2026届高三生物二轮复习专题七 基因工程

**基本信息** 以基因工程核心技术为主线，系统整合工具-操作-应用-蛋白质工程知识链，通过真题与模拟题结合，强化科学思维与探究实践能力。 **综合设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |复习要点|4考点|系统梳理限制酶特性、PCR步骤、载体条件等核心概念|从工具原理（限制酶/连接酶）→操作程序（构建载体→导入→检测）→技术应用（乳腺生物反应器）→蛋白质工程（从功能设计基因），形成完整技术链| |专题练习|21题（含2025广东真题）|PCR技术原理应用、基因表达载体构建策略、蛋白质工程改造思路|通过选择题强化基础判断（如限制酶作用位点），非选择题突出实验设计（如菌株构建、启动子选择），体现结构与功能观及科学探究能力|

专题七 基因工程 一、复习要点 考点1 重组DNA技术的基本工具 1．切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶，这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。它们能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，产生黏性末端或平末端两种形式的末端。 2．DNA连接酶分为两类，一类是E.coli DNA连接酶，另一类是T4DNA连接酶。后者既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。 3．质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 4．在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选。11 5．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。 6．载体必须具备的条件：①能在受体细胞中保存下来并能自我复制；②具有1个或多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。③具有标记基因。 7．DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 考点2 基因工程的基本操作程序 1．培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2．PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 3．PCR技术可以分为变性、复性和延伸三步。 4．PCR反应过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 5．基因表达载体要包括以下四个基本的结构：目的基因、启动子、终止子、标记基因。 6．构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 7．启动子位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。 8．标记基因的作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。（或供重组DNA的鉴定和选择）。 9．花粉管通道法有多种操作方式。例如，可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。除此之外，将目的基因导入植物细胞常用的方法还有农杆菌转化法。 10．转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 11．农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。 12．检查转基因抗虫棉是否培育成功，首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA；从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。 13．在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文库来获取目的基因。 14．将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。研究人员一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 考点3 基因工程的应用 1．科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。 2．用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。 3．目前，科学家正尝试利用基因工程技术对猪的器官进行改造，采用的方法是在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 考点4 蛋白质工程的原理和应用 1．蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 2．基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 3．蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 二、专题练习 1、（2025·广东-7）Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（ ） A. 1'-碱基 B. 2'-氢 C. 3'-羟基 D. 5'-磷酸基团 2、（2024·广东-4）关于技术进步与科学发现之间的促进关系，下列叙述正确的是（　　） A. 电子显微镜的发明促进细胞学说的提出 B. 差速离心法的应用促进对细胞器的认识 C. 光合作用的解析促进花期控制技术的成熟 D. RNA聚合酶的发现促进PCR技术的发明 3、（2022·广东-12）λ噬菌体的线性双链DNA两端各有一段单链序列。这种噬菌体在侵染大肠杆菌后其DNA会自连环化（如图），该线性分子两端能够相连的主要原因是（ ） A. 单链序列脱氧核苷酸数量相等 B. 分子骨架同为脱氧核糖与磷酸 C. 单链序列的碱基能够互补配对 D. 自连环化后两条单链方向相同 4．科学家通过对相关基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变成了半胱氨酸，于是在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，T4溶菌酶的耐热性得到了提高。下列说法错误的是（　　） A．若利用微生物生产T4溶菌酶，可采用显微注射技术将重组质粒导入受体细胞 B．该技术需要从预期的蛋白质功能出发，推测应有的氨基酸序列 C．该技术属于蛋白质工程，合成的蛋白质不是自然界中已存在的 D．改造后T4溶菌酶的氨基酸序列和空间结构都不同于天然溶菌酶 5．利用蛋白质工程对干扰素进行改造，可在一定条件下延长其保存时间。下列叙述错误的是（　　） A．天然蛋白质合成的过程按照中心法则进行，蛋白质工程与之相反 B．利用蛋白质工程对干扰素进行改造时，操作对象是干扰素 C．经改造后的干扰素基因能通过工程菌的繁殖实现遗传 D．