2026届高三生物二轮复习讲义专题八　高阶思维应用10　PCR原理、技术与应用

该高中生物学高考复习讲义聚焦PCR原理、技术与应用核心考点，按“基础原理→技术拓展→实际应用”逻辑组织内容，涵盖变性复性延伸机制、荧光定量PCR技术及目的基因获取检测等，通过情境探究、考点梳理、真题训练环节，帮助学生构建知识体系突破难点。 讲义以情境驱动和问题链探究为特色，如结合实时荧光定量PCR情境分析探针复性温度及Ct值关系，培养科学思维与生命观念。融入高考真题及分层练习，从基础到综合提升复习效率，助力学生掌握解题方法，为教师把控复习节奏提供精准指导。

高阶思维应用10　PCR原理、技术与应用 【思维探究】 【情境】 实时荧光定量PCR 　　以探针法荧光定量PCR为例:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 开始时,探针完整地结合在DNA任意一条单链上,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,检测不到荧光信号;PCR扩增时,Taq酶将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每一个DNA分子扩增一次,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步(如图甲)。 【探究】 (1)实时荧光定量PCR过程中,Taqman探针的复性温度需比引物的高,原因是 ______________________________________________________________。  【解析】(1)引物的化学本质是DNA单链,通常情况下,Taqman探针的复性温度应比引物的高,这有利于保证复性时探针先于引物与模板DNA结合。 答案:(1)有利于保证复性时探针先于引物与模板DNA结合 (2)用实时荧光定量PCR__________(填“能”或“不能”)检测mRNA的量。  【解析】(2)将总RNA或mRNA逆转录为cDNA后,再以此cDNA为模板,用dNTP作为底物进行PCR,可以精确定量分析mRNA的量。 答案:(2)能 (3)根据荧光曲线,可判断达到某荧光强度所需的循环次数与起始模板DNA量呈________(“负相关”或“正相关”)。  【解析】(3)由荧光定量PCR技术原理,每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链部分互补的荧光探针,且“每扩增一个DNA,就有一个荧光分子生成”,起始模板DNA量越多,经过较少的循环次数就能达到某一荧光强度,起始模板DNA量越少,则需要较多的循环次数才能达到该荧光强度,所以达到某荧光强度所需的循环次数与起始模板DNA量呈负相关。 答案:(3)负相关 (4)Ct值:指每个PCR反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。Ct值与起始模板拷贝数(浓度)的对数呈线性关系。起始拷贝数越多,Ct值__________(填“越大”或“越小”)。  【解析】(4)起始拷贝数越多,就越容易被检测出,即Ct值越小。 答案:(4)越小 【思维源点】 一、PCR的应用 1.获取和扩增目的基因: PCR技术广泛应用于目的基因的扩增和分离,如果已知目的基因的全部序列或其两侧的序列,可以通过合成一对与模板DNA互补的引物,有效地扩增所需的DNA片段。 2.检测目的基因是否进入受体细胞: 在载体DNA分子中,外源DNA插入位点的两侧序列多为固定已知的,通过设计引物确定受体细胞中是否有目的基因。 3.检测样本中目的基因的含量: 荧光定量PCR技术可以快速检测得出样本中目的基因的含量。 4.修饰目的基因: 为了便于基因工程的后续操作,可以利用PCR对目的基因进行修饰,如添加限制酶识别序列、启动子等。 5.使目的基因定点突变: 可以利用重叠延伸PCR、大引物PCR等对基因进行定点突变,大引物PCR的思路是设计出诱变引物(含有改变的碱基),以诱变引物和引物1进行第一轮PCR扩增反应,得到的突变分子经纯化后作为大引物再与引物2进行第二轮PCR反应,最后扩增出含突变位点的终产物。 6.构建融合基因: 通过PCR技术也可以把两个不同基因连在一起。基因能够正确融合的关键是设计两种特殊的引物,这两种引物部分区域能发生碱基互补配对,如下图中P2和P3。