2026届高三生物二轮复习讲义专题八　第18讲　基因工程与应用 考向1 基因工程的基本工具与操作程序

该高中生物学高考复习讲义聚焦基因工程核心考点，涵盖标记基因分类与应用、限制酶选择原则及操作程序，按“基础原理-操作逻辑-真题应用”层次架构知识。通过考点梳理明确工具作用机制，方法指导解析限制酶选择策略，真题训练强化操作程序理解，助力学生系统突破难点。 资料突出科学思维与探究实践，如结合“蓝白斑”筛选和影印法实验，引导学生分析标记基因作用原理，通过双酶切避免反向连接的案例培养逻辑推理能力。设置分层练习（研考题+素养提升题），配合命题陷阱分析，帮助学生高效掌握解题关键，为教师把控复习节奏、提升学生应考能力提供实用指导。

第18讲　基因工程与应用 考向1 基因工程的基本工具与操作程序 【通考源·知识奠基】 一、基因工程标记基因的分类和应用 标记基因可分为选择基因和报告基因,二者都可以用来筛选标记目的基因是否成功转化。 1.选择基因: (1)直接选择:载体上的标记选择基因一般是一些抗生素抗性基因,在受体细胞的培养体系中加入该抗生素,就可以只保留转入载体的受体细胞,原理如图所示: (2)间接选择:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果插入某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。 常用方法——“影印法”筛选含有重组质粒的细胞 ①将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌,如图1、2、3、4、5菌落。 ②利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落,如图1、5菌落。 2.报告基因: (1)报告基因是指其编码产物能够被快速测定且不依赖于外界压力的一类基因。常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、荧光素酶基因(luc)、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)等。 (2)常用方法——“蓝白斑”筛选含重组质粒的细胞 大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和蓝色物质,在经人工插入外源基因后,大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断,无法形成完整的β-半乳糖苷酶,故不能对无色化合物X-gal进行切割,菌落呈白色。 二、限制酶选择原则 1.确保目的基因完整: (1)位点在目的基因两侧:所选限制酶的酶切位点应位于目的基因两侧,不能在目的基因内部,否则会将目的基因切断,导致实验失败。若目的基因两侧无合适位点,可在PCR引物5'端添加与载体匹配的限制酶识别序列。 (2)不破坏关键序列:目的基因中的启动子、终止子等关键序列也不能存在限制酶酶切位点,否则会影响目的基因的表达。 2.保证载体功能正常: (1)切点位置合适:载体上的酶切位点应位于启动子下游、终止子上游,确保目的基因插入后,其转录能正常进行,且不会影响载体上其他重要元件的功能。 (2)不破坏载体完整性:不能选择会使载体上出现多个切点的限制酶,以免破坏载体的结构,导致载体无法正常复制或失去功能。同时,要避免破坏载体上的复制原点、标记基因等关键因子,以保证载体在受体细胞中能正常复制和用于筛选。 (3)避免无效切割(一种酶的切割点内含另一种酶的切割点)。 3.优先采用双酶切: (1)避免自身环化:使用两种不同的限制酶分别切割目的基因和载体,可有效防止目的基因和载体自身发生黏性末端互补连接而形成环状结构,提高重组效率。 (2)确保连接方向正确:双酶切能产生不同的黏性末端,可使目的基因以正确的方向插入载体,避免反向连接,保证目的基因能按预期方向表达。 (3)考虑同尾酶应用:当不适合使用某种限制酶时,可选用能产生相同黏性末端的同尾酶,比如限制酶MboⅠ(5'↓GATC3')和BamHⅠ(5'G↓GATCC3')进行替代,以满足实验需求,增加限制酶选择的灵活性。 (4)若质粒经一种限制酶切出平末端,目的基因可不再用限制酶切割(目的基因一端本身是平末端) 【提醒】同尾酶的使用 使用同尾酶由于两端的序列不同,连接后的产物失去酶切位点。 4.农杆菌转化法特殊要求: 若采用农杆菌转化法,限制酶的切点应位于Ti质粒的T-DNA内,这样有利于目的基因随T-DNA转移并整合到受体细胞基因组中。 三、基因工程的基本操作程序 【提醒】农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 (1)两次拼接:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA的中间部位;第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。 (2)两次导入:第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌;第二次导入是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 【研考题·方法领悟】 1.(2025·湖南高考)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒,可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A,其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题: (1)制备特定抗原 ①获取基因A,构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和__________________等;为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,应选用图中的一对引物__________________对待测质粒进行PCR扩增,预期扩增产物的片段大小为______________ bp。  ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌,诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心,发现上清液中无蛋白A,可能的原因是 _________________________________________________(答出两点即可)。  【解析】(1)重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和终止子、复制原点等,终止子能终止转录过程。要确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,应选用引物P1和P3。因为P1与基因A下游的非编码区互补配对,P3与基因A上游且靠近启动子的区域互补配对,这样扩增的片段大小为200+582=782 bp。将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌,培养后上清液中无蛋白A,可能的原因有重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外,转速过高使蛋白A发生沉淀,蛋白A亲水性较差发生沉淀,蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解等。 答案: (1)终止子、复制原点　P1和P3　782　重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、转速过高使蛋白A发生沉淀、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解 (2)制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后,将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,诱导融合的常用方法有____________________________________(答出一种即可)。选择培养时,对杂交瘤细胞进行克隆化培养和______________,多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体,可用于非洲猪瘟的早期诊断。  【解析】(2)诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇(PEG)融合法、灭活的病毒诱导法、电融合法等。选择培养时,对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测,多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 答案:(2)聚乙二醇(PEG)融合法(或灭活的病毒诱导法、电融合法)　抗体检测 【思维建模】 2.(2025·黑吉辽内蒙古高考)香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从________________中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5'端分别引入__________和__________限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用__________连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变。  【解析】(1)可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列,设计特定引物。为保证基因N与质粒pYL正确连接,需要使用双酶切法,为了目的基因能正确表达,目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间,且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶;分析图1可知,质粒pYL应该选用SpeⅠ和XhoⅠ酶切,由于目的基因N含有SpeⅠ识别序列,故N基因不能使用SpeⅠ酶切,但XbaⅠ与其具有相同的黏性末端,基因N酶切时可以用XbaⅠ替换SpeⅠ,即N基因两端应该含有XbaⅠ和XhoⅠ识别序列;题干信息:N基因a链为转录模板链,且引物合成子链的方向是5'→3'端,所以N基因的启动子位于右侧,结合质粒pYL上的启动子和终止子方向,可知应该在引物2的5'端添加XbaⅠ、引物1的5'端添加XhoⅠ识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用DNA连接酶连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变。 答案: (1)基因数据库或序列数据库　XhoⅠ　XbaⅠ　DNA连接酶 (2)进一步筛选构建的质粒,以1~4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有__________的污染。初步判断实验组__________(从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是__________。  【解析】(2)构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变,而质粒pYL本身7.2 kb,可知目的基因N大小为2.3 kb;分析电泳图可知,初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应体系是否存在污染,即检验PCR反应中是否有试剂污染。 