一轮复习第52讲　基因工程的基本工具和基本操作程序①【思维精讲】 课件2026届高三一轮复习（全国通用）

第52课时　基因工程的基本工具和 基本操作程序① 专题9 生物技术与工程 第5部分 生物技术与工程 高考考情： 考 情 解 码 考点要求 真题展示 考点一：重组DNA技术的基本工具 2024·江西卷，12；2024·山东卷，5；2025·四川卷，19；2024·重庆卷，19；2024·湖南卷，21；2024·甘肃卷，24；2024·安徽卷，20；2024·河北卷，22；2024·全国甲卷，38；2024·山东卷，25；2023·湖北卷，4；2023·广东卷，20 考点二 ：基因工程的基本操作程序 考点定标 近年高考中该考点以非选择题为主，部分地区卷会搭配选择题。题目不仅考查知识记忆，更侧重科学思维和科学探究能力。命题聚焦基因工程核心技术的原理和操作细节，且常与 PCR、电泳、基因编辑等技术结合。例如考查 PCR 技术中变性、复性、延伸的温度参数及产物分析，电泳图谱的解读，基因表达载体中启动子、终止子的功能等。 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。　 2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。 　 考点一 重组DNA技术的基本工具 考点二 基因工程的基本操作程序 真题回顾 课标要求及考点预览： 思维预览： 一、重组DNA技术的基本工具 1．基因工程的概念 是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 操作对象： 操作水平： 原理： 结果： 意义： 基因（DNA） DNA 分子水平 基因重组 创造出人类需要的新的生物类型和生物产品 定向改造生物遗传特性；克服远缘杂交不亲和障碍 水母的绿色荧光蛋白基因 S z L w h 一、重组DNA技术的基本工具 2.基因工程的理论基础 若人的胰岛素基因能通过拼接并在受体细胞大肠杆菌中表达出相同的蛋白质。 【思考】1.大肠杆菌和人的遗传物质是： 。 2.不同生物的DNA分子可以拼接在一起，原因是： ①DNA分子的基本组成单位都是 ; ②DNA分子的空间结构都是规则的 ; ③DNA分子的 方式相同; 3.一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达，原因是： ① 是控制生物性状的基本单位; ②遗传信息的传递都遵循 ; ③生物界共用一套 ; DNA 四种脱氧核苷酸 双螺旋结构 碱基互补配对 基因 中心法则 遗传密码 A=T C≡G 注：基因的长度一般在100个碱基对以上。 S z L w h 思考：限制酶不切割自身DNA的原因是？ 一、重组DNA技术的基本工具 3．重组DNA技术的基本工具 ——限制性内切核酸酶（简称“限制酶”） 能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的____________断开。 （1）来源： （2）种类： 主要来自原核生物 数千种 （3）作用特点： 专一性 磷酸二酯键 作用：可以通过切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。 原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 特点？ S z L w h 中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的，称为回文序列。 在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。 特点1：都可以找到一条中心轴线； 一、重组DNA技术的基本工具 特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的，称为回文序列。 总结：能被限制酶所识别的序列一般都有回文序列 在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。 大多数限制酶识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 S z L w h SmaⅠ限制酶 SmaⅠ限制酶 一、重组DNA技术的基本工具 ①EcoRⅠ识别序列为_____________,切割部位为_______________________.产生的是 末端。 ②SmaⅠ识别序列为____________, 切割部位为_______________________.，产生的是 末端。 黏性 平 （4）切割结果： 将一个基因从DNA分子上切割下来需要切____个磷酸二酯键，同时产生____个黏性末端或平末端，消耗_____分子水。 4 4 4 GAATTC GA之间的磷酸二酯键 EcoRⅠ限制酶 EcoRⅠ限制酶 CCCGGG CG之间的磷酸二酯键 S z L w h DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。 、 。 A.1种 B.2种 C.3种 D.4种 D 图中的黏性末端哪些能连接在一起？ ① ② ③ ④ ①② 思考1.下列所示的黏性末端是由几种限制性内切核酸酶作用产生的（　 　） ③④ 思考2.DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端，再经过DNA连接酶处理后（即①②连接到一起后），形成的新的识别序列，能否再被所用的限制酶识别？ T T A A G C T T A A C G ①②连接形成的新序列： C G T T A A 若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得，形成的新的识别序列，不能再被所用的限制酶识别。 A ATT G C A ATT C G 一、重组DNA技术的基本工具 S z L w h 一、重组DNA技术的基本工具 ——DNA连接酶 （1）作用： 将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_______________。 3．重组DNA技术的基本工具 磷酸二酯键 注意： DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA! DNA连接酶作用没有特异性。 （2）类型： E. coli DNA连接酶 (来源：_________)； T4 DNA连接酶（来源：__________） 大肠杆菌 T4噬菌体 作用特点：都可缝合黏性末端和平末端，但是E.coli DNA连接酶连接平末端效率相对较低 S z L w h 一、重组DNA技术的基本工具 拓展：几种相关酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 磷酸二酯键 碱基对之间 的氢键 将DNA切成两个片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将双链DNA分子局部解旋为单链 S z L w h 一、重组DNA技术的基本工具 ——载体 3．