1.2.2 微生物的选择培养和计数课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第1章 发酵工程 第2节 微生物的培养技术及应用 如何从自然界中分离出需要的特定微生物？ 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法很难实现。该怎么办？ 纯培养 配制培养基 灭菌 倒平板 接种和分离 恒温培养 纯培养物 由单一个体繁殖所获得的微生物群体。 2 这是因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 耐高温的酶 耐高温生物 高温环境（热泉、火山口） 寻找 寻找 聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶（70-80℃）。 讨论： 1.筛选耐高温的酶的思路是什么样的？ 美国黄石公园 2.为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？ 科学史 耐高温生物 高温环境 相适应 1973年，科学家布鲁克从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌（Taq细菌），进而提取出耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。这种酶目前已被广泛用于聚合酶链式反应（PCR）。 人为创造某些条件进行筛选 3 （1）原理：人为提供 目的菌生长的条件(包括 、 和 等) ，同时 其他微生物的生长。 （2）概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 不加碳源的培养基 分离出自养微生物 分离耐热菌 70～80℃的高温 不加氮源的培养基 分离固氮微生物 加青霉素的培养基 分离真菌 加高浓度食盐 分离金黄色葡萄球菌 改变培养条件 添加某种化学物质 营养条件 加石油为唯一碳源 分离出分解石油的微生物 特殊碳、氮源 (青霉素能杀死细菌、放线菌) （3）实例： 选择培养基 有利于 营养 温度 pH 抑制或阻止 4 （拓展） 怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌? 影印法转移加氨苄青霉素的培养基中培养 具有氨苄青霉素抗性的菌落 完全培养基培养 没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰 5 思考•讨论 选择培养基配方的设计 p16 土壤中尿素分解菌之所以能将尿素分解，是因为它们能合成脲酶： 尿素含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。NH3再转化成NO3-、NH4+等才能被植物吸收。 尿素的立体结构 CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2 脲酶 NO3-、NH4＋ 被植物吸收 6 1. 如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 2. 该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 培养基配方 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 3. 为了从土壤中分离出分解尿素的细菌，某同学设计了如图的选择培养基。 怎么证明该选择培养基具有选择性呢？ 提供 无机盐 凝固剂 提供氮源 提供碳源 若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌几乎等于该选择培养基，该选择培养基不具有选择性。 思考•讨论 选择培养基配方的设计 设计一种选择培养基，以尿素作为唯一氮源。 应该设置完全培养基作为对照， 若完全培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 7 如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，培养微生物时需要解决哪2个问题？ 选择培养：获得能分解尿素的细菌的纯培养物。 计数：对细菌进行计数 可否直接制备土壤溶液，利用平板划线法接种到选择培养基上，进行培养计数？为什么？ 不能。①平板划线法最开始的划线细菌可能会长成一片，导致无法计数， ②灼烧接种环的时候也会杀死一部分细菌，导致计数偏小。 平板划线法 稀释涂布平板法 聚集的微生物 单个细胞 菌液梯度稀释 单个菌落 涂布平板 生长繁殖 稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 仅通过选择培养基可以知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌吗？ 由于土壤细菌的数量庞大，要想对分解尿素的细菌进行计数，必须要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。 8 02 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107 9 mL 无菌水 90mL无菌水 10g 微量 移液器 ①铲取土样，将样品装入纸袋中 注意：取土样用的小铁铲和盛土样的的纸袋在使用前都要灭菌。 取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 ②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。 （1）梯度稀释 稀释涂布平板法 微生物的选择培养 1×10 1×102 9 ③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 注意：多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 （2）涂布平板 稀释涂布平板法 微生物的选择培养 涂布结束后，要将涂布器灼烧灭菌。 注意：各梯度分别涂布3个平板（重复实验）1个不涂布作空白对照。 10 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板 ，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。 （3）菌落培养与观察 微生物的选择培养 倒置 空白对照 稀释104倍 稀释105倍 稀释106倍 恒温培养箱 √ 注意事项：涂布结束后，应将一个未接种的培养基和已接种的培养基放在一起培养，以检测培养基是否灭菌彻底。 培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养为什么？ 11 案例:两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、 212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的做法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。 通常计数结果相差超过一个数量级，则需舍弃该数据后进行计数 （4）结果与分析 。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果 12 原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测除样品中大约含有多少活菌。 原则 一般选择菌落数在 的平板进行计数。 同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后取其平均值。 缺点 统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。 因为当两个或多个细胞连在一起，平板上观察到的只是一个菌落。 因此，统计结果一般用 而不用活菌数来表示。 30~300 少 菌落数 微生物的数量测定 （间接计数） 、 是成功统计菌落数目的关键。 恰当的稀释度 涂布是否均匀 1 稀释涂布平板计数法计数 13 甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？ （80+90+100）/3 0.1 × 105 = 9 ×107个/克 M代表稀释倍数； C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)； 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 计算公式 微生物的数量测定 1 稀释涂布平板计数法计数 14 原理 利用特定的 或 ，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 细菌计数板 血细胞计数板 较薄，对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 较厚，用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。 细菌计数板 血细胞计数板 优点 快速、直观、设备简单；能观察微生物的形态特征。 ①不能区分死菌和活菌 缺点 也可选择用台盼蓝染色法来区分活菌和死菌。 微生物的数量测定 2 显微镜直接计数 细菌计数板 血细胞计数板 ②不适于运动的和个体小的细菌 →统计结果会偏大 能被染色的为死菌 15 方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供计数用。 中方格16个 每个中方格有小方格25个 大方格 边长为1mm，深度为0.1mm 1个计数室有 个小方格。 1个计数室的体积为 mm3 = ml 1mL培养液所含菌数＝每小格平均菌数×400×104×稀释倍数 血细胞计数板 0.1 400 1×10-4 16 内容 显微镜直接计数法 间接计数法（稀释涂布平板法） 主要用具 计数依据 优点 计算公式 缺点 结果 微生物的计数方法比较 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 细菌个数 培养基上菌落数 计数方便、操作简单 计数的是活菌 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数 每克样品中的菌株数:(C÷V)×M 　C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 比实际值偏大 比实际值偏小 17 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 效果图 相同点 连续划线 梯度稀释→涂布平板 接种环 涂布器 从最后划线区挑取 稀释度合适的整个平板上都可找到单菌落 分离纯化菌种， 获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数 ①都能分离纯化菌种；②都在固体培养基上进行 平板划线法和稀释涂布平板法的比较 18 用平板划线法接种培养结果的图片如下。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？ 不能。