答案:(2)试剂(模板)　1　目的基因N大小为2.3 kb (3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有__________。  a:5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b:5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c:5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d:5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' 【解析】(3)a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),a引物序列为:5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3',其中GCA对应第240位诱变后的丙氨酸密码子,序列中的密码子顺序对应氨基酸位置:GCA(240位)、CCC(241位)、GAG(242位)、TTC(243位)、TGG(244位)、CTG(245位)、TTT(246位),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同,分析题图b、c、d序列可知,引物c中GCC(243位)、TGG(244位)、CTG(245位)、TTT(246位),所以c是诱变第243位苯丙氨酸的引物,故据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有GCC。 答案:(3)GCC (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的__________含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。  【解析】(4)题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇;由此可知,进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 答案:(4)香树脂醇 3.(2025·山东高考)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造,利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中,筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比,突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为__________。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切,再选择SmaⅠ和__________对Ti质粒进行完全酶切,将产生的黏性末端补平,补平时使用的酶是______________。  利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接,构建重组载体,转化大肠杆菌;经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶________________进行完全酶切并电泳检测,若电泳结果呈现一长一短2条带,较短的条带长度近似为__________ bp,则一定为正向重组质粒。  【解析】(1)DNA复制的起点是复制原点,因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaⅠ限制酶识别序列可知,酶切形成的是平末端,若质粒仅用SmaⅠ酶切,抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入,且无法区分,为了确定是否为正向重组质粒,因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶,抗除草剂基因需要插入启动子和终止子之间,黏性末端需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体来补平且DNA聚合酶延伸子链的方向是5'→3',所以pstⅠ酶切后形成的黏性末端不能够被DNA聚合酶延伸,因此不能选择BamHⅠ,因为该限制酶会破坏终止子,黏性末端需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体来补平。且DNA聚合酶延伸子链的方向是5'→3',所以pstⅠ酶切后形成的黏性末端不能够被DNA聚合酶延伸。因此可选择XbaⅠ和SmaⅠ进行酶切。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接,构建重组载体,转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaⅠ酶切位点和一个SpeⅠ酶切位点,可以选择用SmaⅠ和SpeⅠ进行酶切,转录的方向是从模板的3'→5',和质粒对应的方向相同,经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带,较短的条带长度近似为550 bp,若反向连接,较短的条带长度近似为200 bp。 