3.2 基因工程的基本操作程序课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件聚焦基因工程基本操作程序，以转基因抗虫棉为实例导入，通过问题链引导学生理解目的基因筛选与获取、载体构建、导入受体细胞及检测鉴定等核心步骤，结合预习检测、关键点解读等学习支架，辅以DNA合成仪等视频资源，构建完整知识脉络。 其亮点在于以实例驱动教学，如Bt基因抗虫原理分析体现生命观念，PCR技术原理与引物设计问题培养科学思维，电泳实验操作及虚拟实验强化探究实践。学生能理论联系实际提升技能，教师可依托完整资源高效实施探究式教学。

朱作言 朱作言，1941年9月出生，湖南澧县人。1997年当选中国科学院院士，1998年当选发展中国家科学院院士。1965年毕业于北京大学生物系；1980年毕业于中国科学院研究生院细胞及发育生物学专业；2007年获颁英国阿伯丁大学荣誉科学博士学位；1988年至1991年在美国马里兰大学海洋生物技术中心任教授研究员、Faculty member；1991年至1994年任英国阿伯丁大学高级讲师、博士生导师；2007年至2014年任新加坡教育部科学研究理事会委员；2001年至2019年任科技部973计划专家顾问委员会农业组召集人；第九届全国人民代表大会代表，第十届全国政协委员和第十一届全国政协常委； 2008年至今任《中国科学》和《科学通报》总主编。  　　主要从事鱼类遗传发育生物学及生物技术研究。在童第周先生领导下，合作完成鲤鲫间的细胞核移植，首次实现脊椎动物的种间克隆。1985年在世界上首次成功进行农艺性状转基因研究，研制出世界首批转基因鱼，提出了转基因鱼形成的模型理论，开创鱼类基因工程研究新领域。领导培育出具有优良养殖性状、生态及食用安全的转基因鲤鱼家系。领导合作完成草鱼全基因组序列图谱绘制，为发掘鱼类重要经济性状相关基因，培育高产、抗病和高效饵料利用等养殖鱼类优良品种奠定了基础。 选择性必修三：生物技术与工程 第2节 基因工程的基本操作程序 第3章 选择性必修三：生物技术与工程 基因工程 学习目标 核心素养要求 1.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。 2.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。 3.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。 1. 生命观念：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。 2. 科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。 基因工程的基本操作程序 选择性必修三：生物技术与工程 内容聚焦 一 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的筛选与获取 二 三 目的基因的检测与鉴定 四 本节目录 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 五 4 你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 普通棉花 转基因抗虫棉 如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？ 【资料】苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。 目的基因 从社会中来 5 培育转基因抗虫棉的四个步骤 与载体拼接 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 （有抗虫特性） 导入 抗虫基因 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的 检测与鉴定 基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？ 过渡 从社会中来 （核心） 请同学们阅读教材P76-79的内容，思考讨论并回答下列问题： 1.基因的种类和结构？什么是目的基因？举例？ 2.筛选合适目的基因的方法有什么？ 3.总结出PCR的概念、原理、目的、优点、发明者。 4.结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？所需设备是什么？ 5.构建出PCR的大致过程；PCR扩增为什么需要引物？ 6.如何对PCR产物进行鉴定？PCR技术与DNA复制过程有哪些异同？ 预习检测 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。 根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。 一、目的基因 （1）概念: （2）作用: （3）实例: 与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 培育转基因抗虫棉用到的目的基因： Bt 抗虫蛋白基因 简称 Bt 基因 内容1 目的基因的筛选与获取 当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 ①Bt抗虫蛋白的抗虫原理？ ②抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响 内容1 目的基因的筛选与获取 一、目的基因 一 第一步：目的基因的筛选与获取 注意： 所有的基因都编码蛋白质或肽链。 基因的种类一般分为结构基因、转录基因和调控基因。 结构基因的功能： 具有转录和翻译功能，能控制生物性状（编码蛋白质或肽链）。 转录基因的功能： 只有转录功能，没有翻译功能。能转录形成tRNA和rRNA 调控基因的功能： 不能进行转录和翻译，只能调控其他基因的表达。 【关键点解读1】基因类型 不是 内容1 目的基因的筛选与获取 10 mRNA 基因的一条链 科学家分离得到某原核生物基因，并将其解离成两条单链现让其中一条链与由该基因转录而来的mRNA杂交配对，结果如图所示 (1)原核生物基因 基因的编码区 基因的 非编码区 基因的 非编码区 基因的一条链 成熟mRNA 基因的编码区 基因的 非编码区 基因的 非编码区 (2)真核生物基因 科学家分离得到某真核生物基因，并将其解离成两条单链 现让其中一条链与由该基因转录而来的mRNA杂交配对，结果如图所示 【关键点解读2】基因结构 内容1 目的基因的筛选与获取 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 不编码mRNA 不编码mRNA (编码mRNA) 启动子 终止子 启动子： 给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 RNA聚合酶 是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列 终止子： 内容1 目的基因的筛选与获取 【关键点解读2】基因结构 (1)原核生物基因 --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 mRNA 内容1 目的基因的筛选与获取 【关键点解读2】基因结构 (1)原核生物基因 启动子： 给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列 终止子： --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 mRNA 翻译 蛋白质 ？如果该基因为真核细胞基因有什么不同？ 内容1 目的基因的筛选与获取 【关键点解读2】基因结构 (1)原核生物基因 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 不编码mRNA 不编码mRNA (编码mRNA) 启动子 终止子 RNA聚合酶 外显子 内含子 外显子 内含子 外显子 内容1 目的基因的筛选与获取 【关键点解读2】基因结构 (2)真核生物基因 --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 初始mRNA 外显子 内含子 外显子 内含子 外显子 内容1 目的基因的筛选与获取 【关键点解读2】基因结构 (2)真核生物基因 --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 外显子 内含子 外显子 内含子 外显子 RNA加工 CA …… UAGGAUCCAGAUG 翻译 蛋白质 初始mRNA 成熟mRNA 内容1 目的基因的筛选与获取 【关键点解读2】基因结构 (2)真核生物基因 --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区（可转录） 启动子 终止子 外显子 内含子 外显子 内含子 外显子 1.