1.2.2 微生物的选择培养和计数课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第一章 第2节 微生物的培养技术及应用 （二）微生物的选择培养和计数 学习目标 01 阐明微生物选择培养的原理 02 进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 01 问题探讨 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢？ 科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。 02 选择培养基 【任务一】1.阅读课本16页第2段，通过寻找耐高温的DNA聚合酶，明确可以筛选出来的原因，这为实验室筛选微生物提供什么提示？说出选择培养基的定义。 02 选择培养基 为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？ 70℃大肠杆菌 70℃栖热菌 80℃栖热菌 100℃栖热菌 因为水生栖热菌能在 70-80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 02 选择培养基 自然界筛选微生物的原理 根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 耐热微生物 筛选 耐寒微生物 筛选 石油分解菌 筛选 有利于目的菌生长的条件有哪些？ 营养、温度和pH等 02 选择培养基 选择培养基 概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 回忆必修二开展的“探究抗生素对细菌的选择作用” 一般情况下，一定浓度的抗生素会杀死细菌，但变异的细菌可能产生耐药性。在实验室连续培养细菌时，如果向培养基中添加抗生素，耐药菌有可能存活下来。 通过观察细菌在含有抗生素的培养基上的生长状况，探究抗生素对细菌的选择作用。 02 选择培养基 基础培养基 选择培养基 +某种抗生素 接种培养 培养结果 上述过程能否充分说明该选择培养基具有选择性？ 选择培养基 概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 02 选择培养基 设置基础培养基或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 思考：怎么证明一个选择培养基具有选择性？ 基础培养基 选择培养基 02 选择培养基 思考·讨论：选择培养基配方的设计 尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。 尿素分子模型 结合材料思考 1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。 2.怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若对照培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 02 选择培养基 03 微生物的选择培养 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，缺乏脲酶的微生物不能分解尿素，而缺乏氮源的微生物是不能生长发育繁殖的。 利用以尿素作唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 配方： 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml 碳源 氮源 ①提供无机盐； ②调节pH。 凝固剂 03 微生物的选择培养 【任务二】阅读课本17页和18、19页的探究实践“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数，明确实验各步骤的具体操作，尝试计算单位土壤中的细菌数量。 分离：获得尿素分解菌的纯培养物 计数：测定尿素分解菌数量 03 微生物的选择培养 方法: 稀释涂布平板法 主要过程: A、梯度稀释菌液 B、涂布平板 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。 由于土壤细菌的数量庞大，那么怎么获得要想得到特定微生物的纯培养物呢？ 问 03 微生物的选择培养 A.梯度稀释菌液 主要操作: 1×10 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 90mL无菌水 10g ②在火焰旁将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 ①铲取土样，将样品装入纸袋中。 03 微生物的选择培养 ②涂布平板 主要过程: ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 微量移液器（枪）： 可精准吸取少量液体，有不同量程，配合对应规格的一次性灭菌枪头使用 03 微生物的选择培养 恒温培养箱 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。 与平板划线一样，完成涂布后，应将一个未接种的培养基和已接种的培养基放在一起培养，目的是： 在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。 同样是分离得到单菌落，平板划线法和稀释涂布平板法有何不同？ 03 微生物的选择培养 平板划线法 稀释涂布平板法 关键操作 接种环在固体平板培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释 ②涂布平板法操作 注意事项 每次划线前后均需灼烧接种环 稀释度要足够高，为确保试验成功可以增加稀释度的范围 菌体获取 在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 优点 可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落 既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数 缺点 不能对微生物计数 操作复杂，需要涂布多个平板 04 微生物的数量测定 【任务三】阅读课本18~19页，明确微生物的数量测定中的方法，并对每种方法进行分析。 1.稀释涂布平板法 2.显微镜直接计数法 ——间接计数法 ——直接计数法 04 微生物的数量测定 ①分离微生物 ②统计样品中活菌的数目 1.稀释涂布平板法 ②计数原则： ①原理： 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个________。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少________。 活菌 活菌 选择30-300个菌落的平板进行计数； 每个稀释度至少取3个平板取其平均值； 统计的结果一般用菌落数而不是活菌数； 统计的菌落往往比活菌的实际数目低； 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 04 微生物的数量测定 M：代表稀释倍数； C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) 4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为________个 ③ 计算公式： 每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M 1.1×108 ——间接计数法 1.