3.2基因工程的基本操作程序（第3课时）2025-2026学年高二生物同步备课优质课件（人教版2019选择性必修3）

该高中生物学课件聚焦基因工程基本操作程序，涵盖基因表达载体构建、目的基因导入受体细胞及检测鉴定。通过“目的基因能否直接转入受体”等问题导入，衔接目的基因获取，以问题链和概念辨析搭建学习支架，梳理操作逻辑。 其亮点在于融合科学思维与探究实践，通过表格对比启动子/终止子、不同受体细胞方法等强化结构与功能观，结合农杆菌转化法步骤分析及筛选实验拓展，培养逻辑推理与实验探究能力。丰富习题与实例助学生构建知识体系，教师可直接用于课堂教学提升效率。

第2节 基因工程的基本操作程序 第3章 基因工程 1 问：获得的目的基因直接转入受体吗？ 不能。游离的DNA片段进入受体细胞一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。 4 基因表达载体的构建 —基因工程的核心 （1）目的: 使目的基因在受体细胞中稳定存在并且遗传给下一代； 使目的基因能够表达和发挥作用。 （2）基因表达载体的组成： ②标记基因、③复制原点 ④终止子、⑤启动子 ①限制酶切位点（插入目的基因） 限制酶切位点 供目的基因插入载体中 目的基因必须插到_________和_________之间;考虑到翻译，还必须含有能转录出完整的核糖体结合位点、______________ 和______________的序列。 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 启动子：是有特殊序列结构的_______片段， 位于基因的______，是 _____________识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 终止子：位于基因的 。 功能：终止 。 DNA 上游 RNA聚合酶 下游 转录 复制原点：能在受体细胞中 或 _________________， DNA 的起始位点 作用：便于重组DNA的筛选 自我复制 整合到受体DNA上 复制 【辨析概念】 1. 基因表达载体 ≠ 载体 （基因表达载体与载体相比，增加了目的基因） 启动子 复制原点 终止子 目的基因 标记基因 基因表达载体 载体 2.基因表达载体 ≠ 基因克隆载体 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 基因表达载体 ·组成型启动子（一直干活） ·组织特异性启动子（特定组织中干活） ·诱导型启动子（当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达） 基因克隆载体 目的基因 限制酶切割位点 标记基因 启动子 终止子 复制原点 限制酶切割位点 质粒 同种限制酶 或同尾酶或两种酶 带有黏性末端或平末端的切口 带有相同黏性末端或平末端的 目的基因片段 重组 DNA分子 DNA连接酶 （3）构建基因表达载体（重组质粒）：   启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 作用 DNA片段 DNA片段 mRNA上 三个相邻碱基 mRNA上 三个相邻碱基 目的基因首端 目的基因尾端 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出RNA 决定转录 的结束 翻译的 起始信号 决定翻译的结束 编码区（基因） 非编码区 非编码区 启动子 终止子 DNA 转录 成熟mRNA 6 习题巩固 1.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是（ ） A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸 B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件 C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达 D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别 B 7 （2）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是从子链的 延伸。 DNA聚合酶只能特异地复制处于　 　 之间的DNA序列，若这个过程中消 耗了引物62个,则进行了 轮的DNA复制。 （3）若用PCR技术扩增图示目的基因，应选用的引物是 。 (1）第1组： ； 第2组： 。 2.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效 两个引物 5′端向3′端 5 引物甲、引物丙 5 将目的基因导入受体细胞 一.导入植物细胞：_______________________________ 花粉管通道法、农杆菌转化法 1. 花粉管通道法（我国独创） ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 ②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 花粉管 花粉粒 柱头 子房 胚囊 卵细胞 精子 适用：_________ 受体细胞：_______ 受精卵 开花植物 特点： 利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。 