外显子和内含子均会被 ，再经过切去 对应部位、连接 对应部位等RNA加工过程，形成可以直接用于翻译的mRNA 转录成RNA 内含子 外显子 2.外显子： 3.内含子： 编码蛋白质的序列称为外显子 外显子之间不能编码蛋白质的序列. 内容1 目的基因的筛选与获取 【关键点解读2】基因结构 (2)真核生物基因 内含子 外显子 启动子 终止子 不间隔的、连续的 非编码区 非编码区 编码区 启动子 终止子 (2)真核生物基因 (1)原核生物基因 非编码区 非编码区 编码区 RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录 转录 前体mRNA 成熟mRNA 剪切、拼接 间隔的、不连续的 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 终止转录 真核生物的基因： 起始密码子和终止密码子？ 不能编码蛋白质的序列 =非编码区+内含子 能编码蛋白质的序列 =外显子 RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA 启动子 终止子 是一段有特殊序列结构的DNA片段 位于基因上游 也是一段有特殊序列结构的DNA片段 位于基因下游 终止转录 本质： 位置： 作用： 本质： 位置： 作用： 能转录相应的mRNA， 能转录相应的mRNA， 外显子: 内含子: 进一步能编码蛋白质的DNA序列 但却不能编码蛋白质的DNA序列 内容1 目的基因的筛选与获取 【归纳】基因结构 编码区： 非编码区： 原核基因 真核基因 编码区 非编码区： 能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列 不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列 (如启动子、终止子等） 外显子： 内含子： 能转录相应的mRNA，不能编码蛋白质的DNA序列， 然后在翻译前就被剪切掉 能转录相应的mRNA，进一步能编码出蛋白质的DNA序列 不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列 (如启动子、终止子等） 内容1 目的基因的筛选与获取 【归纳】基因结构 【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较 不能编码蛋白质的序列 =非编码区 原核生物的基因： 不能编码蛋白质的序列 真核生物的基因： =非编码区+内含子 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是_____的 编码区是间隔的、_____的 相同点 都由能够编码蛋白质的________和具有调控作用的________区组成的 连续 不连续 编码区 非编码 内容1 目的基因的筛选与获取 【关键点解读2】基因结构 1.下列有关基因结构的叙述，正确的是（ ） A.真核细胞的基因中，编码区也含有不能编码蛋白质的碱基序列，叫外显子 B.原核细胞的基因中，编码区的外显子是连续的 C.无论是真核还是原核生物，能编码蛋白质合成的序列均位于编码区 D.终止密码子是转录终止的信号，阻碍RNA聚合酶的移动 C 真核生物的基因结构:包括编码区和非编码区 (编码区又分为内含子和外显子，内含子转录后被剪切掉) 原核生物的基因结构:包括编码区和非编码区 (编码区无内含子和外显子之分，是连续的) 终止密码子位于mRNA上，作用是终止翻译的过程，而RNA聚合酶则是用于转录的酶 习题检测 【讨论】那么，如何筛选目的基因呢？ 用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害 也对Bt基因的表达产物——Bt 抗虫蛋白有了较为深入的了解 苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关 不仅掌握了Bt 基因的序列信息 Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因 (1) 较为有效的方法之一： 从相关的 和 的基因中进行筛选 1、筛选合适的目的基因 已知结构 功能清晰 内容1 目的基因的筛选与获取 二、第一步：目的基因的筛选与获取 (2)认识基因结构和功能的技术方法 随着测序技术的发展，以及序列数据库(GenBank)、序列比对工具(如BLAST)、公共生物医学数据库、分析分子及基因组数据的软件工具NCBI等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 内容1 目的基因的筛选与获取 1、筛选合适的目的基因 DNA测序仪 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 美国国家生物信息中心 序列数据库 美国国家生物信息中心 序列数据库（如GenBank） 序列数据库是分子生物信息数据库中最基本的数据库，包括核酸和蛋白质两类，以核苷酸碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容，并附有注释信息。 内容1 目的基因的筛选与获取 1、筛选合适的目的基因 二、第一步：目的基因的筛选与获取 25 一 序列比对工具（如BLAST） BLAST全称Basic Local Alignment Search Tool，即“基于局部比对算法的搜索工具”，是生物信息学常用的工具软件，可将输入的核酸或蛋白质序列与数据库中的已知序列进行比对，获得序列相似度等信息，从而判断序列的来源或进化关系。 内容1 目的基因的筛选与获取 1、筛选合适的目的基因 26 DNA测序仪 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 美国国家生物信息中心 ①从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 内容1 目的基因的筛选与获取 1、筛选合适的目的基因 二、第一步：目的基因的筛选与获取 【小结】 明确了目的基因后，该怎么获得它呢？ 人工合成 从基因文库中获取 利用PCR获取和扩增目的基因 内容1 目的基因的筛选与获取 二、第一步：目的基因的筛选与获取 2.获取目的基因的方法 28 (1)人工合成目的基因 DNA合成仪 ①前提： ②方法： 基因比较 、 核苷酸序列 。 小 已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因。 【思考】若不明确基因碱基序列呢？ 内容1 目的基因的筛选与获取 2.获取目的基因的方法 蛋白质的 氨基酸序列 mRNA的 核苷酸序列 基因的 核苷酸序列 目的基因 推测 推测 化学合成 【视频1】DNA合成仪 内容1 目的基因的筛选与获取 (1)人工合成目的基因 内容1 目的基因的筛选与获取 【视频2】DNA合成仪 (1)人工合成目的基因 (2)从基因文库中直接获取 将含有某种生物不同基因的许多 片段，导入 的群体中 ，各个受体菌分别含有这种生物的 ，称为基因文库。 (主要指cDNA文库) 基因文库 基因组文库： 部分基因文库： DNA 储存 不同基因 受体菌 2.获取目的基因的方法 内容1 目的基因的筛选与获取 含有一种生物所有基因的文库 要从基因文库中直接获取，首先要建立基因文库 某种生物体内 的 DNA。 适当的不同限制酶切割 与质粒连接 ①基因组文库 全部 2.获取目的基因的方法 内容1 目的基因的筛选与获取 (2)从基因文库中直接获取 33 一 某种生物体内的全部DNA 适当的不同限制酶切割 与质粒连接 受体菌 导入受体菌 ①基因组文库 内容1 目的基因的筛选与获取 34 一 受体菌 每个受体菌都含有了一段不同的 。这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。 该受体菌群为基因组文库 某种生物体内的全部DNA 适当的不同限制酶切割 与质粒连接 DNA片段 ①基因组文库 内容1 目的基因的筛选与获取 35 ②cDNA文库 如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的 。 