大题05 生物技术与工程（2大热点角度精讲精练）（黑吉辽蒙专用）2026年高考生物终极冲刺讲练测

**基本信息** 聚焦生物技术与工程核心流程，通过命题趋势解码、解题模型构建及分层刷题，系统培养过程推演与信息转译能力，落实生命观念与科学思维。 **专项设计** |模块|题量/典例|方法提炼|知识逻辑| |----|-----------|----------|----------| |命题解码|3年高考真题+热点角度拆解|重过程推演与层级差异分析|从工具识别到流程逻辑构建| |解题建模|2大热点角度典例|限制酶选择四步法、基因工程与蛋白质工程判定流程|微观操作与宏观应用尺度转化| |实战刷题|20+模拟题+6道真题|信息转译技巧（图谱/曲线分析）|技术原理与社会责任关联|

大题05 生物技术与工程 内容导航 【命题解码·定方向】命题趋势+3年高考真题热点角度拆解 【解题建模·通技法】析典例，建模型，技法贯通破类题/变式 【实战刷题·冲高分】精选高考大题+名校模拟题，强化实战能力，得高分 命题·趋势·定位 1.重过程推演：从“识工具”转向基因工程四步流程的时序推导、单克隆抗体制备的链式逻辑、发酵条件的动态优化机制推导。 2.重层级差异：基因水平操作+细胞水平培养/个体水平筛选/群体水平发酵叠加，强化微观操作与宏观产出间的尺度转化考查。 3.重信息转译：以质粒图谱与限制酶切位点、PCR扩增曲线、细胞融合筛选示意图、发酵参数变化表为核心载体。 4.重综合关联：与疾病诊疗、作物育种、环境修复、生物制药、伦理安全深度融合，突出科技向善与社会责任。 热点·角度·拆解 热点角度01 基因工程的操作流程与表达载体构建及筛选应用 2025·黑吉辽蒙：限制酶选择、PCR 原理、目的基因检测鉴定、基因表达载体构建； 2024·黑吉辽蒙：DNA粗提取和鉴定实验及基因工程和蛋白质工程技术。 2023·辽宁：蛋白质工程技术，基因工程技术的基本步骤； 热点角度02 微生物工程与代谢调控及合成生物学应用 24-25高三上·吉林·月考：分离提纯葡萄皮上的野生酵母菌；微生物培养及技术过程。 25-26高三上·黑龙江哈尔滨·期末：本题目以黄皮甜米酒酿造为背景，结合流程图、实验数据折线图考查发酵工程原理。图片中两张折线图分别展示了不同酵母接种量对酒精度和还原糖含量的影响。 热点角度01 基因工程的操作流程与表达载体构建及筛选应用 析典例·建模型 1.（2025·黑吉辽蒙）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 研考点·通技法 限制酶选择策略： 解题步骤​ 核心分析要点与决策逻辑​ 关键知识依据与规范作答​ 1. 分析目的基因酶切位点​ 首先确认目的基因两端的限制酶切点分布情况​ • 完整性原则：选择切点位于目的基因两端的限制酶，避开基因内部的切点 • 优选双酶切：使用两种不同限制酶分别切割两端，避免单酶切导致的自身环化和反向连接 2. 分析质粒载体结构​ 检查质粒上的酶切位点分布与关键元件位置​ • 保护关键元件：确保酶切位点不破坏启动子、终止子、复制原点、标记基因 • 插入位置正确：保证目的基因能插入启动子与终止子之间的合适位置 3. 考虑同尾酶替换​ 当质粒无合适酶切位点时考虑同尾酶替代方案​ • 识别同尾酶：能产生相同黏性末端的不同限制酶（如BamHⅠ和BglⅡ） • 替换条件：质粒上无对应酶切位点或该位点不可用时，可用同尾酶替换 4. Ti质粒特殊要求​ 植物转基因工程中需考虑T-DNA区域限制​ • 必须插入T-DNA：农杆菌转化时，目的基因必须插入Ti质粒的T-DNA片段内 • 选择合适质粒：选择T-DNA区域有合适酶切位点的Ti质粒变体 解题流程图示 目的基因分析 → 质粒结构分析 → 同尾酶替换判断 → Ti质粒特殊要求 ↓ ↓ ↓ ↓ 保护基因完整 保护关键元件 末端兼容性 T-DNA内插入 双酶切优选 正确插入位置 解决位点冲突 农杆菌转化兼容 备考锦囊 1. 优先级别：基因完整性 > 质粒元件保护 > 双酶切 > 单酶切 2. 快速判断：看到"避免自身环化" → 立即选择双酶切方案 3. 特殊记忆：植物转基因必选T-DNA内有切位的Ti质粒 4. 易错提醒：同尾酶产生的末端可连接，但原酶切位点可能消失 破类题·提能力 1．（2026·辽宁抚顺·一模）条锈病是小麦的一种常见疾病，不仅会直接影响产量，更会对品质、种植成本甚至生态环境造成深远影响。科研人员从野生二粒小麦等近缘种中找到广谱抗病基因Yr15，并欲通过基因工程获得抗条锈病小麦。基因Yr15及质粒的结构如图所示，相关酶的识别序列及酶切位点如表所示。回答下列问题： 注：LB/RB为T-DNA的边界序列，为卡那霉素抗性基因。 (1)科研人员利用获得的基因Yr15的mRNA通过___________过程获得目的基因，并通过___________技术对目的基因进行扩增。 (2)已知不同平末端携带的化学基团不同，这导致平末端的连接具有特异性，需要由不同的DNA连接酶催化完成。为了将切割后的目的基因Yr15同质粒连接形成重组质粒，需要使用SmaⅠ和___________(填表格中限制酶)对质粒进行切割并将切割后的黏性末端补齐为平末端，不使用另外一种限制酶的原因是___________。若只使用SmaⅠ连接目的基因和质粒，则弊端是___________。 (3)据图可知，可将导入重组质粒的小麦组织细胞放入含___________的培养基中进行初步筛选，为了使愈伤组织朝着人为既定方向分化，通常可通过调整___________的含量来实现。 热点角度02 微生物工程与代谢调控及合成生物学应用 析典例·建模型 1.（25-26高三下·辽宁·开学考试）研究者利用蛋白质从头设计策略，合成并筛选能与胰岛素受体结合的胰岛素受体激动剂，如图所示。其中，荧光探针是被荧光标记的蛋白，在与靶蛋白结合后可发出荧光；Aga2蛋白与膜锚定，使目标蛋白展示在酵母表面。回答下列问题： (1)构建重组表达载体时，需先用限制酶NheI和BamHI分别切割_____，再用_____酶处理，形成重组质粒。切割后两者产生的_____末端可互补配对，避免质粒自身环化和_____。 (2)转化后的酵母菌先接种于CTUG培养基中增殖，再转移至SGCAA培养基中进行诱导表达，推测培养基CTUG和SGCAA成分的主要差异是_____。 (3)荧光探针Y（通常为荧光标记的胰岛素受体或其关键结构域）与目标蛋白结合，目的是筛选出_____。 (4)若将该实验中的酵母菌换成大肠杆菌（原核生物），则目标蛋白可能无法正常发挥作用，原因是大肠杆菌缺乏_____，不能对目标蛋白进行复杂的_____。 研考点·通技法 1.发酵工程的基本环节 基本环节 核心操作要点 菌种选育 筛选、诱变或通过基因工程获得性状优良的生产菌种 培养基配制 根据菌种需求，配制包含碳源、氮源、无机盐、水等的营养物质，并进行灭菌处理 灭菌 对培养基、发酵罐及所有管路、空气过滤系统进行严格灭菌，杜绝杂菌污染 扩大培养 将保存的菌种经活化后，逐级转移到种子罐中，以获得足够数量和活力的菌种 发酵过程 （中心环节） 将种子液接种至发酵罐，严格控制温度、pH、溶氧量、营养物质流加等条件，维持菌体生长和产物合成 分离提纯 发酵完成后，通过过滤/离心分离菌体，再采用沉淀、萃取、层析等方法获取并纯化目标产物 2.基因工程 vs. 蛋白质工程： 解题步骤​ 核心分析要点与决策逻辑​ 关键知识依据与规范作答​ 1. 审题定位，明确操作对象​ 仔细阅读题干，明确题目描述的技术操作是针对基因序列本身，还是针对蛋白质的功能与结构。​ 关注关键词： • 基因层面操作：如“切割”、“连接”、“载体构建”、“导入”。 • 蛋白质层面目标：如“改良蛋白质特性”、“设计新功能蛋白”。 2. 分析基因序列是否被“实质性改造”（核心判断标准）​ 判断对目的基因的操作是“照搬”天然序列，还是进行了“人工设计”的修改。​ • 基因工程：未改变编码序列。仅将天然的基因序列从生物体中“剪切”下来，或仅对其调控序列（如启动子）进行加工。 • 蛋白质工程：改变了编码序列。对编码蛋白质的序列进行了定点改造，如碱基的替换、增添或缺失，以改变蛋白质的氨基酸序列。 3. 分析最终产物的性质（辅助判断标准）​ 判断最终生产出的蛋白质是自然界已存在的，还是人工创造的新蛋白质。​ • 基因工程：生产的是天然蛋白质。例如，利用工程菌生产人的胰岛素，胰岛素本身是天然存在的。 • 蛋白质工程：生产的是非天然蛋白质或改造蛋白。其产物与天然蛋白质在结构、功能上存在差异，甚至是自然界中原本不存在的蛋白质。 4. 综合判断，得出结论​ 结合以上两个维度的分析，对技术类型做出最终判断。​ 决策逻辑： 1. 如果基因序列未被改造且产物是天然蛋白质​ → 基因工程。 2. 如果基因序列被定向改造，旨在获得新型蛋白质​ → 蛋白质工程。 备考与易错点提醒 1. 核心关系：蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。蛋白质工程的实施，最终必须通过改造基因来实现，因此它依赖于基因工程技术。 2. 快速判断题： · 看到“定向改造”、“优化性能”（如提高酶的热稳定性）、“设计新蛋白”等表述，优先考虑蛋白质工程。 · 看到“剪切目的基因”、“表达天然蛋白”等表述，优先考虑基因工程。 3. 易错点：不要因为操作过程复杂就误判为蛋白质工程。关键看编码蛋白质的基因序列是否被人工定向修改。 破类题·提能力 1．（2026高三上·吉林·月考）某研究小组分离提纯葡萄皮上的野生酵母菌时，选取了从自然界中采集到的葡萄，用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中进行培养。请回答下列问题： (1)该研究小组成功分离出某品种的酵母菌后，取等量菌液分别接种于3个盛有等量液体培养基的锥形瓶中,并分别置于转速为150 r/min、200 r/min、250 r/min的摇床上培养，检测结果如图1所示，摇床转速为250 r/min的酵母菌种群密度大的原因是____________。 (2)图2是采用血细胞计数板直接计数和稀释涂布平板法计数两种方法计数培养液中酵母菌数量时得到的结果，其中采用稀释涂布平板法计数得到的是曲线______，下列判断依据中正确的有______（填序号）。 ①稀释涂布平板法只计数活的酵母细胞，死细胞无法形成菌落 ②采用血细胞计数板直接计数时，可能会将死细胞与活细胞一起计数 ③采用稀释涂布平板法计数时，两个或多个细胞连在一起时，只能观察到一个菌落 ④采用稀释涂布平板法计数时，可能因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目 (3)通过如图3所示的方法进行纯化培养时，用移液枪取最终的酵母菌稀释液0.1mL滴在培养基表面，然后将沾有少量酒精的涂布器______后再进行涂布。在恒温培养箱中培养一段时间后，其中某组的3个平板上菌落数分别为69个、52个、44个，则可以推测原酵母菌液中每毫升含菌数为______个。计数一般要选取____________进行计数。 （建议用时：75分钟） 刷模拟 1．（2026·辽宁·一模）红富士是我国北方广泛栽培的苹果优良品种，但容易感染苹果轮纹病菌。研究人员发现一种扩展蛋白基因MdEXPA8与苹果果实细胞壁的扩展和生长发育密切相关。为探究MdEXPA8蛋白在苹果生长发育及抗病性中的作用，现以红富士苹果为实验材料，利用MdEXPA8基因以及超量表达启动子，构建超量表达载体，并最终获得转基因植株用于研究。回答下列问题： (1)从苹果细胞中提取mRNA，在______酶的作用下可获得互补DNA（cDNA）；mRNA 3′端的poly-A尾是由12～18个腺嘌呤核糖核苷酸重复组成，获得cDNA时需要向反应液中加入由12～18个连续的胸腺嘧啶脱氧核苷酸组成的短单链核酸，其功能是____________；随反应进行溶液中含量逐渐减少的物质有____________。 (2)建构超量表达载体时所用质粒的结构如图所示。获得的cDNA两端没有限制酶的切割位点，则在进行PCR扩增时，应该在上游和下游引物的______端分别添加______（填限制酶的名称）的识别序列；转化成功后欲用Bar（抗除草剂基因）筛选出可超量表达MdEXPA8蛋白的苹果植株，则应该将Bar基因插入图中载体的位点______（填“1处”或“2处”）。 (3)获得转化成功的苹果体细胞后，利用植物组织培养技术获得转基因植株，此过程中需要调整培养基中_______（填植物激素的名称）的浓度配比，以有效调控愈伤组织的形成及生芽或生根。 (4)研究结果表明MdEXPA8基因超表达的植株对轮纹病菌更敏感，结合MdEXPA8蛋白的作用，形成该结果的原因可能是__________。 2．（2026·辽宁·模拟预测）研究人员利用农杆菌转化法将大豆耐盐碱基因GsERF6导入水稻，构建重组表达载体（图甲），并对转化后的细胞进行目的基因检测（图乙）。回答下列问题： (1)利用农杆菌转化法时，将目的基因插入Ti质粒的_____上；需将含GsERF6基因的重组Ti质粒导入农杆菌，再让农杆菌侵染水稻细胞，最终使GsERF6基因进入水稻细胞并整合到水稻细胞的_____上。 (2)构建图甲所示的重组表达载体需要的酶是______，该表达载体中的强启动子的作用是________。新霉素抗性基因属于_____，其作用是________。 (3)对转化细菌进行目的基因检测时，常采用PCR技术，该技术需要_______（填一种酶）。结合图乙结果分析，转基因水稻DNA（泳道1）中_____（填“含有”或“不含有”）GsERF6基因，判断的依据是_______。 3．（2026·辽宁·三模）pdx1蛋白是决定胰岛形成的最为关键的蛋白质。为验证其作用，科研人员以斑马鱼为模式生物，先获得在胰岛细胞中特异性表达GFP（绿色荧光蛋白）的转基因斑马鱼（G品系），特异性敲除G品系的pdx1基因，获得N品系斑马鱼。研究过程如下： (1)利用PCR扩增GFP基因时，引物的作用是________，通过______方法检测扩增产物。 (2)构建基因表达载体时，需先将______的启动子与GFP基因相连，再与质粒相连，该步骤的目的是使GFP基因能够在斑马鱼的细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，且在______细胞中特异性表达。 (3)将构建好的重组质粒通过______法导入斑马鱼的______中，然后再通过早期胚胎培养等技术获得转基因斑马鱼G品系。 (4)为鉴定GFP基因插入的位置，针对插入位点的上下游设计了引物1、2，针对GFP基因自身序列设计了引物3、4，各引物的位置如图1所示。将G品系斑马鱼相互交配，提取不同子代个体的DNA用引物1、2进行PCR并电泳，结果如图2所示，加样孔______（填编号）对应的个体是纯合G品系斑马鱼。若改用引物3、4进行PCR并电泳，结果如图3所示，加样孔______（填编号）对应的个体是纯合野生型斑马鱼。 (5)CRISPR-Cas9技术能特异性敲除基因。先制备针对pdx1基因的CRISPR-Cas9体系，然后导入G品系斑马鱼。若筛选获得了1个pdx1突变品系（N），经测序得到了如图4所示的序列（图中“—”表示缺失1个碱基）。请预计突变品系N的pdx1蛋白含______个氨基酸（已知密码子：CCU—脯氨酸；UAA、UGA和UAG为终止密码子）。 (6)目前科学家们通过蛋白质工程还制造出了蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是______（选填序号）。 ①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸 ②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列 ③表达出蓝色荧光蛋白 ④蓝色荧光蛋白基因的修饰（合成） 4．（2026·甘肃天水·二模）在培育转基因抗虫作物过程中,单一抗虫基因会引起害虫抗药性问题。为提高作物的抗虫性,研究人员提取苏云金芽孢杆菌的抗虫蛋白基因Cry1A．301和Vip3A进行融合,培育抗虫作物,其具体过程如图。回答下列问题: (1)①过程需要使用___________酶。引物P2和引物P3之间碱基序列的特点是必须有_________（填“相同”或“互补”）片段。经图中PCR1过程获得产物1至少需要经过__________次扩增循环。 (2)重组质粒中启动子是_________,可驱动目的基因的转录。除图示信息外,重组质粒中还应该有___________。为使②过程中融合基因能按正确方向插入质粒,需在引物P1的__________端加上限制酶________的识别序列。②过程需用到的工具酶,除限制酶外,还有_____________。 (3)通过酶切法和电泳对重组质粒进行鉴定,结果如图所示。泳道1、2分别是用NcoⅠ切割质粒和重组质粒的结果。若已知融合基因已整合到质粒上,请在图中泳道3绘制出用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒所得的电泳结果_______。（质粒上NcoⅠ和XhoⅠ识别位点间隔较近,长度可忽略不计） (4)将重组质粒转入农杆菌后,应将该农杆菌置于含_______的培养基中培养,从而筛选出含重组质粒的农杆菌。为检测Cry1A．301-Vip3A融合蛋白抗虫的效果,还需进行个体水平检测,请简述实验思路:__________。 5．（2026·辽宁·模拟预测）N蛋白是牛冠状病毒（BCoV）蛋白中表达量最高的蛋白，它可以诱导机体产生抗病毒免疫应答，因此是早期快速诊断、疫苗研发的关键候选蛋白。为制备抗N蛋白的单克隆抗体，科研人员完成了以下过程。回答下列问题： 注：图中限制酶的识别序列和切割位点为：BamHⅠ：，EcoRⅠ：，SalⅠ：。 (1)根据BCoV扩增的全基因组毒株提取的RNA________出的DNA为模板，以该DNA为模板通过PCR扩增合成目的片段，PCR中添加引物的作用是________。 (2)制备引物时需在引物A和B的________端分别添加________（填限制酶）的识别序列，该片段扩增4次循环，需要消耗引物________个。已知N蛋白基因非模板链的碱基序列为，写出N蛋白基因上游引物的12个碱基序列：________。 (3)琼脂糖凝胶电泳是用来鉴定PCR产物的常用方法。下列说法正确的有________。 A．配制的琼脂糖溶液浓度较高时，大分子DNA片段不易分离 B．若电泳出现多种条带，可能是因为引物过短 C．凝胶中加入核酸染料便于观察PCR产物的电泳结果，电泳缓冲液应没过凝胶 D．两条泳道中电泳条带的位置相同，则两个加样孔内加入的样品相同 (4)过程②将目的基因导入骨髓瘤细胞的方法是________，过程③中利用选择培养基筛选时，________细胞都会死亡。 (5)图中过程④可通过体内（或体外）培养获得大量抗N蛋白单克隆抗体。与传统的从血浆中提取的抗体相比，抗N蛋白单克隆抗体的优点是________。 6．（2026·黑龙江吉林·二模）抗体是由两条完全相同的重链（H链）和两条完全相同的轻链（L链）连接而成的，两种链近N端可变区（V区），识别结合抗原，近C端是恒定区（C区），结构如图1所示。人表皮生长因子受体-2（HER2）基因和表皮生长因子受体（EGFR）基因是重要的癌基因，在多种肿瘤中共表达，且互相作为旁路耐药通路，大大影响了传统抗体-药物偶联物（ADC）疗法的治疗效果。为了解决这一问题，科研人员构建了双特异性抗体偶联药物（BsADC），同时靶向肿瘤细胞表面HER2和EGFR，实现了对传统ADC疗法的升级。 (1)利用双杂交瘤融合法制备双特异性抗体（如图2）。以传统的单克隆抗体技术制备分别能产生HER2抗体和EGFR抗体的杂交瘤细胞，再将两种杂交瘤细胞融合，需对融合细胞进行_______和抗体检测，与抗原_______出现阳性反应的即为目标细胞。但是此技术制备出的双特异性抗体仍具有较大的随机性，原因是_______。 (2)利用蛋白质工程技术制备双特异性抗体：将HER2抗体和EGFR抗体的轻链与重链可变区DNA序列，通过重叠延伸PCR技术连接在一起，如图3。 根据图4所示的重叠延伸PCR技术原理，为实现DNA片段的精准融合，引物P2的5＇端需要与引物P3的_______端（填“5＇”或“3＇”）序列_______（填“相同”或“互补”）。按照上述原理合成图3所示重组DNA需要设计_______种引物。将融合序列与质粒连接，导入酵母菌获得纯度较高、装配正确的双特异性单链抗体。与大肠杆菌相比，酵母菌作为受体细胞的优势是_______。还需要根据酵母菌偏好的密码子对融合序列进行优化，目的是_______。 (3)HER2与EGFR在多种肿瘤组织中分布不均匀，单靶点治疗可能因无法有效清除低表达靶点的肿瘤细胞，从而诱导适应性耐药及疾病复发。ADC由抗体、接头、药物所组成，其中的“药物”可以是_______、化学药物或放射性物质。与只使用一种单克隆抗体构建的ADC相比，利用HER2-EGFR双抗构建的BsADC的优势在于_______（答出一点即可）。 7．（2026·吉林·模拟预测）吉林省是东北亚重要的陆路口岸，近几年出现了输入性疟疾病例。疟原虫感染人体后，疟原虫的pfcrt基因编码的蛋白第76位氨基酸（赖氨酸→苏氨酸）的突变会使疟原虫获得对氯喹的抗药性。为快速筛查氯喹抗性疟原虫，研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1、R2四种备选引物（见图甲），用于扩增目的片段。以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示，再将获得的产物用限制酶Dra Ⅰ（识别序列为5＇-AAATTT-3＇）处理。回答下列问题： (1)PCR扩增pfcrt基因时，因参与合成反应，不断消耗而浓度下降的组分有_________。 (2)根据图甲和图乙信息，若要特异性扩增出包含完整Dra Ⅰ酶切位点区域的目的片段，应选择的引物组合是________。据图可以判断泳道2（F1-R2组合）的条带长度________（填“长于”或“短于”）泳道1（F1-R1组合）。导致两条带在电泳中迁移速率不同的直接原因是_______。 (3)已知敏感型pfcrt基因序列中Dra Ⅰ酶识别位点处编码赖氨酸的密码子为AAA，而抗性型突变后此处变为ACA（编码苏氨酸）。据此判断，Dra Ⅰ酶能切割________（填“敏感型”或“抗性型”）基因的PCR产物，原因是__________。 (4)在进行电泳鉴定实验时，将配制的琼脂糖溶液在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后加入适量的________混匀。 8．（25-26高三下·吉林长春·期末）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有_____。 (2)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_____。 (3)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_____（多选题）。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (4)质粒含有2个EcoR Ⅰ、1个Sac Ⅰ和1个BamH Ⅰ的限制酶切割位点。已知BamH Ⅰ位点位于2个EcoR Ⅰ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。泳道③可能是_____的单酶切产物（单酶切产生2个片段大小相同）。 (5)对于电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是_____。 9．（2026·吉林延边·一模）淀粉经淀粉酶催化水解后的产物是重要的工业原料，但工业化生产常需要在高温条件下进行，而现有的淀粉酶耐热性不强。科研人员利用蛋白质工程设计并人工合成了耐热性强的淀粉酶AmyS2基因，将其导入芽孢杆菌，过程如图1所示。回答下列问题。 (1)科研人员发现将淀粉酶（AmyS1）第27位的亮氨酸替换为天冬氨酸后，能产生耐热性高的淀粉酶（AmyS2），其研究基本思路如下：预期AmyS2功能→设计目标蛋白的结构→________→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）→将获得的基因导入芽孢杆菌生产AmyS2，要替换蛋白质基因中相对应的碱基可以采用________法。 (2)根据图2分析，利用PCR技术扩增AmyS2基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的________。若将1个基因扩增4次，共需要引物________个。 (3)将AmyS2基因与原始质粒A构建成质粒B，应选择的限制酶是________；将质粒B与信号肽基因构建成质粒C，应选择的限制酶是________。 (4)信号肽是一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链。据此推测，与质粒B相比，在工业生产中使用导入质粒C的工程菌生产α-淀粉酶的优势是________，从发酵液中可采取适当的________措施来获得产品。 10．（25-26高三上·吉林长春·期末）为利用拟南芥合成原人参二醇，需将原人参二醇合成途径中三个关键酶的基因DS、PPDS、CYP450作为目的基因导入拟南芥，所用Ti质粒如图1所示，图中每段阴影为一个功能序列，其中bar为抗草甘膦（一种除草剂）基因，TetR为四环素抗性基因，AmpR为氨苄青霉素抗性基因。BamHI、SmaI、BclI为限制酶切割位点。 (1)传统构建基因表达载体的方法为先用限制酶切割质粒和含目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶进行连接。利用图1Ti质粒构建重组质粒时，目的基因上游和下游应分别具有限制酶______的切割序列。进行转化操作后的农杆菌中存在转入重组Ti质粒的农杆菌、转入空Ti质粒的农杆菌和未转入任何质粒的农杆菌，需利用标记基因______筛选出转化成功的农杆菌。在对转基因拟南芥进行个体生物学水平鉴定时，需利用的标记基因是______。 (2)为更好的构建含DS、PPDS、CYP450基因的重组Ti质粒，科研人员采用了In-Fusion技术，如图2所示。 In-Fusion技术的关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常为15-20bp），然后用In-Fusion酶处理即可实现无缝连接。In-Fusion酶是一种混合酶制剂，既能从任何线性DNA链的5’末端逐个切割下16个脱氧核苷酸，形成黏性末端，也能将具有互补黏性末端的DNA片段进行连接。 ①在对目的基因进行PCR扩增时，除图示物质外，反应体系中还需要添加4种脱氧核苷酸、______和_______，扩增第______个循环开始出现目标产物。 ②设计引物1、引物2需要依据_______的碱基序列，设计引物A、引物B需要依据_______的碱基序列。 ③同源序列1和同源序列2通常采用不同的核苷酸序列，这样设计的优点是_______。 (3)与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion多片段重组技术的优势有_______（至少答出1点）。 11．（25-26高三上·内蒙古呼和浩特·期末）大豆Y基因表达的蛋白可通过结合S基因的启动子调控其表达，进而影响大豆对干旱和盐胁迫的抗性。科研人员利用PCR技术扩增Y基因，并构建Y-GFP融合基因表达载体，用其转化大豆细胞研究Y基因的功能。请回答下列问题： (1)利用PCR技术扩增Y基因时，反应体系中需加入______，还需添加耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）和引物；PCR的______阶段，引物会与Y基因的模板链互补结合，该阶段的温度一般为50℃左右。 (2)下图所示Y基因单链（部分）为转录的______（填“模板链”或“非模板链”）。为构建Y-GFP融合基因，需先通过PCR技术剔除Y基因终止密码子对应的碱基序列，再与绿色荧光蛋白基因（GFP）进行拼接。已知EcoRI识别序列为5'-GAATTC-3'，BamHI识别序列为5'-GGATCC-3'，为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP融合蛋白，Y基因下游扩增引物应为5'-______……-3'（包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基）。 (3)将构建的融合基因表达载体导入大豆愈伤组织细胞后，需在含______的培养基上筛选出成功转化的细胞，并进行______信号检测。此外还需从目标细胞中提取蛋白质进行______，检测目的基因是否成功表达。 (4)研究发现过表达Y基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性，S基因是大豆类固醇化合物合成的关键基因，结合题干信息分析，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是______。 12．（2026·吉林长春·一模）斜纹夜蛾是危害大豆的主要害虫，该害虫体内的几丁质酶基因（Cht）表达产物能帮助其降解植物细胞壁，从而利于幼虫取食。某科研团队计划通过基因工程结合基因编辑技术，培育一种具有特定抗虫能力的大豆新品种，设计思路如下： ①将Cht基因的启动子（负责响应害虫取食信号）与一种毒蛋白基因（Tox）连接，构建重组载体，并导入大豆细胞。当斜纹夜蛾取食造成植物损伤时，伤口部位分泌的茉莉酸（一种植物信号分子）能诱导该启动子驱动Tox基因表达，产生毒蛋白杀死害虫。 ②利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，敲除或修饰大豆自身的JAZ基因（该基因能抑制茉莉酸信号通路），以增强植株对茉莉酸信号的感知和响应效率，从而提升抗虫效果。 回答下列问题： (1)基因工程的核心步骤是_____。该步骤中，需用_______酶识别并分别切割Cht基因的启动子和Tox基因，使二者产生相同的黏性末端，再用_______酶连接形成融合基因。 (2)茉莉酸诱导Tox基因表达的机制是：茉莉酸与大豆细胞内的受体蛋白结合形成复合物，该复合物与________基因启动子上游的特定响应元件结合，进而启动Tox基因的转录。该设计的优点是____，从而减少对大豆自身代谢的消耗，并降低对非靶标生物的影响。 (3)若要检测Tox基因是否能在茉莉酸诱导下成功表达，可采用________技术检测大豆细胞中是否存在Tox毒蛋白。 (4)利用CRISPR/Cas9编辑JAZ基因后，大豆的抗虫效果显著提升，原因是_______。 (5)与直接喷洒化学杀虫剂相比，该基因工程结合基因编辑的抗虫技术的优势是_______。 13．（25-26高三上·吉林·阶段练习）动物器官移植到人体内（异种移植）或是解决全球器官紧缺的办法之一。研究团队对猪肾内皮细胞进行基因编辑、改造后，得到了3种工程细胞和可提供异种移植肾源的供体猪。具体流程及部分测量数据如图示。 (1)研究证实供体猪的3个聚糖抗原基因（3KO）会引致人类、猴等受体的组织不相容。若以未经改造的猪肾作为异体肾源进行器官移植，受体动物的______________细胞和抗体都有可能对供体器官产生特异性攻击效应，导致出现______________现象。利用CRISPR-Cas9编辑技术敲除肾内皮细胞的3KO，该技术需人工设计一种“向导”RNA，其部分序列与3KO的结合遵循________原则，并引导Cas9蛋白断裂DNA双链，从而敲除3KO。 (2)研究表明7个人类基因（7TG）可增加不同物种之间的兼容性。获取7TG的方法有______（答出一种即可）。 (3)为验证敲除3KO、插入7TG对异体细胞的保护作用，研究者将三组细胞与受体猴血清共孵育，置于CO2培养箱中培养，测量裂解细胞数如图b所示。据此得出结论_______。 (4)供体猪器官常携带多种病毒，其中部分病毒潜在人畜传播风险。例如，已有实验证明PERV（猪内源性逆转录病毒）可以整合到体外培养的人类细胞基因组中。试分析若给人进行异种移植，PERV的基因可能通过供体猪器官整合到人类基因组的途径是_________。因此，为确保安全，对已构建好的3KO。7TG。细胞需要进行灭活PERV处理，且在临床试行前须在动物模型中测试。 (5)利用3KO、7TG、RI细胞通过过程④构建供体猪所利用的现代生物学技术有________（答出两种）。 14．（25-26高三上·吉林松原·开学考试）为保护濒危植物普陀鹅耳枥（2n=16）并改良其生长特性，科研人员尝试将其与同属近缘物种天台鹅耳枥（4n=32）进行体细胞杂交。已知普陀鹅耳枥具有抗虫基因A，但生长缓慢；天台鹅耳枥生长迅速且耐寒，但不抗虫。如图表示体细胞杂交过程，回答下列问题: (1)a过程获得原生质体所用的酶是________，该过程中发现普陀鹅耳枥的原生质体大量破裂，推测原生质体破裂的可能原因有________。 (2)过程b中可采用化学试剂________促使原生质体相互融合，成功融合的杂种细胞含________个染色体组。杂种细胞形成的标志是________。 (3)成功培育的杂种植株（不考虑同种融合的植株）出现三种表型：①抗虫但生长缓慢 ②不抗虫但生长迅速 ③抗虫且生长迅速但不耐寒。从细胞分裂角度分析，表型①和②的出现可能与______过程异常有关，从基因表达调控的角度分析，表型③中耐寒性状缺失的原因可能是______。 15．（2026·黑龙江哈尔滨·一模）单个B细胞抗体制备技术是近年来发展的快速制备单克隆抗体的新技术。该技术利用“一个B细胞只含有一个功能性重链可变区DNA序列和一个轻链可变区DNA序列，且只产生一种特异性抗体”的特点，从免疫动物脾组织或外周血中分离出抗原特异性B细胞，可通过单细胞PCR技术从单个B细胞中扩增IgG重链和轻链可变区基因，再将其导入哺乳动物细胞中表达，最终获得具有生物活性的单克隆抗体。兔单抗以其高亲和力和多样性在基础研究和药物研发中颇受青睐。请结合下图回答问题： (1)对兔多次使用同种抗原进行刺激的目的是_______。 (2)抗原特异性B细胞磁场分离技术核心步骤是：制备混合细胞悬液，目标抗原直接偶联磁珠，再放入磁场，利用抗原与B细胞表面_________特异性结合的原理分离目标细胞，实现目标细胞富集。然后利用动物细胞培养技术对单B细胞进行_________，通过_______进行筛选。 (3)借助融合PCR技术整合抗体轻链和重链基因，图2过程设计的P2和P3引物的添加序列必须能够发生_______。融合PCR步骤1中，至少进行_________次循环才能获得基因重链基因的PCR产物。若要对重链、轻链融合基因继续进行PCR扩增，则图2中的M、N处位置所需要的引物分别是_________。 (4)图3中电泳图中_________号条带最可能表示融合后片段，若PCR没有扩增出任何产物，则可能的原因是________（至少两点）。 (5)由图1和图4判断，构建重组基因表达载体，为保证目的基因的插入部位位于EF1A启动子与SV40 late pA之间的表达框内（在Kozak序列之后），切割质粒时不宜使用的限制酶是________。此外，不宜同时选用酶SpeI和XbaI，原因是__________。 16．（2026·黑龙江哈尔滨·一模）CRISPR/Cas系统是目前最高效的基因组编辑工具之一。CRISPR-Cas9包含两种核心组分：一是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，二是具有导向功能的sgRNA。sgRNA上的支架序列可结合Cas9蛋白，sgRNA5'端的20个碱基可与目标DNA碱基配对，引导Cas9靶向切割DNA（图1）。 利用该技术敲除小鼠胚胎干细胞的目标DNA序列，操作步骤如下。请回答下列问题： 第一步：设计sgRNA5'端序列 5'-GUCACUCUCAUAUAGAGAUC-3'（20个碱基） (1)第二步：构建重组DNA 载体LentiCRISPRv2（图2）上含有限制酶BsmBI的识别序列（N代表任意一种碱基）： 5'-CGTCTCN↓-3' 3'-GCAGAGNNNNN↑-5' ①载体LentiCRISPRv2上的一段序列（包含两个BsmBI的识别序列）为： 5'-ACACCG  GAGACG  GTTGTA……TTTGTA   CGTCTC  TGTTTT-3' 3'-TGTGGC  CTCTGC   CAACAT……AAACAT  GCAGAG  ACAAAA-5' 请在上述序列中用“↓”“↑”标出BsmBI的酶切位点_____。 ②根据sgRNA5'端序列，设计两端带有黏性末端的双链sgDNA，以便直接连接到限制酶BsmBI酶切后的载体上。若其中一条链为5'-CACCGTCACTCTCATATAGAGATC-3'，则另外一条链的序列为_____。 A．5'-AAACGATCTCTATATGAGAGTGAC-3' B．5'-CAGTGAGAGTATATCTCTAGCAAA-3' C．5'-CACCGATCTCTATATGAGAGTGAC-3' (2)第三步：转化与筛选 重组DNA导入小鼠胚胎干细胞前，需先在大肠杆菌中进行扩增。将构建好的重组DNA转入处于_______的生理状态的大肠杆菌，用含________的培养基筛选含重组DNA的大肠杆菌，再通过测序确定sgDNA是否正确连接到载体上。 (3)第四步：导入与编辑 将扩增后的重组DNA通过一定的技术导入小鼠胚胎干细胞。sgRNA5'端的20个碱基序列用来识别结合______，载体LentiCRISPRv2上还含有_______序列，该序列的转录产物可以与载体相应序列表达的Cas9蛋白组装成CRISPR/Cas系统，定点切割DNA双链。在功能上，Cas9蛋白属于_________酶。 (4)Cas9切割DNA后，基因编辑的完成依赖于细胞自身的修复机制，可不依赖任何模板，直接将断裂的DNA末端连接起来。这一过程常会导致多个碱基的插入或缺失，造成目标DNA序列发生_______，从而实现目标DNA序列敲除的效果。 17．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨·期末）甜米酒是我国的传统酒种，某酿酒厂以无核黄皮果（富含维生素、有机酸及特殊的香味）为辅料研制出黄皮甜米酒，该酒具有消食、润肺和清热解毒等功效。制作黄皮甜米酒的工艺流程如下图所示。回答下列问题： (1)图中甜酒曲的主要作用是_______________。 (2)与传统发酵相比，现代发酵工程具有很多的优势，其基本环节一般包括菌种选育，扩大培养，培养基配制，灭菌，__________，发酵，产品的____________________等。 (3)我国的酿酒技术历史悠久，古人在实际生产中积累了很多经验。《齐民要术》记载：“世人云：米过酒甜，此乃不解法候。酒冷沸止，米有不消者，便是曲势尽。”下列有关叙述错误的是____。（单选） A．“米过酒甜”是因为米中糖类物质过量，发酵停止时仍未被完全消耗 B．“酒冷沸止”说明微生物的代谢产热和释放CO2逐渐停止 C．“曲势尽”的原因可能是米酒中pH或酒精含量升高 D．酿制米酒所用的主要微生物，其代谢类型为异养兼性厌氧 (4)对酒曲微生物进行分离纯化时，配制培养基的成分为蛋白胨、酵母提取物、NaCl、水，其中蛋白胨能为细菌提供的主要营养是碳源、_________________。 (5)在制作黄皮甜米酒的过程中，为确定黄酒高活性干酵母（YWBY）的添加量及发酵时间，研究人员进行了相关实验，实验结果如下图所示。根据实验结果制作黄皮甜米酒时，YWBY的最佳接种量及主发酵时间分别是_________________。YWBY接种量为0.12%时，酒精含量最低的原因可能是________________。 18．（2026·内蒙古乌海·模拟预测）香菇是具有丰富营养价值和药用价值的食用真菌，被称作“山珍之王”。研究人员发现香菇体内的Lp-11蛋白具有抑制肿瘤细胞生长并诱导细胞凋亡的作用。为了获得大量纯净的Lp-11蛋白，研究人员操作流程如图1，序号①-④表示各个环节。回答下列问题： 注：pET32a质粒上的KanR中沿转录方向标注的5个限制酶的酶切位点之间的距离依次为40bp、30bp、90bp、50bp，bp表示碱基对。 (1)图1过程①需要在______酶的作用下进行。①②过程获取的目的基因不含______（答出2点）。 (2)为使目的基因与pET32a质粒（长度为5900bp）正确连接，在设计PCR引物时可将引物的______（3'或5'）端添加限制酶的识别序列，与a链和b链相结合的引物上添加的分别是限制酶______、______的识别序列。若计划用1个Lp-11基因为模板获得n个Lp-11基因，则PCR过程中消耗的引物总量是______个。 (3)图1的④过程，通常先用______将受体细胞处理成感受态，此时细胞的特点是______。受体菌应筛选出______（填“具有”或“不具有”）氨苄青霉素抗性的大肠杆菌。 (4)为了检测目的基因是否插入到pET32a质粒中，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图2。样品______最可能是插入了目的基因的重组质粒。 19．（2026·内蒙古呼和浩特·一模）腺相关病毒（AAV）是一种单链DNA缺陷型非包膜病毒，是临床基因治疗广泛使用的载体。Otof基因（6kb）编码R蛋白，突变可导致常见先天性耳聋。中外科研人员利用AAV双载体系统递送人源正常Otof基因，通过基因工程技术治疗先天性耳聋取得显著疗效。请分析回答： (1)体外可利用________技术扩增Otof基因，通过大容量载体将此目的基因导入受体细胞的缺点是感染率和成活率低。 (2)Otof基因和AAV基因组如图1、图2所示，单个AAV能运载的最大目的基因仅为4.7kb．若“↓”为可选择的酶切位点，则图1需要将Otof基因拆分为大小分别为________的5′-Otof和Otof-3′片段，分别装入AAV载体形成AAV重组载体1和2（图3）。此外，为确保两段基因在细胞内表达，重组载体中需包括启动子和________等序列。 (3)重组载体1和2共感染同一受体细胞后复制形成双链，随后重组载体2表达Cre酶切割重组载体1和2中的lox位点，产生黏性末端，实现两段DNA精准对接。若重组载体1中lox序列如图4，则重组载体2的lox序列可否为图5所示序列，请说明理由________。 (4)为了使R蛋白基因只在特定细胞中表达，重组载体1应选择________（填器官名称）部细胞中特异性表达基因的启动子。为减少Cre酶对受体细胞的其他影响，重组载体2的启动子应选择________（填“强”或者“弱）启动子。 (5)若要从个体水平检测Otof基因是否表达并发挥作用，临床上通常先通过动物进行实验，可选取Otof基因敲除小鼠模型，实验组静脉注射AAV双载体，对________（答出一种即可）进行检测，以确定Otof基因在受体细胞中重组并表达。 20．（2026·内蒙古鄂尔多斯·一模）细菌治疗肿瘤是将特定细菌注入机体后，细菌趋向并聚集于肿瘤组织，通过刺激机体产生特异性免疫反应，进而实现清除肿瘤组织的治疗方法。科研人员欲构建一种在激光照射下，可将光能高效转化为热能，诱导Noxa基因表达的工程菌。其中Noxa是一种具有强烈诱导细胞凋亡能力的蛋白质，ClyA是可以展示在细胞膜表面的蛋白质，图为相关基因表达载体的构建过程。回答下列问题。 注：Tcl为温控基因，其控制合成的蛋白质在37℃时能抑制温度诱导型启动子的活性，在42℃时该蛋白质失活。 (1)PCR扩增目的基因：PCR技术中，引物的作用是使DNA聚合酶能从引物的________端开始连接脱氧核苷酸。若2链和4链为基因转录的模板链，则引物________有互补区段，重叠产物1中的两条链是________（从“1链”“2链”“3链”“4链”中选填），其延伸过程不需要引物的原因是____________________________。 (2)制备温度响应型细菌：用EcoRⅠ和SalⅠ对pBV220载体和ClyA-Noxa融合基因片段分别进行双酶切，用________将酶切后的载体和融合基因片段连接，将基因表达载体导入大肠杆菌，并涂布于含________的全营养LB固体培养基中筛选。 (3)目的基因的检测与鉴定：挑取上述培养基中的单菌落，接种后分别置于温度为________的培养箱中培养，一段时间后检测，若________，且表达产物既能展示在细胞表面且具有强促凋亡活性，则温度响应型细菌构建成功。 (4)温度诱导型启动子是该工程菌的重要元件，若其持续活跃，可能带来的风险是__________________。 21．（25-26高三上·内蒙古锡林郭勒·期末）水稻种子主要包括胚和胚乳，其中胚乳被加工成精米食用。为培育在胚乳中不含外源基因的安全转基因水稻，某研究团队设计了一种新策略，思路如下：导入：通过农杆菌转化法将含双T-DNA单质粒导入水稻细胞，并整合至染色体中。单质粒部分结构示意图如下，其中T-DNA1与T-DNA2是两个相对独立的区域。 注：①位于同一质粒且物理距离极短的T-DNA1和T-DNA2，常以大片段形式一同插入染色体DNA某一位点； ②LB和RB分别为T-DNA的左右边界序列； ③“→”和“←”代表相关序列PCR扩增时所需引物，其中“→a”和“b←”为边界序列引物； ④P1~P4为启动子。潮霉素抗性基因（hpt）为标记基因；报告基因gus的染色检测（催化无色底物X-Gluc产生蓝色沉淀）会杀死细胞，无法用于初筛。 初筛：利用T-DNA2中标记基因hpt高效筛选成功吸收外源DNA的活细胞。 复筛：利用gus作为抗虫基因的“替身”，能直观、准确反映抗虫基因在胚乳中的特异性删除情况，其效果远优于抗虫基因繁琐的生物测定。 删除：Cre基因编码的Cre酶可特异性识别同一DNA中两个loxP位点并删除两位点之间的序列。 回答以下问题： (1)初筛时，需向培养液中加入______，从而筛选出成功吸收外源DNA的活细胞；删除时用到的Cre酶与基因工程中的______（工具酶）作用类似。 (2)为初步分析双T-DNA在水稻染色体上的整合情况，研究者进行了两类PCR检测： ①提取______，并以此作为模板，利用引物hpt1/hpt2和gusA/gusB分别进行PCR，目的是检测______。 ②使用边界序列引物“→a”和“b←”进行PCR，若结果为阴性（不能扩增出相关序列条带），则T-DNA1和T-DNA2极有可能整合到_______（填“同一条”或“不同”）染色体上（不考虑两者相互破坏的情况）。 (3)研究人员种植了共转化成功的T0代株系，并对其自交后代T1植株进行表型分析，相关统计结果如下表所示（不考虑减数分裂时染色体互换、突变）。 T0代株系编号 T1代总株树 T1代表型 gus+/hpt+ gus+/hpt- gus-/hpt+ gus-/hpt- GH1-1 30 16 6 6 2 GH1-45 42 30 0 0 12 （gus+和gus-分别表示有、无gus蓝色反应，hpt+和hpt-分别表示有、无潮霉素抗性） 表中T0代编号为_______的株系中的双T-DNA整合到非同源染色体上，且每种T-DNA最有可能是_______（填“单”或“多”）次整合；表中T1代植株表型为_______的即为目标植株，其种子的胚乳进行gus染色检测未出现蓝色反应，这依赖于组织特异性启动子______。（填“P1”“P2”“P3”或“P4”） 22．（25-26高三上·内蒙古乌兰察布·月考）图2表示苹果醋的简易制作装置和制作流程。发酵工程在医药上的应用非常广泛，其中青霉素的发现和产业化生产进一步推动了发酵工程在医药领域的应用和发展。产黄青霉菌是一种广泛存在于自然界中的霉菌，是生产青霉素的重要工业菌种。工业上生产青霉素的发酵工程流程如图1所示，据图回答下列问题： (1)用图2装置酿酒结束后，若要直接转入果醋发酵，改变的环境条件是___________。 (2)图1整个发酵过程的中心环节是___________。在制备该培养基时，除了添加必要的营养成分外，还需要将pH在灭菌___________(填“前”或“后”)调至酸性。在青霉素生产过程中___________都必须经过严格的灭菌。 (3)欲从土壤中分离出能产生纤维素酶的纤维素分解菌，若将样品接种到分离纤维素分解菌的培养基上，在该培养基中需要加入的特殊染料是___________，通过观察是否产生___________来筛选纤维素分解菌。 (4)对产黄青霉菌进行分离纯化并计数采用了___________法，其可以用来计数的原理为___________。为了避免混淆，本实验纯化菌种时使用的平板需要在培养皿的___________(“皿盖”或“皿底”)做好标记。然后在恒温培养箱中需培养1-2d，每隔24h统计一次菌落数目，选择菌落数目稳定时的记录作为结果，其目的是___________。 刷真题 1.