2026届高三生物二轮复习课件PCR

2026高考二轮复习 PCR技术 利用PCR获取和扩增目的基因 概念：PCR是__________________的缩写，它是一项根据___________________的原理，在体外提供________________的各种组分与反应条件，对_________ ________________进行大量复制的技术。 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 参与DNA复制 目的基因 ①原理： ②操作环境： ③优点： DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 可以在短时间内大量扩增目的基因 的核苷酸序列 PCR扩增仪 （2）体外PCR的条件： 耐高温的DNA聚合酶 （Taq酶） DNA模板 引物（2种） 稳定的缓冲溶液 （一般添加Mg2+） 四种脱氧核苷酸(dNTP) 提供原料与能量 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 dATP dGTP dCTP dTTP PCR技术所需的基本条件 参与的组分 在PCR中的作用 高温 模板DNA 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 引物 一定的缓冲溶液(Mg2＋) 打开DNA双链 含目的基因的双链DNA片段(已知基因的部分核苷酸序列) 合成DNA子链的原料 Taq酶 催化合成DNA子链 2种 使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活 PCR技术与细胞内DNA复制的比较 比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术 区别 解旋方式 场所 引物 酶 温度 结果 联系 解旋酶催化，边解旋边复制 高温变性解旋，全部解旋后再复制 主要在细胞核内 细胞外(在PCR扩增仪内) RNA 通常是DNA 解旋酶、DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶（Taq酶） 细胞内温和条件 在不同温度(较高)下进行 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ③原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ②酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3’端合成子链 （3）PCR过程 第一步：加热至90℃以上， ； 第二步：冷却至 ，引物结合到互补DNA链； 第三步：加热至72 ℃左右，热稳定 (Taq 酶)从引物起始进行互补链的合成。如此重复循环多次。 DNA解链为单链 50℃左右 DNA聚合酶 90 50 72 ℃ 延伸 90 50 72 ℃ 变性 90 50 72 ℃ 复性 全解旋再复制过程 90 50 72 ℃ 变性 3` 5` 5` 3` 长度相同但C-G含量高的DNA需要设定的变性温度较高 90 50 72 ℃ 复性 引物与模板链哪端结合？ 3` 5` 5` 3` 3` 用PCR扩增下面的DNA片段： 5′--GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG--3′ 3′--CTGGACACCTTCG…….GTATGCCCTAAC--′5 供选择的引物有 ①5′GACCTGTGGAAGC3′ ②5′CTGGACACCTTCG3′ ③5′GTTAGGGCATAC3′ ④5′CAATCCCGTATG3′ 共四种，你觉得应选择( ) A.①② B.②③ C.③④ D.①④ D 引物的选择： 9 90 50 72 ℃ 延伸 DNA聚合酶与引物的____端结合? DNA聚合酶的延伸（子链）方向是________？ 11 思考： PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 采用 来鉴定PCR的产物。 琼脂糖凝胶电泳 一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次： ①子代DNA分子数为：___个 ②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：__个 ③子代含有的目的基因数目：_____个，含有不等长的 DNA分子______ ④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子数为：______个 ⑤复制过程中共需引物_______个 ⑥第n次复制需要引物___个 2n 2 2n-1 2n＋1 - 2 2n 2n-2n （4）PCR扩增DNA规律 2n PCR技术拓展应用 M：marker；1-阳性质粒； 2：原始品系；3-9转Bt品系； 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 1.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因 2.检测目的基因是否转录出了mRNA Bt基因在抗虫棉中的表达 从左至右依次是苗期叶片、花铃期叶片，苞叶，花，雌雄蕊和铃壳 应用1:检测受体细胞中是否存在目的基因以及目的基因是否转录 思考:用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 总mRNA 杂交双链 单链DNA 双链cDNA 逆转录酶 核酸酶H DNA聚合酶 RNA链 DNA链 mRNA取自什么细胞 应用2：反向PCR测定未知DNA区域 1．反向PCR流程如图所示，该技术可利用一段已知DNA序列设计合理的引物，扩增已知序列两端的未知序列。图中已知序列一条链的碱基排列顺序为“ 5’-AACTATGCGCTCATGA-……-GCAATGCGTAGCCTCT-3'”。下列叙述错误的是（ ） A.I酶切：用一种限制酶切割DNA，以使两端未知序列形成相同的黏性末端 B.II连接：使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键 C.设计的两种引物分别是“5'-AACTATGCGCTCATGA–3’”和“5'-AGAGGCTACGCATTGC-3’” D.对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。该DNA单链序列可能为“5'-AATTCCAGT-……-CTGAATT-3'” C 1.如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的 T－DNA，要想对T－DNA两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是 跟踪训练 A.用引物①和引物④直接进行PCR扩增之后再测序 B.用引物②和引物③直接进行PCR扩增之后再测序 C.用DNA连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR扩增后测序 D.