某种生物体内的全部DNA 某个时期 基因选择性表达 转录 转录 转录 转录 mRNA 翻译 翻译 翻译 翻译 蛋白质 反转录 cDNA文库 包含某种生物 基因 部分 内容1 目的基因的筛选与获取 36 --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 mRNA 翻译 蛋白质 某原核细胞基因 内容1 目的基因的筛选与获取 ②cDNA文库 --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 mRNA 翻译 蛋白质 某原核细胞基因 反转录 GT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC CA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… GT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… cDNA 复制 双链DNA 受体菌 无启动子、终止子等非编码区 内容1 目的基因的筛选与获取 ②cDNA文库 --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 某真核细胞基因 外显子 内含子 外显子 内含子 外显子 RNA加工 CA …… UAGGAUCCAGAUG 翻译 蛋白质 初始mRNA 成熟mRNA 内容1 目的基因的筛选与获取 ②cDNA文库 ②cDNA文库 --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 某真核细胞基因 外显子 内含子 外显子 内含子 外显子 RNA加工 CA …… UAGGAUCCAGAUG 翻译 蛋白质 初始mRNA 成熟mRNA 反转录 GT …… ATCCTAGGTCTAC GT …… ATCCTAGGTCTAC CA …… TAGGATCCAGATG 复制 受体菌 无启动子、终止子等非编码区及无内含子 内容1 目的基因的筛选与获取 部分基因文库和基因组文库的比较 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 基因中启动子(非编码区) 基因中内含子 基因多少 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 使用cDNA文库获得目的基因更加高效，除去了不能编码蛋白质的序列(如非编码区、内含子) 2.获取目的基因的方法 内容1 目的基因的筛选与获取 【讨论1】如果要将人胰岛素基因导入到大肠杆菌中表达，从哪种基因文库获取目的基因较好？为什么？ 从cDNA文库获取目的基因较好。基因组文库的基因含内含子，大肠杆菌缺乏真核基因转录后加工机制（剪切、连接RNA），而cDNA文库不含内含子。 内容1 目的基因的筛选与获取 【讨论2】从基因组文库中获得的胰岛素基因（含内含子），若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是： 胰岛素基因含内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列无法被切除，无法表达出胰岛素 使用cDNA文库获得目的基因更加高效，去除了不能编码蛋白质的序列（如非编码区、内含子） 1. 大肠杆菌缺乏真核基因转录后加工机制 内含子无法被剪切：人胰岛素基因是真核基因，含有内含子，而大肠杆菌是原核生物，其转录系统无法识别和剪切内含子。若直接导入含内含子的基因组DNA，转录后的mRNA会包含内含子序列，导致翻译出的蛋白质错误或无功能。 cDNA文库不含内含子：cDNA文库是通过逆转录mRNA获得的，已去除内含子，因此直接导入大肠杆菌后可直接转录和翻译，生成正确的人胰岛素。 2. cDNA文库更高效 避免冗余序列：基因组DNA包含大量非编码区（如内含子、调控序列），而cDNA仅包含编码区，基因长度更短，便于克隆和操作。 简化表达载体构建：使用cDNA可直接连接至表达载体，无需额外处理内含子，提高重组效率。 42 一 第一步：目的基因的筛选与获取 基因组文库 cDNA文库 某种生物体内的全部DNA 适当的不同限制酶切割 与质粒连接 受体菌 导入受体菌 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？ 这还是一件比较复杂的事情，简单地说就是根据目的基因的有关信息，例如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA 以及基因翻译产物蛋白质等特性来获取目的基因。 内容1 目的基因的筛选与获取 2.获取目的基因的方法 43 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 PCR由穆里斯等人（先入为主）于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等。 穆里斯 2.获取目的基因的方法 内容1 目的基因的筛选与获取 ➊PCR技术： PCR是_____________的缩写，是一项根据________________的原理，在_____提供参与DNA复制的_________与_________，对_____________________进行 的技术 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外 各种组分 反应条件 目的基因的核苷酸序列 大量复制 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 原理 操作环境 目的 全称 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 内容1 目的基因的筛选与获取 2.获取目的基因的方法 PCR扩增仪 【重温】DNA体内复制的过程及条件 合成子链 解旋 形成新DNA 参与的组分 在DNA复制中的作用 DNA母链 4种脱氧核苷酸 解旋酶 DNA聚合酶 引物 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 打开DNA双链 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 内容1 目的基因的筛选与获取 3′ 5′ A:子链的延伸方向是5 ′→3 ′ DNA聚合酶 3′ 5′ 模板链 子链 DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′端 B:子链合成需要引物: 引物为DNA聚合酶提供了游离的3 ′端，使DNA聚合酶从3 ′端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能) 内容1 目的基因的筛选与获取 【重温】DNA体内复制的过程及条件 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 ➋引物: 引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链 ·细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物 ·细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物 ➋用于PCR的引物长度 通常为 个核苷酸 ➊引物结合在模板链 的 端 内容1 目的基因的筛选与获取 3’ DNA母链1 5’ DNA母链2 5’ 3’ 思考讨论 1.PCR扩增需要引物，什么是引物？ 3’ 20~30 (3)利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么？ 目的基因的两条反向平行的链都作为模板，其碱基序列不同。 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA， 只能从3′端延伸DNA链 (2)PCR技术为什么需要引物？ (4)在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是什么？ 内容1 目的基因的筛选与获取 思考讨论 3’ 5’ DNA母链1 3’ 5’ DNA母链2 3’ 5’ 引物1 3’ 5’ 引物2 3’ DNA母链1 5’ DNA母链2 5’ 3’ GGCAGTCTGCCAGTCTAC GGCAGTCTGCCAGTCTAC 发卡结构 CTGCCAGTCTAC GACGG T 引物3 CAGGCT ATCCGA 引物1 引物2 引物1和引物2之间会发生碱基互补配对 不合理 第1组 不合理 引物1（或引物2）自身会发生碱基互补配对 判断：下列设计的引物合理吗？ 