（2024·黑吉辽）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 （1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。 （2）本操作中获取目的基因的方法是______和______。 （3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。 （4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 （5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。 （6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B. 将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C. 将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D. 用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 2.（2023·辽宁）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题： （1）上述过程属于_____工程。 （2）PCR中使用的聚合酶属于_____（填写编号）。 ①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的RNA聚合酶 ③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的DNA聚合酶 （3）某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是_____（填写编号）。 （4）为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和_____。 （5）目的基因（不含EcoRI酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I位点。用EcoR I酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是_____。正确连接的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为_____kb。 （6）采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过_____反应获得PCR的模板。 3．（2025·江苏·高考真题）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题： (1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有 。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有 。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺 获得更多机会。 (2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成 关系。 (3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取① ，加入乙醇 ② 在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③ 、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR (4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基 。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是 。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有 。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用 的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。 注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200个碱基 (5)依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有 （填字母）。 a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流     b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物 c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量     d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量 4．（2025·湖南·高考真题）未成熟豌豆豆荚的绿色和黄色是一对相对性状，科研人员揭示了该相对性状的部分遗传机制。回答下列问题： (1)纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，只有一种表型。自交得到的中，绿色和黄色豆荚植株数量分别为297株和105株，则显性性状为 。 (2)进一步分析发现：相对于绿色豆荚植株，黄色豆荚植株中基因H（编码叶绿素合成酶）的上游缺失非编码序列G。为探究G和下游H的关系，研究人员拟将某绿色豆荚植株的基因H突变为h（突变位点如图a所示，h编码的蛋白无功能），然后将获得的Hh植株与黄色豆荚植株杂交，思路如图a： ①为筛选Hh植株，根据突变位点两侧序列设计一对引物提取待测植株的DNA进行PCR。若扩增产物电泳结果全为预测的1125bp，则基因H可能未发生突变，或发生了碱基对的 ；若H的扩增产物能被酶切为699bp和426bp的片段，而h的酶切位点丧失，则图b（扩增产物酶切后电泳结果）中的 （填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”）对应的是Hh植株。 ②若图a的中绿色豆荚：黄色豆荚=1：1，则中黄色豆荚植株的基因型为 [书写以图a中亲本黄色豆荚植株的基因型（△G+H）/（△G+H）为例，其中“△G”表示缺失G]。据此推测中黄色豆荚植株产生的遗传分子机制是 。 ③若图a的中两种基因型植株的数量无差异，但豆荚全为绿色，则说明 。 5．（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为 。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加 （填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成 键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为 ，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量 ，则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是 。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是 。 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是 和 。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 6．（2025·湖北·高考真题）某种昆虫病毒的遗传物质为双链环状DNA．该病毒具有包膜结构，包膜上的蛋白A与宿主细胞膜上的受体结合后，两者的膜发生融合，从而使病毒DNA进入细胞内进行自我复制。回答下列问题： (1)要清楚观察病毒的形态结构需要使用的显微镜类型是 。 (2)体外培养的梭形昆虫细胞，被上述病毒感染后会转变为圆球形，原因是病毒感染引起了昆虫细胞内 （填细胞结构名称）的改变。 (3)这类病毒的基因组中通常含有抗细胞凋亡的基因，这类基因对病毒的生物学意义是： 。 (4)该病毒DNA能在宿主细胞中自我复制，却无法在大肠杆菌中复制。为解决这一问题，可在该病毒的DNA中插入 序列，以实现利用大肠杆菌扩增该病毒DNA的目的。 (5)用该病毒感染哺乳动物细胞，可以在细胞内检测到该病毒完整的基因组DNA，但无对应的转录产物。推测其无法转录的原因是： 。 (6)采用脂溶剂处理该病毒颗粒可使病毒失去对宿主细胞的感染性，其原因是： 。 4 / 20 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 大题05 生物技术与工程 答案版 热点角度01 基因工程的操作流程与表达载体构建及筛选应用 析典例·建模型 【答案】(1) 基因数据库/序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 (2) 试剂 1 目的基因N大小为2.3kb (3)GCC (4)香树脂醇 破类题·提能力 1．【答案】(1) 逆转录#反转录 PCR（多聚酶链式反应） (2) XbaⅠ或PstⅠ 质粒上有2个BamHⅠ酶切位点，其中一个位于终止子内部，切割后会破坏终止子，丢失终止子片段 目的基因和质粒易发生自身环化，目的基因易反向连接，降低重组质粒的获得效率 (3) 卡那霉素 生长素和细胞分裂素 热点角度02 微生物工程与代谢调控及合成生物学应用 析典例·建模型 【答案】(1) 质粒和目的基因 DNA连接 黏性 目的基因反向连接 (2)是否含有半乳糖 (3)能与胰岛素受体结合的目标蛋白（或有效的胰岛素受体激动剂或可表达有效的胰岛素受体激动剂的酵母菌） (4) 内质网和高尔基体（或复杂细胞器） 加工和修饰 破类题·提能力 1．【答案】(1)摇床转速越高，提供的氧气越充足，酵母菌代谢旺盛，增殖快 (2) 乙 ①②③ (3) 灼烧冷却 5.5×107 菌落数在30-300的平板 （建议用时：75分钟） 刷模拟 1．【答案】(1) 逆转录 作为引物（使逆转录酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸） 引物、脱氧核苷酸 (2) 5′ BamHⅠ和SacⅠ 1处 (3)细胞分裂素与生长素 (4)MdEXPA8蛋白能使细胞壁变得松弛，过表达后使细胞壁过度松弛，从而便于病原菌的侵入和果实细胞壁扩展，使植株更易患病害 2．【答案】(1) T-DNA 染色体DNA (2) 限制性内切核酸酶（或限制酶）和DNA连接酶 驱动GsERF6基因转录 标记基因 便于重组DNA的筛选 (3) 耐高温的DNA聚合酶 含有 泳道1与阳性对照（+）出现了相同大小的条带 3．【答案】(1) 使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 琼脂糖凝胶电泳 (2) 胰岛素基因（或pdx1基因或胰高血糖素基因或胰岛细胞中特异性表达的基因） 斑马鱼胰岛 (3) 显微注射 受精卵 (4) 1 1 (5)36 (6)②①④③ 4．【答案】(1) TaqDNA聚合（耐高温的DNA聚合） 互补 2 (2) RNA聚合酶识别和结合的部位 复制原点 5 NcoⅠ DNA连接酶 (3) (4) 卡那霉素 分别用转入融合蛋白基因的玉米叶片和等量的普通玉米叶片饲喂害虫,一段时间后,比较饲喂后害虫的生长状况（死亡率）（将等量的转基因玉米和非转基因玉米分别饲喂害虫,检测害虫的存活情况） 5．【答案】(1) 逆转录 使DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸 (2) 5′ BamHⅠ、SalⅠ 30 GGATCCTTTAAA (3)ABC (4) 显微注射法 未融合和同种融合的 (5)能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备 6．【答案】(1) 克隆化培养 HER2与EGFR 融合细胞可以产生两种不同的轻重链，这些轻重链可以随机组合 (2) 5′ 互补 8 有内质网和高尔基体，能正确加工真核蛋白，使其活性更高 提高翻译速度和效率（目的蛋白质表达量相应提高） (3) 细胞毒素 BsADC的双靶点识别机制可同时靶向肿瘤细胞表面的两个抗原，提升药物的肿瘤组织特异性（或“克服只使用一种单克隆抗体构建的ADC交叉耐药问题”）。 7．【答案】(1)引物、dNTP (2) F1和R1 长于 DNA片段长度 (3) 敏感型 敏感型pfcrt基因的PCR产物含有DraI酶的识别序列(5’-AAATTT-3’)，而抗性型基因突变导致该识别序列被破坏，无法被DraI酶识别切割 (4)核酸染料 8．【答案】(1)引物、模板 (2)限制酶、DNA连接酶 (3)ABC (4)EcoR Ⅰ (5)PCR扩增可能会发生碱基对的错配（琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列） 9．【答案】(1) 氨基酸序列 定点突变 (2) 乙、丙 30 (3) NdeI和EcoRI MluI和Eco52I (4) 更容易从培养液中获取并提纯目标蛋白质 纯化 10．【答案】(1) SmaI和BclI TetR和AmpR bar (2) 耐高温的DNA聚合酶（或Taq酶） 含Mg2+的缓冲液 3 质粒 目的基因和质粒 避免（目的基因和线性质粒）反向连接和（目的基因、线性质粒）自身环化 (3)可一次性构建含多个目的基因的表达载体、不受限制酶切割位点（的数量、种类、位置等）的限制等（合理即可） 11．【答案】(1) 模板、4种脱氧核苷酸/dNTP 复性 (2) 非模板链 GGATCCATGTTC (3) 潮霉素 绿色荧光 抗原-抗体杂交 (4)Y蛋白通过与S基因启动子结合促进S基因表达，促进大豆类固醇化合物的合成，增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性 12．【答案】(1) 基因表达载体的构建 相同的限制（同尾） DNA连接 (2) Cht 仅在害虫取食诱导茉莉酸产生时启动毒蛋白表达 (3)抗原-抗体杂交 (4)JAZ基因是茉莉酸信号通路的抑制基因，CRISPR/Cas9编辑后JAZ基因功能丧失，茉莉酸信号通路不再被抑制，其诱导Tox基因表达的效率大幅提升，毒蛋白合成量增加，从而增强抗虫效果 (5)减少化学杀虫剂使用，降低环境污染及农产品农药残留 13．【答案】(1) 细胞毒性T 免疫排斥 碱基互补配对 (2)从基因文库中获取、PCR技术扩增目的基因、化学方法直接人工合成 (3)敲除3KO并插入7TG会对异体细胞有更强的保护作用 (4)供体猪器官携带猪内源性逆转录病毒（PERV），PERV接触并侵染人类细胞，在人体细胞内逆转录形成DNA，整合到人类基因组中 (5)动物体细胞核移植、动物细胞培养 14．【答案】(1) 纤维素酶和果胶酶 酶解时间过长、酶浓度过高、渗透压不适宜等 (2) 聚乙二醇/PEG 六/6 新细胞壁的形成 (3) 杂种细胞分裂时来源于不同亲本的染色体随机丢失 天台鹅耳枥控制耐寒性状的基因未表达（或基因的选择性表达，天台鹅耳枥的耐寒基因在杂种植株中未表达） 15．【答案】(1)获得能产生特定抗体的B淋巴细胞 (2) 受体 克隆化培养 抗体（阳性）检测 (3) 碱基互补配对 2 P1、P4 (4) 4 复性温度太高；引物设计不合理无法与目的基因结合 (5) EcoRI 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向连接 16．【答案】(1) A (2) 容易吸收外源DNA 氨苄青霉素 (3) 目标DNA序列 sgRNA支架 限制 (4)（基因）突变 17．【答案】(1)甜酒曲主要作用是分泌糖化酶，将糯米中淀粉分解为葡萄糖等可发酵性糖 (2) 接种 分离、提纯 (3)C (4)氮源、维生素等 (5) 0.10%、8天 接种量较大，酵母菌数量增长过快导致葡萄糖消耗过多，用于酵母菌无氧呼吸产生酒精的葡萄糖减少或酵母菌大量快速繁殖后抑制甜酒曲糖化过程，使碳源少 18．【答案】(1) 逆转录 内含子、启动子和终止子等 (2) 5' Xho Ⅰ BamH Ⅰ 2n-2 (3) Ca2+ 处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 具有 (4)2 19．【答案】(1)PCR (2) 3.5kb和2.5kb（顺序可以互换） 终止子 (3)否，因为经Cre酶切后5’-Otof的片段与含3’-Otof片段的黏性末端没有碱基互补配对，无法连接（能够与含5’-Otof片段黏性末端连接的不是含3’-Otof的片段；能够与含3’-Otof片段黏性末端连接的不是含5’-Otof的片段） (4) 耳 弱 (5)听觉功能（听力） 20．【答案】(1) 3' F2和R1 1链和4链 互为引物 (2) DNA连接酶 氨苄青霉素 (3) 37℃和 42℃ 37℃条件下未检测Cly-Noxa融合蛋白，42℃能检测到（只有42℃能检测到Cly-Noxa融合蛋白） (4)正常细胞凋亡（细菌在未到达肿瘤前就被免疫系统清除，降低疗效） 21．【答案】(1) 潮霉素 限制酶（或限制性内切核酸酶） (2) 转基因水稻的染色体DNA T-DNA1与T-DNA2是否共同转化到了水稻细胞中 不同 (3) GH1-1 单 Gus+/hpt- P1 22．【答案】(1)通入无菌空气(或氧气)，将温度从18~30℃提高到30~35℃ (2) 发酵罐中发酵 前 菌种、培养基、发酵设备(答出两点即可) (3) 刚果红 透明圈 (4) 稀释涂布平板 当样品稀释度足够高时，培养基表面生长的单个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌 皿底 防止因培养时间不足导致遗漏菌落数目 刷真题 1.【答案】（1） ①. 水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离 ②. 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA （2） ①. PCR技术扩增 ②. 人工合成 （3） ①. RNA聚合酶识别并结合的部位 ②. 同时实现两个目的基因的共同表达及调控，从而降低基因工程的成本与复杂性 （4）HygBR （5） ① F3 ②. R2 （6）CD 2.【答案】（1）蛋白质 （2）③ （3）② （4）标记基因 （5） ①. 筛选导入目的基因的大肠杆菌 ②. 5.7 （6）逆转录 3．【答案】(1) 捕食和种内竞争 物理信息、化学信息、行为信息 食物和空间、配偶等 (2)互利共生 (3) 上清液 溶解DNA 4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶 (4) 互补配对 丁 丙丁 叶绿体基因组其他DNA 片段 (5)ab 4．【答案】(1)绿色 (2) 替换 Ⅱ (G+h)/(△G+H) 该植株中基因H上游缺失非编码序列G，导致基因H不能正常表达，表现为黄色豆荚 非编码序列G缺失不影响基因H表达 5．【答案】(1) 脱氧核苷酸 引物 复性 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 (2) SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ 磷酸二酯键 (3) 细胞表面发出黄色荧光 高 (4) 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用 (5) ① ③ 6．【答案】(1)电子显微镜 (2)细胞骨架 (3)抑制宿主细胞的凋亡，为病毒的复制和繁殖提供更多的时间和场所 (4)大肠杆菌复制原点 (5)病毒基因组没有在哺乳动物细胞中表达的启动子 (6)蛋白镶嵌或贯穿于膜上，脂溶剂处理该病毒颗粒使得包膜溶解，包膜上的蛋白A游离，蛋白A与细胞膜受体结合不能使病毒DNA进入细胞内 4 / 20 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 大题05 生物技术与工程 内容导航 【命题解码·定方向】命题趋势+3年高考真题热点角度拆解 【解题建模·通技法】析典例，建模型，技法贯通破类题/变式 【实战刷题·冲高分】精选高考大题+名校模拟题，强化实战能力，得高分 命题·趋势·定位 1.重过程推演：从“识工具”转向基因工程四步流程的时序推导、单克隆抗体制备的链式逻辑、发酵条件的动态优化机制推导。 2.重层级差异：基因水平操作+细胞水平培养/个体水平筛选/群体水平发酵叠加，强化微观操作与宏观产出间的尺度转化考查。 3.重信息转译：以质粒图谱与限制酶切位点、PCR扩增曲线、细胞融合筛选示意图、发酵参数变化表为核心载体。 4.重综合关联：与疾病诊疗、作物育种、环境修复、生物制药、伦理安全深度融合，突出科技向善与社会责任。 热点·角度·拆解 热点角度01 基因工程的操作流程与表达载体构建及筛选应用 2025·黑吉辽蒙：限制酶选择、PCR 原理、目的基因检测鉴定、基因表达载体构建； 2024·黑吉辽蒙：DNA粗提取和鉴定实验及基因工程和蛋白质工程技术。 2023·辽宁：蛋白质工程技术，基因工程技术的基本步骤； 热点角度02 微生物工程与代谢调控及合成生物学应用 24-25高三上·吉林·月考：分离提纯葡萄皮上的野生酵母菌；微生物培养及技术过程。 25-26高三上·黑龙江哈尔滨·期末：本题目以黄皮甜米酒酿造为背景，结合流程图、实验数据折线图考查发酵工程原理。图片中两张折线图分别展示了不同酵母接种量对酒精度和还原糖含量的影响。 热点角度01 基因工程的操作流程与表达载体构建及筛选应用 析典例·建模型 1.（2025·黑吉辽蒙）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 （从“1~4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 。 a：5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3' b：5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3' c：5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3' d：5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 【解题建模】 第一步，思路模板 第一步：信息提取与审题 1．明确核心主题：酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。 2．识别关键信息： ①限制酶选择：从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间。 ②构建重组质粒：电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。 ③目的基因检测：分酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。 第二步，结合图示信息和模板思路进行思路拆解 解题步骤 具体分析思路 1. 限制酶选择及引物选择 GenBank是目前国际上广泛使用 的序列数据库之一，它的数据主要是各国的 实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库或基因数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，由于目的基因N含有Spe Ⅰ识别序列，故N基因不能使用Spe Ⅰ酶切，但Xba Ⅰ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba Ⅰ替换Spe Ⅰ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和Xho Ⅰ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5'端含有引物1序列，而编码链的5'端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加Xba Ⅰ、引物1 5'端添加Xho Ⅰ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 2. 