答案:(1)复制原点　XbaⅠ　DNA聚合酶　SmaⅠ和SpeⅠ　550 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的,提取基因组DNA,经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中,限于后续PCR难以扩增大片段DNA,最好使用识别序列为__________(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶,且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段__________,才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后,进行了一系列操作,其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为______________________(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。  【解析】(2)由于后续PCR难以扩增大片段DNA,所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶,原因是识别序列越短,酶切位点越多,切割产生的片段可能越小,更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的,但此时需要扩增未知序列,因此可以将图乙的片段环化,这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否为同一基因,需要准确比对其上的碱基序列,因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。 答案:(2)4　环化　测序和序列比对 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株,如果检测到野生型基因,________(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。  【解析】(3)突变植株成功导入野生型基因,但野生型基因未必可以正常表达,因此不能确定该植株的表型为野生型。 答案:(3)不能 [识破命题陷阱] 难点 第(1)小题限制酶的选择 第(3)小题 命题 陷阱 命题人设置了两个陷阱,一个是终止子中含有BamHⅠ,如果粗心,可能导致错选,另一个是XbaⅠ和PstⅠ,容易让人答成XbaⅠ或PstⅠ 命题人设置了“通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株,并且检测到野生型基因”的干扰 答题 攻略 不能选择BamHⅠ,因为该限制酶会破坏终止子;选择XbaⅠ进行酶切可使重组质粒最小 联系基因的选择性表达理论,突变植株成功导入野生型基因,但不一定能成功表达 【练考向·素养提升】 1.用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图1所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体,并转化到受体菌中。利用影印法(用无菌绒布轻盖在已长好菌落的原培养基上,然后不转动任何角度,“复印”至新的培养基上)筛选菌株,过程如图2所示。下列叙述正确的是(　　) A.为防止目的基因与质粒的反向连接,可用HindⅢ和ScaⅠ酶切 B.将质粒用ScaⅠ酶切后,所得产物经琼脂糖凝胶电泳可出现3个条带 C.目的基因插入TetR中,筛选时A培养基含四环素,B培养基含氨苄青霉素 D.利用影印法筛选时,能在B培养基中生长的是转化成功的菌落 【解析】选B。若用HindⅢ和ScaⅠ酶切质粒,由于质粒中有两个ScaⅠ酶的切割位点,因而不一定能防止目的基因与质粒的反向连接,A错误;由于图示质粒中有两个ScaⅠ酶的酶切位点,所以用ScaⅠ酶切质粒,能得到3种DNA片段,即完整的片段和两个短片段,所得产物经凝胶电泳可形成3个条带,B正确;目的基因插入TetR中,则含有重组质粒的细菌对四环素不具有抗性,对氨苄青霉素有抗性,所以A培养基含有氨苄青霉素,B培养基含有四环素,C错误;转化成功的菌落对氨苄青霉素有抗性,对四环素没有抗性,所以能够在A培养基中生长,不能在B培养基生长的菌落是转化成功的菌落,D错误。 【加固训练】 农杆菌感知到植物分泌的酚类化合物后,会开启其侵染过程,胞内蛋白V2识别并切割T-DNA的边界序列,切割后的T-DNA的一条链与V2形成复合物经通道复合体进入植物细胞。植物细胞被农杆菌侵染后会合成磷酸化的蛋白(VIP1-P)激活抗病相关基因的表达。同时,农杆菌的VF蛋白通过通道复合体进入植物细胞使VIP1-P去磷酸化且去除T-DNA上的V2为T-DNA的整合作准备。下列说法正确的是(　　) A.V2识别切割T-DNA并与其形成复合物的过程主要由线粒体供能 B.VF降低了植物的抗菌能力并促进了T-DNA与染色体DNA的整合 C.T-DNA与VF借助细胞膜上的蛋白质通过胞吞进入细胞 D.农杆菌侵染进入植物细胞的过程未涉及氢键、磷酸二酯键的断裂与形成 【解析】选B。农杆菌是原核生物,无线粒体,V2识别切割T-DNA并与其形成复合物的过程不是由线粒体供能,A错误;植物细胞被农杆菌侵染后合成的VIP1-P能激活抗病相关基因表达,而VF蛋白使VIP1-P去磷酸化,降低了植物的抗菌能力;同时VF蛋白去除T-DNA上的V2为T-DNA的整合作准备,促进了T-DNA与染色体DNA的整合,B正确;由题干可知,T-DNA的一条链与V2形成复合物以及VF蛋白是经通道复合体进入植物细胞,不是通过胞吞,C错误;胞内蛋白V2识别并切割T-DNA的边界序列,涉及磷酸二酯键的断裂,D错误。 2.研究人员将目的基因插入质粒,构建重组质粒的过程如图所示,再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由β-半乳糖苷酶基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈蓝色,否则菌落为白色。下列叙述正确的是(　　) A.将目的基因插入质粒中时,需要用到的酶有XhoⅠ、NheⅠ和DNA聚合酶 B.大肠杆菌被导入重组质粒前需用Ca2+处理大肠杆菌,使其细胞壁软化 C.将按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后,大肠杆菌不能表达该目的基因 D.