重组DNA技术的基本工具 （1）作用： （2）种类： 质粒、噬菌体和动植物病毒等。 种类 用途 质粒、噬菌体 植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 将目的基因转入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 S z L w h 一、重组DNA技术的基本工具 常见的标记基因： ①抗性基因 ②荧光基因 ③营养物质合成基因 ①能在受体细胞中进行 ，或整合 到受体DNA上，随受体DNA , ②具有一个至多个 ， ③具有特殊的 ， ④对受体细胞无 作用， 限制酶切割位点 自我复制 标记基因 同步复制 毒害 （3）作为载体所具备的条件及原因： 原因：使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制， 以扩增外源基因的数量。 便于外源DNA片段(基因)插入其中。 便于重组DNA分子的筛选。 避免受体细胞受到损伤。 S z L w h 一、重组DNA技术的基本工具 4．限制酶的选择 ①应选择切割位点位于目的基因两 端的限制酶，如图甲可选择_______。 ②不能选择切割位点位于目的基因 和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择_________。 PstⅠ SmaⅠ 若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”（即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选）。 S z L w h 一、重组DNA技术的基本工具 ③“双酶切法”：目的是为避免 目的基因和质粒的自身环化 及反向连接，使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用_________________两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。 ④巧用“同尾酶”： 同尾酶指____________________________________________。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。 4．限制酶的选择 PstⅠ和EcoRⅠ 来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶 S z L w h 一、重组DNA技术的基本工具 1. 某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置（插入点有a、b、c）示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ 　 　 ） 插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况 ① 能生长 能生长 ② 能生长 不能生长 ③ 不能生长 能生长 A. ①是a和b；②是a；③是b B．①是c；②是b；③是a C．①是a和b；②是b；③是a D．①是c；②是a；③是b B S z L w h 一、重组DNA技术的基本工具 2.（2023·新课标卷，6）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（　　） A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 C S z L w h 酶3切割后得到的是平末端，E.coli DNA连接酶连接平末端的效率极低，×； 酶3-平末端，酶1-黏性末端，二者不能连接，×； 双酶切法-保证目的基因在质粒上的连接方向，合理且高效，√； 酶4会破坏质粒上的抗生素抗性基因-无法进行后续的筛选，×； 一、重组DNA技术的基本工具 2．（2025·辽宁本溪模拟）限制性内切核酸酶Hind Ⅲ和XhoⅠ的识别序列及切割位点分别为 下列相关叙述正确的是(　　) A．两种限制酶是在同一种生物中分离出来的 B．两种限制酶切割DNA形成的黏性末端相同 C．用Hind Ⅲ酶切割含目的基因的DNA片段和用XhoⅠ酶切割质粒后，目的基因和质粒能连接成重组质粒 D．实验中可通过控制反应时间、酶的浓度等控制酶切效果 D S z L w h D　限制酶命名规则为属名首字母＋种名前两个字母＋菌株或血清型＋同菌株的多种限制酶流水号（罗马数字），由此可知Hind Ⅲ和XhoⅠ是从不同的生物中分离得到的，A错误；两种限制酶识别和切割后形成的黏性末端分别是AGCT－、TCGA－，B错误；两种限制酶切割形成的黏性末端不同，无法连接成重组质粒，C错误 【实验】DNA的粗提取与鉴定 1.实验原理 （1）提取DNA的原理 （2）鉴定DNA的原理 ①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 ②DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同， 能溶于2mol/L NaCl溶液。0.14mol/LNaCl溶液溶解度最低 在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 实验组 空白对照组 变蓝 不变蓝 初步分离DNA和蛋白质 S z L w h 注：二苯胺有毒，需现配现用并用棕色瓶存放。 【实验】DNA的粗提取与鉴定 2.材料用具 （1）选什么样的材料实验更易成功？ （2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？ DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜和猪肝等。 猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核和线粒体，几乎不含DNA，不适合； 鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。 含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。 每100 mL血液中需要加入3 g 柠檬酸钠，防止血液凝固。 S z L w h 【实验】DNA的粗提取与鉴定 称取洋葱，切碎，放入研钵，倒入研磨液，充分研磨。 