稀释涂布平板法 04 微生物的数量测定 利用特定的______________或 ________________在___________下观察、计数，然后再计算 __________的样品中微生物的数量； ①原理： 细菌计数板 血细胞计数板 显微镜 一定体积 ②优点： ③缺点： 快速、直观 ①不能区分死菌和活菌→偏大 ②不适于对运动细菌的计数。 ③个体小的细菌在显微镜下难以观察。 台盼蓝染液染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。 对细菌等较小的细胞进行观察和计数 2.显微镜直接计数法 ——直接计数法 常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数 04 微生物的数量测定 计数区 放大后的计数室 ④计数方法： 每毫升原液所含细菌数＝ 每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数 2.显微镜直接计数法 ——直接计数法 3.比较稀释涂布平板法和显微镜直接计数法 项目 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法 主要用具 显微镜、_________________ 　　　　　　　　 等 培养基等 计数依据 菌株本身 培养基上的　 　数 优点 计数方便、操作简单 计数的都是活菌 缺点 死菌、活菌都计数在内 操作复杂、有一定误差 血细胞计数板 或细菌计数板 菌落 04 微生物的数量测定 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.土壤取样 ①取样地点要求： 细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长。 ②取样过程： 铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。 ③注意事项： 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后一定要洗手。 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 2.样品的稀释与涂布平板 测细菌时，一般选用1×104、1×105、×106倍稀释的稀释液进行平板培养。 在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基 （用以判断选择培养基是否具有选择作用） ②如何验证培养基中是否含有杂菌？ 设置2个平板作为对照：不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。 若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目，则说明选择培养基具有筛选作用。 若对照的培养基中无菌落生长，则说明未被杂菌污染。 2.样品的稀释与涂布平板 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 案例分析 两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的做法正确吗？ 如果有问题，错在哪？ 如何改进？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。 3.微生物的培养与观察 ①培养条件： 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 ②观察： 每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等） 探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 进一步探究 利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物不一定都是能分解尿素的微生物，因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 方法： 呈碱性，遇酚红指示剂呈 红 色。 在培养基中加入酚红指示剂——鉴别培养基 ①液体培养基可以直接看液体的变色情况； ②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带。 04 课堂小结 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法——稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法——稀释涂布平板法 直接计数——计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 实验设计 05 课堂小测 1.下列关于选择培养基的叙述，错误的是( ) A.选择培养基可允许特定种类的微生物在其上生长 B.制备选择培养基时，应根据所选微生物的特点确定培养基的配方 C.筛选能分解尿素的细菌时，应以尿素作为唯一的氮源 D.与普通培养基相比，选择培养基上生长的微生物的数量一般较多 D 解析：普通培养基可满足多数微生物的生长需求，而选择培养基上只能生长特定种类的微生物，因此与普通培养基相比，选择培养基上生长的微生物的数量一般较少，D错误。 05 课堂小测 2.稀释涂布平板法是分离菌种常用的方法，下列相关叙述不恰当的是( ) A.倒好的平板冷却后需立即使用，以免表面干燥，影响菌种的生长 B.不同稀释度的菌液在固体培养基表面不一定都能形成单个的菌落 C.稀释涂布平板法分离到的单菌落需进一步纯化鉴定后方可用于生产应用 D.稀释涂布平板法既可用于微生物的分离，也可用于微生物的计数 A 解析：倒好的平板冷却后不一定要立即使用，未使用的平板可以冷藏保存，A错误；稀释度较低的菌液不一定能在培养基表面形成单个的菌落，B正确；稀释涂布平板法分离到的单菌落仍需进一步纯化鉴定后，才能用于生产应用或者菌种保藏，C正确；稀释涂布平板法既可用于微生物的分离，也可用于微生物的计数，D正确。 05 课堂小测 3.下列关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验的叙述，正确的是( ) A.统计菌落数应注意选择菌落数在30-100的平板进行计数 B.判断选择培养基是否起选择作用，需设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作对照 C.将未接种的培养基置于恒温培养箱中培养24～48h，以检验培养基灭菌是否合格 D.以尿素为唯一氮源且加入酚红的培养基上长出的菌落周围可能会出现紫色区域 C 解析：统计菌落数应注意选择菌落数在30-300的平板进行计数，A错误；判断选择培养基是否起到选择作用，需将菌液稀释相同的倍数后接种在牛肉膏蛋白胨培养基上作为对照，若在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目明显多于选择培养基上的数目，则说明选择培养基起到了选择作用，B错误；将未接种的培养基置于恒温培养箱中培养24～48h，可以检验培养基灭菌是否合格，若灭菌合格，则培养基上应没有任何菌落出现，C正确；用以尿素为唯一氮源且加入酚红指示剂的培养基培养该细菌后能产生脲酶，使尿素分解成氨，导致酚红指示剂变红，故菌落周围可能会出现红色区域，D错误。 感谢指正 Thanks To Correct Me $