对干扰素的改造遇到的最大难题是干扰素的高级结构十分复杂 6．枯草杆菌蛋白酶能催化蛋白质水解为氨基酸，在有机溶剂中也能催化多肽的合成。这些碱性蛋白酶具有重要的应用价值，被广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。将枯草杆菌蛋白酶分子的天冬氨酸（99）和谷氨酸（156）改成赖氨酸，可使其在一定条件下的活力提高。下列叙述正确的是（　　） A．枯草杆菌蛋白酶分子活性提高的原因是组成它的氨基酸种类和数量发生了改变 B．对枯草杆菌蛋白酶进行分子设计必须从预期蛋白酶的功能出发 C．经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状不可遗传 D．该成果体现了蛋白质工程在培育新物种方面具有独特的优势 7．常规胰岛素注射后易在皮下堆积，需经过较长时间才能进入血液，且进入血液后又易被分解，因此常规胰岛素对糖尿病的治疗效果往往会受限。新型速效胰岛素的生产过程如图所示，下列叙述错误的是（    ） A．该过程属于蛋白质工程，其核心是通过基因改造改变胰岛素的结构和功能 B．常规胰岛素的合成过程与速效胰岛素的生产过程不完全相同 C．该技术从预期蛋白质的功能出发，设计出相应基因的碱基序列 D．若利用酵母菌生产速效胰岛素，则其过程与图示过程完全相同 8．研究人员将脂肪酶外环上的天冬氨酸定点突变为碱性赖氨酸，成功将其最适 pH 从 7.0 提高到 9.0，从而提高了其在碱性环境下的稳定性，该过程中直接操作的对象是（    ） A．蛋白质 B．氨基酸 C．基因 D．mRNA 9．干扰素是一种具有抗病毒、免疫调节等重要功能的蛋白质。科研人员为了提高干扰素的稳定性和活性，利用蛋白质工程对其进行改造。下表是改造前后干扰素的相关参数对比，据此分析，下列有关叙述错误的是（　　） 对比项目 改造前 改造后 热稳定性（在50℃下活性保留时间） 2小时 8小时 与受体的结合亲和力 相对较弱 相对较强 氨基酸数量 166个 166个 第17位氨基酸 半胱氨酸 丝氨酸 A．蛋白质工程可通过改变氨基酸的种类来改造蛋白质 B．第17位氨基酸的替换可能降低了干扰素对高温的敏感性 C．改造前后氨基酸数量不变，说明蛋白质工程未改变相关基因结构 D．改造后干扰素与受体的结合亲和力增强，这可能提高其生物学效应 （二）非选择题 1、（2025·广东-21）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题： （1）研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及______检测，筛选获得重组菌株W1。 （2）将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有______（答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是________。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是________。 （3）研究者选用启动子PX、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为________。 （4）莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：______。 2、（2024·广东-21）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 回答下列问题： （1）研究者优化了培养基_______（答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。 （2）研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为________，理由是___________。 （3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为________________________（答两点）。 （4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____。 （5）有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路______。 3、（2023·广东-20）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。 回答下列问题： （1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。 （2）用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备_________。 （3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。 ①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性植株_________（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑_________。 。 4、（2022·广东-选考22）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 回答下列问题： （1）研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对________________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 （2）研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是________________，终止子的作用是________________。 （3）培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。 （4）这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 5、（2021·广东-选考22）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。 回答下列问题： （1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有___________。（答出两种即可） （2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有___________。（答出两种即可） （3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备___________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有___________。 （4）依图所示流程，在一定温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是___________。在分子水平上，可以通过改变___________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。 