平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。 与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？ 稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌类的密度，再通过计算可以得知原液的菌落数。 19 20 1.提出问题（实验目的） （1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。 （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_______的微生物才能分解尿素，利用_____________________的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 组分 含量 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g H2O 定容至1000mL 脲酶 以尿素作为唯一氮源 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 p18 （分离） （计数） 常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 2.实验原理 21 3.实验步骤 （1）土壤取样 ①取样地点要求： 。细菌适宜在该环境中生长。 ②取样过程： 铲去表层土（一般 左右）。细菌绝大部分分布在距地表 的土壤层。 ③注意事项： 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要 。 操作完成后，一定要 。 （2）制备培养基 ①选择培养基： 以尿素为唯一氮源。 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000ml ②牛肉膏蛋白胨培养基： 作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。 ③KH2PO4和Na2HPO4的作用是： ①提供无机盐； 酸碱度接近中性的潮湿土壤 3cm 3～8cm 灭菌 洗手 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 p18 ② 调节pH 22 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在 之间适于计数的平板。 思考：在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证 从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？ 选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分 别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300 的平板进行计数。 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 p18 （3）样品的稀释 30～300 测细菌数：一般用104、105、106稀释液 测放线菌：一般用103、104、105稀释液 测真菌数：一般用102、103、104稀释液 23 ①1、2、3是 （实验组） 作用： 。 （1）每个浓度至少设置 个平板。 对目标微生物进行分离和计数 （4）涂布平板 本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如：注明组别、培养日期和稀释度。 4 接种的选择培养基 （2）实验还要设置 个 对照。 选择培养过程所用到的培养基： ②4是 (对照组) 作用： 。 ① 。② 。 作用： 。 空白 不接种的选择培养基 不接种的牛肉膏蛋白胨培养基 验证培养基是否有杂菌污染 判断选择培养基是否具有选择作用 接种的牛肉膏蛋白胨培养基 2 24 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征， 如 等 （5）微生物的培养与观察 ①培养条件： 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 （细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d） ②观察： 每隔 统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果， 原因： 。 防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目 24h 形状、大小和颜色 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 p18 ③结果： 稀释度 104 105 106 107 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 菌落数/平板 25 内容 现象 结论 有无杂菌污染 的判断 选择培养基的 筛选作用 样品的稀释操作 操作成功 重复组的结果 未被杂菌污染 选择培养基具有 筛选作用 若选取同一种土样，统计结果应相近 （6）结果分析与评价 结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。 空白对照的培养基中无菌落生长 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目多于选择培养基上的数目 得到2个或2个以上菌落数目在30~300的平板 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 p18 （2）你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。 （3）你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？ 如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。 26 思考：得到的菌落一定是能分解尿素的细菌吗？ 得到的菌落不一定就是分解尿素的细菌， ①还可能是固氮菌 ②其他从分解尿素的细菌的代谢物中获取氮源的微生物。 探究•实践 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 p18 培养基配方 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2 脲酶 氮源 尿素 作为分解尿素的细菌的碳源 不能 还需要进一步的鉴定 27 资料：细菌合成的脲酶将尿素分解为NH3 ， NH3会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。 ①液体培养基可以直接看液体的变色情况； ②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带， 红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越 。 土壤中分解尿素的细菌的鉴定 CO(NH2)2+H2O 脲酶 2NH3+CO2 呈碱性 遇酚红指示剂呈 色 酚红可用作酸碱指示剂，其变色范围较为明确。 在低pH值时（如pH<6.8），酚红呈现黄色； 在高pH值时（如pH>8.4），则呈现红色。 在pH值6.8至8.4之间，酚红会呈现橙色过渡色。 红 强 28 一、概念检测 1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。 （1）这种培养基是一种选择培养基。（ ） （2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ） （3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌（ ） √ √ √ 2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是( ) A. 菌落中的细菌数目是固定的 B. 平板上的一个菌落就是一个细菌 C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同 D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌 练习与运用 D 29 二、拓展应用 1.反刍动物，如牛和羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验，从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。 ①用“尿素为唯一氮源”的选择培养基进行培养； ②瘤胃中的微生物多为厌氧菌，需创造无氧环境进行培养。 练习与运用 30 2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料， 它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物， 但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反 应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时， 刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤 维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中 会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。 请回答下列问题。 二、拓展应用 练习与运用 31 土壤取样 → 富含纤维素的环境 → 以纤维素为唯一碳源，增加目的菌浓度 （选择培养基） → 制备系列稀释液 筛选产生透明圈的菌落 制备培养基 涂布平板 → 添加刚果红作为指示剂 （鉴别培养基） 梯度稀释 挑选 （1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。 二、拓展应用 练习与运用 恒温培养 几种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈 32 （2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？ （3）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段 时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。 请你评价这一做法。 纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。 这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 二、拓展应用 练习与运用 33 Lavf58.51.100 $