内容1 目的基因的筛选与获取 ①引物1和引物2之间不能发生碱基互补配对 ②引物1（或引物2）自身不能发生碱基互补配对 ➋引物: 50 试一试：请你为Bt 基因设计合适的引物 5′-T C C• • •C A A T T C • • • T A T G A A• • • C C A -3′ 3′-A G G• • •G T T A A G • • •A T A C T T• • • G G T -5′ Bt 基因 变性 5′-T C C• • •C A A T T C • • •T A T G A A • • • C C A -3′ 3′-A G G• • •G T T A A G • • •A T A C T T • • • G G T -5′ A T A -5′ 引物1 引物2 5′-T T C 内容1 目的基因的筛选与获取 ➋引物: 51 试一试：请你为Bt 基因设计合适的引物 5′-T C C• • •C A A T T C • • • T A T G A A• • • C C A -3′ 3′-A G G• • •G T T A A G • • •A T A C T T• • • G G T -5′ Bt 基因 变性 5′-T C C• • •C A A T T C • • •T A T G A A • • • C C A -3′ 3′-A G G• • •G T T A A G • • •A T A C T T • • • G G T -5′ 引物2 5′-C A A C T T -5′ 引物1 引物可以设计在目的基因内 也可以设计在目的基因的外 内容1 目的基因的筛选与获取 ➋引物: 试一试：若用PCR技术扩增图示目的基因，请选用合适的引物 选用引物甲、引物丙 引物乙 内容1 目的基因的筛选与获取 ➋引物: 耐高温的DNA聚合酶 （Taq酶） DNA模板 引物（2种） 稳定的缓冲溶液 （一般添加Mg2+） 四种脱氧核苷酸(dNTP) 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 dATP dGTP dCTP dTTP 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 ➌原料: dATP 腺嘌呤脱氧核苷酸 dADP 腺苷（A) 腺嘌呤 脱氧核糖 P P P ~ ~ OH H 在PCR过程中实际加入的为dNTP （即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成 。 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 提供能量 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 PCR还需要其它条件： 说明：PCR所用原料实为dNTP，dNTP和ATP类似可以通过基团转移为反应提供能量。 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物（通常为小的单链RNA） 无需解旋酶，用高温代替 DNA母链 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 引物（通常为小的单链DNA） PCR的条件 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 如缓冲液（一般添加Mg2+）和控温设备 【视频】 PCR过程可以在PCR（扩增）仪中自动完成 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 ➌过程： A:变性 不需要解旋酶 当温度超过 时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 90℃ 氢键 单链 1. 变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？ 因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 3′ 5′ 5′ 3′ 第1次循环 目的基因 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 变性 复性 延伸 58 B:复性 当温度下降到 左右时， 种引物通过 ,与两条单链DNA结合。 50℃ 两 碱基互补配对 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 5′ 目的基因 第1次循环 引物1 引物2 ➌过程： 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 变性 复性 延伸 3. 为什么温度要上升至72℃？ 2. Taq DNA聚合酶结合在引物的5′还是3′端？ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ C: 延伸 当温度上升到 左右时，溶液中的4种 在耐高温的 的作用下，根据 原则合成新的DNA链。 72℃ DNA聚合酶 脱氧核苷酸 碱基互补配对 72℃是Taq DNA聚合酶的最适温度 第1次循环 目的基因 引物1 引物2 3′端 ➌过程： 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 变性 复性 延伸 5′ 3′ 3′ 5′ 第1次循环 循环次数 第1次循环 DNA分子数 长链-中链DNA数 中链-短链DNA数 短链-短链DNA数 需要引物的总数 同时含引物1和2的DNA分子数 特点：一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板 2 2 0 0 目的基因 引物1 引物2 2 0 5′ 3′ 3′ 5′ ➌过程： 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 变性 复性 延伸 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 第2次循环 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 循环次数 第2次循环 DNA分子数 长链-中链DNA数 中链-短链DNA数 短链-短链DNA数 需要引物的总数 同时含引物1和2的DNA分子数 目的基因 引物1 引物2 4 2 2 0 6 2 ➌过程： 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 变性 复性 延伸 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 第3次循环 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 循环次数 第3次循环 DNA分子数 长链-中链DNA数 中链-短链DNA数 短链-短链DNA数 需要引物的总数 同时含引物1和2的DNA分子数 目的基因 引物1 引物2 ➌过程： 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 变性 复性 延伸 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 第3次循环 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 循环次数 第3次循环 DNA分子数 长链-中链DNA数 中链-短链DNA数 短链-短链DNA数 需要引物的总数 同时含引物1和2的DNA分子数 目的基因 引物1 引物2 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 5′ 3′ 3′ 5′ 8 2 4 2 14 6 从第 次循环才会获得完整的目的基因 ➌过程： 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 3 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 长链-中链DNA数 中链-短链DNA数 短链-短链DNA数 需要引物的总数 同时含引物1和2的DNA分子数 第1次循环的产物 8 2 4 2 14 6 2 2 0 0 2 0 4 2 2 0 6 2 第2次循环的产物 第3次循环的产物 2n 2 2(n-1) 2n-2n 2n+1-2 2n-2 ➌过程： 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 变性 复性 延伸 以 方式扩增，即 （n为扩增循环的次数） 指数 2n 可采用 来鉴定PCR的产物。 琼脂糖凝胶电泳 ➍结果： 目标DNA为： 2n-2n ➎产物鉴定： 一 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 1、利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（ ） A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP 和4种核糖核苷酸 D 习题检测 全部解旋后再复制 1.在PCR仪内进行DNA复制是边解旋边复制吗？ 不一定 2.复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？ ①引物与DNA模板链结合； ③解旋的两条DNA模板链重新结合 ②引物与引物结合； 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 思考讨论 适当降低 3：若设计的引物与模板不完全配对时，复性的温度要怎么变化？ 常造成引物与模板错配，导致扩增的非特异性片段过多 4：若复性温度过低会造成什么结果？ 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 5：怎样提高复性时引物与模板配对结合率，而不是模板链之间配对结合呢？ 