操作简单、技术成本低，免去组织培养及诱导再生植株的全套人工培养过程。 2. 农杆菌转化法（采用最多） （1）农杆菌有何特点？ ①能在自然条件下侵染____________和___________，对大多数单子叶植物没有侵染能力。 ②当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，农杆菌能将 上的 （可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并将其整合到 。 双子叶植物 裸子植物 Ti质粒 T-DNA 该细胞的染色体DNA上 将目的基因插入Ti质粒中的________上，构成重组质粒，通过农杆菌的侵染作用，就可以使目的基因进入植物细胞。 （2）利用农杆菌进行转化的思路： T-DNA 转化：指目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 实质：基因重组。 （3）农杆菌转化法过程： （含目的基因） 问：该过程涉及几次拼接、几次导入？哪些拼接或导入的操作是非人工操作？ 第1次拼接：将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。 第2次拼接：含目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上 第1次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌 第2次导入：含目的基因的T-DNA导入受体细胞 非人工操作 非人工操作 具体的转化方法： ①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。 ②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 受体细胞：体细胞 受体细胞：受精卵 问：以上两种方法的受体细胞有何不同？ 随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 习题巩固 1.下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是(　　) A A.⑤只要表现出抗虫性状就 表明植株发生了可遗传变异 B.③侵染植物细胞后，重组 Ti质粒整合到④的染色体上 C.④的染色体上若含抗虫基因， 则⑤就表现出抗虫性状 D.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与 ⑤为转基因植物，只要表现出抗虫性状就说明转入的目的基因成功表达了，基因工程的原理是基因重组，属于可遗传变异，A正确；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T-DNA整合到植物细胞的染色体上，B错误；受体细胞的染色体上可能含抗虫基因，但不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C错误；基因表达载体的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，D错误。 13 2.研究人员将两个抗虫基因(T)导入棉花细胞内培育转基因抗虫棉。那么两个抗虫基因在染色体上随机整合有几种情况？ 转两个T基因 普通棉花细胞 有三种情况，如下图 甲 乙 丙 若甲、乙、丙三种植株自交，后代抗虫与不抗虫的比例各为多少？ 自交 自交 自交 全为抗虫 抗虫：不抗虫=3:1 抗虫：不抗虫=15:1 3.基因枪法 ——适用于单子叶植物 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 二.目的基因导入动物细胞的方法：_______________ 显微注射法 将含有目的基因的表达裁体提纯→显微注射入动物的受精卵 →受精卵发育→获得具有新性状的动物 显微注射仪 受精卵 注射器 固定吸管 ① 体积大，易操作； ② 全能性高，易培养成完整个体。 受体细胞：受精卵 注：转基因植物的受体细胞可采用植物体细胞，因为可以利用植物组织培养将受体细胞发育成完整的植株。但如果做转基因动物，就不能用体细胞作为受体细胞，因为要保证全身上下的细胞都带有目的基因，如果已经是一个成熟的个体，只往它身上某个部位（如肝脏细胞）导入基因，就不能保证身体所有细胞都带上目的基因，所以唯一的受体细胞就是受精卵。 【拓展】病毒侵染法 也可用病毒DNA与目的基因一起构建载体，用病毒去感染受体细胞，使目的基因导入受体细胞内，如慢病毒载体、腺病毒载体等。 如：疫情期间我国陈薇院士团队研发的重组新型冠状病毒疫苗，就是将编码新冠病毒刺突蛋白的S基因插入腺病毒的基因组中，接种后在人体内随载体增殖，并表达产生S蛋白（抗原），引发人体产生对S蛋白的免疫反应。 Ca2+处理大肠杆菌 细胞 将重组的基因表达载体 溶于缓冲液中 混合 细胞吸收DNA完成转化 （1）原核生物作为受体细胞有哪些优点？ ①繁殖快②单细胞③遗传物质少 （2）导入方法：Ca2+处理法 三.目的基因导入微生物细胞： 感受态 使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态 Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性 【应用】如何用原核细胞（如大肠杆菌）生产人的胰岛素？ 