构建重组质粒 构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，而质粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有试剂污染。。 3. 基因表达及基因突变 编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA；密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），可知a引物延申后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延申后的序列为编码链，根据a引物5'-端首位GCA为240位，则c引物5'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。 4.目的基因检测 题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 第三步：规范作答 【答案】(1) 基因数据库/序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA 连接酶 (2) 试剂 1 目的基因N大小为2.3kb (3)GCC (4)香树脂醇 研考点·通技法 限制酶选择策略： 解题步骤​ 核心分析要点与决策逻辑​ 关键知识依据与规范作答​ 1. 分析目的基因酶切位点​ 首先确认目的基因两端的限制酶切点分布情况​ • 完整性原则：选择切点位于目的基因两端的限制酶，避开基因内部的切点 • 优选双酶切：使用两种不同限制酶分别切割两端，避免单酶切导致的自身环化和反向连接 2. 分析质粒载体结构​ 检查质粒上的酶切位点分布与关键元件位置​ • 保护关键元件：确保酶切位点不破坏启动子、终止子、复制原点、标记基因 • 插入位置正确：保证目的基因能插入启动子与终止子之间的合适位置 3. 考虑同尾酶替换​ 当质粒无合适酶切位点时考虑同尾酶替代方案​ • 识别同尾酶：能产生相同黏性末端的不同限制酶（如BamHⅠ和BglⅡ） • 替换条件：质粒上无对应酶切位点或该位点不可用时，可用同尾酶替换 4. Ti质粒特殊要求​ 植物转基因工程中需考虑T-DNA区域限制​ • 必须插入T-DNA：农杆菌转化时，目的基因必须插入Ti质粒的T-DNA片段内 • 选择合适质粒：选择T-DNA区域有合适酶切位点的Ti质粒变体 解题流程图示 目的基因分析 → 质粒结构分析 → 同尾酶替换判断 → Ti质粒特殊要求 ↓ ↓ ↓ ↓ 保护基因完整 保护关键元件 末端兼容性 T-DNA内插入 双酶切优选 正确插入位置 解决位点冲突 农杆菌转化兼容 备考锦囊 1. 优先级别：基因完整性 > 质粒元件保护 > 双酶切 > 单酶切 2. 快速判断：看到"避免自身环化" → 立即选择双酶切方案 3. 特殊记忆：植物转基因必选T-DNA内有切位的Ti质粒 4. 易错提醒：同尾酶产生的末端可连接，但原酶切位点可能消失 破类题·提能力 1．（2026·辽宁抚顺·一模）条锈病是小麦的一种常见疾病，不仅会直接影响产量，更会对品质、种植成本甚至生态环境造成深远影响。科研人员从野生二粒小麦等近缘种中找到广谱抗病基因Yr15，并欲通过基因工程获得抗条锈病小麦。基因Yr15及质粒的结构如图所示，相关酶的识别序列及酶切位点如表所示。回答下列问题： 注：LB/RB为T-DNA的边界序列，为卡那霉素抗性基因。 (1)科研人员利用获得的基因Yr15的mRNA通过___________过程获得目的基因，并通过___________技术对目的基因进行扩增。 (2)已知不同平末端携带的化学基团不同，这导致平末端的连接具有特异性，需要由不同的DNA连接酶催化完成。为了将切割后的目的基因Yr15同质粒连接形成重组质粒，需要使用SmaⅠ和___________(填表格中限制酶)对质粒进行切割并将切割后的黏性末端补齐为平末端，不使用另外一种限制酶的原因是___________。若只使用SmaⅠ连接目的基因和质粒，则弊端是___________。 (3)据图可知，可将导入重组质粒的小麦组织细胞放入含___________的培养基中进行初步筛选，为了使愈伤组织朝着人为既定方向分化，通常可通过调整___________的含量来实现。 【答案】(1) 逆转录#反转录 PCR（多聚酶链式反应） (2) XbaⅠ或PstⅠ 质粒上有2个BamHⅠ酶切位点，其中一个位于终止子内部，切割后会破坏终止子，丢失终止子片段 目的基因和质粒易发生自身环化，目的基因易反向连接，降低重组质粒的获得效率 (3) 卡那霉素 生长素和细胞分裂素 【详解】（1）以mRNA为模板合成DNA的过程为逆转录，是获取真核生物目的基因的常用方法，科研人员利用获得的基因Yr15的mRNA通过逆转录（反转录）过程获得目的基因，体外扩增目的基因的技术为PCR技术。 （2）由图可知，目的基因两端仅含SmaⅠ酶切位点，切割后产生平末端；需选择不破坏启动子、终止子的限制酶切割质粒，由于质粒上有两个BamHⅠ识别位点，其中一个位于终止子内部，切割后会破坏终止子，丢失终止子片段，导致转录无法终止，而XbaⅠ和PstⅠ的酶切位点位于启动子和终止子之间，不会破坏启动子和终止子，故需要使用SmaⅠ和PstⅠ或XbaⅠ对质粒进行切割并将切割后的黏性末端补齐为平末端，而不使用BamHⅠ。仅用SmaⅠ单酶切时，由于所有末端相同，会出现目的基因和质粒易发生自身环化，目的基因易反向连接，降低重组质粒的获得效率等弊端。 （3）质粒上的标记基因是卡那霉素抗性基因，因此可将受体细胞放在含卡那霉素的培养基中初步筛选；植物组织培养中，生长素和细胞分裂素的含量比例可以调控愈伤组织的分化方向，因此可通过调整生长素和细胞分裂素含量实现定向分化。 热点角度02 微生物工程与代谢调控及合成生物学应用 析典例·建模型 1.（25-26高三下·辽宁·开学考试）研究者利用蛋白质从头设计策略，合成并筛选能与胰岛素受体结合的胰岛素受体激动剂，如图所示。其中，荧光探针是被荧光标记的蛋白，在与靶蛋白结合后可发出荧光；Aga2蛋白与膜锚定，使目标蛋白展示在酵母表面。回答下列问题： (1)构建重组表达载体时，需先用限制酶NheI和BamHI分别切割_____，再用_____酶处理，形成重组质粒。切割后两者产生的_____末端可互补配对，避免质粒自身环化和_____。 (2)转化后的酵母菌先接种于CTUG培养基中增殖，再转移至SGCAA培养基中进行诱导表达，推测培养基CTUG和SGCAA成分的主要差异是_____。 (3)荧光探针Y（通常为荧光标记的胰岛素受体或其关键结构域）与目标蛋白结合，目的是筛选出_____。 (4)若将该实验中的酵母菌换成大肠杆菌（原核生物），则目标蛋白可能无法正常发挥作用，原因是大肠杆菌缺乏_____，不能对目标蛋白进行复杂的_____。 第一步，思路模板 第一步：信息提取与审题 1. 明确核心主题：利用蛋白质从头设计策略，合成并筛选能与胰岛素受体结合的胰岛素受体激动剂。 2．识别关键信息： 基因工程技术的基本步骤： （1） 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2） 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3） 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4） 目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （5） 第二步：思路拆解与建模 解题步骤 具体分析思路 1.基因表达载体构建的核心 基因表达载体构建的核心步骤是“酶切-连接”：先用相同限制酶切割载体（质粒）和目的基因，保证两者产生互补的黏性末端，再通过DNA连接酶将两者连接形成重组质粒。这一步的关键是利用限制酶的特异性切割，避免载体自身环化和目的基因反向连接，提高重组效率。。 2. 筛选酵母菌 根据题图“注：GAL1启动子仅在半乳糖存在时被激活”，CTUG培养基用于增殖，SGCAA培养基用于诱导表达（激活GAL1启动子），因此两者主要差异为是否含有半乳糖。 3.筛选与鉴定 本实验旨在筛选胰岛素受体激动剂，因此荧光探针Y通常由荧光标记的胰岛素受体（或其关键结构域）构成，其与目标蛋白结合后的荧光信号可直接反映目标蛋白与受体的结合能力，从而实现对候选分子功能的定向筛选与鉴定。 4. 蛋白质加工 酵母是真核生物，含内质网、高尔基体等细胞器，可对蛋白质进行折叠、糖基化等加工修饰；大肠杆菌是原核生物，无此类细胞器，仅合成原始多肽链，无法形成有功能的成熟蛋白。 第三步：规范作答 【答案】(1) 质粒和目的基因 DNA连接 黏性 目的基因反向连接 (2)是否含有半乳糖 (3)能与胰岛素受体结合的目标蛋白（或有效的胰岛素受体激动剂或可表达有效的胰岛素受体激动剂的酵母菌） (4) 内质网和高尔基体（或复杂细胞器） 加工和修饰 研考点·通技法 1.发酵工程的基本环节 基本环节 核心操作要点 菌种选育 筛选、诱变或通过基因工程获得性状优良的生产菌种 培养基配制 根据菌种需求，配制包含碳源、氮源、无机盐、水等的营养物质，并进行灭菌处理 灭菌 对培养基、发酵罐及所有管路、空气过滤系统进行严格灭菌，杜绝杂菌污染 扩大培养 将保存的菌种经活化后，逐级转移到种子罐中，以获得足够数量和活力的菌种 发酵过程 （中心环节） 将种子液接种至发酵罐，严格控制温度、pH、溶氧量、营养物质流加等条件，维持菌体生长和产物合成 分离提纯 发酵完成后，通过过滤/离心分离菌体，再采用沉淀、萃取、层析等方法获取并纯化目标产物 2.基因工程 vs. 蛋白质工程： 解题步骤​ 核心分析要点与决策逻辑​ 关键知识依据与规范作答​ 1. 审题定位，明确操作对象​ 仔细阅读题干，明确题目描述的技术操作是针对基因序列本身，还是针对蛋白质的功能与结构。​ 关注关键词： • 基因层面操作：如“切割”、“连接”、“载体构建”、“导入”。 • 蛋白质层面目标：如“改良蛋白质特性”、“设计新功能蛋白”。 2. 分析基因序列是否被“实质性改造”（核心判断标准）​ 判断对目的基因的操作是“照搬”天然序列，还是进行了“人工设计”的修改。​ • 基因工程：未改变编码序列。仅将天然的基因序列从生物体中“剪切”下来，或仅对其调控序列（如启动子）进行加工。 • 蛋白质工程：改变了编码序列。对编码蛋白质的序列进行了定点改造，如碱基的替换、增添或缺失，以改变蛋白质的氨基酸序列。 3. 分析最终产物的性质（辅助判断标准）​ 判断最终生产出的蛋白质是自然界已存在的，还是人工创造的新蛋白质。​ • 基因工程：生产的是天然蛋白质。例如，利用工程菌生产人的胰岛素，胰岛素本身是天然存在的。 • 蛋白质工程：生产的是非天然蛋白质或改造蛋白。其产物与天然蛋白质在结构、功能上存在差异，甚至是自然界中原本不存在的蛋白质。 4. 综合判断，得出结论​ 结合以上两个维度的分析，对技术类型做出最终判断。​ 决策逻辑： 1. 如果基因序列未被改造且产物是天然蛋白质​ → 基因工程。 2. 如果基因序列被定向改造，旨在获得新型蛋白质​ → 蛋白质工程。 备考与易错点提醒 1. 核心关系：蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。蛋白质工程的实施，最终必须通过改造基因来实现，因此它依赖于基因工程技术。 2. 快速判断题： · 看到“定向改造”、“优化性能”（如提高酶的热稳定性）、“设计新蛋白”等表述，优先考虑蛋白质工程。 · 看到“剪切目的基因”、“表达天然蛋白”等表述，优先考虑基因工程。 3. 易错点：不要因为操作过程复杂就误判为蛋白质工程。关键看编码蛋白质的基因序列是否被人工定向修改。 破类题·提能力 1．（24-25高三上·吉林·月考）某研究小组分离提纯葡萄皮上的野生酵母菌时，选取了从自然界中采集到的葡萄，用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中进行培养。请回答下列问题： (1)该研究小组成功分离出某品种的酵母菌后，取等量菌液分别接种于3个盛有等量液体培养基的锥形瓶中,并分别置于转速为150 r/min、200 r/min、250 r/min的摇床上培养，检测结果如图1所示，摇床转速为250 r/min的酵母菌种群密度大的原因是____________。 (2)图2是采用血细胞计数板直接计数和稀释涂布平板法计数两种方法计数培养液中酵母菌数量时得到的结果，其中采用稀释涂布平板法计数得到的是曲线______，下列判断依据中正确的有______（填序号）。 ①稀释涂布平板法只计数活的酵母细胞，死细胞无法形成菌落 ②采用血细胞计数板直接计数时，可能会将死细胞与活细胞一起计数 ③采用稀释涂布平板法计数时，两个或多个细胞连在一起时，只能观察到一个菌落 ④采用稀释涂布平板法计数时，可能因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目 (3)通过如图3所示的方法进行纯化培养时，用移液枪取最终的酵母菌稀释液0.1mL滴在培养基表面，然后将沾有少量酒精的涂布器______后再进行涂布。在恒温培养箱中培养一段时间后，其中某组的3个平板上菌落数分别为69个、52个、44个，则可以推测原酵母菌液中每毫升含菌数为______个。计数一般要选取____________进行计数。 【答案】(1)摇床转速越高，提供的氧气越充足，酵母菌代谢旺盛，增殖快 (2) 乙 ①②③ (3) 灼烧冷却 5.5×107 菌落数在30-300的平板 【分析】1、酵母菌是兼性厌氧型的单细胞真菌，能够进行产酒精的无氧呼吸，酵母菌对青霉素不敏感，酵母菌在有氧条件下可以迅速增殖。进行酵母菌计数时需要将菌液进行梯度稀释。 2、微生物常见的接种的方法： （1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。 （2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 【详解】（1）根据题意可知，摇床转速越高，提供的氧气越充足，从图中可看出摇床转速越高，酵母菌代谢旺盛，增殖快，因此繁殖的速度和总量越高，种群密度最大。 （2）根据图2可知，由于稀释涂布平板法只计数活的酵母菌，血细胞计数板直接计数会将死细胞一起计数，且采用稀释涂布平板法计数时，两个或多个细胞连在一起时，只能观察到一个菌落，因此稀释涂布平板法获得的菌落数目比血细胞计数法计数时微生物数目少，采用稀释涂布平板法计数的是曲线乙，因此判断依据有①②③。 （3）在培养基上进行涂布时，要将涂布器灼烧（杀死杂菌）冷却后（以免杀死菌种）才能进行操作；根据图解可知菌液被稀释了105倍（M），同时选择菌落数目在30-300的进行计数，所以每毫升含菌数为 （69+52+44）÷3÷0.1×105=5.5×107个。为保证结果准确，一般选择菌落数在30-300的平板进行计数。 （建议用时：75分钟） 刷模拟 1．（2026·辽宁·一模）红富士是我国北方广泛栽培的苹果优良品种，但容易感染苹果轮纹病菌。研究人员发现一种扩展蛋白基因MdEXPA8与苹果果实细胞壁的扩展和生长发育密切相关。为探究MdEXPA8蛋白在苹果生长发育及抗病性中的作用，现以红富士苹果为实验材料，利用MdEXPA8基因以及超量表达启动子，构建超量表达载体，并最终获得转基因植株用于研究。回答下列问题： (1)从苹果细胞中提取mRNA，在______酶的作用下可获得互补DNA（cDNA）；mRNA 3′端的poly-A尾是由12～18个腺嘌呤核糖核苷酸重复组成，获得cDNA时需要向反应液中加入由12～18个连续的胸腺嘧啶脱氧核苷酸组成的短单链核酸，其功能是____________；随反应进行溶液中含量逐渐减少的物质有____________。 (2)建构超量表达载体时所用质粒的结构如图所示。获得的cDNA两端没有限制酶的切割位点，则在进行PCR扩增时，应该在上游和下游引物的______端分别添加______（填限制酶的名称）的识别序列；转化成功后欲用Bar（抗除草剂基因）筛选出可超量表达MdEXPA8蛋白的苹果植株，则应该将Bar基因插入图中载体的位点______（填“1处”或“2处”）。 (3)获得转化成功的苹果体细胞后，利用植物组织培养技术获得转基因植株，此过程中需要调整培养基中_______（填植物激素的名称）的浓度配比，以有效调控愈伤组织的形成及生芽或生根。 (4)研究结果表明MdEXPA8基因超表达的植株对轮纹病菌更敏感，结合MdEXPA8蛋白的作用，形成该结果的原因可能是__________。 【答案】(1) 逆转录 作为引物（使逆转录酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸） 引物、脱氧核苷酸 (2) 5′ BamHⅠ和SacⅠ 1处 (3)细胞分裂素与生长素 (4)MdEXPA8蛋白能使细胞壁变得松弛，过表达后使细胞壁过度松弛，从而便于病原菌的侵入和果实细胞壁扩展，使植株更易患病害 【分析】基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA一分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原一抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）从苹果细胞中提取mRNA，在逆转录酶的作用下可获得cDNA；反应液中加入由12～18个连续的胸腺嘧啶脱氧核苷酸组成的短单链核酸能与mRNA 3'端的poly-A尾进行互补配对，推测其功能是作为引物，使逆转录酶从引物的3′端连接脱氧核苷酸；随逆转录的进行，引物和脱氧核苷酸被消耗，含量会不断减少。 （2）由图可知，限制酶上有两个EcoRⅠ的切割位点，无法用EcoRⅠ切割质粒，需要用BamHⅠ和SacⅠ切割质粒获得黏性末端，因此在对cDNA扩增时需要添加这两种酶的切割位点，且需要添加到引物的5'端，这样才不会影响引物的功能；若转化成功后用Bar（抗除草剂基因）筛选出可超量表达MdEXPA8蛋白的苹果植株，Bar应该随目的基因整合到苹果的基因组中，只有T-DNA上的基因才能转移并整合到宿主细胞的基因组中，因此应该插入1处。 （3）植物组织培养过程中调整细胞分裂素与生长素的浓度配比，可以有效调控愈伤组织的形成及生芽或生根。 （4）由题干可知，扩展蛋白基因MdEXPA8与苹果果实细胞壁的扩展和生长发育密切相关，MdEXPA8基因过表达的植株对轮纹病菌更敏感，推测MdEXPA8蛋白能使细胞壁变得松弛，过表达后使细胞壁过度松弛，从而便于病原菌的侵入和果实细胞壁扩展，使植株更易患病害。 2．（2026·辽宁·模拟预测）研究人员利用农杆菌转化法将大豆耐盐碱基因GsERF6导入水稻，构建重组表达载体（图甲），并对转化后的细胞进行目的基因检测（图乙）。回答下列问题： (1)利用农杆菌转化法时，将目的基因插入Ti质粒的_____上；需将含GsERF6基因的重组Ti质粒导入农杆菌，再让农杆菌侵染水稻细胞，最终使GsERF6基因进入水稻细胞并整合到水稻细胞的_____上。 (2)构建图甲所示的重组表达载体需要的酶是______，该表达载体中的强启动子的作用是________。新霉素抗性基因属于_____，其作用是________。 (3)对转化细菌进行目的基因检测时，常采用PCR技术，该技术需要_______（填一种酶）。结合图乙结果分析，转基因水稻DNA（泳道1）中_____（填“含有”或“不含有”）GsERF6基因，判断的依据是_______。 【答案】(1) T-DNA 染色体DNA (2) 限制性内切核酸酶（或限制酶）和DNA连接酶 驱动GsERF6基因转录 标记基因 便于重组DNA的筛选 (3) 耐高温的DNA聚合酶 含有 泳道1与阳性对照（+）出现了相同大小的条带 【详解】（1）农杆菌转化法是将目的基因插入Ti质粒上的T-DNA上，然后转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，保证目的基因能稳定遗传和表达。 （2）构建目的基因的表达载体需要的酶是限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶。该表达载体中的目的基因是GsERF6基因，强启动子的作用就是驱动GsERF6基因的转录。图甲中的新霉素抗性基因属于标记基因，其作用是通过在含新霉素的培养基中培养细胞，筛选出成功导入重组质粒的水稻细胞，不含重组质粒的细胞因无新霉素抗性基因，无法在该培养基中存活。 （3）PCR的原理是DNA复制，所以PCR技术需要耐高温的DNA聚合酶。图乙中，转基因水稻DNA（泳道1）的条带与阳性对照（含GsERF6基因）的条带大小一致，说明转基因水稻DNA中含有GsERF6基因。 3．（2026·辽宁·三模）pdx1蛋白是决定胰岛形成的最为关键的蛋白质。为验证其作用，科研人员以斑马鱼为模式生物，先获得在胰岛细胞中特异性表达GFP（绿色荧光蛋白）的转基因斑马鱼（G品系），特异性敲除G品系的pdx1基因，获得N品系斑马鱼。研究过程如下： (1)利用PCR扩增GFP基因时，引物的作用是________，通过______方法检测扩增产物。 (2)构建基因表达载体时，需先将______的启动子与GFP基因相连，再与质粒相连，该步骤的目的是使GFP基因能够在斑马鱼的细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，且在______细胞中特异性表达。 (3)将构建好的重组质粒通过______法导入斑马鱼的______中，然后再通过早期胚胎培养等技术获得转基因斑马鱼G品系。 (4)为鉴定GFP基因插入的位置，针对插入位点的上下游设计了引物1、2，针对GFP基因自身序列设计了引物3、4，各引物的位置如图1所示。将G品系斑马鱼相互交配，提取不同子代个体的DNA用引物1、2进行PCR并电泳，结果如图2所示，加样孔______（填编号）对应的个体是纯合G品系斑马鱼。若改用引物3、4进行PCR并电泳，结果如图3所示，加样孔______（填编号）对应的个体是纯合野生型斑马鱼。 (5)CRISPR-Cas9技术能特异性敲除基因。先制备针对pdx1基因的CRISPR-Cas9体系，然后导入G品系斑马鱼。若筛选获得了1个pdx1突变品系（N），经测序得到了如图4所示的序列（图中“—”表示缺失1个碱基）。请预计突变品系N的pdx1蛋白含______个氨基酸（已知密码子：CCU—脯氨酸；UAA、UGA和UAG为终止密码子）。 (6)目前科学家们通过蛋白质工程还制造出了蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是______（选填序号）。 ①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸 ②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列 ③表达出蓝色荧光蛋白 ④蓝色荧光蛋白基因的修饰（合成） 【答案】(1) 使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 琼脂糖凝胶电泳 (2) 胰岛素基因（或pdx1基因或胰高血糖素基因或胰岛细胞中特异性表达的基因） 斑马鱼胰岛 (3) 显微注射 受精卵 (4) 1 1 (5)36 (6)②①④③ 【详解】（1）利用PCR扩增GFP基因时，引物的作用是使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，通过琼脂糖凝胶电泳法检测得到扩增产物。 （2）启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，可驱动基因的转录，将在胰岛细胞中特异性表达基因（pdx1基因/胰高血糖素基因/胰岛素基因）的启动子和GFP基因相连后，再与质粒相连，构建基因表达载体，使GFP基因只在胰岛细胞中特异性表达。