加入过量的引物，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 一般不是，扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段 6：PCR 扩增的是完整的模板 DNA 分子吗？ 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 不能 7：用PCR可以扩增mRNA吗？为什么？ 需要将mRNA逆转录为cDNA，然后再进行扩增 8：如果需要扩增mRNA上的遗传信息，该如何操作？ ①DNA聚合酶无法识别RNA； ②高温变性步骤会破坏RNA的结构，导致其降解。 单链RNA 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA 引物、DNA聚合酶 双链DNA PCR扩增 内容1 目的基因的筛选与获取 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术 区别 解旋方式 场所 酶 温度 结果 联系 解旋酶催化 主要在细胞核内 解旋酶、DNA聚合酶等 细胞内温和条件 合成整个DNA分子 ①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料：均为四种脱氧核苷酸 ③酶：均需DNA聚合酶 ④引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成 DNA在高温下变性解旋 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 耐高温的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶） 控制温度，需在不同温度下进行 扩增特定的DNA片段或基因 在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可提供合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量 脱氧核苷三磷酸 PCR技术扩增时需要能量，所需要的能量可由dNTP提供，无需添加ATP 内容1 目的基因的筛选与获取 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 （　 　） (2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚 （　 　） (3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温 （　 　） (4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就 越高 （　 ） (5)PCR扩增过程中，需要添加ATP为新链合成提供能量（ ） (6)PCR扩增过程中，通过温度变化的控制为变性、复性和延伸等过程提供能量 （ ） 1.判断常考语句，澄清易混易错 温度不能为变性、复性和延伸等过程提供能量 PCR技术扩增时需要能量，所需要的能量可由dNTP提供 习题检测 2.利用 PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。图中引物为单链DNA 片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是（ ） A. 用 PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列 B. 设计引物时需要避免引物之间形成碱基 互补配对而造成引物自连 C. 复性温度过高可能导致PCR 反应得不到 任何扩增产物 D. 第四轮循环产物中同时含有引物A和引 物B的 DNA片段所占的比例为15/16 D 习题检测 3、金属硫蛋白(MT)是一种广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，如图是PCR扩增过程的示意图，请回然下列问题。 (1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA， 通过 获得 用于PCR扩增。 (2)设计一对与 MT 基因两端序列互补配对的引 物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在 引物中需要增加适当的 识别序列。设计 引物时需要避免引物之间形成 ，而造成引物之间相互配对。 逆转录 cDNA 限制酶 碱基互补 习题检测 3、金属硫蛋白(MT)是一米广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，如图是PCR扩增过程的示意图，请回然下列问题。 (3)图中步骤1代表 ，步骤2代表复性，步 骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。 (4)PCR扩增时，复性温度的设定是成败的关键。 复性温度过高会破坏 的碱基配对。 复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关， 长度相同但 的引物需要设定更高的复性温度。 变性 引物与模板 G、C含量高 习题检测 3、金属硫蛋白(MT)是一米广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，如图是PCR扩增过程的示意图，请回然下列问题。 (5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以 采取的改进措施有 (填序号)。 ①升高复性温度； ②降低复性温度； ③重新设计引物 ② ③ 习题检测 4.下列属于PCR技术所需条件的是（ ） ①单链的核苷酸序列引物　 ②目的基因所在的DNA片段 ③脱氧核苷酸　④核糖核苷酸　⑤DNA连接酶　 ⑥DNA聚合酶　⑦限制酶 A.①②③⑤ B.①②③⑥ C.①②③⑤⑦ D.①②④⑤⑦ B 习题检测 获得足量的目的基因后，是否能直接将目的基因导入受体细胞呢？ 【讨论】 就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解 不能原因 内容2 基因表达载体的构建 1.构建基因表达载体的目的： （1）使目的基因在受体细胞中 ，且 给下一代； （2）使目的基因能够在受体细胞中 。 稳定存在 可以遗传 表达和发挥作用 第二步：基因表达载体的构建——核心步骤 目的基因 复制原点 启动子 终止子 位置：基因的上游 作用： 识别和结合的部位，起始转录。 位置：基因的下游 作用：终止转录 2. 基因表达载体的组成 标记基因 DNA复制的起始位点 作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 抗生素抗性 基因、荧光蛋白基因等。 目的基因位置： 必须插到______ 和________之间 一段有 特殊序列结构的DNA片段 RNA聚合酶 启动子 终止子 第二步：基因表达载体的构建——核心步骤 内容2 基因表达载体的构建 ——核心步骤 80 【注意】启动子、终止子、起始密码子和终止密码子的比较 编码区（基因） 编码区 上游 启动子 终止子 编码区 下游 密码子 密码子 密码子 3' 5' mRNA 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 功能 DNA片段 目的基因上游 目的基因下游 RNA聚合酶识别和结合的部位，起始转录 终止转录 mRNA上3个相邻的碱基 mRNA首端 mRNA尾端 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（不编码氨基酸） 有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 内容2 基因表达载体的构建 81 ➊同种限制酶或 ➋产生相同黏性末端的限制酶切割 DNA 连接酶 目的基因 限制酶切割位点 获取目的基因 限制酶切割位点 质粒 重组 DNA分子 限制酶 限制酶 内容2 基因表达载体的构建 ——核心步骤 3.基因表达载体构建过程 【问题探讨1】使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？有何缺点？ 载体 目的基因 自连 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 2’ 1’ 1 如何解决这一问题？ 选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。 双酶切 内容2 基因表达载体的构建 ——核心步骤 83 -G -CTTAA -A -TCTAG -G -CTTAA 要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。 