破碎细胞 目的：裂解细胞，释放DNA 过滤 在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取上清液；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取上清液。 问题1:过滤能否用滤纸代替纱布？ 不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。 问题2:此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？ 可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。 3.方法步骤 研磨液成分 作用 SDS EDTA Tris-HCl缓冲液 使蛋白质变性 抑制DNA酶 稳定DNA S z L w h 利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。 【实验】DNA的粗提取与鉴定 破碎细胞 过滤 DNA的析出 在上清液中加入体积相等的预冷的体积分数为______酒精溶液, 静置2~3min，出现的白色丝状物就是粗提取的DNA 。 问题3:此步骤的目的是？ 使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。 问题4：酒精预冷的作用？ ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 3.方法步骤 95% S z L w h 【实验】DNA的粗提取与鉴定 破碎细胞 过滤 DNA的析出 在上清液中加入体积相等的预冷的体积分数为______酒精溶液, 静置2~3min，出现的白色丝状物就是粗提取的DNA 。 3.方法步骤 95% 方法一： 用玻璃棒沿 搅拌，卷起丝状物， 并用 吸去上面的水分； 方法二： 将溶液倒入塑料离心管中，在 r/min的转速下离心5min，弃 ，将管底的 (粗提取的DNA)晾干。 一个方向 滤纸 10000 上清液 沉淀物 S z L w h 【实验】DNA的粗提取与鉴定 实验组 对照组 水浴加热 破碎细胞 过滤 DNA的析出 DNA的鉴定 将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min 二苯胺 2mol/L的NaCl 空白对照： 在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。 评价结果： （1）DNA纯度: 看提取物颜色 （2）DNA的量: 看与二苯胺反应颜色的深浅 3、实验步骤 S z L w h 【实验】DNA的粗提取与鉴定 为了提纯DNA，某同学提出以下实验方案，请分析原因： 操作2:上述得到的DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液的浓度为0.14mol/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。 操作1:得到的DNA粗提取物（丝状物或沉淀）加入2mol/L的NaCl溶液溶解，过滤，取滤液（DNA提取液）。 ①加2mol/L的NaCl溶液的目的： ②加蒸馏水的目的： 溶解DNA，除掉高盐溶液中不能溶解的杂质，提纯DNA液。 降低NaCl溶液浓度，从而降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出，除掉溶解在低盐溶液中的杂质。 通过反复溶解与析出DNA，就能够除去 的多种杂质。 与DNA溶解度不同 S z L w h 【实验】DNA的粗提取与鉴定 3.(2024·安徽卷)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是 （　　） A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 D S z L w h 研磨液的作用：保护DNA，破坏膜结构；更换为蒸馏水，效率会降低，√； DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，可初步分离DNA，√； DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液，可纯化，√； 二苯胺试剂可以用于鉴定DNA，不能检测出溶液中是否含有蛋白质杂质，×； 真题重现 1．（2024·湖南卷）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是 (　　) A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 B S z L w h B　限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和pH等，调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 真题重现 2．（2023·重庆卷）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　) A．其中一个引物序列为 5′-TGCGCAGT-3′ B．步骤①所用的酶是 Spe Ⅰ和Cfo Ⅰ C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶 B S z L w h B　由于引物只能引导子链从5′到3′，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5′-TGCGCAGT-3′，A正确；根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用Nhe Ⅰ切割形成的，右边的黏性末端是用Cfo Ⅰ切割形成的，B错误；用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了Nhe Ⅰ和Cfo Ⅰ进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确；图中形成的是黏性末端，E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接黏性末端，D正确。 真题重现 3.(2024·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是 （　　） A.整个提取过程中可以不使用离心机 B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 A S z L w h 结语：感谢观看！ 空谈者以空谈粉饰自我， 实干家凭实干缔造奇迹！ $