构建基因表达载体的目的是使GFP基因能够在斑马鱼细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，且只在斑马鱼胰岛细胞中特异性表达。 （3）将构建好的重组质粒通过显微注射法导入斑马鱼的受精卵中，然后再通过早期胚胎培养等技术获得转基因斑马鱼G品系。 （4）用引物1、2进行PCR并电泳，若子代是插入GFP基因成功的纯合G品系斑马鱼，DNA分子量均最大，电泳后的条带离加样孔均最近，为加样孔1对应条带；若改用引物3、4进行PCR并电泳，野生型无GFP基因，即无法扩增出对应DNA条带，为加样孔1对应条带。 （5）由题意可知，筛选获得了1个pdx1突变品系（N），PCR后进行测序，可得到图4对应序列，由脯氨酸密码子CCU可知，且UGA是终止密码子，图4序列为转录的非模板链（编码链），可知突变品系N转录的模板链的碱基序列为GGAGGTTG-GAAATATACT，因此突变品系N的序列转录为mRNA的碱基序列为：CCU（32位）CCA（33位）ACC（34位）UUU（35位）AUA（36位）UGA（终止密码子不编码氨基酸），故预计突变品系N的pdx1蛋白含36个氨基酸。 （6）蛋白质工程的过程为从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列→①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸→④蓝色荧光蛋白基因的修饰（合成）→③表达出蓝色荧光蛋白。 4．（2026·甘肃天水·二模）在培育转基因抗虫作物过程中,单一抗虫基因会引起害虫抗药性问题。为提高作物的抗虫性,研究人员提取苏云金芽孢杆菌的抗虫蛋白基因Cry1A．301和Vip3A进行融合,培育抗虫作物,其具体过程如图。回答下列问题: (1)①过程需要使用___________酶。引物P2和引物P3之间碱基序列的特点是必须有_________（填“相同”或“互补”）片段。经图中PCR1过程获得产物1至少需要经过__________次扩增循环。 (2)重组质粒中启动子是_________,可驱动目的基因的转录。除图示信息外,重组质粒中还应该有___________。为使②过程中融合基因能按正确方向插入质粒,需在引物P1的__________端加上限制酶________的识别序列。②过程需用到的工具酶,除限制酶外,还有_____________。 (3)通过酶切法和电泳对重组质粒进行鉴定,结果如图所示。泳道1、2分别是用NcoⅠ切割质粒和重组质粒的结果。若已知融合基因已整合到质粒上,请在图中泳道3绘制出用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒所得的电泳结果_______。（质粒上NcoⅠ和XhoⅠ识别位点间隔较近,长度可忽略不计） (4)将重组质粒转入农杆菌后,应将该农杆菌置于含_______的培养基中培养,从而筛选出含重组质粒的农杆菌。为检测Cry1A．301-Vip3A融合蛋白抗虫的效果,还需进行个体水平检测,请简述实验思路:__________。 【答案】(1) TaqDNA聚合（耐高温的DNA聚合） 互补 2 (2) RNA聚合酶识别和结合的部位 复制原点 5 NcoⅠ DNA连接酶 (3) (4) 卡那霉素 分别用转入融合蛋白基因的玉米叶片和等量的普通玉米叶片饲喂害虫,一段时间后,比较饲喂后害虫的生长状况（死亡率）（将等量的转基因玉米和非转基因玉米分别饲喂害虫,检测害虫的存活情况） 【详解】（1）①过程为PCR扩增,该过程需要耐高温的DNA聚合酶。为使实验PCR1的产物与PCR2的产物融合,设计引物P2和P3时,需让二者5′端一小段DNA序列互补配对。①过程至少需经历2次循环才能得到产物1,如图所示。 （2）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,可驱动目的基因转录出mRNA。图中重组质粒含有标记基因、启动子、终止子和目的基因,除此之外还需含复制原点。分析图中的质粒,卡那霉素抗性基因中有EcoRⅠ的识别序列,因此切割重组质粒和目的基因时需选择NcoⅠ和XhoⅠ,根据融合基因的转录方向以及质粒中启动子的方向判断,需在引物P1的5′端加上限制酶NcoⅠ的识别序列。②过程为构建基因表达载体,该过程需要用到限制酶和DNA连接酶。 （3）用NcoⅠ切割后,质粒的长度为5.5kb,重组质粒的长度为7kb,故融合基因的长度为7-5.5=1.5（kb）。若融合基因已整合到质粒上,用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒,将产生融合基因（1.5kb）、质粒（5.5kb）两种长度的片段,据此在泳道3的相应位置画图。 （4）重组质粒中有卡那霉素抗性基因,将重组质粒转入农杆菌后,需将农杆菌置于含有卡那霉素的培养基中进行培养,从而筛选出含有重组质粒的农杆菌。在个体水平检测该融合蛋白的抗虫效果时,可用转入融合蛋白基因的玉米叶片和等量的普通玉米叶片分别饲喂害虫,在相同的条件下饲养一段时间后,比较害虫的存活情况。 5．（2026·辽宁·模拟预测）N蛋白是牛冠状病毒（BCoV）蛋白中表达量最高的蛋白，它可以诱导机体产生抗病毒免疫应答，因此是早期快速诊断、疫苗研发的关键候选蛋白。为制备抗N蛋白的单克隆抗体，科研人员完成了以下过程。回答下列问题： 注：图中限制酶的识别序列和切割位点为：BamHⅠ：，EcoRⅠ：，SalⅠ：。 (1)根据BCoV扩增的全基因组毒株提取的RNA________出的DNA为模板，以该DNA为模板通过PCR扩增合成目的片段，PCR中添加引物的作用是________。 (2)制备引物时需在引物A和B的________端分别添加________（填限制酶）的识别序列，该片段扩增4次循环，需要消耗引物________个。已知N蛋白基因非模板链的碱基序列为，写出N蛋白基因上游引物的12个碱基序列：________。 (3)琼脂糖凝胶电泳是用来鉴定PCR产物的常用方法。下列说法正确的有________。 A．配制的琼脂糖溶液浓度较高时，大分子DNA片段不易分离 B．若电泳出现多种条带，可能是因为引物过短 C．凝胶中加入核酸染料便于观察PCR产物的电泳结果，电泳缓冲液应没过凝胶 D．两条泳道中电泳条带的位置相同，则两个加样孔内加入的样品相同 (4)过程②将目的基因导入骨髓瘤细胞的方法是________，过程③中利用选择培养基筛选时，________细胞都会死亡。 (5)图中过程④可通过体内（或体外）培养获得大量抗N蛋白单克隆抗体。与传统的从血浆中提取的抗体相比，抗N蛋白单克隆抗体的优点是________。 【答案】(1) 逆转录 使DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸 (2) 5′ BamHⅠ、SalⅠ 30 GGATCCTTTAAA (3)ABC (4) 显微注射法 未融合和同种融合的 (5)能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备 【详解】（1）根据BCoV扩增的全基因组毒株提取的RNA经过逆转录酶，按照碱基互补配对原则，逆转录出的DNA为模板扩增目的基因片段。引物与模板结合，使DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸，扩增目的基因。 （2）双酶切便于目的基因和质粒正确连接，因此在引物A的5′端添加BamHⅠ酶切序列，引物B的5′端添加SalⅠ酶切序列。PCR循环4次得到16个DNA分子32条链母链不含引物，所以需要引物30个。根据非模板链给出的序列，非模板链序列与引物A部分序列相同，引物A的5′端加BamHⅠ酶切序列，引物序列为5'-GGATCCTTTAAA-3'。 （3）A、琼脂糖浓度较高时，凝胶孔径较小，大分子DNA片段迁移阻力大，难以有效分离，A正确； B、引物过短会导致与模板特异性降低，可能扩增出非目标DNA，导致电泳出现多种条带，B正确； C、凝胶中加入核酸染料，便于紫外灯下观察，电泳缓冲液应没过凝胶，C正确； D、电泳条带位置仅反映DNA片段大小，不同DNA片段若大小相同，则位置一致，无法确定样品是否相同，D错误。 （4）将目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法；过程③的筛选包括：在选择培养基上筛选出杂交瘤细胞，未融合和同种融合的细胞都会死亡。 （5）与传统的从血浆中提取的抗体相比，抗N蛋白单克隆抗体的优点是能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。 6．（2026·黑龙江吉林·二模）抗体是由两条完全相同的重链（H链）和两条完全相同的轻链（L链）连接而成的，两种链近N端可变区（V区），识别结合抗原，近C端是恒定区（C区），结构如图1所示。人表皮生长因子受体-2（HER2）基因和表皮生长因子受体（EGFR）基因是重要的癌基因，在多种肿瘤中共表达，且互相作为旁路耐药通路，大大影响了传统抗体-药物偶联物（ADC）疗法的治疗效果。为了解决这一问题，科研人员构建了双特异性抗体偶联药物（BsADC），同时靶向肿瘤细胞表面HER2和EGFR，实现了对传统ADC疗法的升级。 (1)利用双杂交瘤融合法制备双特异性抗体（如图2）。以传统的单克隆抗体技术制备分别能产生HER2抗体和EGFR抗体的杂交瘤细胞，再将两种杂交瘤细胞融合，需对融合细胞进行_______和抗体检测，与抗原_______出现阳性反应的即为目标细胞。但是此技术制备出的双特异性抗体仍具有较大的随机性，原因是_______。 (2)利用蛋白质工程技术制备双特异性抗体：将HER2抗体和EGFR抗体的轻链与重链可变区DNA序列，通过重叠延伸PCR技术连接在一起，如图3。 根据图4所示的重叠延伸PCR技术原理，为实现DNA片段的精准融合，引物P2的5＇端需要与引物P3的_______端（填“5＇”或“3＇”）序列_______（填“相同”或“互补”）。按照上述原理合成图3所示重组DNA需要设计_______种引物。将融合序列与质粒连接，导入酵母菌获得纯度较高、装配正确的双特异性单链抗体。与大肠杆菌相比，酵母菌作为受体细胞的优势是_______。还需要根据酵母菌偏好的密码子对融合序列进行优化，目的是_______。 (3)HER2与EGFR在多种肿瘤组织中分布不均匀，单靶点治疗可能因无法有效清除低表达靶点的肿瘤细胞，从而诱导适应性耐药及疾病复发。ADC由抗体、接头、药物所组成，其中的“药物”可以是_______、化学药物或放射性物质。与只使用一种单克隆抗体构建的ADC相比，利用HER2-EGFR双抗构建的BsADC的优势在于_______（答出一点即可）。 【答案】(1) 克隆化培养 HER2与EGFR 融合细胞可以产生两种不同的轻重链，这些轻重链可以随机组合 (2) 5′ 互补 8 有内质网和高尔基体，能正确加工真核蛋白，使其活性更高 提高翻译速度和效率（目的蛋白质表达量相应提高） (3) 细胞毒素 BsADC的双靶点识别机制可同时靶向肿瘤细胞表面的两个抗原，提升药物的肿瘤组织特异性（或“克服只使用一种单克隆抗体构建的ADC交叉耐药问题”）。 【详解】（1）单克隆抗体的制备过程，在筛选出杂交瘤细胞后需进行克隆化培养和抗体检测，利用特定抗原（HER2和EGFR）筛选出能产生与之特异性结合的抗体的杂交瘤细胞；在细胞融合后，融合细胞可以产生两种不同的轻重链，这些轻链和重链可以随机组合。 （2）引物的方向均为5'-3'，为构建融合基因，需将引物P2的5'端与引物P3的5'端碱基序列互补；重组DNA中含有4个序列，每个序列需要2种引物，共8种引物；抗体为分泌蛋白，需要内质网和高尔基体的加工和修饰，大肠杆菌为原核生物，不具内质网和高尔基体，但酵母菌为真核生物，具有这两个结构；根据酵母菌偏好的密码子对融合序列进行优化目的是促进目的基因的表达，提高翻译速率。 （3）ADC的药物需要杀伤肿瘤细胞，所以可以是细胞毒素或化学物质等；BsADC的双靶点识别机制可同时靶向肿瘤细胞表面的两个抗原，提高对肿瘤细胞的特异性识别，进而提升药物的杀伤力。 7．（2026·吉林·模拟预测）吉林省是东北亚重要的陆路口岸，近几年出现了输入性疟疾病例。疟原虫感染人体后，疟原虫的pfcrt基因编码的蛋白第76位氨基酸（赖氨酸→苏氨酸）的突变会使疟原虫获得对氯喹的抗药性。为快速筛查氯喹抗性疟原虫，研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1、R2四种备选引物（见图甲），用于扩增目的片段。以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示，再将获得的产物用限制酶Dra Ⅰ（识别序列为5＇-AAATTT-3＇）处理。回答下列问题： (1)PCR扩增pfcrt基因时，因参与合成反应，不断消耗而浓度下降的组分有_________。 (2)根据图甲和图乙信息，若要特异性扩增出包含完整Dra Ⅰ酶切位点区域的目的片段，应选择的引物组合是________。据图可以判断泳道2（F1-R2组合）的条带长度________（填“长于”或“短于”）泳道1（F1-R1组合）。导致两条带在电泳中迁移速率不同的直接原因是_______。 (3)已知敏感型pfcrt基因序列中Dra Ⅰ酶识别位点处编码赖氨酸的密码子为AAA，而抗性型突变后此处变为ACA（编码苏氨酸）。据此判断，Dra Ⅰ酶能切割________（填“敏感型”或“抗性型”）基因的PCR产物，原因是__________。 (4)在进行电泳鉴定实验时，将配制的琼脂糖溶液在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后加入适量的________混匀。 【答案】(1)引物、dNTP (2) F1和R1 长于 DNA片段长度 (3) 敏感型 敏感型pfcrt基因的PCR产物含有DraI酶的识别序列(5’-AAATTT-3’)，而抗性型基因突变导致该识别序列被破坏，无法被DraI酶识别切割 (4)核酸染料 【详解】（1）PCR 扩增时，需要引物、dNTP、Taq酶、模板DNA， 模板DNA数量相对固定，Taq酶起催化作用，含量不会改变，引物、dNTP均会被消耗而浓度下降。 （2）由图乙可知，引物F1和R2扩增出两个条带，引物特异性不强，引物F2和R1无法扩增出条带，引物F1和R1可扩增出一个条带，且扩增的条带包含完整Dra Ⅰ 酶切位点（5'-AAATTT-3'）的区域。R1位于R2的下游（R2更靠近 3' 端），F1-R1扩增的片段更短，迁移速率更快；F1-R2扩增片段更长，迁移更慢。 电泳中，DNA分子的迁移速率主要由片段长度决定（长度越短，迁移越快）。 （3）Dra Ⅰ的识别序列为5'-AAATTT-3'。 敏感型pfcrt基因的PCR产物含有DraI酶的识别序列(5’-AAATTT-3’)，而抗性型基因突变导致该识别序列被破坏，无法被DraI酶识别切割。 （4）琼脂糖熔化稍冷后，加入适量的核酸染料混匀，以便后续观察条带。 8．（25-26高三下·吉林长春·期末）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有_____。 (2)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_____。 (3)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_____（多选题）。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (4)质粒含有2个EcoR Ⅰ、1个Sac Ⅰ和1个BamH Ⅰ的限制酶切割位点。已知BamH Ⅰ位点位于2个EcoR Ⅰ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。泳道③可能是_____的单酶切产物（单酶切产生2个片段大小相同）。 (5)对于电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是_____。 【答案】(1)引物、模板 (2)限制酶、DNA连接酶 (3)ABC (4)EcoR Ⅰ (5)PCR扩增可能会发生碱基对的错配（琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列） 【详解】（1）PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。 （2）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，由于PCR产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶。 （3）A、用稀释涂布平板法计数时，为了使结果更准确，一般选择菌落数为30~300的平板进行计数，稀释涂布平板纯化培养不需要控制每个平板的菌落数，A错误； B、抗性平板上未长出菌落的原因可能是转化失败或涂布器温度过高，一般不是培养基温度太高，B错误； C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能生长，故抗性平板上不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误； D、稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化微生物的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上接种后，长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。 （4）该质粒含2个EcoR Ⅰ位点、1个Sac Ⅰ和1个BamH Ⅰ位点，因此Sac I和BamH Ⅰ有1个酶切位点，单酶切会产生1个线性片段，且大小相同，产生的条带应该是一样的，符合泳道②④中的条带，EcoR Ⅰ单酶切会产生2个大小的片段，电泳后仅显示1个条带，且片段分子量为原质粒的一半，电泳迁移更远（条带位置更靠下），符合泳道③的特征。 （5）PCR扩增可能会发生碱基对的错配，且琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 9．（2026·吉林延边·一模）淀粉经淀粉酶催化水解后的产物是重要的工业原料，但工业化生产常需要在高温条件下进行，而现有的淀粉酶耐热性不强。科研人员利用蛋白质工程设计并人工合成了耐热性强的淀粉酶AmyS2基因，将其导入芽孢杆菌，过程如图1所示。回答下列问题。 (1)科研人员发现将淀粉酶（AmyS1）第27位的亮氨酸替换为天冬氨酸后，能产生耐热性高的淀粉酶（AmyS2），其研究基本思路如下：预期AmyS2功能→设计目标蛋白的结构→________→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）→将获得的基因导入芽孢杆菌生产AmyS2，要替换蛋白质基因中相对应的碱基可以采用________法。 (2)根据图2分析，利用PCR技术扩增AmyS2基因时，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的________。若将1个基因扩增4次，共需要引物________个。 (3)将AmyS2基因与原始质粒A构建成质粒B，应选择的限制酶是________；将质粒B与信号肽基因构建成质粒C，应选择的限制酶是________。 (4)信号肽是一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链。据此推测，与质粒B相比，在工业生产中使用导入质粒C的工程菌生产α-淀粉酶的优势是________，从发酵液中可采取适当的________措施来获得产品。 【答案】(1) 氨基酸序列 定点突变 (2) 乙、丙 30 (3) NdeI和EcoRI MluI和Eco52I (4) 更容易从培养液中获取并提纯目标蛋白质 纯化 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。它是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是涉及多学科的综合科技工程。 【详解】（1）蛋白质工程通常是根据人们对蛋白质功能的特殊要求，对蛋白质的结构进行分子设计，最终通过基因完成，故基本流程是：预期蛋白质功能→蛋白质分子结构设计→推测氨基酸序列多肽链→据核苷酸序列推出脱氧核苷酸序列→DNA合成。本实验利用蛋白质工程对淀粉酶（AmyS2）进行了如下改造：预期AmyS2的功能→设计AmyS2的结构→设计AmyS2的氨基酸序列→人工合成AmyS2基因的脱氧核苷酸序列→将获得的AmyS2基因导入芽孢杆菌生产AmyS2；要替换蛋白质基因中特定碱基，通常采用 ‌定点突变技术‌，该方法允许在已知DNA序列的特定位点引入精确的碱基替换，从而实现对编码氨基酸序列的定向改造。 （2）PCR扩增目的基因时，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸子链。据图分析可知，扩增AmyS2基因时，应选择引物乙、丙。若扩增4次，会产生16个DNA，32条链，其中2条链是原来的母链不需要引物，所以需要30个引物。 （3）目的基因上只有BamHI、NdeI和EcoRI识别序列，若用BamHI进行切割，会破坏AmyS2基因，因此选择NdeI和EcoRI进行切割。根据质粒C的结构以及信号肽基因上的酶切位点可知，将质粒B与信号肽基因构建成质粒C，应选择的限制酶是MluI和Eco52I。 （4）信号肽是一段能够引导目标蛋白质分泌到细胞外的肽链，在工业生产中，使用导入质粒C的工程菌生产α-淀粉酶时，更容易从培养液中获取并提纯目标蛋白质；从发酵液中可采取适当的分离纯化的措施来获得产品，如吸附法获得产品。 10．（25-26高三上·吉林长春·期末）为利用拟南芥合成原人参二醇，需将原人参二醇合成途径中三个关键酶的基因DS、PPDS、CYP450作为目的基因导入拟南芥，所用Ti质粒如图1所示，图中每段阴影为一个功能序列，其中bar为抗草甘膦（一种除草剂）基因，TetR为四环素抗性基因，AmpR为氨苄青霉素抗性基因。BamHI、SmaI、BclI为限制酶切割位点。 (1)传统构建基因表达载体的方法为先用限制酶切割质粒和含目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶进行连接。利用图1Ti质粒构建重组质粒时，目的基因上游和下游应分别具有限制酶______的切割序列。进行转化操作后的农杆菌中存在转入重组Ti质粒的农杆菌、转入空Ti质粒的农杆菌和未转入任何质粒的农杆菌，需利用标记基因______筛选出转化成功的农杆菌。在对转基因拟南芥进行个体生物学水平鉴定时，需利用的标记基因是______。 (2)为更好的构建含DS、PPDS、CYP450基因的重组Ti质粒，科研人员采用了In-Fusion技术，如图2所示。 In-Fusion技术的关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常为15-20bp），然后用In-Fusion酶处理即可实现无缝连接。In-Fusion酶是一种混合酶制剂，既能从任何线性DNA链的5’末端逐个切割下16个脱氧核苷酸，形成黏性末端，也能将具有互补黏性末端的DNA片段进行连接。 ①在对目的基因进行PCR扩增时，除图示物质外，反应体系中还需要添加4种脱氧核苷酸、______和_______，扩增第______个循环开始出现目标产物。 ②设计引物1、引物2需要依据_______的碱基序列，设计引物A、引物B需要依据_______的碱基序列。 ③同源序列1和同源序列2通常采用不同的核苷酸序列，这样设计的优点是_______。 (3)与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion多片段重组技术的优势有_______（至少答出1点）。 