6．（2025·广东惠州·一模）科学家们正在开发一种混有枯草芽孢杆菌孢子的新型复合塑料，该孢子能耐受塑料生产工艺中的高温热熔条件。废弃复合塑料内的孢子在特定条件下能萌发产生大量枯草芽孢杆菌，从而有效分解塑料。回答下列问题： (1)在实验室中培养枯草芽孢杆菌时，可根据菌落的 将它与其他微生物初步区分开，再将接种有枯草芽孢杆菌的培养基置于 条件下培养来筛选所需的菌株。 (2)适应性实验室进化（ALE）是指通过模拟自然选择过程，在实验室中对微生物进行长期培养和筛选，使其逐渐适应特定环境条件。与其相比，利用基因工程直接改造微生物的优点是 。 (3)科学家对经过ALE处理的孢子进行了全基因组测序，发现fusA突变和abrB突变均能够显著提高孢子的耐热性。为了进一步探究这两种突变对提高孢子耐热性是否存在协同效应，请写出相关实验设计思路： 。 (4)科学家将表面蛋白基因cotB与绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，导入耐热孢子形成的菌株中表达出融合蛋白，从而使绿色荧光能锚定在细胞表面显示材料中孢子的萌发状态。下图中最适合的表达载体是 ，判断理由是 。 (5)未来若将该技术应用于生产实践中，还需考虑哪些具体问题： （回答1点即可）。 7．（2025·广东惠州·一模）科学家们正在开发一种混有枯草芽孢杆菌孢子的新型复合塑料，该孢子能耐受塑料生产工艺中的高温热熔条件。废弃复合塑料内的孢子在特定条件下能萌发产生大量枯草芽孢杆菌，从而有效分解塑料。回答下列问题： (1)在实验室中培养枯草芽孢杆菌时，可根据菌落的 将它与其他微生物初步区分开，再将接种有枯草芽孢杆菌的培养基置于 条件下培养来筛选所需的菌株。 (2)适应性实验室进化（ALE）是指通过模拟自然选择过程，在实验室中对微生物进行长期培养和筛选，使其逐渐适应特定环境条件。与其相比，利用基因工程直接改造微生物的优点是 。 (3)科学家对经过ALE处理的孢子进行了全基因组测序，发现fusA突变和abrB突变均能够显著提高孢子的耐热性。为了进一步探究这两种突变对提高孢子耐热性是否存在协同效应，请写出相关实验设计思路： 。 (4)科学家将表面蛋白基因cotB与绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，导入耐热孢子形成的菌株中表达出融合蛋白，从而使绿色荧光能锚定在细胞表面显示材料中孢子的萌发状态。下图中最适合的表达载体是 ，判断理由是 。 (5)未来若将该技术应用于生产实践中，还需考虑哪些具体问题： （回答1点即可）。 8．（2025·广东湛江·二模）研究人员利用基因工程的方法将油料作物紫苏的二酰甘油酰基转移酶（DGAT1）基因导入四尾栅藻（操作过程如图），获得转基因的高产油脂四尾栅藻。利用地热废水培养该藻，在生产生物柴油的同时，还能治理地热废水。请回答下列问题： 注：lacZ基因编码产物在X-gal和IPTG存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。 (1)为保证从紫苏细胞中获得的DGAT1基因与pMD19克隆质粒相连，可在设计PCR所用引物时，在引物的 端加上特定限制酶的识别序列。第一次转化的受体细胞是大肠杆菌，结合该细胞的特点说明这样做的目的是 。 (2)经转化的大肠杆菌可通过 （方法）接种到培养基上继续培养。为筛选目标菌株，培养基应加入的成分有 。在该培养基中，目标菌株的菌落呈 色。 (3)启动子往往具有物种特异性，在载体pBI121质粒中插入紫苏DCAT1基因，其上游启动子应选择 （填“紫苏DGAT1基因”、“大肠杆菌”或“四尾栅藻”）的启动子。 (4)为检测转基因四尾栅藻对地热废水的治理能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表。该实验不能说明转DGAT1基因显著提高了四尾栅藻的去污能力。请进一步完善实验设计： 。 表培养转基因四尾栅蕴的地热废水培养基各项指标测定结果 各项指标 总氮//（mg·L-1） 总磷//（mg·L-1） 氟化物/（mg·L-1） 初始 23.2 4.32 4.56 培养转基因四尾栅藻11天后 1.9 0.45 0.84 9．（2025·广东·模拟预测）高粱是重要的粮食和经济作物。为加速其遗传改良进程，科研人员进行了一系列研究。 (1)目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内 的过程称为转化。已有研究发现，过表达植物发育调节因子（WUS、BBM、GRF、GIF等）可有效提高转化效率。 (2)科研人员欲利用上述四种调节因子加速高粱的遗传改良，构建了如图所示的三种基因表达载体，其中LB和RB分别是T-DNA的左右边界，DsRed和NPTH作为 用于筛选转化成功的受体细胞。GIF是GRF的辅助因子，从蛋白质结构和功能角度推测GRF-GIF以融合基因的形式插入的意义是 。 (3)将三种载体分别导入高粱胚中，统计结果如表。 组别 载体 胚 愈伤组织 存活率（%） 带芽的愈伤组织 转化效率（%） 1 对照载体 121 56 46.28 8 6.61 2 WUS+BBM 98 55 56.12 21 21.43 3 GRF-GIF 96 46 47.92 25 26.04 ①转化效率的计算公式为 。 ②结果显示WUS+BBM的存活率高而转化效率低，GRF-GIF则相反。对此合理的解释是 。 ③观察3月龄植物生长状况，发现WUS+BBM会造成叶片扭曲、生育能力降低等生长缺陷，而GRF-GIF与对照组相比没有明显差异，说明 。 10．（2025·广东广州·二模）不同的启动子活性不同，可引起基因表达强度的差异。MCS是一段含多种限制酶切割位点的DNA序列，广泛用于插入不同外源启动子，但MCS自身序列也可能会启动下游基因的表达，对外源启动子活性检测造成干扰。为了构建能灵敏检测外源启动子活性的质粒，科研人员利用无启动子的lacZ基因和质粒p构建出质粒p-lacZ(如图甲)，并以此进行进一步研究。回答下列问题。 (1)为构建更为灵敏的外源启动子活性检测质粒，最好选择限制酶 切割质粒p-lacZ,然后将MCS与p-lacZ连接构建成质粒p01。在此基础上对MCS列进行不同改造分别得到质粒p02、p03、p04、p05、p06。 (2)将质粒p01~p06分别与lacZ基因缺失菌株混合后接种至含 的液体培养基中培养并筛选出成功转入质粒的菌株，然后分别于28℃和37℃条件下培养后进行β-半乳糖苷酶活性测定，结果（如图乙）表明，应选择质粒 并在 的温度下用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏，理由是 。 (3)β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色。请利用(2)筛选得到的质粒（记为pR)为工具，用固体培养基初步比较外源启动子A和B的活性，试写出简要的实验思路 。 11．（2025·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）~（4）题。 野生动物个体识别的新方法 识别野生动物个体有助于野外生态学的研究。近年，人们发现可以从动物粪便中提取该动物的DNA，PCR扩增特定的DNA片段，测定产物的长度或序列，据此可识别个体，在此基础上可以获得野生动物的多种生态学信息。 微卫星DNA是一种常用于个体识别的DNA片段，广泛分布于核基因组中。