3.1.1 重组DNA技术的基本工具课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

DNA是主要遗传物质 第三章 基因工程 第1节 重组DNA技术的工具 选必三 REN JIAO BAN GAO ZHONG SHENG WU XUAN BI SAN 我国是棉花的生产和消费大国。在棉花种植过程中常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最常见。 大量施用农药？ × 思考：棉花怎么抵抗虫害呢? 杂交育种？ × 造成农产品和环境污染 同种生物之间进行 诱变育种？ × 不定向 情境导入 我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染，如果能培育出自身能抵抗棉铃虫的棉花就能解决这个问题。 2 能不能导入“杀虫基因”到棉花细胞，使棉花自身产生抗虫蛋白来抵抗棉铃虫呢？ 抗虫基因 转基因技术 基因工程 转基因抗虫棉 苏云金杆菌 苏云金杆菌含有一种Bt毒蛋白基因。 我国成为世界第二个拥有抗虫基因自主知识产权的国家！ 情境导入 能否培育出自身能抵抗虫害的棉花新品种呢？棉花本身不具有“杀虫基因”，而苏云金杆菌有一种“杀虫基因”，它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。 3 什么是基因工程？ 指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 操作对象及环境 操作水平 操作原理 结果 意义 基因；生物体外 DNA分子水平 赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 基因重组 定向改造生物遗传特性，能克服远缘杂交不亲和的障碍。 1.基因工程的概念： 什么是基因工程？ 2.图解“基因工程实质” 转移 A生物 B生物 萤火虫 普通动植物 发光基因 A生物 取出优秀基因 “剪切”“拼接”　 B生物 表达　 新类型 新的生物产品 什么是基因工程？ 理论基础 DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸) 都遵循碱基互补配对原则 DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 理论基础 基因是控制生物性状的结构与功能单位 遗传信息传递都遵循中心法则 所有生物几乎共用一套遗传密码 复制 拼接的基础 表达的基础 3.基因工程诞生的理论基础 基因在空间上转移并成功表达。、不同生物的基因为什么能拼接？外源基因为什么能在受体细胞中表达？ 1.基因是什么？ 2.基因的功能是什么？ 基因通过控制蛋白质的合成，直接或间接控制生物的性状。 转录 DNA mRNA 蛋白质 翻译 （RNA聚合酶） ——体现相关的生物性状 基因是有遗传效应的DNA片段。 温故知新 9 知识回顾——基因：板书画图 基因是有遗传效应的DNA片段。 ①组成元素:　　　　　　　 ②DNA中文全称:　　　　　　　 ③基本单位:　　　　　　　　　 脱氧核糖核酸 C H O N P 脱氧核糖核苷酸 = 磷酸 + 脱氧核糖 + 含氮碱基 脱氧 核糖 含氮碱基 磷酸 1′ 4′ 3′ 2′ 5′ A T G C 脱氧核苷酸 (4种) 鸟嘌呤脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 腺嘌呤脱氧核苷酸 温故知新 脱氧 核糖 A 磷酸 脱氧 核糖 G 磷酸 脱氧 核糖 T 磷酸 T 磷酸 脱氧 核糖 C 磷酸 脱氧 核糖 A 磷酸 脱氧 核糖 氢键 磷酸二酯键 脱氧核苷酸如何链接成脱氧核苷酸链的呢？ DNA聚合酶： 解旋酶： 温故知新 双螺旋结构 温故知新 DNA的结构特点： 5’ 3’ 3’ 5’ ②脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在内侧。 ③两条链上的碱基通过氢键连接成碱基对，且遵循碱基互补配对原则。 ①DNA是由两条单链组成的，这两条链按 反向平行方式盘旋成双螺旋结构。 温故知新 ①DNA分子的两条链反向平行盘旋成双螺旋结构。 ②脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在内侧。 ③两条链上的碱基通过氢键连接成碱基对，且遵循碱基互补配对原则。 …… ATGCCGTGGAATTCC …… …… TACGGCACCTTAAGG …… ① ② ①磷酸二酯键 ②氢键 简图： 温故知新 番木瓜易受番木瓜环斑病毒的侵袭，被感染后产量大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜。DNA双螺旋的直径只有2 nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。 科学家用到了哪些“分子工具”？ 这些“分子工具”各具有什么特征呢？ 从社会中来 左图：非转基因番木瓜，右图：转基因番木瓜 15 培育抗番木瓜环斑病毒的木瓜 抗番木瓜环斑病毒基因提取 抗番木瓜环斑病毒基因与载体DNA连接 抗番木瓜环斑病毒基因导入受体细胞 “分子手术刀” “分子缝合针” “分子运输车” 准确切割DNA分子 将DNA片段连接起来 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞 重组DNA技术的基本工具 1.简称： 。 限制酶 2.来源： 主要是从 中分离纯化出来的。 3.种类： 种。 4.特点： ①识别 的某种特定的核苷酸序列， ②使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断开。 原核生物 数千 双链DNA分子 磷酸二酯键 5.作用部位： 磷酸二酯键 限制酶不是一种酶，而是一类酶 专一性 【即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子】 【无法识别切割RNA】 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 01. 【限制酶无法识别切割RNA】背景：限制酶就是细菌的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ G 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ A 磷酸二酯键 T G C C G T A A 5' 3' 5' 3' 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 01. 旁栏思考题 你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？ 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。 试推测限制酶为什么不会切割自身的DNA？ 