【答案】(1) SmaI和BclI TetR和AmpR bar (2) 耐高温的DNA聚合酶（或Taq酶） 含Mg2+的缓冲液 3 质粒 目的基因和质粒 避免（目的基因和线性质粒）反向连接和（目的基因、线性质粒）自身环化 (3)可一次性构建含多个目的基因的表达载体、不受限制酶切割位点（的数量、种类、位置等）的限制等（合理即可） 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）Ti 质粒上的启动子和终止子之间，只有 SmaI 、 BclI 、BamHI 酶切位点，且位于 T-DNA 区，可将目的基因整合到植物染色体上；但同时，BamHI 会破坏 TetR基因，因此应选择 SmaI 和 BclI 来切割质粒和目的基因，保证目的基因插入方向正确且不破坏必需的启动子 / 终止子。空 Ti 质粒含有 TetR（四环素抗性）和 AmpR（氨苄青霉素抗性）基因。重组质粒因插入目的基因，会破坏其中一个抗性基因（如 AmpR）。因此，可同时用 TetR和 AmpR 进行筛选： 未转化农杆菌：对两种抗生素均敏感，无法存活。 转入空 Ti 质粒的农杆菌：对两种抗生素均有抗性。 转入重组 Ti 质粒的农杆菌：仅对其中一种抗生素有抗性（取决于插入位点）。bar 基因是抗草甘膦基因，可作为筛选标记。在转基因拟南芥个体水平鉴定时，可喷洒草甘膦，存活的植株即为成功表达 bar 基因的转基因植株。 （2）① 除模板 DNA 和 4 种脱氧核苷酸外，PCR 体系还需要： 耐高温的 DNA 聚合酶（如 Taq 酶）：催化 DNA 子链合成。 含 Mg²⁺的缓冲液：为 Taq 酶提供适宜的催化环境。 PCR 扩增时，前 2 个循环产物长短不一，从 第 3 个循环 开始才会出现两端引物限定的目标产物。 ② 引物 1 和引物 2 需要依据质粒的碱基序列设计，用于线性化质粒。 引物 A 和引物 B 需要依据目的基因和质粒的碱基序列设计，使 PCR 产物两端带有与线性化质粒匹配的同源序列。 ③ 同源序列设计优点，不同的核苷酸序列可避免 目的基因和线性化质粒反向连接，也能防止 目的基因或线性化质粒自身环化，保证重组方向正确。 （3）与传统酶切连接相比，In-Fusion 技术的优势包括： 可一次性构建含多个目的基因的表达载体，实现多基因共表达。 不受限制酶切位点的数量、种类和位置限制，设计更灵活。 无缝连接，避免酶切位点残留对基因表达的影响。 11．（25-26高三上·内蒙古呼和浩特·期末）大豆Y基因表达的蛋白可通过结合S基因的启动子调控其表达，进而影响大豆对干旱和盐胁迫的抗性。科研人员利用PCR技术扩增Y基因，并构建Y-GFP融合基因表达载体，用其转化大豆细胞研究Y基因的功能。请回答下列问题： (1)利用PCR技术扩增Y基因时，反应体系中需加入______，还需添加耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）和引物；PCR的______阶段，引物会与Y基因的模板链互补结合，该阶段的温度一般为50℃左右。 (2)下图所示Y基因单链（部分）为转录的______（填“模板链”或“非模板链”）。为构建Y-GFP融合基因，需先通过PCR技术剔除Y基因终止密码子对应的碱基序列，再与绿色荧光蛋白基因（GFP）进行拼接。已知EcoRI识别序列为5'-GAATTC-3'，BamHI识别序列为5'-GGATCC-3'，为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP融合蛋白，Y基因下游扩增引物应为5'-______……-3'（包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基）。 (3)将构建的融合基因表达载体导入大豆愈伤组织细胞后，需在含______的培养基上筛选出成功转化的细胞，并进行______信号检测。此外还需从目标细胞中提取蛋白质进行______，检测目的基因是否成功表达。 (4)研究发现过表达Y基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性，S基因是大豆类固醇化合物合成的关键基因，结合题干信息分析，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是______。 【答案】(1) 模板、4种脱氧核苷酸/dNTP 复性 (2) 非模板链 GGATCCATGTTC (3) 潮霉素 绿色荧光 抗原-抗体杂交 (4)Y蛋白通过与S基因启动子结合促进S基因表达，促进大豆类固醇化合物的合成，增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1） PCR反应体系中需加入模板、4种脱氧核苷酸/dNTP作原料，还需添加耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）和引物；PCR扩增过程包括变性、复性和延伸三个阶段，复性阶段使引物通过碱基互补配对与Y基因的模板链结合，这是DNA聚合酶能够沿着模板链延伸合成新的DNA链的前提，该阶段的温度一般为50℃左右。 （2）转录出来的mRNA，翻译时的起始密码子应该是AUG，AUG应该跟模板链TAC互补配对，跟非模板链ATG相同的，图中Y基因单链部分，左端起始位置是ATG刚好跟mRNA的起始位置是相同的，故图1所示Y基因序列为转录的非模板链。Y基因上面没有EcoR I和BamH I的识别序列，所以要扩增Y基因时，引物的5'端是要加上EcoR I和BamH I的识别序列，根据载体结构，左端是启动子，右端是终止子，图中Y基因单链部分是非模板链，所以Y基因是从左到右与载体部分连接。故在Y基因的左端连接EcoR I的识别序列，Y基因的右端连接BamH I的识别序列。即Y基因的下游扩增引物上面应该加BamH I的识别序列，再根据题干信息“在获得Y基因并将其下游终止密码子对应序列剔除”可知，Y基因下游最左端的三个碱基转录为终止密码子UAG，故这三个碱基要剔除，所以为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP融合蛋白，Y基因下游扩增引物12个碱基序列应为5'-GGATCCATGTTC-3'。 （3）由图可知，在T-DNA内部有潮霉素抗性基因，将构建的融合基因表达载体导入大豆愈伤组织细胞后，需在含潮霉素的培养基上筛选出成功转化的细胞，并进行绿色荧光信号检测。此外还需从目标细胞中提取蛋白质进行抗原-抗体杂交，检测目的基因是否成功表达融合蛋白。 （4）由题干信息可知，过表达Y基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性，S基因是大豆类固醇化合物合成的关键基因，根据题目信息和分析结果，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是Y蛋白与S基因启动子序列结合，促进S基因的表达，进而促进大豆类固醇化合物的合成，从而增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。 12．（2026·吉林长春·一模）斜纹夜蛾是危害大豆的主要害虫，该害虫体内的几丁质酶基因（Cht）表达产物能帮助其降解植物细胞壁，从而利于幼虫取食。某科研团队计划通过基因工程结合基因编辑技术，培育一种具有特定抗虫能力的大豆新品种，设计思路如下： ①将Cht基因的启动子（负责响应害虫取食信号）与一种毒蛋白基因（Tox）连接，构建重组载体，并导入大豆细胞。当斜纹夜蛾取食造成植物损伤时，伤口部位分泌的茉莉酸（一种植物信号分子）能诱导该启动子驱动Tox基因表达，产生毒蛋白杀死害虫。 ②利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，敲除或修饰大豆自身的JAZ基因（该基因能抑制茉莉酸信号通路），以增强植株对茉莉酸信号的感知和响应效率，从而提升抗虫效果。 回答下列问题： (1)基因工程的核心步骤是_____。该步骤中，需用_______酶识别并分别切割Cht基因的启动子和Tox基因，使二者产生相同的黏性末端，再用_______酶连接形成融合基因。 (2)茉莉酸诱导Tox基因表达的机制是：茉莉酸与大豆细胞内的受体蛋白结合形成复合物，该复合物与________基因启动子上游的特定响应元件结合，进而启动Tox基因的转录。该设计的优点是____，从而减少对大豆自身代谢的消耗，并降低对非靶标生物的影响。 (3)若要检测Tox基因是否能在茉莉酸诱导下成功表达，可采用________技术检测大豆细胞中是否存在Tox毒蛋白。 (4)利用CRISPR/Cas9编辑JAZ基因后，大豆的抗虫效果显著提升，原因是_______。 (5)与直接喷洒化学杀虫剂相比，该基因工程结合基因编辑的抗虫技术的优势是_______。 【答案】(1) 基因表达载体的构建 相同的限制（同尾） DNA连接 (2) Cht 仅在害虫取食诱导茉莉酸产生时启动毒蛋白表达 (3)抗原-抗体杂交 (4)JAZ基因是茉莉酸信号通路的抑制基因，CRISPR/Cas9编辑后JAZ基因功能丧失，茉莉酸信号通路不再被抑制，其诱导Tox基因表达的效率大幅提升，毒蛋白合成量增加，从而增强抗虫效果 (5)减少化学杀虫剂使用，降低环境污染及农产品农药残留 【分析】基因工程的基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）基因工程的基本操作程序包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测和鉴定，其中基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。该步骤中，需用相同的限制（同尾）识别并分别切割Cht基因的启动子和Tox基因，使二者产生相同的黏性末端，再用DNA连接酶连接形成融合基因。 （2）由题干信息可知：将Cht基因的启动子（负责响应害虫取食信号）与一种毒蛋白基因（Tox）连接，构建重组载体，并导入大豆细胞。当斜纹夜蛾取食造成植物损伤时，伤口部位分泌的茉莉酸（一种植物信号分子）能诱导该启动子驱动Tox基因表达，产生毒蛋白杀死害虫。已知茉莉酸是一种植物信号分子，诱导Tox基因表达的机制是：茉莉酸与大豆细胞内的受体蛋白结合形成复合物，该复合物与Cht基因启动子上游的特定响应元件结合，进而启动Tox基因的转录，翻译出毒蛋白杀死害虫。该设计用到Cht基因的启动子，该启动子能负责响应害虫取食信号，故优点是仅在害虫取食诱导茉莉酸产生时启动毒蛋白表达，从而减少对大豆自身代谢的消耗，并降低对非靶标生物的影响。 （3）若要检测Tox基因是否能在茉莉酸诱导下成功表达出Tox毒蛋白，可利用抗原与抗体特异性结合的原理，采用抗原-抗体杂交技术检测大豆细胞中是否存在Tox毒蛋白。 （4）由题干信息可知，JAZ基因能抑制茉莉酸信号通路，利用CRISPR/Cas9编辑技术敲除或修饰大豆自身的JAZ基因后，JAZ基因功能丧失，茉莉酸信号通路不再被抑制，其诱导Tox基因表达的效率大幅提升，毒蛋白合成量增加，从而增强大豆的抗虫效果。 （5）通过基因工程结合基因编辑技术培育出具有特定抗虫能力的大豆新品种，与直接喷洒化学杀虫剂相比，该基因工程结合基因编辑的抗虫技术的优势是可以减少化学杀虫剂使用，降低环境污染及农产品农药残留。 13．（25-26高三上·吉林·阶段练习）动物器官移植到人体内（异种移植）或是解决全球器官紧缺的办法之一。研究团队对猪肾内皮细胞进行基因编辑、改造后，得到了3种工程细胞和可提供异种移植肾源的供体猪。具体流程及部分测量数据如图示。 (1)研究证实供体猪的3个聚糖抗原基因（3KO）会引致人类、猴等受体的组织不相容。若以未经改造的猪肾作为异体肾源进行器官移植，受体动物的______________细胞和抗体都有可能对供体器官产生特异性攻击效应，导致出现______________现象。利用CRISPR-Cas9编辑技术敲除肾内皮细胞的3KO，该技术需人工设计一种“向导”RNA，其部分序列与3KO的结合遵循________原则，并引导Cas9蛋白断裂DNA双链，从而敲除3KO。 (2)研究表明7个人类基因（7TG）可增加不同物种之间的兼容性。获取7TG的方法有______（答出一种即可）。 (3)为验证敲除3KO、插入7TG对异体细胞的保护作用，研究者将三组细胞与受体猴血清共孵育，置于CO2培养箱中培养，测量裂解细胞数如图b所示。据此得出结论_______。 (4)供体猪器官常携带多种病毒，其中部分病毒潜在人畜传播风险。例如，已有实验证明PERV（猪内源性逆转录病毒）可以整合到体外培养的人类细胞基因组中。试分析若给人进行异种移植，PERV的基因可能通过供体猪器官整合到人类基因组的途径是_________。因此，为确保安全，对已构建好的3KO。7TG。细胞需要进行灭活PERV处理，且在临床试行前须在动物模型中测试。 (5)利用3KO、7TG、RI细胞通过过程④构建供体猪所利用的现代生物学技术有________（答出两种）。 【答案】(1) 细胞毒性T 免疫排斥 碱基互补配对 (2)从基因文库中获取、PCR技术扩增目的基因、化学方法直接人工合成 (3)敲除3KO并插入7TG会对异体细胞有更强的保护作用 (4)供体猪器官携带猪内源性逆转录病毒（PERV），PERV接触并侵染人类细胞，在人体细胞内逆转录形成DNA，整合到人类基因组中 (5)动物体细胞核移植、动物细胞培养 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）免疫排斥反应主要与细胞免疫中的细胞毒性T细胞有关，故若以未经改造的猪肾作为异体肾源进行器官移植，受体动物的细胞毒性T细胞和抗体都有可能对供体器官产生特异性攻击效应，导致出现免疫排斥反应；利用CRISPR-Cas9编辑技术敲除肾内皮细胞的3KO，该技术需人工设计一种“向导”RNA，其部分序列与3KO遵循碱基互补配对原则，并引导Cas9蛋白断裂DNA双链，从而敲除3KO。 （2） 7TG属于目的基因，获取目的基因的方法有：从基因文库中获取、PCR技术扩增目的基因、化学方法直接人工合成等方法。 （3）动物细胞培养时二氧化碳的作用是维持培养液的pH；结合图示可知，与猪肾内皮处理组相比，敲除3KO 并插入7TG最少，说明敲除3KO并插入7TG会对异体细胞有更强的保护作用。 （4）PERV的基因可能通过供体猪器官整合到人类基因组的途径是：供体猪器官携带猪内源性逆转录病毒(PERV)，PERV接触并侵染人类细胞，在人体细胞内逆转录形成DNA，整合到人类基因组中。 （5）从3KO、7TG、RI细胞通过④过程构建供体猪需要对培养动物细胞到早期胚胎阶段，还涉及体细胞核移植的过程，故所利用的现代生物学技术有：动物体细胞核移植、动物细胞培养(或早期胚胎培养、胚胎移植)。 14．（25-26高三上·吉林松原·开学考试）为保护濒危植物普陀鹅耳枥（2n=16）并改良其生长特性，科研人员尝试将其与同属近缘物种天台鹅耳枥（4n=32）进行体细胞杂交。已知普陀鹅耳枥具有抗虫基因A，但生长缓慢；天台鹅耳枥生长迅速且耐寒，但不抗虫。如图表示体细胞杂交过程，回答下列问题: (1)a过程获得原生质体所用的酶是________，该过程中发现普陀鹅耳枥的原生质体大量破裂，推测原生质体破裂的可能原因有________。 (2)过程b中可采用化学试剂________促使原生质体相互融合，成功融合的杂种细胞含________个染色体组。杂种细胞形成的标志是________。 (3)成功培育的杂种植株（不考虑同种融合的植株）出现三种表型：①抗虫但生长缓慢 ②不抗虫但生长迅速 ③抗虫且生长迅速但不耐寒。从细胞分裂角度分析，表型①和②的出现可能与______过程异常有关，从基因表达调控的角度分析，表型③中耐寒性状缺失的原因可能是______。 【答案】(1) 纤维素酶和果胶酶 酶解时间过长、酶浓度过高、渗透压不适宜等 (2) 聚乙二醇/PEG 六/6 新细胞壁的形成 (3) 杂种细胞分裂时来源于不同亲本的染色体随机丢失 天台鹅耳枥控制耐寒性状的基因未表达（或基因的选择性表达，天台鹅耳枥的耐寒基因在杂种植株中未表达） 【详解】（1）植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，要获得原生质体，需要用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁。普陀鹅耳枥的原生质体大量破裂，可能是因为酶解时间过长，对原生质体造成过度损伤；也可能是酶浓度过高，破坏了原生质体的结构；或者是渗透压不适宜，原生质体因吸水或失水而破裂等。 （2）促使原生质体融合的化学试剂常用聚乙二醇（PEG）。普陀鹅耳枥（2n=16）含2个染色体组，天台鹅耳枥（4n=32）含4个染色体组，二者原生质体融合后，成功融合的杂种细胞含2+4=6个染色体组。杂种细胞形成的标志是新细胞壁的形成，因为细胞壁的形成意味着细胞结构的完整构建。 （3）表型①（抗虫但生长缓慢）和②（不抗虫但生长迅速）的出现，从细胞分裂角度分析，可能是杂种细胞分裂时来源于不同亲本的染色体随机丢失，从而使杂种植株只表现出亲本一方的部分性状。表型③中耐寒性状缺失，从基因表达调控角度看，是因为天台鹅耳枥控制耐寒性状的基因在杂种植株中未表达，即基因的选择性表达，导致该性状无法体现。 15．（2026·黑龙江哈尔滨·一模）单个B细胞抗体制备技术是近年来发展的快速制备单克隆抗体的新技术。该技术利用“一个B细胞只含有一个功能性重链可变区DNA序列和一个轻链可变区DNA序列，且只产生一种特异性抗体”的特点，从免疫动物脾组织或外周血中分离出抗原特异性B细胞，可通过单细胞PCR技术从单个B细胞中扩增IgG重链和轻链可变区基因，再将其导入哺乳动物细胞中表达，最终获得具有生物活性的单克隆抗体。兔单抗以其高亲和力和多样性在基础研究和药物研发中颇受青睐。请结合下图回答问题： (1)对兔多次使用同种抗原进行刺激的目的是_______。 (2)抗原特异性B细胞磁场分离技术核心步骤是：制备混合细胞悬液，目标抗原直接偶联磁珠，再放入磁场，利用抗原与B细胞表面_________特异性结合的原理分离目标细胞，实现目标细胞富集。然后利用动物细胞培养技术对单B细胞进行_________，通过_______进行筛选。 (3)借助融合PCR技术整合抗体轻链和重链基因，图2过程设计的P2和P3引物的添加序列必须能够发生_______。融合PCR步骤1中，至少进行_________次循环才能获得基因重链基因的PCR产物。若要对重链、轻链融合基因继续进行PCR扩增，则图2中的M、N处位置所需要的引物分别是_________。 (4)图3中电泳图中_________号条带最可能表示融合后片段，若PCR没有扩增出任何产物，则可能的原因是________（至少两点）。 (5)由图1和图4判断，构建重组基因表达载体，为保证目的基因的插入部位位于EF1A启动子与SV40 late pA之间的表达框内（在Kozak序列之后），切割质粒时不宜使用的限制酶是________。此外，不宜同时选用酶SpeI和XbaI，原因是__________。 【答案】(1)获得能产生特定抗体的B淋巴细胞 (2) 受体 克隆化培养 抗体（阳性）检测 (3) 碱基互补配对 2 P1、P4 (4) 4 复性温度太高；引物设计不合理无法与目的基因结合 (5) EcoRI 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向连接 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取和鉴定；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）对兔多次使用同种抗原进行刺激的目的是‌促进B细胞增殖、分化，产生更多的产生特定抗体的B淋巴细胞。因为多次抗原刺激可以使免疫系统对该抗原的记忆更深刻，激活更多的B细胞，从而产生大量能分泌特定抗体的B细胞，为后续获取足够数量的抗原特异性B细胞做准备。 （2）抗原特异性B细胞磁场分离技术是基于抗原与B细胞表面的受体特异性结合的原理。单B细胞数量较少，需要克隆化培养进行体外扩增以获得足够数量用于后续实验，而抗原-抗体杂交技术（抗原阳性检测）可以特异性地筛选出能产生目标抗体的细胞。 （3）P2和P3引物的添加序列能够碱基互补配对才能使轻链和重链基因在PCR过程中连接起来。第一次循环是以重链基因和轻链基因为模板分别合成部分融合链，第二次循环才能以新合成的链为模板合成完整的重链基因PCR产物，所以至少进行2次循环才能获得基因重链基因的PCR产物。据图可知，M处要扩增融合基因的上游需要P1引物，N处扩增下游需要P4引物。 （4）融合后的片段长度较长，在电泳图中迁移速度最慢，所以4号条带最可能是融合后片段。引物设计不合理可能导致引物与模板无法结合；模板质量差会影响扩增效率；反应体系不合适可能使反应无法正常进行；退火温度不合适会影响引物与模板的特异性结合。 （5）从图4可以看出EcoRI的切割位点在Kozak序列之前，不在EF1A启动子与SV40 late pA之间的表达框内，所以不宜使用。SpeI和XbaI酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向连接。 16．（2026·黑龙江哈尔滨·一模）CRISPR/Cas系统是目前最高效的基因组编辑工具之一。CRISPR-Cas9包含两种核心组分：一是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，二是具有导向功能的sgRNA。sgRNA上的支架序列可结合Cas9蛋白，sgRNA5'端的20个碱基可与目标DNA碱基配对，引导Cas9靶向切割DNA（图1）。 利用该技术敲除小鼠胚胎干细胞的目标DNA序列，操作步骤如下。请回答下列问题： 第一步：设计sgRNA5'端序列 5'-GUCACUCUCAUAUAGAGAUC-3'（20个碱基） (1)第二步：构建重组DNA 载体LentiCRISPRv2（图2）上含有限制酶BsmBI的识别序列（N代表任意一种碱基）： 5'-CGTCTCN↓-3' 3'-GCAGAGNNNNN↑-5' ①载体LentiCRISPRv2上的一段序列（包含两个BsmBI的识别序列）为： 5'-ACACCG  GAGACG  GTTGTA……TTTGTA   CGTCTC  TGTTTT-3' 3'-TGTGGC  CTCTGC   CAACAT……AAACAT  GCAGAG  ACAAAA-5' 请在上述序列中用“↓”“↑”标出BsmBI的酶切位点_____。 ②根据sgRNA5'端序列，设计两端带有黏性末端的双链sgDNA，以便直接连接到限制酶BsmBI酶切后的载体上。若其中一条链为5'-CACCGTCACTCTCATATAGAGATC-3'，则另外一条链的序列为_____。 A．5'-AAACGATCTCTATATGAGAGTGAC-3' B．5'-CAGTGAGAGTATATCTCTAGCAAA-3' C．5'-CACCGATCTCTATATGAGAGTGAC-3' (2)第三步：转化与筛选 重组DNA导入小鼠胚胎干细胞前，需先在大肠杆菌中进行扩增。将构建好的重组DNA转入处于_______的生理状态的大肠杆菌，用含________的培养基筛选含重组DNA的大肠杆菌，再通过测序确定sgDNA是否正确连接到载体上。 (3)第四步：导入与编辑 将扩增后的重组DNA通过一定的技术导入小鼠胚胎干细胞。sgRNA5'端的20个碱基序列用来识别结合______，载体LentiCRISPRv2上还含有_______序列，该序列的转录产物可以与载体相应序列表达的Cas9蛋白组装成CRISPR/Cas系统，定点切割DNA双链。在功能上，Cas9蛋白属于_________酶。 (4)Cas9切割DNA后，基因编辑的完成依赖于细胞自身的修复机制，可不依赖任何模板，直接将断裂的DNA末端连接起来。这一过程常会导致多个碱基的插入或缺失，造成目标DNA序列发生_______，从而实现目标DNA序列敲除的效果。 【答案】(1) A (2) 容易吸收外源DNA 氨苄青霉素 (3) 目标DNA序列 sgRNA支架 限制 (4)（基因）突变 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）①根据限制酶BsmB I的识别序列5'-CGTCTCN↓-3'和3'-GCAGAGNNNNN↑-5'，N代表任意一种碱基，在载体LentiCRISPRv2的给定序列中，第一个BsmB I识别序列为3'-GCAGAGGCCAC↑-5'（对应3'-GCAGAGNNNNN↑-5'），5'-CGTCTCC↓-3'（对应5'-CGTCTCN↓-3'），第二个BsmBI识别序列为3'-GCAGAGACAAA↑-5'（对应3'-GCAGAGNNNNN↑-5'），5'-CGTCTCT↓-3'（对应5'-CGTCTCN↓-3'），所以酶切结果为。 ②根据sgRNA5'端序列，设计两端带有黏性末端的双链sgDNA，根据已知链，确定互补链，再结合黏性末端设计。已知一条链为5'-CACCGTCACTCTCATATAGAGATC-3'（5'-CACC是黏性末端，与BsmB I酶切形成的黏性末端相同），其互补链的碱基序列需与该链反向互补，且黏性末端需匹配BsmB Ⅰ酶切后的末端（5'-AAAC-），所以其互补链的序列为5'-AAACGATCTCTATATGAGAGTGAC-3'，A正确，BC错误。 故选A。 （2）将构建好的重组DNA转入处于容易吸收外源DNA的生理状态的大肠杆菌。用含氨苄青霉素的培养基筛选含重组DNA的大肠杆菌，由于载体上含有氨苄青霉素抗性基因，含重组DNA的大肠杆菌能在该培养基上生长。 （3）由题图信息可知，sgRNA5'端的20个碱基序列用来识别结合目标DNA序列，载体LentiCRISPRv2上还含有sgRNA支架序列，该序列的转录产物可以与载体相应序列表达的Cas9蛋白组装成CRISPR/Cas系统，定点切割DNA双链。在功能上，Cas9蛋白能切割DNA双链，属于限制酶。 （4）Cas9切割DNA后，细胞自身修复机制导致多个碱基的插入或缺失，造成目标DNA序列发生基因突变，从而实现目标DNA序列敲除的效果。 17．（25-26高三上·黑龙江哈尔滨·期末）甜米酒是我国的传统酒种，某酿酒厂以无核黄皮果（富含维生素、有机酸及特殊的香味）为辅料研制出黄皮甜米酒，该酒具有消食、润肺和清热解毒等功效。制作黄皮甜米酒的工艺流程如下图所示。回答下列问题： (1)图中甜酒曲的主要作用是_______________。 (2)与传统发酵相比，现代发酵工程具有很多的优势，其基本环节一般包括菌种选育，扩大培养，培养基配制，灭菌，__________，发酵，产品的____________________等。 (3)我国的酿酒技术历史悠久，古人在实际生产中积累了很多经验。《齐民要术》记载：“世人云：米过酒甜，此乃不解法候。酒冷沸止，米有不消者，便是曲势尽。”下列有关叙述错误的是____。（单选） A．“米过酒甜”是因为米中糖类物质过量，发酵停止时仍未被完全消耗 B．“酒冷沸止”说明微生物的代谢产热和释放CO2逐渐停止 C．“曲势尽”的原因可能是米酒中pH或酒精含量升高 D．酿制米酒所用的主要微生物，其代谢类型为异养兼性厌氧 (4)对酒曲微生物进行分离纯化时，配制培养基的成分为蛋白胨、酵母提取物、NaCl、水，其中蛋白胨能为细菌提供的主要营养是碳源、_________________。 (5)在制作黄皮甜米酒的过程中，为确定黄酒高活性干酵母（YWBY）的添加量及发酵时间，研究人员进行了相关实验，实验结果如下图所示。根据实验结果制作黄皮甜米酒时，YWBY的最佳接种量及主发酵时间分别是_________________。YWBY接种量为0.12%时，酒精含量最低的原因可能是________________。 【答案】(1)甜酒曲主要作用是分泌糖化酶，将糯米中淀粉分解为葡萄糖等可发酵性糖 (2) 接种 分离、提纯 (3)C (4)氮源、维生素等 (5) 0.10%、8天 接种量较大，酵母菌数量增长过快导致葡萄糖消耗过多，用于酵母菌无氧呼吸产生酒精的葡萄糖减少或酵母菌大量快速繁殖后抑制甜酒曲糖化过程，使碳源少 【分析】本题目以黄皮甜米酒酿造为背景，结合流程图、实验数据折线图考查发酵工程原理。图片中两张折线图分别展示了不同酵母接种量对酒精度和还原糖含量的影响。不同YWBY接种量（0.06%~0.12%）下，酒精含量在第8天达峰值，0.10%组最高；还原糖随时间下降，8天后趋于稳定。表明最佳接种量为0.10%，主发酵时间为8天左右。 【详解】（1）甜酒曲中含有多种微生物，微生物会分泌糖化酶，能将糯米中的淀粉先水解为葡萄糖（糖化），再由酵母菌发酵生成酒精和CO2。 （2）现代发酵工程的基本流程包括：菌种选育→扩大培养→培养基配制→灭菌→接种→发酵→产品的分离、提纯。 （3）A、“米过酒甜”指米未完全发酵，糖分残留导致酒味偏甜，A正确； B、“酒冷沸止”指发酵停止，不再产热和CO₂，说明微生物代谢活动减弱或终止，B正确； C、“曲势尽”指酒曲中微生物活性丧失，通常是因为环境条件恶化（如pH下降、酒精浓度升高抑制微生物生长），但“pH升高”不符合事实——发酵过程中酵母菌产生CO₂溶于水形成碳酸，且酒精发酵本身不显著提高pH，反而可能因有机酸积累而降低pH，C错误； D、酿制米酒主要依赖酵母菌，其代谢类型为异养兼性厌氧，C正确。 故选C。 （4）蛋白胨是蛋白质部分水解产物，主要提供氮源，也含有碳源、维生素等营养物质。 （5）根据左图（酒精含量随时间变化）和右图（还原糖含量随时间变化），在发酵第8天左右，酒精含量达到峰值，且不同接种量下0.10%的酒精产量最高；同时还原糖消耗也趋于稳定。因此，最佳接种量为0.10%，主发酵时间为8天左右；YWBY接种量为0.12%时，酒精含量最低的原因可能是：接种量较大，酵母菌数量增长过快导致葡萄糖消耗过多，用于酵母菌无氧呼吸产生酒精的葡萄糖减少或酵母菌大量快速繁殖后抑制甜酒曲糖化过程，使碳源少 。 18．（2026·内蒙古乌海·模拟预测）香菇是具有丰富营养价值和药用价值的食用真菌，被称作“山珍之王”。研究人员发现香菇体内的Lp-11蛋白具有抑制肿瘤细胞生长并诱导细胞凋亡的作用。为了获得大量纯净的Lp-11蛋白，研究人员操作流程如图1，序号①-④表示各个环节。回答下列问题： 注：pET32a质粒上的KanR中沿转录方向标注的5个限制酶的酶切位点之间的距离依次为40bp、30bp、90bp、50bp，bp表示碱基对。 (1)图1过程①需要在______酶的作用下进行。①②过程获取的目的基因不含______（答出2点）。 (2)为使目的基因与pET32a质粒（长度为5900bp）正确连接，在设计PCR引物时可将引物的______（3'或5'）端添加限制酶的识别序列，与a链和b链相结合的引物上添加的分别是限制酶______、______的识别序列。若计划用1个Lp-11基因为模板获得n个Lp-11基因，则PCR过程中消耗的引物总量是______个。 (3)图1的④过程，通常先用______将受体细胞处理成感受态，此时细胞的特点是______。受体菌应筛选出______（填“具有”或“不具有”）氨苄青霉素抗性的大肠杆菌。 (4)为了检测目的基因是否插入到pET32a质粒中，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图2。样品______最可能是插入了目的基因的重组质粒。 【答案】(1) 逆转录 内含子、启动子和终止子等 (2) 5' Xho Ⅰ BamH Ⅰ 2n-2 (3) Ca2+ 处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 具有 (4)2 【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 2、分析题图：①②是目的基因的获取，③是基因表达载体的构建，④是将目的基因导入细胞，⑤目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）①过程是以RNA为模板合成cDNA的过程，被称为逆转录，需要逆转录酶催化。①②过程获得的目的基因不含内含子、启动子和终止子等。 （2）在设计PCR引物时可将引物的5'端添加限制酶的识别序列，扩增后的产物两端会包含该序列，从而被相应的限制酶切割。目的基因上有Sal Ⅰ和Mun Ⅰ两个限制酶的酶切位点，若选用它们，目的基因因切割破坏基因的结构而失去活性，pET32a质粒上也有多个酶切位点，但两个标记基因中有EcoR Ⅰ的酶切位点，若选用它，会破坏两个标记基因，因此不能选，由于Lp-11基因的b链为转录的模板链，结合质粒上PO(启动子)所在位置，可推知与a链和b链相结合的引物上添加的分别是限制酶Xho Ⅰ和BamH Ⅰ。当DNA在进行PCR扩增时，每个子链的延伸都需要引物，1个Lp-11基因为模板获得n个Lp-11基因，共有2n条链，两条母链不需要引物，所以PCR过程中消耗的引物总量是2n-2。 （3）④过程是将目的基因导入受体细胞中，通常先用Ca2+将受体细胞处理成感受态，此时细胞的特点是处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。限制酶Xho Ⅰ和BamH Ⅰ切割质粒而插入目的基因，会导致卡那霉素抗性基因失活，而氨苄青霉素抗性基因保持活性，作为标记基因在筛选中起作用。因此，重组大肠杆菌的质粒上必须含有氨苄青霉素抗性基因，即选用具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌进行进一步检测。 （4）pET32a质粒长度为5900bp，用限制酶Xho Ⅰ和BamH Ⅰ进行切割，会切割掉长度为120bp（30bp+90bp）的片段，剩余的质粒的长度为5780bp，然后再与长度为357bp的目的基因连接。这样插入了目的基因的重组质粒用两端添加的限制酶切割，会出现长度为5780bp、357bp的片段，故样品2最可能是插入了目的基因的重组质粒。 19．（2026·内蒙古呼和浩特·一模）腺相关病毒（AAV）是一种单链DNA缺陷型非包膜病毒，是临床基因治疗广泛使用的载体。Otof基因（6kb）编码R蛋白，突变可导致常见先天性耳聋。中外科研人员利用AAV双载体系统递送人源正常Otof基因，通过基因工程技术治疗先天性耳聋取得显著疗效。请分析回答： (1)体外可利用________技术扩增Otof基因，通过大容量载体将此目的基因导入受体细胞的缺点是感染率和成活率低。 (2)Otof基因和AAV基因组如图1、图2所示，单个AAV能运载的最大目的基因仅为4.7kb．若“↓”为可选择的酶切位点，则图1需要将Otof基因拆分为大小分别为________的5′-Otof和Otof-3′片段，分别装入AAV载体形成AAV重组载体1和2（图3）。此外，为确保两段基因在细胞内表达，重组载体中需包括启动子和________等序列。 (3)重组载体1和2共感染同一受体细胞后复制形成双链，随后重组载体2表达Cre酶切割重组载体1和2中的lox位点，产生黏性末端，实现两段DNA精准对接。若重组载体1中lox序列如图4，则重组载体2的lox序列可否为图5所示序列，请说明理由________。 (4)为了使R蛋白基因只在特定细胞中表达，重组载体1应选择________（填器官名称）部细胞中特异性表达基因的启动子。为减少Cre酶对受体细胞的其他影响，重组载体2的启动子应选择________（填“强”或者“弱）启动子。 (5)若要从个体水平检测Otof基因是否表达并发挥作用，临床上通常先通过动物进行实验，可选取Otof基因敲除小鼠模型，实验组静脉注射AAV双载体，对________（答出一种即可）进行检测，以确定Otof基因在受体细胞中重组并表达。 【答案】(1)PCR (2) 3.5kb和2.5kb（顺序可以互换） 终止子 (3)否，因为经Cre酶切后5’-Otof的片段与含3’-Otof片段的黏性末端没有碱基互补配对，无法连接（能够与含5’-Otof片段黏性末端连接的不是含3’-Otof的片段；能够与含3’-Otof片段黏性末端连接的不是含5’-Otof的片段） (4) 耳 弱 (5)听觉功能（听力） 【详解】（1）体外可利用PCR技术扩增Otof基因，通过大容量载体将此目的基因导入受体细胞的缺点是感染率和成活率低，因而需要改进相应的方法。 （2）Otof基因和AAV基因组如图1、图2所示，单个AAV能运载的最大目的基因仅为4.7kb．若“↓”为可选择的酶切位点，则图1需要将Otof基因拆分为大小分别为3.5kb和2.5kb的5′-Otof和Otof-3′片段，分别装入AAV载体形成AAV重组载体1和2（图3）。此外，为确保两段基因在细胞内表达，重组载体中需包括启动子和终止子等序列，保证目的基因的顺利表达。 （3）重组载体1和2共感染同一受体细胞后复制形成双链，随后重组载体2表达Cre酶切割重组载体1和2中的lox位点，产生黏性末端，实现两段DNA精准对接。若重组载体1中lox序列如图4，则重组载体2的lox序列不能为图5所示序列，因为经Cre酶切后<5’-Otof的片段与含3’-Otof片段的黏性末端没有碱基互补配对，无法连接。 （4）为了使R蛋白基因只在特定细胞中表达，重组载体1应选择耳部细胞中特异性表达基因的启动子，该操作可以保证目的基因在特定部位的表达。为减少Cre酶对受体细胞的其他影响，重组载体2的启动子应选择弱启动子，避免对受体细胞其他部位的基因产生切割。 （5）若要从个体水平检测Otof基因是否表达并发挥作用，临床上通常先通过动物进行实验，可选取Otof基因敲除小鼠模型，实验组静脉注射AAV双载体，对听觉功能（听力）进行检测，进而检测Otof基因在受体细胞中是否进行重组并表达。 20．（2026·内蒙古鄂尔多斯·一模）细菌治疗肿瘤是将特定细菌注入机体后，细菌趋向并聚集于肿瘤组织，通过刺激机体产生特异性免疫反应，进而实现清除肿瘤组织的治疗方法。科研人员欲构建一种在激光照射下，可将光能高效转化为热能，诱导Noxa基因表达的工程菌。其中Noxa是一种具有强烈诱导细胞凋亡能力的蛋白质，ClyA是可以展示在细胞膜表面的蛋白质，图为相关基因表达载体的构建过程。回答下列问题。 注：Tcl为温控基因，其控制合成的蛋白质在37℃时能抑制温度诱导型启动子的活性，在42℃时该蛋白质失活。 (1)PCR扩增目的基因：PCR技术中，引物的作用是使DNA聚合酶能从引物的________端开始连接脱氧核苷酸。若2链和4链为基因转录的模板链，则引物________有互补区段，重叠产物1中的两条链是________（从“1链”“2链”“3链”“4链”中选填），其延伸过程不需要引物的原因是____________________________。 (2)制备温度响应型细菌：用EcoRⅠ和SalⅠ对pBV220载体和ClyA-Noxa融合基因片段分别进行双酶切，用________将酶切后的载体和融合基因片段连接，将基因表达载体导入大肠杆菌，并涂布于含________的全营养LB固体培养基中筛选。 (3)目的基因的检测与鉴定：挑取上述培养基中的单菌落，接种后分别置于温度为________的培养箱中培养，一段时间后检测，若________，且表达产物既能展示在细胞表面且具有强促凋亡活性，则温度响应型细菌构建成功。 (4)温度诱导型启动子是该工程菌的重要元件，若其持续活跃，可能带来的风险是__________________。 【答案】(1) 3' F2和R1 1链和4链 互为引物 (2) DNA连接酶 氨苄青霉素 (3) 37℃和 42℃ 37℃条件下未检测Cly-Noxa融合蛋白，42℃能检测到（只有42℃能检测到Cly-Noxa融合蛋白） (4)正常细胞凋亡（细菌在未到达肿瘤前就被免疫系统清除，降低疗效） 【详解】（1）PCR 中，DNA 聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。若2链和4链为转录模板链（即 3'→5'），则引物需与模板链互补，故引物F2和R1有互补区段。重叠产物1中的两条链是1链和4链（1链的3'端与4链的5'端存在互补序列）。延伸过程不需要引物的原因是：两条单链的末端存在互补序列，变性后可互为引物，在DNA聚合酶作用下延伸。 （2）用DNA连接酶（T4DNA 连接酶）将酶切后的载体和融合基因片段连接。涂布于含氨苄青霉素的全营养LB固体培养基中筛选（因为质粒上含有氨苄青霉素抗性基因）。 （3）根据题注可知，Tcl为温控基因，其控制合成的蛋白质在37℃时能抑制温度诱导型启动子的活性，在42℃时该蛋白质失活，所以要分别置于温度为37℃和42℃的培养箱中培养。若37℃条件下未检测Cly-Noxa融合蛋白，42℃能检测到（只有42℃能检测到Cly-Noxa融合蛋白），说明温度响应型细菌构建成功。 （4）若启动子持续活跃，会导致Noxa 基因持续表达，使工程菌正常细胞凋亡（细菌在未到达肿瘤前就被免疫系统清除，降低疗效）。 21．（25-26高三上·内蒙古锡林郭勒·期末）水稻种子主要包括胚和胚乳，其中胚乳被加工成精米食用。为培育在胚乳中不含外源基因的安全转基因水稻，某研究团队设计了一种新策略，思路如下：导入：通过农杆菌转化法将含双T-DNA单质粒导入水稻细胞，并整合至染色体中。单质粒部分结构示意图如下，其中T-DNA1与T-DNA2是两个相对独立的区域。 注：①位于同一质粒且物理距离极短的T-DNA1和T-DNA2，常以大片段形式一同插入染色体DNA某一位点； ②LB和RB分别为T-DNA的左右边界序列； ③“→”和“←”代表相关序列PCR扩增时所需引物，其中“→a”和“b←”为边界序列引物； ④P1~P4为启动子。潮霉素抗性基因（hpt）为标记基因；报告基因gus的染色检测（催化无色底物X-Gluc产生蓝色沉淀）会杀死细胞，无法用于初筛。 初筛：利用T-DNA2中标记基因hpt高效筛选成功吸收外源DNA的活细胞。 复筛：利用gus作为抗虫基因的“替身”，能直观、准确反映抗虫基因在胚乳中的特异性删除情况，其效果远优于抗虫基因繁琐的生物测定。 删除：Cre基因编码的Cre酶可特异性识别同一DNA中两个loxP位点并删除两位点之间的序列。 回答以下问题： (1)初筛时，需向培养液中加入______，从而筛选出成功吸收外源DNA的活细胞；删除时用到的Cre酶与基因工程中的______（工具酶）作用类似。 (2)为初步分析双T-DNA在水稻染色体上的整合情况，研究者进行了两类PCR检测： ①提取______，并以此作为模板，利用引物hpt1/hpt2和gusA/gusB分别进行PCR，目的是检测______。 ②使用边界序列引物“→a”和“b←”进行PCR，若结果为阴性（不能扩增出相关序列条带），则T-DNA1和T-DNA2极有可能整合到_______（填“同一条”或“不同”）染色体上（不考虑两者相互破坏的情况）。 (3)研究人员种植了共转化成功的T0代株系，并对其自交后代T1植株进行表型分析，相关统计结果如下表所示（不考虑减数分裂时染色体互换、突变）。 T0代株系编号 T1代总株树 T1代表型 gus+/hpt+ gus+/hpt- gus-/hpt+ gus-/hpt- GH1-1 30 16 6 6 2 GH1-45 42 30 0 0 12 （gus+和gus-分别表示有、无gus蓝色反应，hpt+和hpt-分别表示有、无潮霉素抗性） 表中T0代编号为_______的株系中的双T-DNA整合到非同源染色体上，且每种T-DNA最有可能是_______（填“单”或“多”）次整合；表中T1代植株表型为_______的即为目标植株，其种子的胚乳进行gus染色检测未出现蓝色反应，这依赖于组织特异性启动子______。（填“P1”“P2”“P3”或“P4”） 【答案】(1) 潮霉素 限制酶（或限制性内切核酸酶） (2) 转基因水稻的染色体DNA T-DNA1与T-DNA2是否共同转化到了水稻细胞中 不同 (3) GH1-1 单 Gus+/hpt- P1 【分析】基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）初筛原理：标记基因hpt编码潮霉素抗性蛋白，因此加入潮霉素可筛选出成功转化并表达该基因的活细胞；删除机制：Cre酶能特异性识别并切割loxP位点，删除其间序列，此“识别特定序列并进行切割”的功能与基因工程中的限制酶作用类似。 （2）①通过农杆菌转化法将含双T-DNA单质粒导入水稻细胞，并整合至染色体中，故共转化检测时应提取转基因植株的染色体DNA作为模板；用两对分别位于T-DNA1（gus）和T-DNA2（hpt）内部的引物进行PCR，是为了检测两个T-DNA是否同时存在于同一细胞（即共转化成功），据此可计算共转化率。 ② 因位于同一质粒且物理距离极短的T-DNA1和T-DNA2，常以大片段形式一同插入染色体DNA 某一位点，使用边界序列引物进行PCR，若结果为阴性，说明这两个边界在基因组上不邻近，即两个T-DNA没有首尾相连地整合到同一位点，因此它们极有可能整合到了不同的染色体上。 （3）若双T-DNA整合到一对同源染色体上，共转化片段将连锁遗传，后代不会出现9∶3∶3∶1的比例。若双T-DNA整合到非同源染色体上，则遵循基因自由组合定律，后代性状分离比为9∶3∶3∶1的比例，据此可判断GH1-1为双T-DNA整合到非同源染色体上的株系；由于T1代植株的表型分离比符合9∶3∶3∶1的理论值，表明两个T-DNA均作为单一位点遵循孟德尔遗传，故可推断每种T-DNA最有可能是单次整合，因为多次整合会破坏该理论分离比；表中表型为（Gus+/hpt-）的个体为目标植株，因为该植株由T0通过自交删除标记基因hpt，同时其胚乳中组织特异性启动子P1驱动Cre表达，表达产物Cre酶特异性地删除了抗虫基因和gus基因（表现为胚乳gus染色阴性），从而实现了胚乳不含外源基因且植株无标记基因残留的育种目标。 22．（25-26高三上·内蒙古乌兰察布·月考）图2表示苹果醋的简易制作装置和制作流程。发酵工程在医药上的应用非常广泛，其中青霉素的发现和产业化生产进一步推动了发酵工程在医药领域的应用和发展。产黄青霉菌是一种广泛存在于自然界中的霉菌，是生产青霉素的重要工业菌种。工业上生产青霉素的发酵工程流程如图1所示，据图回答下列问题： (1)用图2装置酿酒结束后，若要直接转入果醋发酵，改变的环境条件是___________。 (2)图1整个发酵过程的中心环节是___________。在制备该培养基时，除了添加必要的营养成分外，还需要将pH在灭菌___________(填“前”或“后”)调至酸性。在青霉素生产过程中___________都必须经过严格的灭菌。 (3)欲从土壤中分离出能产生纤维素酶的纤维素分解菌，若将样品接种到分离纤维素分解菌的培养基上，在该培养基中需要加入的特殊染料是___________，通过观察是否产生___________来筛选纤维素分解菌。 (4)对产黄青霉菌进行分离纯化并计数采用了___________法，其可以用来计数的原理为___________。为了避免混淆，本实验纯化菌种时使用的平板需要在培养皿的___________(“皿盖”或“皿底”)做好标记。然后在恒温培养箱中需培养1-2d，每隔24h统计一次菌落数目，选择菌落数目稳定时的记录作为结果，其目的是___________。 【答案】(1)通入无菌空气(或氧气)，将温度从18~30℃提高到30~35℃ (2) 发酵罐中发酵 前 菌种、培养基、发酵设备(答出两点即可) (3) 刚果红 透明圈 (4) 稀释涂布平板 当样品稀释度足够高时，培养基表面生长的单个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌 皿底 防止因培养时间不足导致遗漏菌落数目 【分析】本题图1展示青霉素工业化生产流程，包括菌种扩增、培养基制备、灭菌、接种、发酵及产物提取等环节，体现发酵工程的系统性。图2为苹果醋简易装置，含充气口和排气口，用于酒精发酵后转为有氧醋酸发酵，结构简单但功能明确，反映发酵过程对氧气需求的变化。 【详解】（1）酿酒过程需要在无氧条件下进行，果醋发酵需要在有氧条件下发生，酿酒的适宜温度大约在18~30℃，而果醋酿造的适宜温度大约是30~35℃，因此用图1装置酿酒结束后，若要直接转入果醋发酵，改变的环境条件是通入无菌空气（氧气）、升高温度。 （2）图1整个发酵过程的中心环节是发酵罐中发酵。在制备该培养基时，除了添加必要的营养成分外，还需要将pH在灭菌前调至酸性。灭菌对象包括培养基、发酵罐、接种菌种等所有接触发酵液的设备和材料，以防止污染。 （3）欲从土壤中分离出能产生纤维素酶的纤维素分解菌，可用加入纤维素作为唯一碳源制成的选择培养基进行分离，这样只有能分解利用纤维素的细菌才能在该培养基上生长。在分离纤维素分解菌的培养基中需要加入的特殊染料是刚果红。刚果红能与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，所以通过观察是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 （4）产黄青霉菌进行分离纯化并计数采用了稀释涂布平板法，其可以用来计数的原理为当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。为了避免混淆，本实验纯化菌种时使用的平板需要在培养皿的皿底做好标记。