PCR1和PCR2得到的产物就能在P2和P3区域互补配对,在延伸过程中两条子链的作用是既可作为模板,又可以起到相当于引物的作用,合成融合基因。 7.测定未知DNA序列: 利用反向PCR技术可以测定已知序列两侧的未知序列,具体方法如下图。 二、PCR常见问题及原因 1.无扩增产物: (1)PCR反应体系错误或操作不当:Mg2+浓度太低或没有,Taq酶量太少或失活,复性温度过高等。 (2)DNA模板问题:DNA模板放置时间过长或DNA模板杂质含量过高,会抑制PCR反应进行。 (3)引物问题:引物过长,GC含量过少,引物自身及引物之间存在互补序列,出现发夹结构。 2.非特异性扩增: (1)引物特异性差、引物过短等。 (2)复性温度偏低。 (3)模板被降解或被污染。 【迁移应用】 1.根据某基因上游和下游的碱基序列,设计合成了用于该基因PCR的两段引物(单链DNA)。引物与该基因变性DNA(单链DNA)结合为双链DNA的过程称为复性。下图是两引物的Tm(引物熔解温度,即50%的引物与其互补序列形成双链DNA分子时的温度)测定结果,以下分析错误的是(　　) A.PCR过程中,复性温度应高于引物的Tm值以提高PCR效率 B.两引物分别与DNA的两条互补单链结合,是子链延伸的起点 C.若两引物的脱氧核苷酸数相同,推测引物2的(G+C)含量较高 D.适当减少引物2的脱氧核苷酸数,可使其Tm值接近引物1 【解析】选A。PCR过程中,复性温度应低于引物的Tm值以提高PCR效率,A错误。PCR过程是:目的基因DNA受热变性后解链为单链,引物与单链互补结合,合成的子链在DNA聚合酶的作用下进行延伸,所以两引物分别与DNA的两条互补单链结合,是子链延伸的起点,B正确。DNA含有的氢键数越多,其热稳定性越高,而A和T碱基对间有两个氢键,C和G碱基对间有三个氢键,曲线图显示:引物2的Tm高于引物1,说明引物2的热稳定性较高,因此若两引物的脱氧核苷酸数相同,推测引物2的(G+C)含量较高,C正确。适当减少引物2的脱氧核苷酸数,会降低引物2的热稳定性,可使其Tm值接近引物1,D正确。 2.(2025·汕头模拟)根据PCR的原理,复性温度要根据引物确定,下列说法错误的是(　　) A.引物是一小段能与DNA母链的一段碱基互补配对的短单链核酸 B.引物偏长,则复性温度要相应地降低 C.引物设计的过短可能会导致非特异性扩增 D.在一定温度范围内,提高复性温度可以增强PCR的特异性 【解析】选B。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,A正确;引物偏长时,由于碱基配对增多,引物与模板DNA的结合更稳定,因此复性温度应提高,B错误;引物设计过短,特异性差,易与非目标序列结合,可能导致非特异性扩增,C正确;在一定温度范围内,提高复性温度可增强引物与目标序列结合的严格性,减少非特异性结合,从而提高PCR的特异性,D正确。 3.天然β-淀粉酶大多耐热性差,不利于工业化应用。某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成,研究发现,将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺,耐热性明显提升。科研人员借助PCR技术对该β-淀粉酶基因改造,并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌,最终获得耐高温的β-淀粉酶。图1表示对改造后的基因进行PCR扩增的过程,①~④表示引物。回答下列问题: (1)PCR扩增时先要将温度上升到90 ℃以上,使DNA变性,在该过程中,双链DNA发生的变化是________________________,复性时需要让温度下降到________,其目的是____________________________________________________。  【解析】(1)PCR反应的每个循环可以分为变性、复性和延伸三步。当温度上升到90 ℃以上时,氢键断裂,双链DNA解旋为单链。当温度下降到50 ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对原则与两条单链DNA结合,即为复性过程。即PCR的过程包括高温变性、低温复性、中温延伸。 