含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。即：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰 ①大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 ②呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。 切点 切点 能被限制酶特异性识别切割的部位基本都具有回文序列：一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。 6.识别序列长度: 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 01. 思考1、仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何特点？几种常见的限制酶的识别序列及切割位点： 1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ） A．GAATTC B．GGGGCCCC CTTAAG CCCCGGGG C．CTGCAG D．CTAAATC GACGTC GATTTAG D 针对训练 资料卡：限制酶的命名 EcoRⅠ 属名Escherichia首字母 种名coli前两个字母 R型菌株 从中分离的第一种限制酶 练习：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae) d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为: Hind I Hind II Hind III EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶； SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。 EcoRI 限制酶的切割： EcoR I 5' 5' 3' 3' 黏性末端 当限制酶从识别序列的中心轴线两侧将DNA两条单链分别切开，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 黏性末端 EcoRI限制酶的切割：专一识别GAATTC的序列，并使G和A之间切开。注意：限制酶切割磷酸二酯键后氢键会自动断裂！ EcoRI 限制酶的切割： EcoR I 限制酶 5´GAATTC 3´ EcoRI 限制酶的切割： 限制酶(EcoRⅠ)能识别 序列，并在 和 之间切开 键,形成 末端。 -GAATTC- -CTTAAG- G A 黏性 磷酸二酯 EcoR I 5' 5' 3' 3' 黏性末端 黏性末端 SmaI 限制酶的作用： Sma I 5' 5' 3' 3' 平末端 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 SmaI 限制酶的作用： Sma I 5' 5' 3' 3' 平末端 限制酶(SmaⅠ)能识别 序列，并在 和 之间切割形成 末端。 -CCCGGG- -GGGCCC- G C 平 产生黏性末端或平末端 7.结果： 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 01. A.形成的黏性末端（从5’往3’读）为_____ B.一个限制酶切割一次断____个磷酸二酯键,形成___个黏性末端 C.同一种限制酶切割形成的黏性末端____ D.两个黏性末端有___个游离的磷酸基团 E.限制酶切割一次消耗____分子H2O AATT 两 2 相同 两 2 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 01. 探究‧活动一、用剪刀模拟EcoRI剪切目的基因(Bt基因)操作 （1）该DNA片段上EcoRI的识别序列在哪儿？ （2）请用剪刀模拟EcoRI的识别序列和切割位点将目的基因“切割”下来。 5’...G 3’...CTTAA AATTC...3’ G...5’ 黏性 末端 黏性 末端 目的基因 黏性末端 黏性末端 (3)要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？ 要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。 2、写出下列限制酶切割形成的黏性末端 BamHⅠ_______ EcoRⅠ______ HindⅢ______ BglⅡ ______ GATC AATT AGCT GATC 思考：你从中发现什么现象了？ 针对训练 2、写出下列限制酶切割形成的黏性末端 BamHⅠ_______ EcoRⅠ______ HindⅢ______ BglⅡ ______ GATC AATT AGCT GATC 不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同： (也有可能切割出相同的黏性末端，可以相互配对连接成链） 同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制性内切核酸酶 针对训练 同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同。不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同；(也有可能切割出相同的黏性末端，可以相互配对连接成链） 32 ①不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同。 ②同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同；(也有可能切割出相同的黏性末端，可以相互配对连接成链） 总结：产生相同的黏性末端不一定都是用同一种限制酶切割的。 ③不同限制酶切割形成的黏性末端，如果互补则可以相互重新配对连接 判断1：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端（ ） 判断2：相同的黏性末端一定是由同一种限制酶切割形成的（ ） √ × 归纳总结 3.限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列。如图所示为四种限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的识别序列，箭头表示每一种限制酶的特定切割位点，切割出来的DNA片段末端可以互补黏合的是 (限制酶)，其正确的末端互补序列应该为 。 A.BamHⅠ和EcoRⅠ；末端互补序列为—AATT— B.BamHⅠ和Hind Ⅲ；末端互补序列为—GATC— C.EcoRⅠ和Hind Ⅲ；末端互补序列为—AATT— D.BamHⅠ和BglⅡ；末端互补序列为—GATC— √ 针对训练 以下黏性末端是由_____种限制酶作用产生的 3 技巧：注意识别序列和切割位点！！ ①找到切割位点。②补全序列 针对训练 1.下列黏性末端属于由同种限制酶切割而成的是( ) ① ② ③　　　 　④ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 A.①② B.①③ C.①④ D.②③ 判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180度，若与另一个完全相同，则说明两个末端是用同一种限制酶切割 旋转180度 针对训练 2.下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点， 据图回答： （1）用EcoR Ⅰ 酶切，能得到 种DNA片段； （2）用Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 种DNA片段； （3）同时用Sma Ⅰ 和Pst Ⅰ 完全酶切，能得到 种DNA片段； （4）只用Pst Ⅰ 酶切，最多能得到 种DNA片段。 2 3 5 5 针对训练 3.下图中，选择哪种限制酶来获得抗病基因（目的基因）？ 选择限制酶切割目的基因的基本原则是： _______________________________________________ 能切下目的基因且不破坏目的基因 针对训练 4.某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。下列叙述错误的是 a酶切割产物(bp) b酶再次切割产物(bp) 2 100；1 400；1 000；500 1 900；200；800；600；1 000；500 A.a酶与b酶切断的化学键相同 B.a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接 C.a酶与b酶切割该DNA分子位点分别有3个和5个 D.限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子 √ 针对训练 切开的黏性末端或平末端如何连接起来呢？ 2.作用： 将 “缝合”起来，恢复被 切开的两个核苷酸之间的__________。 双链DNA片段 限制酶 磷酸二酯键 1.概念： 能够将 连接起来的酶，称之为DNA连接酶。 两个DNA片段 DNA连接酶——“分子缝合针” 02. 注意：不是连接氢键，氢键的形成不需要酶的催化 41 两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， 注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能将单个脱氧核苷酸连接到DNA链上！ DNA连接酶——“分子缝合针” 02. 2.作用： 将 “缝合”起来，恢复被 切开的两个核苷酸之间的__________。 双链DNA片段 限制酶 磷酸二酯键 1.概念： 能够将 连接起来的酶，称之为DNA连接酶。 两个DNA片段 3.种类和差别： 类型 E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 ____________ ____________ 功能 缝合_________和_________ 缝合__________和__________ 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌 T4噬菌体 黏性末端 黏性末端 平末端 磷酸二酯键 平末端 (效率较低) DNA连接酶——“分子缝合针” 02. （1）E·coli DNA连接酶或T4DNA连接酶连接粘性末端 DNA连接酶——“分子缝合针” 02. （2）E·coli DNA连接酶（效率低）或T4DNA连接酶连接平末端 DNA连接酶——“分子缝合针” 02. 旁栏思考题 DNA聚合酶 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么? 旁栏思考题 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么? DNA连接酶 A G T A C T A A T DNA母链 DNA聚合酶 DNA聚合酶 T … … T … … A … … A … … T … … A … … T … … C … … … G … … … DNA连接酶 DNA连接酶 A T A G T C C G A A T T 连接两个DNA片段 DNA连接酶： C A A T T DNA聚合酶 G A G T A T C DNA聚合酶 连接单个脱氧核苷酸形成单链 DNA连接酶和DNA聚合酶功能比较 项目 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 只能将游离的单个脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 1.通过基因工程产生的变异是不定向的 （　 　） 2.限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列 （　 ） 3.DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来 （　 　） 4.E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端（ 　 ） 5.限制酶和解旋酶的作用部位相同 （ 　） 判断常考语句，澄清易混易错 针对训练 1.根据所学知识，完成以下填空： ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶 b a A.切断a处的酶为_______ B.连接a处的酶为_______ C.切断b处的酶为_______ ① ③④ ②⑤ a：磷酸二酯键；b：氢键 针对训练 解旋酶 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 几种酶作用的图解 几种相关酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 2.你能用DNA连接酶将他们连接起来吗？ 2和 ； 3和 ； 1和 ； 4和 。 7 6 5 8 针对训练 3.关于下图所示黏性末端的叙述，正确的是 A.①与③是由相同限制酶切割产生的 B.DNA连接酶可催化①与③的连接 C.经酶切形成④需要脱去2分子水 D.DNA连接酶与DNA聚合酶均能作用于上述黏性末端。 B 消耗2分子水 针对训练 4.DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端 C 针对训练 57 5.以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是 A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的 B.