在含有X-gal和四环素的培养基上形成的蓝色菌落就是含重组质粒的大肠杆菌 【解析】选C。分析题图可知,将目的基因插入质粒中时,需要用限制酶XhoⅠ、NheⅠ切割质粒和含有目的基因的DNA片段,以产生相同的黏性末端,再用DNA连接酶将目的基因与质粒连接起来,而DNA聚合酶用于DNA复制过程,不是基因工程中构建重组质粒所需的酶,A错误;用Ca2+处理大肠杆菌,是使其处于感受态,从而能够吸收周围环境中的DNA分子,而不是使其细胞壁软化,B错误;从题图中可以看出,目的基因插入的方向与启动子的方向相反,启动子无法启动目的基因的转录,所以大肠杆菌不能表达该目的基因,C正确;分析题图可知,目的基因未插入β-半乳糖苷酶基因中,没有破坏β-半乳糖苷酶基因,其可以正常表达,并能分解X-gal产生蓝色物质,可见含重组质粒的大肠杆菌形成的菌落也是蓝色菌落,但含空质粒的大肠杆菌也是蓝色的,可见在含有X-gal和四环素的培养基上形成的蓝色菌落就不一定是含重组质粒的大肠杆菌,D错误。 3.(2025·肇庆模拟)为了获得抗蚜虫转基因棉花植株,研究人员分别从雪花莲和尾穗苋两种植物中提取了凝集素基因GNA和ACA,经PCR扩增(如图甲所示),连接成GNA-ACA融合基因,再与质粒(pBI121)构建成重组载体(如图乙所示),最后经一系列操作将融合基因导入棉花细胞。回答下列问题: 注:KpnⅠ、BsaBⅠ、XhoⅠ表示限制酶。 (1)甲图中B过程调节至50 ℃,目的是________________________________,该过程需要两种引物,加入两种引物的原因是________________________________。  PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定,在凝胶中DNA分子的迁移速率与________________________________等有关(答出两点)。  【解析】(1)复性的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。加入两种引物的原因是DNA的两条链反向平行,DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA链,用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。PCR产物迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 答案:(1)使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合　DNA的两条链反向平行,DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA链,用两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增　凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象 (2)分析图乙可知,先使用限制酶______________和______________酶处理获得GNA-ACA融合基因;再将GNA-ACA融合基因导入质粒时最好选用限制酶_________________________,其目的是______________________________。  【解析】(2)通过限制酶BsaBⅠ使两种基因形成相同的黏性末端,再通过DNA连接酶将两者连接起来。GNA-ACA融合基因和质粒上都含有限制酶KpnⅠ和XhoⅠ识别序列,因此将GNA-ACA融合基因导入质粒时应选用限制酶KpnⅠ和XhoⅠ,用不同的限制酶切割目的基因和质粒的目的是避免目的基因和质粒的自连,确保融合基因正确插入质粒中。 答案:(2)BsaBⅠ　DNA连接　KpnⅠ和XhoⅠ　确保融合基因正确插入质粒中 (3)利用含重组载体的农杆菌感染棉花细胞的方法称为________________,该方法利用了T-DNA的作用是____________________________________________。  【解析】(3)利用含重组载体的农杆菌感染棉花细胞的方法称为农杆菌转化法,T-DNA的特点是可转移至受体细胞,并且可整合到受体细胞染色体DNA上。 答案:(3)农杆菌转化法　可转移至受体细胞,并且可整合到受体细胞染色体DNA上 (4)图中卡那霉素抗性基因的作用是____________________________。导入目的基因的棉花细胞经________________可获得抗蚜虫转基因棉花植株,该过程需要添加生长素和细胞分裂素,这两种激素是启动__________________________的关键激素。  【解析】(4)卡那霉素抗性基因作为标记基因,便于重组质粒的筛选,含有重组质粒的细胞能够在含卡那霉素的培养基上生存;导入目的基因的棉花细胞经植物组织培养可获得抗蚜虫转基因棉花植株,生长素和细胞分裂素在植物组织培养过程中可以启动细胞分裂、脱分化和再分化。 答案:(4)作为标记基因,便于重组质粒(重组DNA分子)的筛选　植物组织培养　细胞分裂、脱分化和再分化 【加固训练】 乙烯受体是乙烯感受和转导信号的初始元件,广泛存在于各种植物中,并决定植物各种组织对乙烯反应的敏感性。通过对多种植物研究表明,钝化植物对外源乙烯的敏感性比抑制内源乙烯的生物合成更为有效地延长植物的采后寿命。科学家从草莓中提取乙烯受体Ers1基因,通过基因工程将Ers1基因反向连接在启动子后,筛选转入反义Ers1基因的草莓,达到延长储藏期的效果。DNA酶的活性需要金属离子作为辅基,EDTA能够螯合溶液中的Mg2+、Ca2+等金属离子。回答下列问题: (1)草莓DNA的提取:取草莓植株叶片,置于预冷的研钵中,加入液氮研磨至粉碎后,加入400 μL SDSDNA提取液继续研磨,提取液中含有________________可防止DNA被水解。待充分研磨后收集至离心管中,离心后取①于另一干净离心管中,加入200 μL异丙醇,离心10 min之后弃去管中的②,加入80 μL体积分数为70%的乙醇,离心5 min之后取③保存。