问：真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？ 原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性， 需要在体外进行再加工。 前体mRNA 转录 汉水丑生侯伟作品 真核基因 成熟mRNA 剪切、拼接 原因：①真核生物的基因有内含子，原核生物细胞里没有相应的机制来剪切、拼接前体RNA；②原核生物没有真核生物的蛋白质加工系统（内质网、高尔基体等）。 思考：要获得抗虫性状，可以不切割目的基因，直接将苏云金杆菌的所有DNA直接导入普通棉花细胞不是更简便吗？ 有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体植物。 练习：基因工程常用的受体细胞有 （ ） ①大肠杆菌 ②枯草杆菌 ③支原体 ④动植物细胞 A．①②③④ B．①②③ C．②③④ D．①②④ D 受体细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞法 受体细胞 转化过程 以农杆菌转化法为例： 将目的基因插入Ti质粒的 上 ↓ 转入农杆菌中 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞的DNA上 提纯含目的基 因的表达载体 ↓ ___________ ↓ 受精卵发育 ↓ 具有新性 状的个体 Ca2＋处理细胞 ↓ 细胞 ↓ 基因表达载体与 感受态细胞混合 ↓ 感受态细胞 吸收DNA分子 体细胞或受精卵 受精卵 通常选原核细胞 T-­DNA 显微注射 感受态 ——检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持 和表达其遗传特性。 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 ①检测转基因生物染色体DNA上是否导入目的基因 ②检测目的基因是否转录 ③检测目的基因是否翻译 分子水平的检测： 个体水平的检测： 问：将基因3表达载体导入受体细胞后，如何判断是否导入成功？ 利用标记基因（如抗生素抗性基因）筛选成功导入基因表达载体的受体细胞。 不一定，若导入的是空载体、载体-载体连接物，标记基因筛选也呈阳性。 问：标记基因筛选呈阳性就能确定目的基因进入细胞了吗？ 5 目的基因的检测 1. 检测目的基因是否导入受体细胞（分子水平） （1）DNA分子杂交技术： ①制作分子探针：探针是与目的基因有相同序列的DNA片段，通常用放射性同位素（或荧光分子或化学发光催化剂）作标记，并用PCR扩增。 探针 15N 15N ②提取转基因生物的基因组DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液； ③高温处理使DNA解开成单链，基因探针的单链会与目的基因的单链在一定条件下互补配对，结合成双链，出现杂交带，通过观察杂交带，表明受体生物染色体DNA上含有目的基因。 转基因生物DNA 变性 变性 碱基互补配对原则 基因探针：可以是DNA，也可以是由DNA转录而来的RNA，探针的长度可包括整个基因，或基因的一部分。 杂交带的检测：检测放射性或电泳检测DNA片段的大小。 酶切 多种DNA片段 注：凝胶中DNA易降解，难以直接用于杂交，膜更能牢固的固定DNA，便于后续探针结合和显影 1. 检测目的基因是否导入受体细胞（分子水平） （2）PCR扩增： 判断是否 扩增出 目的基因 提取DNA DNA作为模板 PCR操作 转基因生物 根据目的基因序列设计PCR引物 电泳（常用） DNA测序技术DNA分子杂交技术等 M：marker； 1：阳性质粒（含目的基因） 2：原始品系 3-9：转Bt品系 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 2.检测目的基因是否转录 （1）RNA分子杂交技术： 含目的基因序列的基因探针 15N 15N 转基因生物的mRNA 变性 变性 杂交分子（可检测） （2）RT-PCR扩增： 电泳检测是否 扩增出目的基因 PCR操作 作为模板 提取mRNA 转基因生物 逆转录 cDNA 电泳（常用） DNA测序技术DNA分子杂交技术等 3.检测目的基因是否翻译 如何检测目的基因是否翻译产生Bt抗虫蛋白？（提示：免疫学方法） 方法：提取转基因植物的蛋白质（抗原）+相应抗体 → 是否出现杂交带 提取蛋白 电泳分离 转基因生物 多种蛋白质条带 (抗原) 杂交 放射性检测 （杂交带） 抗原与抗体的特异性结合 原理：___________________________ 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt抗虫蛋白 注射小鼠体内 Bt蛋白抗体 标记抗体 4. 检测目的基因是否表现出相应的性状 方法：通过抗虫、抗病的接种实验鉴定生物是否具有抗性以及抗性的程度等。 例：通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫，来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性程度。 普通棉花 棉铃虫 转基因抗虫棉 （棉铃虫死亡） 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）感染（抗病接种实验） 未侵染上病斑 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 A.