②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的 C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子 D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键 D 针对训练 6.如表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。如图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是 A.BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键 B.Sau3AⅠ和BamHⅠ切割的序列产生的片段能够相连，连接后的片段还能被Sau3AⅠ切割 C.DNA连接酶能连接②⑤，不能连接②④ D.E.coli DNA连接酶和T4DNA连接酶都能连接①③，且连接效率低 B 针对训练 外源基因很难进入细胞，进入后也不容易稳定存在并表达，怎么解决这个问题呢？ 将外源基因送入受体细胞，还需要有运输工具，这就是分子运输车，又叫载体或运载体。 1.载体: 2.作用： ①作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中 ②使目的基因在受体细胞中稳定存在并表达。 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 03. 3.种类： 在基因工程中使用的载体包括 等。 质粒、噬菌体和动植物病毒 种类 用途 不同点 质粒、噬菌体 植物病毒 动物病毒 将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 它们来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别 动物病毒 噬菌体 利用病毒对宿主细胞的侵染性（具物种或组织特异性） 思考：若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。 噬菌体 噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 03. 4.常用载体：质粒 拟核DNA 质粒 大肠杆菌 氨苄青霉素抗性基因 目的基因插入位点 复制起点 大肠杆菌及质粒结构模式图 (1)化学本质：是一种裸露、结构简单、独立于 或______________ 外，具有 能力的 。 质粒来源于细菌、霉菌和酵母菌等的细胞质，对细胞的正常生活几乎没有影响，最常用的是大肠杆菌质粒。 真核细胞细胞核 原核细胞拟核DNA 自我复制 环状双链DNA 其基因属于细胞质基因。 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 03. 4.常用载体：质粒 拟核DNA 质粒 大肠杆菌 氨苄青霉素抗性基因 目的基因插入位点 复制起点 大肠杆菌及质粒结构模式图 (2)基因工程中使用质粒的特点：在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是天然质粒的基础上进行过__________的。 人工改造 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 03. 5.载体具备的条件： ③有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选 ①有一或多个限制酶切割位点 ②能在受体细胞内大量复制并稳定保存 （通常是抗性基因，也可以是荧光蛋白基因） 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 03. 问题1：如何将目的基因插入到质粒中？有一个至多个限制酶切割位点， 便于插入目的基因；问题2：如何鉴定重组质粒是否进入了受体细胞？ 具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选 问题3：重组质粒进入受体细胞后，要使目的基因能遗传给子代，质粒需要有什么功能？能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；问题4：能从破伤风杆菌中提取质粒作为基因工程的载体吗？对受体细胞无害。真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 64 5.作为载体需具备的条件： (1)有一个至多个 ，供外源DNA片段（基因）插入其中。 限制酶切割位点 (2)能够在宿主细胞中 或整合到 上，随受体DNA同步 。 自我复制 受体DNA 复制 (3)具有特殊的 ，便于重组DNA分子的 。 标记基因 筛选 (4)对受体细胞无害、易分离，大小合适、方便操作。 标记基因通常有： ①抗生素的抗性基因，如：氨苄青霉素抗性基因(ampr)、四环素抗性基因(tetr)。 ②荧光蛋白基因，如：绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 03. 问题1：如何将目的基因插入到质粒中？有一个至多个限制酶切割位点， 便于插入目的基因；问题2：如何鉴定重组质粒是否进入了受体细胞？ 具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选 问题3：重组质粒进入受体细胞后，要使目的基因能遗传给子代，质粒需要有什么功能？能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；问题4：能从破伤风杆菌中提取质粒作为基因工程的载体吗？对受体细胞无害。真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 65 拓展：标记基因的筛选原理 导入 受体细胞 培养 加入氨苄青霉素 ①导入重组质粒的受体细胞存活并繁殖 ②导入普通载体的体细胞存活并繁殖 含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒） 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，导入了载体并成功表达了的受体细胞才能够生存。如图所示： 目的基因一定成功重组到质粒上了吗？ 66 拓展：标记基因的筛选原理 无法存活 存活；白色 存活；蓝色 如何提高筛选的准确性？ LacZ 基因表达产生的β-半乳糖甘酶能够分解 X-gal 产生蓝色物质，从而使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。 请分析下列3种大肠杆菌在含 X-gal 和氨苄青霉素的固体培养基上的存活情况及菌落颜色。 当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。