【问题探讨2】要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 内容2 基因表达载体的构建 ——核心步骤 （1）不破坏目的基因原则： 如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ （2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则： 所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 （3）确保出现相同黏性末端原则： 通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ； 为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），可选用什么限制酶？ 可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。 （4）保证目的基因和质粒发生定向连接 【补充】限制酶的选择原则 内容2 基因表达载体的构建 ——核心步骤 1.某目基因两侧的 DNA序列所含的限制酶酶切位点如图所示,下列可作该目的基因最佳载体的是 (　　) 　　　　　　　　 A　　　　 B C　　　　　　 　D A 习题检测 2.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是(　　) A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码 B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用 C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选 D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别 A 习题检测 3.构建基因表达载体：为使目的基因与载体正确连接，应用__________________两种不同限制酶的来分别切割载体和目的基因。 Pvit Ⅱ和EcoR Ⅰ 习题检测 4.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，Amp R表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是 ( 　) A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接 D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 D 习题检测 合作探究：请同学们自主阅读教材P81，小组合作思考讨论完成问题 1.总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些？ 各自适用于什么生物？ 2.农杆菌的特点？农杆菌转化法的原理。 3.请文字和箭头表示农杆菌转化法的过程。 内容3 将目的基因导入受体细胞 90 2. 方法 植物细胞： 动物细胞： 微生物细胞： 花粉管通道法、农杆菌转化法 显微注射法 Ca2+处理法 第三步：将目的基因导入受体细胞 基因表达载体需要通过一定的方法才能进入受体细胞。 1. 转化 内容3 将目的基因导入受体细胞 目的基因进入 细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和 的过程。实质是 。 受体 基因重组 表达 v (1)花粉管通道法 精子 (我国科学家独创的方法) 方式1： ①操作 方式 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。 方式2： 含目的基因 的DNA 溶液 内容3 将目的基因导入受体细胞 3. 将目的基因导入植物细胞 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。 3. 将目的基因导入植物细胞 (1)花粉管通道法 (我国科学家独创的方法) 方式1： ①操作 方式 方式2： v 在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。 适用生物： 受体细胞： 受精卵 开花植物 内容3 将目的基因导入受体细胞 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。 是一种在土壤中生活的微生物。能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 ①农杆菌的特点： Q1：农杆菌具有怎样的结构基础，利于目的基因进入植物细胞？（p81） 内容3 将目的基因导入受体细胞 3. 将目的基因导入植物细胞 (2)农杆菌转化法 3. 将目的基因导入植物细胞 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 ①农杆菌的特点： 内容3 将目的基因导入受体细胞 (2)农杆菌转化法 T-DNA（可转移的DNA） ②过程： 农杆菌 提取Ti质粒 构建表达载体 目的基因 含目的基因的的重组Ti质粒 导回农杆菌 转基因植物细胞 农杆菌感染植物细胞 T-DNA及其中的目的基因成功整合到植物染色体 表现出新性状的植株 内容3 将目的基因导入受体细胞 (2)农杆菌转化法 96 ②过程： 农杆菌转化法流程图 Ti质粒 目的基因 含目的基因的重组Ti质粒 农杆菌 植物细胞 植物细胞染色体DNA中 表现出新性状的植株 构建基因表达载体 转入 导入 目的基因插入 植物组织培养 该过程经过____ 次拼接、___次导入 两 两 第一次拼接 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作） 第二次拼接 内容3 将目的基因导入受体细胞 (2)农杆菌转化法 97 ②过程： 农杆菌转化法流程图 Ti质粒 目的基因 含目的基因的重组Ti质粒 农杆菌 植物细胞 植物细胞染色体DNA中 表现出新性状的植株 构建基因表达载体 转入 导入 目的基因插入 植物组织培养 该过程经过___ 次拼接、____次导入 两 两 第一次导入 第二次导入 将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌 含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作） 内容3 将目的基因导入受体细胞 (2)农杆菌转化法 98 (2)农杆菌转化法 ③具体转化方法： 方法1：可将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。 方法2：可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 受体细胞为体细胞 受体细胞为受精卵 随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 内容3 将目的基因导入受体细胞 方法1筛选出的转化细胞怎样再生成植株？植物组织培养：利用植物细胞的全能性 99 4. 将目的基因导入动物细胞 将含有目的基因的表达载体采用显微注射仪显微注射到 内；受精后经 ，再移植到雌性动物的 内，使其发育成为具有新性状的动物。 显微注射法 ②易表现出全能性。 ①体积大，易操作。 内容3 将目的基因导入受体细胞 受精卵 胚胎早期培养 输卵管或子宫 100 5. 将目的基因导入微生物细胞 (1)常用方法： Ca2+处理 (2)受体细胞： 常用原核细胞（大肠杆菌应用最广泛） 目的：增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态（感受态细胞） 大肠 杆菌 Ca2+ 表达 载体 感受态 细胞 单细胞 遗传物质少 繁殖快 Ca2+ 重组质粒 吸收 内容3 将目的基因导入受体细胞 101 种类项目 　　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 受体细胞 转化过程 目的基因插入Ti质粒的 T-DNA上→ 农杆菌（Ca2+处理）→ 导入植物细胞→ 整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→ 显微注射→ 受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→ 感受态细胞→ 表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 农杆菌转化法 花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法 受精卵 常用原核细胞 【小结】将目的基因导入受体细胞的方法 内容3 将目的基因导入受体细胞 体细胞或受精卵 1、下图为基因工程中基因表达载体的模式图，相关叙述错误的是（ ） A. 