做RT－PCR之前，需要先 根据cDNA的核苷酸序列合成 引物和探针 B.RNA不能作为PCR扩增的 模板，故需要将样本中的RNA 逆转录为DNA后再进行扩增 C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒 D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交 1.实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是（ ） C 30 【拓展延伸】筛选含目的基因的受体细胞（以大肠杆菌为例） （1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入到某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。 如图，若将目的基因插入到四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 上述操作后导入细菌细胞，得到的受体细胞类型可能有： ①含目的基因的细菌——无抗性 ②含目的基因—目的基因的细菌——无抗性 ③含质粒的细菌——有氨苄青霉素和四环素抗性 ④含质粒—质粒的细菌——有氨苄青霉素和四环素抗性 ⑤含重组质粒的细菌——有氨苄青霉素抗性 （2）筛选方法： ①将转化后的细菌放在含氨苄青霉素培养基上培养，能生长的如图1、2、3、4、5菌落是： 。 ②再利用灭菌的绒布影印到含四环素培养基上， 的即为含目的基因的菌落，如图1、5。最后，可在 的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 含重组质粒的细菌、含质粒的细菌和含质粒—质粒的细菌 不生长 含氨苄青霉素 2．为提高红豆杉细胞培养物中紫杉醇的产量，研究人员构建紫杉醇合成关键酶基因（Bapt）的超表达载体，并将其导入红豆杉细胞，具体流程如下图所示。下列相关说法错误的是（　　） A．工厂化生产紫杉醇需将改造后的红豆杉细胞培养至愈伤组织 B．超表达载体中应含有潮霉素抗性基因作为标记基 C．p1301 载体上应含有增强 Bapt 基因表达的序列 D.可使用 Bapt 基因制成的探针检测过程⑤是否成功 D 3．把人胰岛素基因注入大肠杆菌体内，再将大肠杆菌放入发酵罐中进行大规模培养，可大量生产胰岛素。如表为不同限制酶的识别序列及切割位点，如图为质粒及胰岛素基因的结构示意图。 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ BclⅠ San3AⅠ HindⅢ 识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC T↓GATCA ↓GATC A↓AGCTT (1)在构建重组质粒前，需对胰 岛素基因进行PCR扩增，其需要 的物质条件为DNA模板、4种脱 氧核苷酸、引物和__________________。 PCR时需要在图中引物_____的5'端添加限制酶________的识别序列，同时在引物____的5'端添加限制酶__________的识别序列。 耐高温的DNA聚合酶 C BclⅠ B HindⅢ (2)胰岛素基因在大肠杆菌中开始 转录时，RNA聚合酶首先结合的 位点是_________。 (3)将重组质粒转入大肠杆菌过程中，一般选用Ca2+处理大肠杆菌，目的是使大肠杆菌处于____________________________________的生理状态，然后将菌液接种在含____________的培养基上培养，在该培养基上生长的菌落______________（填“是”“不是”或“不一定是”）导入重组质粒的大肠杆菌。 3．把人胰岛素基因注入大肠杆菌体内，再将大肠杆菌放入发酵罐中进行大规模培养，可大量生产胰岛素。如表为不同限制酶的识别序列及切割位点，如图为质粒及胰岛素基因的结构示意图。 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ BclⅠ San3AⅠ HindⅢ 识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC T↓GATCA ↓GATC A↓AGCTT 启动子 能吸收周围环境中DNA分子 氨苄青霉素 不一定是 【课堂总结】 1.目的基因的筛选和获取（前提） 基因工程的基本程序 DNA合成仪合成 基因文库获取 利用PCR获取和扩增 2.构建基因表达载体（核心） 目的基因、标记基因 启动子、终止子 3.将目的基因导入受体细胞（关键） 花粉管通道法、农杆菌转化法、 显微注射法(动物) 、感受态细胞转化法(微生物) 4.目的基因的检测与鉴定（保证） 分子水平：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等 感谢观看! 2019人教版·生物·选择性必修3 37 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.37 EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn EVCapture4.1.9软件录制 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