则没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状，导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。 67 （1）质粒与拟核中的DNA有哪些相同点：（至少写出两点） ①______ 。 ②______ 。 ③___________________ 。 （2）质粒 （是/不是）一种细胞器。 （3）细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别 ①化学本质不同：细胞膜上的载体： 。基因工程中的载体可能是物质, 如_ ; 也可是生物, 如___ ；也可是λ噬菌体的衍生物。 ②功能不同：细胞膜上的载体功能是 。 基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把 ____________ . 化学本质和结构相同 能够自我复制 具有遗传效应或都能够指导蛋白质的合成等 不是 蛋白质 质粒 动植物病毒 协助细胞膜控制物质进出细胞 目的基因导入受体细胞 针对训练 【检测】辨析填空 68 1.选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。 （1）在培养细菌的培养基中添加 抗生素B，则应该选择的限制酶 为_______。 （2）在培养细菌的培养基中添加 抗生素A，则应该选择的限制酶 为_____。 ①或② ① 针对训练 2.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是 插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况 ① 能生长 能生长 ② 能生长 不能生长 ③ 不能生长 能生长 A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是b C.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b A 针对训练 70 请你在上述序列中EcoRⅠ的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶带将切口粘起来。 重组DNA分子的模拟制作 思考讨论 1．EcoR I限制酶的识别序列是什么？在哪两个碱基之间进行切割？ 2．切割后产生的黏性末端是什么？ 5´GAATTC 3´ G与A之间切割 5´AATT 3´ 学生活动1 重组DNA分子的模拟制作 思考讨论 72 请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列，找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。： 重组DNA分子的模拟制作 思考讨论 AATTCGGCATAC… …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG GCCGTATG… 目的基因 … TCCTAG … AGGATCTTAA AATTCCATAC … GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG GGTATG … 运载体 重组DNA分子的模拟制作 思考讨论 要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？共产生几个游离的磷酸基团? …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG 目的基因 … TCCTAG … AGGATCTTAA AATTCCATAC … GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG GGTATG … AATTCGGCATAC… GCCGTATG… DNA连接酶 重组DNA分子的模拟制作 思考讨论 剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？ 2. 你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？ 3. 你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？ 学生活动2 限制酶；DNA连接酶 可能是剪切位点或连接位点选得不对，需重新操作 不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。 重组DNA分子的模拟制作 思考讨论 76 4.目的基因是要与运载体结合的， 那如何处理质粒？ ★重组质粒的形成： 用相同的限制酶处理目的基因和运载体，获得相同的末端，然后用DNA连接酶对其进行连接。 重组DNA分子的模拟制作 思考讨论 GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG DNA连接酶的连接结果 重组DNA分子的模拟制作 思考讨论 GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG DNA连接酶的连接结果 重组DNA分子的模拟制作 思考讨论 …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG 反向拼接 正向 反向 DNA连接酶的连接结果 重组DNA分子的模拟制作 思考讨论 GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG TTAA 载体自身连接 目的基因自身环化 GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG 目的基因和目的基因 DNA连接酶的连接结果 重组DNA分子的模拟制作 思考讨论 探究‧活动：重组DNA分子的模拟操作 5’................... pBI121 ................GAATTC........3’ 3’................... 质 粒 ...............CTTAAG........5’ 使用一种限制酶进行切割Bt基因和pBI121质粒，共有几种连接情况？ 请大家尝试用胶带模拟DNA连接酶进行操作。 GTC... 基因 ....... TGGACTTAA AATTCAG... Bt .......ACCTG 探究‧活动：重组DNA分子的模拟操作 目的基因 使用一种限制酶进行切割Bt基因和pBI121质粒，共有几种连接情况？ 请大家尝试用胶带模拟DNA连接酶进行操作。 探究‧活动：重组DNA分子的模拟操作 载体与目的基因 反向连接 载体与目的基因 正向连接 目的基因与目的基因之间的连接 目的基因自身环化 载体自身环化 载体与载体之间的连接 通常用两种不同限制酶同时切割目的基因和运载体（双酶切法）： 防止载体自身连接、目的基因自身环化和反向拼接 双酶切产生不同末端，确保目的基因与运载体定向连接，减少重组杂物。 