选择菌落数稳定时记录是为了确保计数准确，防止因培养时间不足导致遗漏菌落数目。 刷真题 1.（2024·黑吉辽）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 （1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。 （2）本操作中获取目的基因的方法是______和______。 （3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。 （4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 （5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。 （6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。 A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B. 将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C. 将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D. 用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 【答案】（1） ①. 水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离 ②. 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA （2） ①. PCR技术扩增 ②. 人工合成 （3） ①. RNA聚合酶识别并结合的部位 ②. 同时实现两个目的基因的共同表达及调控，从而降低基因工程的成本与复杂性 （4）HygBR （5） ① F3 ②. R2 （6）CD 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【小问1详解】 从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。 【小问2详解】 本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。 【小问3详解】 穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是同时实现两个目的基因的共同表达及调控，从而降低基因工程的成本与复杂性。 【小问4详解】 结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 【小问5详解】 为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。 【小问6详解】 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列、用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，AB不符合题意，CD符合题意。 故选CD。 2.（2023·辽宁）天然β淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题： （1）上述过程属于_____工程。 （2）PCR中使用的聚合酶属于_____（填写编号）。 ①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的RNA聚合酶 ③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的DNA聚合酶 （3）某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是_____（填写编号）。 （4）为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和_____。 （5）目的基因（不含EcoRI酶切位点）全长为1．5kb，将其插入BamH I位点。用EcoR I酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是_____。正确连接的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为_____kb。 （6）采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过_____反应获得PCR的模板。 【答案】（1）蛋白质 （2）③ （3）② （4）标记基因 （5） ①. 筛选导入目的基因的大肠杆菌 ②. 5.7 （6）逆转录 【解析】 【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【小问1详解】 根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。 【小问2详解】 PCR的原理是DNA双链复制，利用的酶是耐热的DNA聚合酶，合成子链时是以DNA为模板。 【小问3详解】 根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。 【小问4详解】 作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。 【小问5详解】 目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ酶切位点，则切割后的长度为4.2+1.5=5.7kb。 【小问6详解】 转录是以DNA为模板合成RNA的过程，通过PCR在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以RNA为模板逆转录出DNA作为PCR反应的模板。 3．（2025·江苏·高考真题）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题： (1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有 。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有 。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺 获得更多机会。 (2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成 关系。 (3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取① ，加入乙醇 ② 在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③ 、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR (4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基 。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是 。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有 。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用 的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。 注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200个碱基 (5)依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有 （填字母）。 a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流     b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物 c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量     d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量 【答案】(1) 捕食和种内竞争 物理信息、化学信息、行为信息 食物和空间、配偶等 (2)互利共生 (3) 上清液 溶解DNA 4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶 (4) 互补配对 丁 丙丁 叶绿体基因组其他DNA 片段 (5)ab 【难度】0.4 【知识点】群落中生物的种间关系、生态系统中信息的种类、作用及传递过程、生物多样性丧失原因及其保护措施、PCR扩增的原理与过程 【分析】生态系统中信息的种类(1)物理信息：生态系统中的光、声、温度、湿度、磁力等，通过物理过程传递的信息，如蜘蛛网的振动频率；(2)化学信息：生物在生命活动中，产生了一些可以传递信息的化学物质，如植物的生物碱、有机酸，动物的性外激素等；(3)行为信息：动物的特殊行为，对于同种或异种生物也能够传递某种信息，如孔雀开屏。 【详解】（1）捕食者与川金丝猴是捕食关系，川金丝猴和同种个体之间是种内竞争关系。生态系统中信息的种类有物理信息、化学信息和行为信息。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺食物和空间等资源获得更多机会。 （2）川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物从川金丝猴胃内获取营养物质，又能为川金丝猴分解纤维素，两者构成互利共生关系。 （3）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下：释放DNA：在去杂后的样本中加入裂解液，细胞裂解，内容物释放，→析出DNA：DNA呈溶解状态，离心后取①上清液，再加入乙醇，DNA不溶于酒精→故在沉淀物中加入纯水，②再次溶解DNA→扩增DNA：PCR扩增DNA，需要将③4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR。 （4）为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbeL基因的保守序列的碱基互补配对，从而在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸子链。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示，可知植物甲乙丙的条带一样长，植物丁的短，对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，只能区分不同长度的DNA片段，故能检出的样本是丁。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，说明摄食的植物有三种，甲和乙的序列相同，不能确定，故据此可确定川金丝猴摄食的植物有丙和丁。选用叶绿体的其他基因的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析，能更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物。 （5） a、建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流，能够保护川金丝猴遗传多样性和物种多样性，a正确； b、保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物，能够保护川金丝猴，b正确； c、川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，不能用标记重捕法定期重捕，c错误； d、保护川金丝猴主要依赖就地保护，d错误。 故选ab。 4．（2025·湖南·高考真题）未成熟豌豆豆荚的绿色和黄色是一对相对性状，科研人员揭示了该相对性状的部分遗传机制。回答下列问题： (1)纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，只有一种表型。自交得到的中，绿色和黄色豆荚植株数量分别为297株和105株，则显性性状为 。 (2)进一步分析发现：相对于绿色豆荚植株，黄色豆荚植株中基因H（编码叶绿素合成酶）的上游缺失非编码序列G。为探究G和下游H的关系，研究人员拟将某绿色豆荚植株的基因H突变为h（突变位点如图a所示，h编码的蛋白无功能），然后将获得的Hh植株与黄色豆荚植株杂交，思路如图a： ①为筛选Hh植株，根据突变位点两侧序列设计一对引物提取待测植株的DNA进行PCR。若扩增产物电泳结果全为预测的1125bp，则基因H可能未发生突变，或发生了碱基对的 ；若H的扩增产物能被酶切为699bp和426bp的片段，而h的酶切位点丧失，则图b（扩增产物酶切后电泳结果）中的 （填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”）对应的是Hh植株。 ②若图a的中绿色豆荚：黄色豆荚=1：1，则中黄色豆荚植株的基因型为 [书写以图a中亲本黄色豆荚植株的基因型（△G+H）/（△G+H）为例，其中“△G”表示缺失G]。据此推测中黄色豆荚植株产生的遗传分子机制是 。 ③若图a的中两种基因型植株的数量无差异，但豆荚全为绿色，则说明 。 【答案】(1)绿色 (2) 替换 Ⅱ (G+h)/(△G+H) 该植株中基因H上游缺失非编码序列G，导致基因H不能正常表达，表现为黄色豆荚 非编码序列G缺失不影响基因H表达 【难度】0.4 【知识点】基因分离定律的实质和应用、PCR扩增的原理与过程 【分析】判断性状显隐性通常有两种方法。一是具有相对性状的纯合亲本杂交，子一代所表现出来的性状就是显性性状，比如本题中纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，F1只有一种表型，此表型对应的性状即为显性性状 。二是杂合子自交，后代出现性状分离，分离比中占比多的那个性状为显性性状，像本题F1自交得到F2，绿色和黄色豆荚植株数量比约为3:1 ，绿色植株数量多，所以绿色是显性性状。 【详解】（1）纯合绿色豆荚植株与纯合黄色豆荚植株杂交，F1只有一种表型，说明F1表现的性状为显性性状。F1自交得到F2，绿色和黄色豆荚植株数量比约为297:105≈3:1，符合孟德尔分离定律中杂合子自交后代显性性状与隐性性状的分离比，所以显性性状为绿色。 （2）①若扩增产物电泳结果全为预测的 1125bp ，基因 H 可能未发生突变，若发生突变且产物长度不变，则可能是发生了碱基对的替换。 H 的扩增产物能被酶切为 699bp 和 426bp 的片段，h的酶切位点丧失。 Hh植株会产生两种类型的扩增产物，一种是H经酶切后的699bp 和426bp 片段，一种是h未被酶切的1125bp 片段，所以图 b 中的 Ⅱ 对应的是 Hh 植株。 ② Hh 植株与黄色豆荚植株 (△G+H)/(△G+H) 杂交，若 F1 ​中绿色豆荚：黄色豆荚 =1:1 ，说明 Hh 植株产生了两种配子 G+H 和G+ h ，且黄色豆荚植株只能产生含 △G+H 的配子，所以 F1 中黄色豆荚植株的基因型为 (G+h)/(△G+H) 。中黄色豆荚植株产生的遗传分子机制是：该植株中基因H上游缺失非编码序列G，导致基因H不能正常表达，表现为黄色豆荚。 ③ 若图a的F1中两种基因型植株的数量无差异，但豆荚全为绿色，说明虽然黄色亲本中基因H上游缺失G ，但H基因仍能正常表达（或表达量足够）合成叶绿素，使豆荚表现为绿色，即非编码序列G缺失不影响基因H表达。 5．（2025·河北·高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为 。 (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPl两端应添加 （填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成 键。 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为 ，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量 ，则表明融合蛋白能结合镉离子。 (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是 。240μmol·L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是 。 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是 和 。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 【答案】(1) 脱氧核苷酸 引物 复性 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 (2) SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ 磷酸二酯键 (3) 细胞表面发出黄色荧光 高 (4) 转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用 镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用 (5) ① ③ 【难度】0.4 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）在 PCR 反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在 PCR 过程中会结合到模板 DNA 上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核苷酸。 模板与引物在 PCR 的复性阶段开始结合。在复性过程中，温度降低，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。 PCR 中使用的 DNA 聚合酶需耐高温，是因为 PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤（90 - 95℃使双链 DNA 解旋为单链） ，普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。 （2）观察图 1，要避免错误连接，GPI 两端应添加SmaⅠ 和 EcoR Ⅰ的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，使用这两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。又因为Nbe Ⅰ和XbaⅠ限制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选一个，按照连接的顺序在将GPl连接到载体时应该用SmaⅠ 和 EcoRⅠ 。DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。 （3）若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有黄色荧光蛋白YFP，其表达后会发出黄色荧光。 将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高，则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中的 CADR 可吸附水体中的镉离子，若融合蛋白发挥作用，会使细胞壁镉离子含量升高。 （4）转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用。 240μmol・L⁻¹ 镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用。 （5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是①和③。①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖，能够持续发挥作用；③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质，便于后续处理，而化学药物可能存在二次污染等问题。 6．（2025·湖北·高考真题）某种昆虫病毒的遗传物质为双链环状DNA．该病毒具有包膜结构，包膜上的蛋白A与宿主细胞膜上的受体结合后，两者的膜发生融合，从而使病毒DNA进入细胞内进行自我复制。回答下列问题： (1)要清楚观察病毒的形态结构需要使用的显微镜类型是 。 (2)体外培养的梭形昆虫细胞，被上述病毒感染后会转变为圆球形，原因是病毒感染引起了昆虫细胞内 （填细胞结构名称）的改变。 (3)这类病毒的基因组中通常含有抗细胞凋亡的基因，这类基因对病毒的生物学意义是： 。 (4)该病毒DNA能在宿主细胞中自我复制，却无法在大肠杆菌中复制。为解决这一问题，可在该病毒的DNA中插入 序列，以实现利用大肠杆菌扩增该病毒DNA的目的。 (5)用该病毒感染哺乳动物细胞，可以在细胞内检测到该病毒完整的基因组DNA，但无对应的转录产物。推测其无法转录的原因是： 。 (6)采用脂溶剂处理该病毒颗粒可使病毒失去对宿主细胞的感染性，其原因是： 。 【答案】(1)电子显微镜 (2)细胞骨架 (3)抑制宿主细胞的凋亡，为病毒的复制和繁殖提供更多的时间和场所 (4)大肠杆菌复制原点 (5)病毒基因组没有在哺乳动物细胞中表达的启动子 (6)蛋白镶嵌或贯穿于膜上，脂溶剂处理该病毒颗粒使得包膜溶解，包膜上的蛋白A游离，蛋白A与细胞膜受体结合不能使病毒DNA进入细胞内 【难度】0.65 【知识点】病毒结构、分类和增殖、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞 【分析】病毒的结构较为简单，无细胞结构，主要由核酸（DNA 或 RNA）和蛋白质外壳组成。有些病毒在核衣壳之外还有包膜结构。核酸是病毒的遗传物质，储存着病毒的遗传信息，控制着病毒的繁殖、变异等生命活动。蛋白质外壳则起到保护核酸的作用，同时还能介导病毒与宿主细胞的识别与结合。具有包膜的病毒，其包膜一般来源于宿主细胞膜或核膜，包膜上镶嵌着一些糖蛋白刺突，这些刺突有助于病毒吸附和侵入宿主细胞。 【详解】（1）病毒个体极其微小，普通光学显微镜无法清晰观察其形态结构，需要使用电子显微镜才能清楚观察病毒的形态结构。 （2）细胞骨架对于维持细胞的形态具有重要作用，体外培养的梭形昆虫细胞被病毒感染后转变为圆球形，很可能是病毒感染引起了昆虫细胞内细胞骨架的改变。 （3）病毒需要在宿主细胞内进行生存和繁殖，细胞凋亡会导致宿主细胞死亡，不利于病毒的生存和繁殖。病毒基因组中含有的抗细胞凋亡基因可以抑制宿主细胞的凋亡，为病毒的复制和繁殖提供更多的时间和场所 。 （4）要使病毒 DNA 能在大肠杆菌中复制，需要在病毒 DNA 中插入大肠杆菌复制原点序列，这样才能利用大肠杆菌细胞内的复制系统进行复制。 （5）转录需要特定的酶等条件，该病毒 DNA 能进入哺乳动物细胞，但无对应的转录产物，可能是因为病毒基因组没有在哺乳动物细胞中表达的启动子。 （6）该病毒具有包膜结构，包膜的主要成分是脂质等，脂溶剂可以溶解病毒的包膜，蛋白镶嵌或贯穿于膜上，脂溶剂处理该病毒颗粒使得包膜溶解，包膜上的蛋白A游离，蛋白A与细胞膜受体结合不能使病毒DNA进入细胞内。 4 / 20 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $