3.基因工程例题讲解 课件-2025-2026学年高二下学期人教版生物选择性必修3

3.基因工程例题讲解 11．不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物。PCR反应的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。 最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列相同 5’-ATTTAGCC-3’ 3’-TAAATCGG-5’ 3’-CGG-5’ 5’-ATT-3’ 5’-ATTTAGCC-3’ 3’-TAAATCGG-5’ 5’-ATT TTAGCC-3’ 3’-TAAATCGG-5’ 5’-ATTTTAGCC-3’ 5’-ATT TTAGCC-3’ 无限制性引物的 第一次扩增 无限制性引物的 第二次扩增 不对称PCR 小蓝112 利用PCR融合基因 在基因工程技术中常指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套启动子和终止子内部构成的嵌合基因。 利用PCR融合基因 5’-AATT................GGGC-3’ 3’-TTAA................CCCG-5’ 5’-GAAT................GTCT-3’ 3’-CTTA................CAGA-5’ 5’-AAT- CCG-5’ 5’-GAA- AGA-5’ CCG AAA-5’ 5’-AATT................GGGC-3’ 3’-TTAA................CCCG-5’ 5’-AAT................. GGGC-3’ 3’-TTAA............ CCG AAA-5’ 添加序列 第1次复制 第2次复制 5’-AATT................GGGC-3’ 3’-TTAA............ CCG AAA-5’ 3’-TTAA............ CCG AAA-5’ 5’-AAT................. GGC TTT-3’ 其他的子代DNA省略 利用PCR融合基因 5’-AATT................GGGC-3’ 3’-TTAA................CCCG-5’ 5’-GAAT................GTCT-3’ 3’-CTTA................CAGA-5’ 5’-AAT- 5’-GAA- AGA-5’ CCG AAA-5’ 5’-AATT................GGGC TTT-3’ 3’-TTAA................CCCG AAA-5’ 5’-TTT GAA- 添加序列 5’-TTT GAA......................GTCT-3’ 3’-AAACTT .......................AGA-5’ 引物① 引物② 引物③ 引物④ 需要引物①和② 需要引物③和④ 利用PCR融合基因 甲5’-AATT................GGGCTTT-3’ 乙3’-TTAA................CCCGAAA-5’ 丙5’-TTT GAA.................GTCT-3’ 丁3’-AAACTT ........ ........AGA-5’ 甲5’-AATT................GGGC TTT -3’ 丁3’- AAACTT ........ ........AGA-5’ 情况一： 情况二： 乙3’-TTAA................CCCG AAA-5’ 丙5’- TTTGAA.................GTCT-3’ DNA聚合酶无法 从5’开始延伸 利用PCR融合基因 情况一： 情况二： 3’-TTAA................CCCG AAA TTTGAA.................GTCT-3’ 5’-AATT................GGGC CTT .................AGA-5’ 该步骤，需要额外添加引物吗？ × 甲5’-AATT................GGGCTTT-3’ 乙3’-TTAA................CCCGAAA-5’ 丙5’-TTT GAA.................GTCT-3’ 丁3’-AAACTT ........ ........AGA-5’ 乙3’-TTAA................CCCG AAA-5’ 丙5’- TTTGAA.................GTCT-3’ DNA聚合酶无法 从5’开始延伸 利用PCR融合基因 若要得到大量的融合基因片段，需要哪几种引物？ 引物②和引物③ 3’-TTAA................CCCG AAA TTTGAA.................GTCT-3’ 5’-AATT................GGGC CTT .................AGA-5’ 6.为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒 (2)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，不需要使用的酶主要有 限制酶、DNA连接酶。 大蓝68 (3)为验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图2。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3 P4。 10.科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测， 其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (2)为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2(或F2和R1)　 小蓝116 正 反 F1 R1 R1 F1 若选F1和R1 10.科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测， 其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (2)为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2(或F2和R1)　 小蓝116 正 反 F2 R2 F2 R2 若选F2和R2 10.科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测， 其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (2)为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2(或F2和R1)　 小蓝116 正 反 F1 R2 F1 R2 若选F1和R2 就只能扩增出正向插入的序列 若选F2和R1 同理，也只能扩增出正向插入的序列 10.科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (2)已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的a链相应部分的序列相同。 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 转录方向是从左向右 小蓝116 ① ② ③ (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了J－V5融合蛋白，条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 J蛋白 V5蛋白 J蛋白 V5蛋白 J+V5 J J+V5 双脱氧测序法 H ddADP ddATP 大蓝67 双脱氧测序法 5.最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸 模板DNA 引物 Taq酶 dNTP ddATP 1 A G T a C 双脱氧测序法 5.最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸 模板DNA 引物 Taq酶 dNTP ddATP 1 A G T a C 5’-CATACATGACCG-3’ GGC-5’ 3’-GTATGTACTGGC-3’ 双脱氧测序法 5’-CATACATGACCG-3’ CT 3’-a 5’-CATCATGACCG-3’ CT GGC-5’ 假设以第一条链为模板， 设计引物 3’-aGTA A......A.......GGC-5’ 引物合成的子链 1 2 模板DNA 引物 Taq酶 dNTP ddCTP 2 模板DNA 引物 Taq酶 dNTP ddGTP 3 模板DNA 引物 Taq酶 dNTP ddTTP 4 模板DNA 引物 Taq酶 dNTP ddATP 3’-TAGTGCCCATC 引物序列 模板链 5’-ATCACGGGTAG-3’ 互补链 3’-TAGTGCCCATC-5’ 该方法，只用加一种引物，就可以测出所有序列 模板链 5’-ATCACGGGTAG-3’ 互补链 3’-TAGTGCCCATC-5’ 3’-TAGTGCCCATC 引物序列 模板链 互补链 3’-TAGTGTCCATC 引物序列 3’-TAGTGTCCATC-5’ 5’-ATCACAGGTAG-3’ 一般情况下，若是普通质粒，质粒会全部进到受体细胞 用双标记基因可以筛选表达载体是否进入受体细胞 （需要将目的基因插入其中一个标记基因，破坏其功能，用两个标记基因来检测目的基因是否进入受体细胞) 若是Ti质粒，一般只有T－DNA会进入受体细胞 不能破坏抗性基因，需要用T－DNA部分的标记基因检测目的基因是否进入受体细胞 $