每个微卫星DNA是一段串联重复序列，每个重复单位长度为2~6bp（碱基对），重复数可以达到几十个（图1）．基因组中有很多个微卫星DNA，分布在不同位置。每个位置的微卫星DNA可视为一个“基因”，由于重复单位的数目不同，同一位置的微卫星“基因”可以有多个“等位基因”，能组成多种“基因型”．分析多个微卫星“基因”，可得到个体特异的“基因型”组合，由此区分开不同的个体。 依据微卫星“基因”两侧的旁邻序列（图1），设计并合成特异性引物，PCR扩增后，检测扩增片段长度，即可得知所测个体的“等位基因”（以片段长度命名），进而获得该个体的“基因型”。例如，图2是对某种哺乳动物个体A和B的一个微卫星“基因”进行扩增后电泳分析的结果示意图，个体A的“基因型”为177/183。 有一个远离大陆的孤岛，陆生哺乳动物几乎无法到达，人类活动将食肉动物貉带到该岛上。科学家在岛上采集貉的新鲜粪便，提取DNA，扩增并分析了10个微卫星“基因”，结果在30份样品中成功鉴定出个体（如表）。几个月后再次采集貉的新鲜粪便，进行同样的分析，在40份样品中成功鉴定出个体（如表）。据此，科学家估算出该岛上貉的种群数量。 两次采样所鉴定出的貉的个体编号 第一次采集的30份粪便样品所对应的个体编号 N01 N02 N03 N04 N05 N06 N07 N08 N08 N09 N10 N11 N12 N12 N13 N14 N14 N15 N16 N17 N18 N18 N19 N20 N21 N22 N22 N23 N24 N24 第二次采集的40份粪便样品所对应的个体编号 N03 N04 N05 N08 N09 N09 N12 N14 N18 N23 N24 N25 N26 N26 N26 N27 N28 N29 N30 N30 N31 N32 N32 N33 N33 N33 N34 N35 N36 N37 N38 N39 N40 N41 N42 N43 N44 N44 N45 N46 (1)图2中个体B的“基因型”为 。 (2)使用微卫星DNA鉴定个体时，能区分的个体数是由微卫星“基因”的数目和 的数目决定的。 (3)科学家根据表1信息，使用了 法的原理来估算这个岛上貉的种群数量，计算过程及结果为 。 (4)在上述研究基础上，利用现有DNA样品，设计一个实验方案，了解该岛貉种群的性别比例 。 12．（2025·湖南·高考真题）未成熟豌豆豆荚的绿色和黄色是一对相对性状，科研人员揭示了该相对性状的部分遗传机制。回答下列问题： (1)纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，只有一种表型。自交得到的中，绿色和黄色豆荚植株数量分别为297株和105株，则显性性状为 。 (2)进一步分析发现：相对于绿色豆荚植株，黄色豆荚植株中基因H（编码叶绿素合成酶）的上游缺失非编码序列G。为探究G和下游H的关系，研究人员拟将某绿色豆荚植株的基因H突变为h（突变位点如图a所示，h编码的蛋白无功能），然后将获得的Hh植株与黄色豆荚植株杂交，思路如图a： ①为筛选Hh植株，根据突变位点两侧序列设计一对引物提取待测植株的DNA进行PCR。若扩增产物电泳结果全为预测的1125bp，则基因H可能未发生突变，或发生了碱基对的 ；若H的扩增产物能被酶切为699bp和426bp的片段，而h的酶切位点丧失，则图b（扩增产物酶切后电泳结果）中的 （填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”）对应的是Hh植株。 ②若图a的中绿色豆荚：黄色豆荚=1：1，则中黄色豆荚植株的基因型为 [书写以图a中亲本黄色豆荚植株的基因型（△G+H）/（△G+H）为例，其中“△G”表示缺失G]。据此推测中黄色豆荚植株产生的遗传分子机制是 。 ③若图a的中两种基因型植株的数量无差异，但豆荚全为绿色，则说明 。 参考答案 1-9 CBCAB BDCC 1【答案】（1）琼脂糖凝胶电泳 （2） ①. 稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 ②. 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 ③. PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解 （3）先上升后保持稳定 （4）应用质粒①导入酶B，质粒②导入酶A 2【答案】（1）碳源、氮源、无机盐 （2） ①. PT7、PBAD 和PBAD ②. 启动子②和③选用 PBAD可以使工程菌无论有、无蓝光 照射都可表达无活性的T7RNAP，在蓝光照射后，无活性的 T7RNAP 转变为有活性的T7RNAP，与特异性启动子P7识别结合并转录基因1，即可用蓝光控制酪氨酸酶的表达 （3）杀死不含光控表达载体的杂菌，避免杂菌污染；筛选出含光控表达载体的工程菌 （4）蓝光诱导酪氨酸酶基因的表达，酪氨酸酶催化酪氨酸转化为黑色素，蓝光照射不到的部位酪氨酸酶不表达 （5）将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白) 3【答案】（1）野生型 （2） ①. 载体（基因表达载体） ②. 启动子和终止子 （3） ①. DAI基因和卡那霉素抗性基因 ②. 75 ③. 自交 ④. 100 ⑤. 4【答案】（1）引物 （2） ①. 作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞 ②. 终止转录，使转录在需要的地方停下来 （3）酶蛋白大量表达需要消耗大量能量，而厌氧代谢供能不足 （4） ①. 工业废气资源化 ②. 通过捕获二氧化 碳，实现固碳减排 5【答案】 ①. 基因文库中获取、人工合成法 ②. 盐析法、酶解法或高温变性 ③. 感受态 ④. 抗原-抗体杂交技术 ⑤. 有的酶失活而使反应中断 ⑥. 基因的碱基序列 6【答案】(1) 形态特征 适宜的温度 (2)定向改造微生物的遗传特性 (3)构建同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，与仅有fusA突变或仅具有abrB突变的菌株进行比较，观察耐热性表现 (4) 甲 乙中TAG对应终止密码，会导致翻译完cotB蛋白后不能继续翻译gfp蛋白 (5)确保孢子在不同环境条件下的稳定性和活性 7【答案】(1) 形态特征 适宜的温度 (2)定向改造微生物的遗传特性 (3)构建同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，与仅有fusA突变或仅具有abrB突变的菌株进行比较，观察耐热性表现 (4) 甲 乙中TAG对应终止密码，会导致翻译完cotB蛋白后不能继续翻译gfp蛋白 (5)确保孢子在不同环境条件下的稳定性和活性 8【答案】(1) 5′ 大肠杆菌繁殖速度快，利用克隆载体随着细菌分裂而大量复制，得到充足的目的基因（或是利用结构简单的大肠杆菌构建基因文库，实现目的基因的长期保存） (2) 稀释涂布平板法 氨苄青霉素、X-gal、IPTG 白色 (3)四尾栅藻 (4)应添加对照组：用相同废水培养基培养等量非转基因四尾栅藻（其余条件相同），11天后检测对照组总氮、总磷和氟化物的含量并与实验组进行比较 9【答案】(1)维持稳定和表达 (2) 标记基因 融合基因表达产物是GIF﹣GRF融合蛋白，GIF已与GRF结合，可更好发挥作用 (3) 带芽的愈伤组织÷胚×100% WUS+BBM促进脱分化，GRF﹣GIF促进愈伤组织再分化 GRF﹣GIF比WUS+BBM能更好地加速高粱的遗传改良 10【答案】(1)SacⅡ、BglⅡ (2) 氯霉素 P06 28℃ 28℃条件下，β-半乳糖苷酶活性最低，对外源性启动子活性检测干扰最小 (3)将PR空质粒、PR-A、PR-B分别导入LacZ基因缺失菌种中，并接种到含有X-gal平板上，在适宜条件下培养，检测不同组平板上菌落菌落蓝色深浅 11【答案】(1)174/174 (2)每个微卫星“基因”的“等位基因” (3) 标记重捕 根据标记重捕法的计算公式N=（M×n）/m，则该岛上豹的种群数量N=(24×32)/10≈77（只）。 (4)选取X和Y染色体上长度不同的DNA片段，设计貉的特异性引物，对现有DNA样 品进行扩增。产物中只有X片段为雌性，同时有X和Y片段的为雄性。计数46个个体中的雌雄数目，可得性别比例 12【答案】(1)绿色豆荚 (2) 替换 Ⅱ (G+h)/(△G+H) 该植株中基因H上游缺失非编码序列G，导致基因H不能正常表达，表现为黄色豆荚，另一条染色体上的h无功能 非编码序列G缺失不影响基因H表达 参考答案 详解 1、 选择题 【答案】C 【解析】 【分析】在DNA复制过程中，在DNA聚合酶的催化作用下，将一个个的脱氧核苷酸连接形成磷酸二酯键，使子链延伸，但是DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′。 【详解】已知DNA聚合酶催化延伸子链方向只能从5′→3′，原因是脱氧核苷酸的3'碳有羟基，可以结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，故为了DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的3'-羟基，使其不能结合下一个脱氧核苷酸的5′碳的磷酸基团，C正确。 故选C。 2【答案】B 【解析】 【分析】差速离心法可以通过不同离心速度将细胞内大小、密度不同的细胞器分离开来，使得科学家能够单独对各种细胞器进行研究和分析，从而极大地促进了对细胞器的结构、功能等方面的认识。像线粒体、叶绿体、内质网等细胞器的详细研究，都得益于差速离心法的应用。 【详解】A、电子显微镜的发明是在细胞学说提出之后，细胞学说的提出主要基于光学显微镜的观察和研究，A 错误； B、差速离心法可以通过不同的离心速度将细胞内大小、密度不同的细胞器分离开来，促进对细胞器的认识，B正确； C、 光合作用的解析主要是对植物的光合作用机制进行研究，而花期控制技术更多地涉及到植物激素、环境因素等方面的知识，光合作用的解析与花期控制技术的成熟关系不大，C 错误； D、 PCR 技术的发明并非直接由于 RNA 聚合酶的发现，PCR 技术的关键在于热稳定的 DNA 聚合酶的应用，D 错误。 故选B。 3【答案】C 【解析】 【分析】双链DNA的两条单链方向相反，脱氧核糖与磷酸交替连接构成DNA分子的基本骨架，两条单链之间的碱基互补配对。 【详解】AB、单链序列脱氧核苷酸数量相等、分子骨架同为脱氧核糖与磷酸交替连接，不能决定该线性DNA分子两端能够相连，AB错误； C、据图可知，单链序列的碱基能够互补配对，决定该线性DNA分子两端能够相连，C正确； D、DNA的两条链是反向的，因此自连环化后两条单链方向相反，D错误。 故选C。 4【答案】A 【详解】A、利用微生物生产T4溶菌酶，可以使用处理的方法将目的基因导入受体细胞，A错误； B、该技术需要从预期的蛋白质功能出发，推测应有的氨基酸序列，属于蛋白质工程，B正确； C、该技术属于蛋白质工程，合成的蛋白质不是自然界中已存在的，C正确； D、改造后T4溶菌酶的氨基酸序列与天然溶菌酶不同，由于新形成了二硫键，其空间结构也不同于天然蛋白质，D正确。 故选A。 5【答案】B 【详解】A、天然蛋白质的合成遵循中心法则（DNA→RNA→ 蛋白质）；蛋白质工程是从预期蛋白质功能出发，反向推导基因序列（蛋白质→氨基酸序列→基因），与中心法则方向相反，A正确； B、蛋白质工程的操作对象是基因（通过修饰或合成基因来改造蛋白质），而非蛋白质（干扰素）本身。若直接操作蛋白质，无法实现可遗传的改造，B错误； C、经改造的干扰素基因可导入工程菌，工程菌繁殖时会复制该基因，从而实现基因的遗传（进而持续表达改造后的干扰素），C正确； D、蛋白质的高级结构（空间结构）十分复杂，而蛋白质工程需精准设计蛋白质的空间结构以实现预期功能，这是改造过程中面临的最大难题之一，D正确。 故选B。 6【答案】B 【详解】A、根据题干信息“将枯草杆菌蛋白酶分子的天冬氨酸（99）和谷氨酸（156）改成赖氨酸，可使其在一定条件下的活力提高”可知，枯草杆菌蛋白酶分子的氨基酸数量没有发生变化，A错误； B、对蛋白质进行分子设计应从预期的蛋白质功能出发，从而对蛋白质的结构进行设计，因此对枯草杆菌蛋白酶进行分子设计必须从预期蛋白酶的功能出发，B正确； C、经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶的基因发生了改变，因此经蛋白质工程改造后的枯草杆菌蛋白酶活性提高这一性状可以遗传，C错误； D、该成果培育了新的枯草杆菌蛋白酶，而不是新物种，D错误。 故选B。 7【答案】D 【详解】A、该过程属于蛋白质工程，蛋白质工程的核心是通过基因改造来改变蛋白质的结构和功能，从而获得具有特定功能的蛋白质，A正确； B、常规胰岛素是通过天然的基因表达合成的，而速效胰岛素是通过蛋白质工程，对基因进行改造后表达得到的，二者合成过程不完全相同，B正确； C、蛋白质工程是从预期蛋白质的功能出发，设计出相应蛋白质的结构，进而推测出基因的碱基序列，C正确； D、酵母菌是真核生物，其细胞内有内质网、高尔基体等细胞器，可对合成的蛋白质进行加工；而大肠杆菌是原核生物，没有这些细胞器，其过程与图示过程不完全相同，D错误。 故选D。 8【答案】C 【详解】研究人员将脂肪酶外环上的天冬氨酸定点突变为碱性赖氨酸，成功将其最适 pH 从 7.0 提高到 9.0，从而提高了其在碱性环境下的稳定性，该过程是通过蛋白质工程实现的，在生物体内蛋白质的合成是受到基因控制的，因此为了获得符合人类要求的蛋白质，需要设计蛋白质的结构，进而推测相应的氨基酸序列，进而获得相关基因的碱基序列，实现对基因的改造，通过对基因的修饰和改造可实现对蛋白质的改造，因而蛋白质工程被称为第二代基因工程，即上述蛋白质的改造需要直接对基因进行操作，C正确。 故选C。 9【答案】C 【详解】A、蛋白质工程可以通过定点突变等方法改变蛋白质的氨基酸序列，从而改变其结构和功能，该过程中第17位氨基酸从Cys变为Ser，说明通过改变氨基酸种类来改造蛋白质，A正确； B、改造后干扰素的热稳定性显著提高（从2小时到8小时），说明第17位氨基酸的替换（Cys→Ser）可能减少了高温下蛋白质的不稳定性，B正确； C、氨基酸数量不变，但第17位发生替换，说明基因发生了定点突变（如碱基对的替换），因此基因结构被改变，C错误； D、与受体结合亲和力增强（从“相对较弱”到“相对较强”）可能使干扰素更容易与靶细胞受体结合，从而增强其抗病毒或免疫调节功能，提高生物学效应，D正确。 故选C。 （二）非选择题 1【答案】（1）琼脂糖凝胶电泳 （2） ①. 稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 ②. 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 ③. PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解 （3）先上升后保持稳定 （4）应用质粒①导入酶B，质粒②导入酶A 【解析】 【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。 