基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建 B. 图中启动子位于目的基因的首端，是核糖体 识别和结合的部位 C. 复制原点是基因表达载体在受体细胞中独立 复制和稳定存在所必需的 D. 抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用 于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因 B 习题检测 【问题】将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？ 请大家回顾基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？ 讨论： 内容4 目的基因的检测与鉴定 检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。 1. 目的 检查转基因抗虫棉是否培育成功的一步 Bt 抗虫 蛋白 抗虫棉 Bt 基因 mRNA 检测内容 检测水平 ①检测受体细胞的染色体DNA 上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录 出了mRNA ③检测目的基因是否翻译 成蛋白质 ④检测个体是否具有相应性状 分子水平 分子水平 分子水平 个体水平 内容4 目的基因的检测与鉴定 第四步：目的基因的检测与鉴定 105 2. 检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 (1)方法一： PCR扩增 提取 PCR 培育的抗虫棉 使用琼脂糖凝胶电泳鉴定是否扩增出Bt 基因 分子水平 Bt 基因 DNA 根据Bt 基因的序列设计 2种PCR引物 转基因抗虫棉 非转基因 棉花 阴性对照 内容4 目的基因的检测与鉴定 (1)方法二： 分子杂交技术 基因探针：一般是指一小段单链DNA或RNA，能与目的基因的一条链碱基互补配对，并带有放射性同位素标记或荧光标记。 变性 转基因生物的DNA 基因探针 出现杂交带 碱基互补配对 变性 分子水平 内容4 目的基因的检测与鉴定 2. 检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 3. 检测目的基因是否转录出了mRNA (1)方法一： PCR扩增 (2)方法二： 分子杂交技术 提取RNA 使用琼脂糖凝胶电泳鉴定是否扩增出目的基因 PCR cDNA 转基因生物 逆转录 mRNA 基因探针 变性 转基因生物的mRNA 出现杂交带 碱基互补配对 分子水平 内容4 目的基因的检测与鉴定 人体的细胞中，胰岛B细胞的______________（DNA/RNA/DNA和RNA）能与胰岛素基因探针形成杂交分子，而其他细胞中只有______（DNA/RNA）能与之形成杂交分子。 例如，胰岛素基因探针，既能与胰岛素基因的一条链形成杂交分子，也可与胰岛素基因转录形成的________形成杂交分子。用胰岛素基因探针既可以检测受体细胞中是否含有_____________，也可以检测胰岛素基因是否______。 mRNA 胰岛素基因 转录 DNA和RNA DNA 分子水平 内容4 目的基因的检测与鉴定 3. 检测目的基因是否转录出了mRNA 4. 检测目的基因是否翻译成蛋白质 分子水平 (1)方法： (2)原理： 抗原—抗体杂交 抗原与抗体特异性结合 苏云金杆菌 Bt 抗虫 蛋白 小鼠体内 培育的抗虫棉 提取 抗体 标记抗体 放射性检测 （杂交带） 提取蛋白 电泳分离 抗体 抗原 杂交 内容4 目的基因的检测与鉴定 5. 检测个体是否具有相应性状 个体水平 抗虫鉴定 用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未导入Bt 基因或导入了Bt 基因但未表达或蛋白没有活性； 如虫吃后中毒死亡，则说明导入了Bt 基因并得到表达。 内容4 目的基因的检测与鉴定 (1)通过抗虫、抗病（抗性）的接种实验鉴定生物是否具有抗性以及抗性的程度等 LacZ 基因表达产生的 β-半乳糖甘酶能够分解 X-gal ，产生蓝色物质 个体水平 抗性鉴定 培养 LacZ 基因 氨苄青霉素抗性基因 含氨苄青霉素和X-gal等 成分的选择培养基 蓝色 白色 导入空载质粒 (1)通过抗虫、抗病（抗性）的接种实验鉴定生物是否具有抗性以及抗性的程度等 内容4 目的基因的检测与鉴定 5. 检测个体是否具有相应性状 个体水平 (2)有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同 转基因生物 检测方法 观察指标 抗虫植物 饲喂害虫(抗虫接种实验) 抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染(接种实验) 抗盐植物 盐水浇灌 抗除草剂植物 喷洒除草剂 获取目的基因产物 (如胰岛素) 的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 害虫死亡 未染病 正常生长 正常生长 功能活性正常 内容4 目的基因的检测与鉴定 5. 检测个体是否具有相应性状 1.目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是（ ） A. 目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA B. 可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译 C. 可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质 D. 抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平 的检测 C 习题检测 2．可通过转基因技术将耐受或经修饰的能降解草甘膦的基因导入作物，使其耐除草剂。请回答下列问题： （1）为便于目的基因的表达和筛选，在基因表达载体的构建时应选用限制酶                来切割质粒和目的基因； （2）在构建好的基因表达载体中的标记基因是           ，其作用是                      。 BamHI和Sau3AI 四环素抗性基因 便于对重组DNA分子的筛选 习题检测 115 3.脱水素是青稞植株中的一种抗冻物质，脱水素基因Dhn4 的结构如图1所示，其中B链为模板链。研究人员利用图2所示的质粒，通过农杆菌转化法将该基因导入草莓中，成功培育出了抗冻草莓植株。请回答下列问题： 在PCR扩增Dhn4 基因时应选择的引物组合是                ，为使扩增后的产物按照正确方向与质粒连接，需在引物的       （选填“5′”或“3′”）末端分别添加限制酶                 （顺序需与选择的引物组合对应）的识别序列。 引物Ⅱ、Ⅲ； 5′ KpnⅠ、XhoⅠ 习题检测 116 【思考】如何对PCR产物进行检测鉴定？ 琼脂糖凝胶电泳 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 1.原理 ①DNA分子具有 ，在一定的 下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些 会向着 的电极移动，这个过程就是 。 可解离的基团 pH 电场 带电分子 电泳 与它所带电荷相反 ②PCR的产物一般通过 来鉴定 琼脂糖凝胶电泳 ④凝胶中的DNA分子通过 ，可以在波长为 的 下被检测出来。 染色 300nm 紫外灯 ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与 、 和 等有关。 凝胶的浓度 DNA分子的大小 构象 DNA片段的电泳鉴定 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 2.材料用具 ①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） ⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28--33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1--2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5--10μL 总体积 50μL ⑧PCR反应体系的配方 ⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、 扩增缓冲液、无菌水 ⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 2.材料用具 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 3.