答案:(1)双链DNA解聚为单链　50 ℃左右(55 ℃)　使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合(引物与单链相应互补序列结合) (2)为了使改造后的基因能够完整地扩增,需要选择图1中的引物是________。经过n次循环后,一共消耗的引物数量为________________个。  【解析】(2)为了使改造后的基因能够完整地扩增,则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内,则所用的引物是②③。PCR过程中子链的延伸均需要引物,即无论复制多少次,除了最初的模板DNA链中不含引物,其他的子链均带有引物,据此推测,PCR经过n次循环后,一共消耗的引物数量为2n+1-2个,2n+1为复制n次后产生的DNA分子中的单链数,2为最初的模板链。 答案:(2)②③　2n+1-2 (3)改造成功后的耐高温淀粉酶在工业上的实用意义是______________________________________(答出1点即可)。  【解析】(3)改造成功后的耐高温淀粉酶在工业上的实用意义主要体现在以下几个方面:在较高温度下催化淀粉水解,可以提高生产效率;高温条件下具有稳定性,降低生产成本;耐高温淀粉酶适用于更多的工业过程,扩展应用范围;在稳定的高温环境下,反应条件更容易控制,提高产品质量。 答案:(3)在较高温度下催化淀粉水解,可以提高生产效率;高温条件下具有稳定性,降低生产成本;耐高温淀粉酶适用于更多的工业过程,扩展应用范围;在稳定的高温环境下,反应条件更容易控制,提高产品质量 4.SOLiD测序技术在基因工程中被广泛运用,SOLiD系统采用双碱基编码探针,即探针的第1、2位碱基决定探针所带荧光标记的颜色,具体情况参照图1,测序时共需要进行5轮。第1轮测序时,待测DNA与测序引物n结合,然后加入各种荧光探针,用DNA连接酶处理,只有一个特定探针会被连接到引物n上,然后除去其他探针,记录荧光后切除所连荧光探针的一部分,之后重复上述操作。后续开始第2轮测序时,应用引物n-1(较引物n向DNA一端移位1个碱基),其他操作与第1轮相同。之后几轮依次使用引物n-2,引物n-3引物n-4,具体参照图2。在测序前,需对待测目的基因进行PCR扩增,引物分布情况见图4。 (1)图4中PCR技术扩增目的基因时,需要选择的引物是__________(填字母),至少经过________次循环才能得到目的基因。已知其中一种引物序列为:5'-ATG……AAT-3',则在第3次扩增时与该引物结合的DNA链是5'-________________-3'。  【解析】(1)PCR技术中,DNA聚合酶只能从5'端向3'端延伸DNA链,要扩增目的基因,引物应分别与目的基因两条模板链的3'端结合,所以需要选择的引物是b和c;PCR技术的原理是DNA双链复制,第1次循环得到的是2个比目的基因长的DNA片段;第2次循环得到的4个DNA片段中,有3个是比目的基因长的,只有1个是完整的目的基因,因此至少经过2次循环才能得到目的基因;已知引物序列为5'-ATG……AAT-3',根据碱基互补配对原则,在第3次扩增时与该引物结合的DNA链是5'-ATT……CAT-3'。 答案:(1)bc　2　ATT……CAT (2)进行PCR扩增时,若在模板DNA分子上两个引物结合区之间有一个与引物识别序列高度相似的序列,则用电泳技术来鉴定PCR的产物时,电泳结果除目的基因所在条带外,还出现一个与加样孔距离更________(填“远”或“近”)的条带。  【解析】(2)在模板DNA分子上两个引物结合区之间有一个与引物识别序列高度相似的序列时,会导致引物在该相似序列处也结合并进行DNA合成,得到比正常目的基因短的DNA片段。在电泳时,DNA分子的迁移速率与分子大小有关,分子越小,迁移速度越快,离加样孔越远。所以电泳结果除目的基因所在条带外,还出现一个与加样孔距离更远的条带。 答案:(2)远 (3)设计的探针应在________(填“3'”或“5'”)端分别添加红、黄、蓝、绿4种颜色的荧光蛋白。切割探针时,应在第________位核苷酸之间进行。  【解析】(3)DNA合成是从5'端到3'端,为了保证探针能正常与目标序列结合并进行后续检测,设计的探针应在5'端分别添加红、黄、蓝、绿4种颜色的荧光蛋白;切割探针时,应在第5和6位碱基之间进行切割并发出代表探针第1、2位碱基的荧光信号,每次测序的位置间隔3个碱基。 