使用一种限制酶进行切割Bt基因和pBI121质粒，共有几种连接情况？ 请大家尝试用胶带模拟DNA连接酶进行操作。 原因：由同种限制酶切割，形成相同的粘性末端 用限制酶切割时需注意的事项 (1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是为了 ________________________________。 但是使用该法缺点是容易发生____________________________， 以及 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是________________________________________。 产生相同的黏性末端，便于连接 目的基因、质粒的自身环化 目的基因与质粒反向连接 分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体 用限制酶切割时需注意的事项 (2)选择限制酶切割位点的基本原则： ①切割目的基因时：________________________________。 ②切割质粒时：_______________________________________。 能切下目的基因且不破坏目的基因 至少保留一个完整的标记基因，便于筛选 A 、BamHⅠ B 、HindⅢ C、 PstⅠ D、PstⅠ和 HindⅢ D 针对训练 3.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 （1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________ 和__________________________。 （2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，___________________________________________________。 目的基因 质粒上的抗生素抗性基因 目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中 针对训练 （3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是____________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。 目的基因与目的基因 质粒片段与质粒片段 反向连接 针对训练 随着生物技术的飞速发展，生产和消费“分子工具”的公司大量涌现。感兴趣的话，你可以登录这些公司的网站，查询和了解相关产品的特点、价格和使用说明等。有些这样的公司已经上市，你还可以通过分析公司的股票价格走势，大致了解公司的运营状况以及投资者目前对该行业的认可程度。 在调查中需要了解企业的生产技术、产品的种类和产量、销售渠道和销售情况等，这样才有可能对企业的经营状况进行正确的判断。 与生活的联系 限制酶 DNA连接酶 载体 ①对受体细胞无害； ②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因； ④能自我复制或能整合到宿主DNA上。 质粒、λ噬菌体衍生物 、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类： 磷酸二酯键 来源： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有专一性 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位：磷酸二酯键 种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶 作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 课堂小结 (1)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(　　) (2)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体(　　) (3)载体(如质粒)和细胞膜中的载体蛋白的成分相同(　　) (4)作为载体，必须要有标记基因(　　) × √ × √ 针对训练 1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ） A.大肠杆菌的质粒 B. 切割DNA分子的酶 C. DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针 C A 一、概念检测 练习与应用 1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 二、拓展应用 迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。 练习与应用 2. 有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ , XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？ (2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ XbaⅠ 因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。 练习与应用 1.为制备目的基因Y(图1)与质粒X(图2)的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制性内切核酸酶BglⅡ与BamHⅠ的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR。请回答下列问题： 针对训练 (1)根据图3分别写出BglⅡ与BamHⅠ酶切后形成的末端序列： 、 。 (2)使用BglⅡ处理重组质粒，可以得到 。 长度为3 300 bp的环状DNA 学以致用 (3)BglⅡ酶切后的质粒X与BamHⅠ酶切后的目的基因Y能够连接的原因是 。 酶切后产生相同的黏性末端，并遵循碱基互补配对原则 (4)将连接后的产物转入一种Z细菌，Z细菌对卡那霉素敏感，且不能在缺乏亮氨酸的培养基中培养。要筛选含有重组质粒的Z细菌，应选择___ ________________________的培养基。 含卡那霉素但不含亮氨酸 学以致用 目的基因是一个DNA片段，不含有复制原点、不含有启动子和终止子。 为什么需要载体 思考：形成一个重组质粒会形成几个磷酸二酯键？ 四 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 03. Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.7.28 或 或 $