3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【小问1详解】 在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，还有核酸分子杂交（或DNA - DNA分子杂交、DNA - RNA分子杂交、抗原-抗体杂交 ）。核酸分子杂交可以检测目的基因是否导入受体细胞以及是否转录，抗原-抗体杂交可以检测目的基因是否表达出相应的蛋白质。 【小问2详解】 检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法（通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量，进而得到细胞密度）、显微镜直接计数法（利用血细胞计数板在显微镜下直接对细胞进行计数）。接种前检测液体培养基的荧光强度，是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰，作为空白对照。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。 【小问3详解】 在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在培养初期，细胞处于快速生长阶段，随着细胞数量的增加，阻遏蛋白X的量相对不足，PX启动子可能会有一定程度的启动，从而合成mKate2，使荧光强度上升；随着培养的进行，阻遏蛋白X的量逐渐增多，对PX启动子的阻遏作用增强，转录受到抑制，荧光强度保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为先上升后保持稳定。 【小问4详解】 为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，需满足以下条件：条件1：为了保证细胞正常生长，必须保证酶A和酶B都正常。条件2：为了在稳定期有大量莽草酸，需要使酶A增加酶B减少。条件3：质粒①生长期无明显差异稳定期下降，质粒②生长期无明显差异稳定期不变。因此，应用质粒①导入酶B，质粒②导入酶A。 2【答案】（1）碳源、氮源、无机盐 （2） ①. PT7、PBAD 和PBAD ②. 启动子②和③选用 PBAD可以使工程菌无论有、无蓝光 照射都可表达无活性的T7RNAP，在蓝光照射后，无活性的 T7RNAP 转变为有活性的T7RNAP，与特异性启动子P7识别结合并转录基因1，即可用蓝光控制酪氨酸酶的表达 （3）杀死不含光控表达载体的杂菌，避免杂菌污染；筛选出含光控表达载体的工程菌 （4）蓝光诱导酪氨酸酶基因的表达，酪氨酸酶催化酪氨酸转化为黑色素，蓝光照射不到的部位酪氨酸酶不表达 （5）将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白) 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。 【小问1详解】 培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。 【小问2详解】 题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。 【小问3详解】 光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，可杀死不含光控表达载体的杂菌，避免杂菌污染；筛选出含光控表达载体的工程菌。 【小问4详解】 由小问2分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。蓝光照射不到的部位酪氨酸酶不表达。 【小问5详解】 由小问2分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。 3【答案】（1）野生型 （2） ①. 载体（基因表达载体） ②. 启动子和终止子 （3） ①. DAI基因和卡那霉素抗性基因 ②. 75 ③. 自交 ④. 100 ⑤. 【解析】 【分析】1、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换；基因突变发生的时间主要是细胞分裂的间期；基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【小问1详解】 根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。 【小问2详解】 利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。 【小问3详解】 ①根据题干信息和图形分析，将T0代植株花序浸没在农杆菌（T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因）液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。 ②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。 ③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图： 4【答案】（1）引物 （2） ①. 作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞 ②. 终止转录，使转录在需要的地方停下来 （3）酶蛋白大量表达需要消耗大量能量，而厌氧代谢供能不足 （4） ①. 工业废气资源化 ②. 通过捕获二氧化 碳，实现固碳减排 【解析】 【分析】（1）PCR技术的原理是DNA半保留复制，是在体外大量复制DNA的技术，该技术的关键是Taq酶可以从引物的3’端延伸子链。 （2）减缓温室效应，一方面要减少二氧化碳的排放，另一方面通过植树造林等手段增加大气中二氧化碳的消耗。 【小问1详解】 利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，Taq酶才能从引物的3’端延伸子链。 【小问2详解】 基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。 【小问3详解】 重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，需要消耗大量能量，而厌氧代谢供能不足，所以会导致生长迟缓。 【小问4详解】 根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了工业废气资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程通过捕获二氧化 碳，实现固碳减排，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 5【答案】 ①. 基因文库中获取、人工合成法 ②. 盐析法、酶解法或高温变性 ③. 感受态 ④. 抗原-抗体杂交技术 ⑤. 有的酶失活而使反应中断 ⑥. 基因的碱基序列 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。 （2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。 （3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其 易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因（目的基因）成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术进行检测。 （4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。 【点睛】本题考查基因工程、DNA的粗提取和鉴定的相关知识，意在考查考生把握知识间的联系、理论与实际相结合解决实际问题的能力，难度中等。 6【答案】(1) 形态特征 适宜的温度 (2)定向改造微生物的遗传特性 (3)构建同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，与仅有fusA突变或仅具有abrB突变的菌株进行比较，观察耐热性表现 (4) 甲 乙中TAG对应终止密码，会导致翻译完cotB蛋白后不能继续翻译gfp蛋白 (5)确保孢子在不同环境条件下的稳定性和活性 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）在实验室中培养枯草芽孢杆菌时，可根据菌落的形态特征将它与其他微生物初步区分开，再将接种有枯草芽孢杆菌的培养基置于适宜的温度下培养来筛选所需的菌株。 （2）适应性实验室进化（ALE）是指通过模拟自然选择过程，在实验室中对微生物进行长期培养和筛选，使其逐渐适应特定环境条件。与其相比，利用基因工程可定向改造微生物的遗传特性，比如需要微生物具有耐寒的性质，可以通过基因工程将耐寒的基因导入微生物。 （3）该实验的目的是fusA突变和abrB突变对提高孢子耐热性是否存在协同效应，因此要构建同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，可将实验分为三组，甲组fusA突变的菌株，乙组abrB突变的菌株，丙组同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，将三组菌株放到高温环境下培养一段（相同）时间，观察三组菌株的耐热性表现，若丙组菌株的耐热性大于甲和乙，则说明fusA突变和abrB突变对提高孢子耐热性存在协同效应，反之不行。 （4）根据题意分析，表面蛋白基因cotB与绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，需去除cotB基因中编码终止密码的序列，导入耐热孢子形成的菌株中才能表达出融合蛋白，乙中的TAG编码终止密码，会使翻译完cotB蛋白后不能继续翻译gfp蛋白。 （5）未来若将该技术应用于生产实践中，需要考虑孢子在不同环境条件下的稳定性和活性 7【答案】(1) 形态特征 适宜的温度 (2)定向改造微生物的遗传特性 (3)构建同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，与仅有fusA突变或仅具有abrB突变的菌株进行比较，观察耐热性表现 (4) 甲 乙中TAG对应终止密码，会导致翻译完cotB蛋白后不能继续翻译gfp蛋白 (5)确保孢子在不同环境条件下的稳定性和活性 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）在实验室中培养枯草芽孢杆菌时，可根据菌落的形态特征将它与其他微生物初步区分开，再将接种有枯草芽孢杆菌的培养基置于适宜的温度下培养来筛选所需的菌株。 （2）适应性实验室进化（ALE）是指通过模拟自然选择过程，在实验室中对微生物进行长期培养和筛选，使其逐渐适应特定环境条件。与其相比，利用基因工程可定向改造微生物的遗传特性，比如需要微生物具有耐寒的性质，可以通过基因工程将耐寒的基因导入微生物。 （3）该实验的目的是fusA突变和abrB突变对提高孢子耐热性是否存在协同效应，因此要构建同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，可将实验分为三组，甲组fusA突变的菌株，乙组abrB突变的菌株，丙组同时具有fusA突变和abrB突变的菌株，将三组菌株放到高温环境下培养一段（相同）时间，观察三组菌株的耐热性表现，若丙组菌株的耐热性大于甲和乙，则说明fusA突变和abrB突变对提高孢子耐热性存在协同效应，反之不行。 （4）根据题意分析，表面蛋白基因cotB与绿色荧光蛋白基因gfp构建成基因表达载体，需去除cotB基因中编码终止密码的序列，导入耐热孢子形成的菌株中才能表达出融合蛋白，乙中的TAG编码终止密码，会使翻译完cotB蛋白后不能继续翻译gfp蛋白。 （5）未来若将该技术应用于生产实践中，需要考虑孢子在不同环境条件下的稳定性和活性 8【答案】(1) 5′ 大肠杆菌繁殖速度快，利用克隆载体随着细菌分裂而大量复制，得到充足的目的基因（或是利用结构简单的大肠杆菌构建基因文库，实现目的基因的长期保存） (2) 稀释涂布平板法 氨苄青霉素、X-gal、IPTG 白色 (3)四尾栅藻 (4)应添加对照组：用相同废水培养基培养等量非转基因四尾栅藻（其余条件相同），11天后检测对照组总氮、总磷和氟化物的含量并与实验组进行比较 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）为保证从紫苏细胞中获得的DGAT1基因与pMD19克隆质粒相连，需保证目的基因与质粒有相同的末端，DNA复制时从引物的3'开始，所以可以在引物的5′端加上特定的限制酶识别序列，然后用限制酶切割目的基因和质粒。利用大肠杆菌的快速复制能力，可低成本、快速地扩增目的基因。同时，将目的基因与克隆载体连接导入到大肠杆菌，将菌种冻存可实现重组质粒的长期保存，以便长期保存目的基因，保证后续实验有充足的目的基因。 （2）转化后的大肠杆菌用稀释涂布平板法接种于培养基表面以便获得单菌落，为了筛选成功导入重组载体的大肠杆菌，应在培养基中添加氨苄青霉素、X-gal、IPTG。据图分析可知，目的基因转入的位置是在lacZ基因内，因此转入重组载体的大肠杆菌在选择培养基上的菌落呈白色。 （3）由于启动子具有物种特异性，载体pBI121质粒是要转入四尾栅藻中保证目的基因能成功表达，因此需选择在四尾栅藻细胞中的启动子。 （4）要想证明转DGAT1基因显著提高了四尾栅藻的去污能力，应增加非转基因四尾栅藻对废水的去污能力，将转基因四尾栅藻与非转基因组结果进行比较，应添加对照组：废水培养非转基因四尾栅藻11天后，检测总氮、总磷和氟化物的含量。 9【答案】(1)维持稳定和表达 (2) 标记基因 融合基因表达产物是GIF﹣GRF融合蛋白，GIF已与GRF结合，可更好发挥作用 (3) 带芽的愈伤组织÷胚×100% WUS+BBM促进脱分化，GRF﹣GIF促进愈伤组织再分化 GRF﹣GIF比WUS+BBM能更好地加速高粱的遗传改良 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化，转化不仅仅是目的基因的进入和稳定存在，还包括其在受体细胞内的表达。 （2）据题干信息“DsRed是红色荧光基因，NPTH是新霉素抗性基因”可知，DsRed和NPTⅡ作为标记基因，可用于筛选转化成功的受体细胞；已知GIF是GRF的辅助因子，GRF-GIF以融合基因形式插入可以确保融合基因表达产物是GIF﹣GRF融合蛋白，GIF已与GRF结合，可更好发挥作用。 （3）①分析题意，将三种载体分别导入高粱胚中，据表中数据可知，转化效率的计算公式为（带芽的愈伤组织数量 / 胚的数量）× 100%。 ②分析表格数据可知，WUS+BBM的存活率高而转化效率低，GRF-GIF则相反，说明外源基因的转化和表达可能会对原有基因的功能造成不同程度的影响：WUS+BBM促进脱分化，GRF﹣GIF促进愈伤组织再分化。 ③观察3月龄植物生长状况，发现WUS+BBM会造成叶片扭曲、生育能力降低等生长缺陷，而GRF-GIF与对照组相比没有明显差异，说明GRF-GIF嵌合蛋白在提高转化效率的同时，不会对植株的正常生长和发育产生明显的负面影响，而WUS+BBM的表达则可能导致植株生长异常，故GRF﹣GIF比WUS+BBM能更好地加速高粱的遗传改良。 10【答案】(1)SacⅡ、BglⅡ (2) 氯霉素 P06 28℃ 28℃条件下，β-半乳糖苷酶活性最低，对外源性启动子活性检测干扰最小 (3)将PR空质粒、PR-A、PR-B分别导入LacZ基因缺失菌种中，并接种到含有X-gal平板上，在适宜条件下培养，检测不同组平板上菌落菌落蓝色深浅 【分析】1.工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。 2.基因工程技术的基本步骤：1、提取目的基因；2、目的基因与运载体结合；3、将目的基因导入受体细胞；4、目的基因的检测和表达。 【详解】（1）切割质粒p-lacZ时，不能破坏复制原点和标记基因，所以不能选择限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ，依据基因转录方向，且MCS自身序列也可能会启动下游基因的表达，酶切位点应位于转录的上游，且应实行双酶切法，所以应选择限制酶SacⅡ、BglⅡ切割质粒p-lacZ，然后将MCS与p-lacZ连接构建成质粒p01。在此基础上对MCS列进行不同改造分别得到质粒p02、p03、p04、p05、p06。 （2）构建的重组质粒中含有氯霉素抗性基因，所以将质粒p01~p06分别与lacZ基因缺失菌株混合后接种至含氯霉素的液体培养基中培养并筛选出成功转入质粒的菌株，然后分别于28℃和37℃条件下培养后进行β-半乳糖苷酶活性测定。LacZ基因编码产物为β-半乳糖苷酶，若β-半乳糖苷酶活性较低，说明其对外源性启动子活性检测干扰较小，则用于插入外源启动子进行活性检测较为灵敏，反之较大，据图，质粒p06在28℃的温度条件下，β-半乳糖苷酶活性最低，对外源性启动子活性检测干扰最小，说明用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏。 （3）依据题干信息可知，实验的自变量为外源启动子的不同，实验应分为三组，分别将不含外源启动子的pR空质粒、pR-A、pR-B导入LacZ基因缺失菌种中，并接种到含有X-gal平板上，在适宜条件下培养，检测不同组平板上菌落菌落蓝色深浅，蓝色越深，说明其活性越强。 11【答案】(1)174/174 (2)每个微卫星“基因”的“等位基因” (3) 标记重捕 根据标记重捕法的计算公式N=（M×n）/m，则该岛上豹的种群数量N=(24×32)/10≈77（只）。 (4)选取X和Y染色体上长度不同的DNA片段，设计貉的特异性引物，对现有DNA样 品进行扩增。产物中只有X片段为雌性，同时有X和Y片段的为雄性。计数46个个体中的雌雄数目，可得性别比例 【分析】标记重捕法是一种用于估算动物种群数量的常用方法。其原理是在被调查种群的活动范围内，捕获一部分个体，做上标记后再放回原来的环境，经过一段时间后进行重捕，根据重捕到的动物中标记个体数占总个体数的比例，来估计种群密度。标记重捕法适用于活动能力强、活动范围大的动物，使用时需要满足一定条件，比如标记个体与未标记个体在重捕时被捕获的概率相等，在调查期间没有个体迁入、迁出、出生、死亡等。 【详解】（1）从图 2 中可知，个体 B 扩增后的电泳条带对应的片段只有长度为 174 ，根据 “以片段长度命名” 等位基因进而确定基因型的规则，个体 B 的 “基因型” 为 174/174。 （2）根据题干信息 “每个位置的微卫星 DNA 可视为一个‘基因’，由于重复单位的数目不同，同一位置的微卫星‘基因’可以有多个‘等位基因’，能组成多种‘基因型’，分析多个微卫星‘基因’，可得到个体特异的‘基因型’组合，由此区分开不同的个体” 可知，使用微卫星 DNA 鉴定个体时，能区分的个体数是由微卫星 “基因” 的数目和重复单位的数目决定的。 （3）科学家采用了标记重捕法的原理来估算种群数量。第一次采集 30 份粪便样品鉴定出 24 个不同个体（相当于标记数M=24），第二次采集 40 份粪便样品鉴定出 32 个不同个体（相当于重捕数n=32），其中两次都有的个体数为 10 个（相当于重捕中被标记的个体数m=10）。根据标记重捕法的计算公式N=（M×n）/m，则该岛上豹的种群数量N=(24×32)/10≈77（只）。 （4）选取X和Y染色体上长度不同的DNA片段，设计貉的特异性引物，对现有DNA样 品进行扩增。产物中只有X片段为雌性，同时有X和Y片段的为雄性。计数46个个体中的雌雄数目，可得性别比例。 12【答案】(1)绿色豆荚 (2) 替换 Ⅱ (G+h)/(△G+H) 该植株中基因H上游缺失非编码序列G，导致基因H不能正常表达，表现为黄色豆荚，另一条染色体上的h无功能 非编码序列G缺失不影响基因H表达 【分析】判断性状显隐性通常有两种方法。一是具有相对性状的纯合亲本杂交，子一代所表现出来的性状就是显性性状，比如本题中纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，F1只有一种表型，此表型对应的性状即为显性性状 。二是杂合子自交，后代出现性状分离，分离比中占比多的那个性状为显性性状，像本题F1自交得到F2，绿色和黄色豆荚植株数量比约为3:1 ，绿色植株数量多，所以绿色是显性性状。 【详解】（1）纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，F1只有一种表型，说明F1表现的性状为显性性状。F1自交得到F2，绿色和黄色豆荚植株数量比约为297:105≈3:1，符合孟德尔分离定律中杂合子自交后代显性性状与隐性性状的分离比，所以显性性状为绿色。 （2）①若扩增产物电泳结果全为预测的 1125bp ，基因 H 可能未发生突变，若发生突变且产物长度不变，则可能是发生了碱基对的替换。 H 的扩增产物能被酶切为 699bp 和 426bp 的片段，h的酶切位点丧失。 Hh植株会产生两种类型的扩增产物，一种是H经酶切后的699bp 和426bp 片段，一种是h未被酶切的1125bp 片段，所以图 b 中的 Ⅱ 对应的是 Hh 植株。 ② Hh 植株与黄色豆荚植株 (△G+H)/(△G+H) 杂交，若 F1 ​中绿色豆荚：黄色豆荚 =1:1 ，说明 Hh 植株产生了两种配子 G+H 和G+ h ，且黄色豆荚植株只能产生含 △G+H 的配子，所以 F1 中黄色豆荚植株的基因型为 (G+h)/(△G+H) 。中黄色豆荚植株产生的遗传分子机制是：该植株中基因H上游缺失非编码序列G，导致基因H不能正常表达，另一条染色体上的h无功能，表现为黄色豆荚。 ③ 若图a的F1中两种基因型植株的数量无差异，但豆荚全为绿色，说明虽然黄色亲本中基因H上游缺失G ，但H基因仍能正常表达（或表达量足够）合成叶绿素，使豆荚表现为绿色，即非编码序列G缺失不影响基因H表达。 1 学科网（北京）股份有限公司 $