胞死亡的机制是___________。 (4)工程菌植入肿瘤部位会破坏肿瘤组织的血管，肿瘤组织颜色变暗对近红外光的吸收值增大，肿瘤组织部位温度升高。通过近红外光照射肿瘤部位，可达到杀死肿瘤的目的。肿瘤细胞死亡的因素包括___________(多选)。 ①营养和氧气供应障碍    ②高温导致细胞热损伤和坏死 ③肿瘤细胞快速表达Noxa蛋白    ④Noxa蛋白诱导肿瘤细胞凋亡 9．（25-26高三上·山东烟台·期末）为了快速简便检测口蹄疫病毒（FMDV），科研人员采用重叠延伸PCR技术将抗FMDV纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞（cRBC）纳米抗体NbRBC48的基因片段连接，制备双特异纳米抗体Nb205-48，相关过程、所用引物及质粒等如图1所示。 (1)图1中由杂交链获得融合基因的②过程，________（填“需要”或“不需要”）添加引物，其原因是________。引物P2中linker的碱基序列是5'-________-3'。 (2)对Nb205-linker-NbRBC48融合基因扩增时需要的引物是________。若利用PCR技术扩增1个融合基因时，共消耗了126个引物分子，则该过程扩增了________次。利用图1中质、粒构建基因表达载体时，为使融合基因正确插入质粒，需用限制酶________对该质粒进行酶切。 (3)将基因表达载体导入大肠杆菌时，大肠杆菌需用________处理。目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞维持稳定和表达的过程称为________。 (4)科研人员将抗FMDV纳米抗体Nb205、抗cRBC纳米抗体NbRBC48及获得的双特异纳米抗体Nb205-48进行亲和免疫反应性能检测，结果如图2。检测结果显示________，说明双特异纳米抗体Nb205-48构建成功。 10．（2026·河南信阳·模拟预测）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员利用重叠延伸PCR（重叠链相互搭桥、互为模板而延伸，最终将不同来源的DNA片段拼接起来）将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。利用重叠延伸PCR获取融合基因的基本过程如图1所示，所用的Ti质粒如图2所示，请回答下列问题： 注：Nco Ⅰ、BamH Ⅰ、Sac Ⅰ、Sal Ⅰ为限制酶酶切位点。启动子1、2属于真核细胞表达系统，Sm+是链霉素抗性基因，Amp+是氨苄青霉素抗性基因，GUS基因编码的酶能将无色物质X-Gluc分解，使植物细胞呈蓝色。 (1)PCR反应体系中需加入______（答两点）、4种脱氧核苷酸、引物、Mg2+、缓冲液等。PCR反应中的每次循环一般分为变性、______、延伸三步。 (2)图1中的PCR1和PCR2不能置于一个PCR体系中同时进行，原因是______。为了重叠链顺利延伸，杂交的两条链分别为______（从字母“a”“b”“c”“d”中选）。获得融合基因后，用引物1和4继续进行PCR大量扩增该序列。 (3)根据图2中Ti质粒的结构及后续筛选的需要分析，在设计引物1和4时需分别加入限制酶______的识别序列。经过相应酶切处理后，将融合基因与该质粒在DNA连接酶作用下形成重组质粒。为了提高重组质粒导入农杆菌的效率，一般要用______处理农杆菌。 (4)用农杆菌侵染拟南芥后，为了将被侵染的拟南芥细胞进行脱菌处理以及筛选含有融合基因的拟南芥细胞，培养基上需要添加______。然后，通过______技术可培育出完整的转基因拟南芥植株。 (5)通过观测转基因拟南芥根尖细胞中______，了解PA的分布和含量。 试卷第14页，共15页 试卷第13页，共15页 学科网（北京）股份有限公司 $