过程中的①②③分别是_________________(填“上清液”或“沉淀”)。  【解析】(1)取草莓植株叶片,置于预冷的研钵中,加入液氮研磨至粉碎后,加入400 μL SDSDNA提取液继续研磨,提取液中含有EDTA用以螯合二价金属离子,防止DNA被内切核酸酶水解。待充分研磨后收集至离心管中离心,沉淀物中含细胞结构等其他杂质,上清液中含有DNA,故离心后取①上清液于另一干净离心管中,加入200 μL异丙醇,离心10 min之后沉淀中含有DNA,故弃去管中的②上清液,加入80 μL体积分数为70%的乙醇,DNA不溶于乙醇,部分蛋白质杂质可溶于乙醇,故离心5 min之后取③沉淀保存。即过程中的①②③分别是上清液、上清液、沉淀。 答案:(1)EDTA　上清液、上清液、沉淀 (2)通过上述方法获得DNA后,需要通过PCR技术进行扩增Ers1基因(如图1)。为使目的基因与质粒连接,在设计PCR引物扩增Ers1基因时需添加限制酶 XhoⅠ的识别序列(5'-CTCGAG-3')。已知Ers1基因左端①处的碱基序列为-TTCCAATTTTAA-,则其中一种引物设计的序列是5'______________________3'。在PCR体系中,加入的dNTP可提供________________。PCR产物通过电泳进行分离后,可割下________________回收扩增的Ers1基因。  【解析】(2)图中有磷酸基团连接处为5'端,-OH连接处为3'端,由题意得,Ers1基因左端①处的碱基序列为5'-TTCCAATTTTAA-3',故可设计引物5'-TTCCAATTTTAA-3',在设计PCR引物扩增Ers1基因时需添加限制酶XhoⅠ识别序列5'-CTCGAG-3',故其中一种引物设计的序列是5'-CTCGAGTTCCAATTTTAA-3'。在PCR体系中,dNTP(脱氧核苷三磷酸)在反应过程中可以提供原料(合成DNA的脱氧核苷酸)和能量(dNTP水解会释放能量)。PCR产物通过电泳进行分离后,可切下相应的目的条带并回收,以获得纯化的Ers1基因片段。 答案:(2)-CTCGAGTTCCAATTTTAA-　原料和能量　目的条带 (3)经XhoⅠ酶切后的载体和Ers1基因进行连接(如图),连接产物经筛选得到的载体主要有三种:单个载体自连、Ers1基因与载体正向连接、Ers1基因与载体反向连接。为鉴定这3种连接方式,选择HpaⅠ和BamHⅠ对筛选的载体进行双酶切,并对酶切后的DNA片段进行电泳分析,请在图2中画出电泳结果,需标明电泳片段DNA大致长度。 【解析】(3)经XhoⅠ酶切后的载体和Ers1基因进行连接(如图),连接产物经筛选得到的载体主要有三种:单个载体自连、Ers1基因与载体正向连接、Ers1基因与载体反向连接。若连接产物为单个载体自连,载体上没有BamHⅠ酶识别位点,则使用HpaⅠ酶和BamHⅠ酶切割后,产生6 000 bp的产物;Ers1基因与载体正向连接,重组载体上存在1个BamHⅠ酶和1个HpaⅠ酶识别位点,BamHⅠ酶和HpaⅠ酶识别位点之间的距离为200+(700-100)=800,故使用双酶切后的产物为800 bp和6 000+700-800=5 900 bp;若Ers1基因与载体反向连接,则BamHⅠ酶和HpaⅠ酶识别位点之间的距离为200+100=300 bp,双酶切后的产物为300 bp和 6 000+700-300=6 400 bp,故电泳结果如图: 答案:(3) (4)用__________处理农杆菌,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,将筛选得到的反向连接质粒与处理后的农杆菌混合,使重组质粒进入农杆菌,完成__________实验。将农杆菌涂布接种于添加有卡那霉素的LB固体培养基上,目的是________________________________。  【解析】(4)用Ca2+处理农杆菌,目的是使农杆菌处于感受态,即成为一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,便于重组质粒进入农杆菌,完成转化实验。质粒上含有卡那霉素抗性基因,将农杆菌涂布接种于添加有卡那霉素的LB固体培养基上,只有含有重组质粒(重组质粒中含有卡那霉素抗性基因)的农杆菌才能在该培养基上生长,所以目的是筛选出含有反向连接质粒的农杆菌。 答案:(4)Ca2+　转化　筛选出含有反向连接质粒的农杆菌 (5)用阳性农杆菌感染植物细胞,目的基因就会随________________整合到植物染色体DNA中,最后通过________________技术培育出完整的转基因植株。为获得转基因植株,农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、________________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料,得到的转基因植株乙烯受体的合成受阻,其原因是__________________________________。  【解析】(5)用阳性农杆菌感染植物细胞,目的基因就会随Ti质粒的T-DNA片段整合到植物染色体DNA中,最后通过植物组织培养技术培育出完整的转基因植株。为获得转基因植株,农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、全能性表达充分(或再生能力强)及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。由题意可知,通过基因工程将Ers1基因反向连接在启动子后,筛选转入反义Ers1基因的草莓,达到延长储藏期的效果,说明得到的转基因植株乙烯受体的合成受阻,其原因是反义Ers1基因的转录产物与Ers1基因的转录产物碱基互补配对,使得翻译过程受阻。 答案:(5)T-DNA　植物组织培养　再生能力强　Ers1基因的转录产物与反义Ers1基因转录的产物碱基互补配对,使得翻译过程受阻 - 18 - 学科网（北京）股份有限公司 $