3.1 重组DNA技术的基本工具（第1课时）课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

基 因 工 程 基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。 别名： 操作环境： 操作对象： 操作水平： 原理： 结果： 意义： 重组DNA技术 主要在生物体外 基因 DNA分子水平 创造出人类需要的新的生物类型和生物产品 基因重组 定向改造生物遗传特性；彻底打破种间界限 基 因 工 程 活动1：阅读课本P68、P69“基因工程的诞生和发展”，回答下列问题： ①梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了什么？ ②在什么生物中发现了第一个限制酶？ DNA的半保留复制 细菌 ③基因工程正式问世的标志事件？ ④第一个基因工程药物是什么？ 重组人胰岛素 ⑤世界上第一例转基因烟草使用了什么方法培育？ 农杆菌转化法 ⑥什么为获取目的基因提供了有效手段？ PCR ⑦最新的基因组编辑技术是什么？ CRISPR技术 CH2 H OH H H H H 碱基 磷酸 5’ 4’ 3’ 2’ 1’ 回顾DNA的结构 P A 脱氧 核糖 T G C A G T T G A C C A 5′ 3′ 3′ 5′ DNA分子平面结构图 磷酸 二酯键 课堂导入 讨论 DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。科学家究竟用到了哪些“分子工具”？ 这些“分子工具”各具有什么特征呢？ 第3章 基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具 （第1课时） 重组DNA技术的基本工具 “分子手术刀” 作用：准确切割DNA分子 限制性内切核酸酶 “分子缝合针” 作用：将DNA片段连接起来 “分子运输车” DNA连接酶 作用：将体外重组DNA分子导入受体细胞 通常使用质粒 1. 简称 一、限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 2. 来源 限制酶 主要来自原核生物 大肠杆菌 3. 种类 数千种 思考：你能推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？ 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。 （限制酶不是一种酶，而是一类酶） 蓝细菌 一、限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 4. 命名 用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的 例：一种限制酶是从大肠杆菌（ Escherichia coli）的R型菌株分离来的，就用字母 EcoR 表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoR I。 练一练： ①粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）中分离的第一种限制酶，即 ； ②流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的d菌株中分离到的第3种限制酶，则命名为 。 Sma Ⅰ Hind Ⅲ 5. 作用特点 一、限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 能够识别双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 T G C A G T G A C C 5′ 3′ 3′ 5′ 磷酸 二酯键 具有专一性 一、限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 6. 识别的序列特点 ①大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成； ②少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成； 中轴线 ③都可以找到一条中轴线； ④中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的，称为回文序列。 7. 结果 一、限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 产生的DNA片段末端通常有两种形式 (1)黏性末端： 限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开 黏性末端 5’ 3’ 3’ 5’ 中轴线 EcoR Ⅰ 限制酶： (在G与A之间切割) 特异性识别 GAATTC 序列 7. 结果 一、限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 产生的DNA片段末端通常有两种形式 限制酶在它识别序列的中心轴线处切开 平末端 5’ 3’ 3’ 5’ 中轴线 Sma Ⅰ 限制酶： (在G与C之间切割) 特异性识别 CCCGGG 序列 (2)平末端： 一、限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 5’ 3’ 3’ 5’ 思考：①限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？ ②产生多少个游离的磷酸基团？ ③产生几个黏性末端？ ④消耗几分子水？ 黏性末端 中轴线 2个 2个 2个 2个 一、限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 试一试：写出下列限制酶切割形成的末端序列（教材P75） 5'-A 3'-TTCGA AGCTT-3' A-5' 5'-A 3'-TGATC CTAGT-3' A-5' 5'-T 3'-AGATC CTAGA-3' T-5' 总结：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端 同尾酶 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶。 --ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA ……TCCCTAAGAATTC CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- Bt蛋白基因 3’ 5’ 5’ 3’ 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Bt蛋白基因 5’ 3’ 3’ 5’ EcoRⅠ识别 5'-GAATTC-3' 序列，并在G与A之间切割。 一、限制性内切核酸酶 ——“分子手术刀” 15 那么需要用到什么工具将切下来的 DNA 片段拼接成新的 DNA 分子呢？ 1. 作用 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被 切开的两个核苷酸之间的 。 