答案:(3)5'　5、6 (4)图3为5轮反应后得到的测序结果,结合图1分析,待测序列中△标记的7个碱基依次为5'-________________-3'。  【解析】(4)由图3可知,待测序列的测序结果依次为绿色、蓝色、绿色、黄色、绿色、红色,由图1碱基组合与荧光颜色对应表可知,荧光对应碱基分别为TG、GG、GT、TC、CA、AT,故待测序列中△标记的7个碱基依次为5'-TGGTCAT-3'。 答案:(4)TGGTCAT 5.研究人员从麻疯树油中筛选出能产生脂肪酶(LA)的两种菌株。菌株1产生的LA1酶可耐高温,菌株2产生的LA2酶具有高催化效率,且LA1基因和LA2基因具有93%的同源性。研究人员采用交错延伸PCR技术获得了重组LA基因,生产出了更高效的酶。 (1)交错延伸PCR技术具体流程如上图(图中仅显示其中一条链延伸情况)。该技术采用LA1、LA2均作为模板,起始所需引物相同,引物的作用是__________ ______________________________________________________________。  已知过程①起始引物片段均为25个核苷酸,Taq DNA聚合酶延伸速度为1 200个碱基/min,本实验的循环扩增条件为:变性30 s、复性15 s、延伸15 s,经过80轮交错循环后,可获得PCR混合产物。第二轮循环后所得重组型子链长度为________个核苷酸。  【解析】(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。TaqDNA聚合酶延伸速度为1 200个碱基/min,延伸15 s,即子链合成了300个碱基,第二轮循环后合成了600个碱基,起始引物片段为25个核苷酸,因此第二轮循环后所得重组型子链长度为300+300+25=625个核苷酸。 答案:(1)使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸　625 (2)获得的重组LA基因中,同时含有LA1和LA2基因序列的原因是__________________________________________________________。  【解析】(2)第一轮以LA1(LA2)为模板合成子链,该片段在第二轮复制时作为引物,结合到LA2(LA1)的模板上继续合成子链,经多轮交错循环扩增,可以使产物同时含有两种基因的序列。 答案:(2)第一轮以LA1为模板合成子链,该片段在第二轮复制时作为引物,结合到LA2(LA1)的模板上继续合成子链,经多轮交错循环扩增,可以使产物同时含有两种基因的序列 (3)过程②用到的PM质粒中A为启动子、B为氯霉素抗性基因cat、C为终止子、D为asd-突变基因、E为复制原点,箭头处指不同限制酶的识别位点。asd基因是编码细菌细胞壁的主要成分DAP合成途径的关键酶,asd基因缺失时,将导致菌株生长对DAP依赖。为使目的基因定向插入PM质粒,交错延伸PCR过程中引物的5'端需引入__________酶的识别序列。为便于目的基因的检测与鉴定,过程③中应采用asd基因__________的受体菌。从含有PM质粒、重组PM质粒的受体菌中将含有重组PM质粒的受体菌筛选出来的思路为____________________ ________________________________________________________。  【解析】(3)由于Sal和Pvit2有两个识别位点,若选用则会破坏标记基因或复制原点,因此要选用XhoⅠ和BamHⅠ进行切割,为使目的基因定向插入PM质粒,交错延伸的PCR过程引物的5'端需引入XhoⅠ和BamHⅠ的识别序列。PM质粒中带有asd基因,为了筛选含有PM质粒或重组PM质粒的受体菌,需要选用asd基因缺失的受体菌,在含DAP的培养基上能生长的应为导入了载体或重组载体的受体菌,即过程③中应采用asd基因缺失的受体菌。PM质粒有完整的氯霉素抗性基因cat,重组PM质粒没有完整的氯霉素抗性基因cat,可以将正常培养基上分离出的受体菌单菌落,平移影印到含氯霉素的培养基上,在含氯霉素的培养基上无法生长的菌落对应的原菌落即为含有重组PM质粒的受体菌。 答案:(3)XhoⅠ　缺失　将正常培养基上分离出的受体菌单菌落,平移影印到含氯霉素的培养基上,在含氯霉素的培养基上无法生长的菌落对应的原菌落即为含有重组PM质粒的受体菌 - 6 - 学科网（北京）股份有限公司 $