方法步骤 (1)DNA片段的扩增 ①移液： 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 ②离心： 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（ ） ③反应： 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min / / 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 预变性： 提高反应速率 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合 【视频】DNA片段的扩增 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 2.琼脂糖凝胶电泳的过程 根据待分离DNA片段的大小，用 缓冲液配置 溶液，一般配置质量体积比为0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。在 内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的 染料混匀。 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 ④ 配制琼脂糖溶液 电泳 琼脂糖 沸水浴或微波炉 核酸 梳子 模具 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 ⑤制备凝胶 加样孔 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成 。 1 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入 内。 2 电泳槽 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电容缓冲液没过凝胶 为宜。 3 1mm 将扩增得到的PCR产物与 （内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的 内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物(Marker)。 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 ⑧加样 凝胶载样缓冲液 加样孔 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为 1∼5V/cm2。待指示剂前沿迁移接近 时，停止电泳。 点样孔 电泳槽 样品 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 ⑨电泳 凝胶边缘 取出凝胶，置于300nm紫外灯下观察和照相。 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 ⑩观察记录 【视频】DNA片段的电泳鉴定 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和 蒸馏水等在使用前必须进行 处理 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并 在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪 头都必须 。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套 实验注意事项: 高压灭菌 更换 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 5.电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越　 ，迁移速 率越　 ，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越　 ，迁移 速率越　 。 大 慢 小 快 3.电泳结果的分析 条带 每条泳道有几条条带说明样品DNA中就有几种不同大小的DNA分子，条带的大小表示这种DNA分子数目的多少。 3.电泳结果的分析 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 (1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该图示片段大小约为750bp 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 (2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 4.结果分析与评价 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300纳米的紫外灯下被检测出来。 可以通过观察 DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果 3.电泳结果的分析 内容5 DNA片段的扩增及电泳的鉴定 132 1.下列有关电泳的叙述，不正确的是（ ） A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA 在电泳中的迁移速率 C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动 D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 C 习题检测 2.利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是(　　) A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽 灭菌处理 B.PCR利用了DNA的热变性原理 C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化 D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都 必须更换 C 习题检测 A. PCR产物的分子大小在250至500bp之间 B. 3号样品为不含目的基因的载体DNA C. 9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D. 10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 3号PCR结果包含250~500bp片段，应包含目的基因 3. 用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到如图所示电泳图谱，其中1号为DNA标准样液（Marker），10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是（　　） B 9号PCR结果不包含250~50bp片段，所以不是所需转基因植株 习题检测 本讲小结 一.概念检测 1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 （1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ） （2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ） （3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ） √ × × 练习与应用 一.概念检测 2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ） A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸 D 练习与应用 二、拓展应用 1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。 外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 练习与应用 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.29 Lavf57.71.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.45.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 Lavf58.29.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.10 $