限制酶 磷酸二酯键 2. 种类 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 作用部位 差别 大肠杆菌 T4噬菌体 E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶 磷酸二酯键 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” 16 试一试：写出下列限制酶切割形成的末端序列（教材P75） 5'-A 3'-TTCGA AGCTT-3' A-5' 5'-A 3'-TGATC CTAGT-3' A-5' 5'-T 3'-AGATC CTAGA-3' T-5' 总结：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端 同尾酶 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶。 5'-A 3'-TGATC CTAGA-3' T-5' 不能被Spe Ⅰ 限制酶 和Xba Ⅰ 限制酶识别 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” —GGATC— —CCTAG— —G —CCTAG GATC— — 课堂小测 1、已知限制酶Ⅰ 的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ 的识别序列和切点是—↓GATC—。（均填“能/不能/不一定能” ） ①能被限制酶I 切割的DNA， 被限制酶II切割； ②能被限制酶II 切割的DNA， 被限制酶I切割； ③DNA1被限制酶I 切割，DNA2被限制酶II 切割，加入DNA连接酶可得到DNA1和DNA2的重组DNA片段，该重组DNA片段 被限制酶I 切割， 被限制酶II 切割。 —GATC— —CTAG— —GGATCC— —CCTAGG— 能 不一定能 不一定能 能 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键 蛋白质 3. DNA连接酶 VS DNA聚合酶 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” 19 种类 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 RNA聚合酶 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割双链DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 将双链DNA分子局部解旋为单链、 将单个的核糖核苷酸连接到RNA单链末端 磷酸二酯键 氢键和 磷酸二酯键 氢键 4. 几种相关酶的比较 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” 课堂小测 2、(教材P74) DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 C 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 1. 目的 将外源基因送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 2. 种类 种类 用途 不同点 将外源基因导入 细胞 将外源基因导入 等细胞 将外源基因导入 细胞 将外源基因导入 细胞 质粒 噬菌体 植物病毒 动物病毒 (主) 各种 植物 大肠杆菌 动物 来源不同，在大小、结构、复制方式 以及可以插入外源DNA片段的大小也 有很大差别 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 3. 最常用的载体——质粒 拟核 质粒 大肠杆菌细胞 氨苄青霉素抗性基因 目的基因插入位点 复制原点 定义： 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 来源： 主要存在于细菌和真菌体内 本质： 环状双链DNA分子 (细胞质基因) 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 4. 载体需具备的条件 ①有一个至多个限制酶切割位点 氨苄青霉素抗性基因 目的基因插入位点 复制原点 启动子 终止子 供外源DNA片段（基因）插入其中 ②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制 ③具有特殊的标记基因 (便于重组DNA分子的筛选) 如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等 ④对受体细胞无害 DNA聚合酶的结合位点，能复制并带着插入的目的基因一起复制 转录的起点 转录的终点 在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 5. 标记基因的筛选原理 重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低 培养 含氨苄青霉素的培养基 未导入质粒 导入空载质粒 导入重组质粒 存活 存活 无法存活 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 5. 标记基因的筛选原理 思考：如何提高筛选的准确性？ 【资料】LacZ 基因表达产生的 β-半乳糖甘酶能够分解 X-gal ，产生蓝色物质，从而使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。 请分析下列3种大肠杆菌在含 X-gal 和青霉素的固体培养基上的存活情况及菌落颜色。 LacZ 基因 氨苄青霉素抗性基因 无法存活 存活；蓝色 存活；白色 课堂小测 3、在重组DNA技术中，将外源基因导入受体细胞，通常是利用质粒作为载体。下列关于质粒的叙述，正确的是（ ） A. 质粒是一种只存在于原核细胞中的结构简单的环状DNA分子 B. 质粒的复制和表达过程都遵循中心法则和碱基互补配对原则 C. 目的基因只有通过质粒整合到受体细胞的DNA中才能表达 D. 大多数天然质粒都不需要人工改造，可以直接作为载体使用 B 课堂小测 4、质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插人的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是（ ） A. 质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B. ①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C. 质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D. 将外源基因与质粒连接时需用 DNA 聚合酶 C 项目 细菌在含氨苄青霉素的 培养基上生长情况 细菌在含四环素的 培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 $