用DNA连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR扩增后测序 √ 应用3：PCR定点突变技术 该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。 重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。下列说法错误的是 A.过程②需要含Mg2＋的缓冲液、DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等 B.若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生2种DNA分子 C.经过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程⑤获得目的基因 D.过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸，不需要引物 B 利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是 A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引 　物b扩增的结果 B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互 　补的碱基 C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却 　至50 ℃左右 D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变 　产物AD D 题型剖析 重叠延伸PCR技术： 大引物PCR： 应用4：(实时)荧光定量PCR(RT－PCR) 先从样本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA，并进行PCR扩增，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。 荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当TaqDNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。Ct值(循环阈值)的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。下列说法不正确的是 A.检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA 　转化为cDNA B.PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延 　伸3个阶段 C.Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高 D.若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，检测结果可能为阴性 C 题型剖析 应用5：引入酶切位点 大丽轮枝菌（一种丝状真菌）是引起棉花黄萎病的主要病原菌。为观察大丽轮枝菌对棉花根侵染路径，研究人员利用绿色荧光蛋白基因（sGFP）转染大丽轮枝菌，培育出表达绿色荧光蛋白的转基因菌株，主要过程如下（图中a链和b链分别是相应基因转录模板链，mRNA分子的合成方向是5′→3′）。分析回答： （1）过程①中，PCR扩增sGFP的原理是 ， 该过程除需要根据 设计特异性引物序 列外，为保证sGFP正确插 入到质粒中，还需要在引 物的5′端添加 限制酶 识别序列，图中b链的黏性 末端碱基序列（5′→3′）为 。 DNA半保留复制 已知sGFP基因的一段核苷酸（或碱基）序列 HindⅢ、 BamHⅠ AGCT- 科学家在利用农杆菌转化法把一段T-DNA插入到A基因中，从而诱发突变，获得a基因，用PCR法确定T-DNA插入位置时，应从图1中选择的引物组合是 。 应用6：选择特定引物，进行基因定位 Ⅱ，Ⅲ 26 练习4. 为研究水稻 D基因的功能，研究者将T-DNA插入到D基因中（图3），致使该基因失活，失活后的基因记为 d。为验证F2植株基因型（DD、Dd和dd），研究者根据D基因、T-DNA的序列，设计了3种引物，如图4所示。 随机选取F2植株若干，提取各植株的总DNA，分别用引物“Ⅰ+Ⅲ”组合及“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，检测是否扩增（完整的T-DNA过大，不能完成PCR）。 如果引物“I+Ⅲ”组及“Ⅱ+Ⅲ”组进行PCR 均可完成扩增，则相应植株的基因型为____。 如果_______________， 则相应植株的基因型为_____________； 如果_______________， 则相应植株的基因型为______________。 27 引物Ⅰ 引物Ⅲ 引物Ⅱ 知识：PCR产物主要为两种引物为之间的DNA片段 引物“Ⅰ+Ⅲ”只能扩增d基因 引物“Ⅱ+Ⅲ”只能扩增D基因 如果引物“I+Ⅲ”组及“Ⅱ+Ⅲ”组进行PCR均可完成扩增，则相应植株的基因型为____。 如果 _______________， 则相应植株的基因型为________； 如果______________ _， 则相应植株的基因型为______________。 Dd 引物“Ⅰ+Ⅲ”能扩增，引物“Ⅱ+Ⅲ”不能扩增 dd 引物“Ⅰ+Ⅲ”不能扩增，引物“Ⅱ+Ⅲ”能扩增 DD 28 应用7：设计引物序列，实现不同DNA的拼接 为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：（2）有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。 A. ATGGTG------CAACCA B. TGGTTG------CACCAT C. GACGAG------CTGCAG D. CTGCAG------CTCGTC’ 问题情境5： 为研究基因A与四膜虫对DDT的耐药性是否有关，科研人员提取耐药四膜虫个体的DNA，用下图所示的引物组合，分别扩增A基因的A1片段、A3片段。 将大量N基因片段与扩增得到的A1片段、 A3片段置于PCR反应体系中进行扩增，得到的绝大多数扩增产物是____________。 30 知识：PCR产物主要为两种引物为之间的DNA片段，且以两种引物为起点 A1片段、 A3片段PCR结果主要序列为： A1 X 5' 5' 3' 3' Y A3 3' 3' 5' 5' 31 将大量N基因片段与扩增得到的A1片段、 A3片段置于PCR反应体系中进行扩增 A1 X 5' 5' 3' 3' Y A3 3' 3' 5' 5' A1 X 5' 3' Y A3 3' 5' A1基因 A3基因 N基因 32 关于PCR和引物的一些问题： ③扩增目的基因时两种引物都结合在DNA模板链的3'端；扩增已知序列旁的未知序列时，引物结合在模板链的5'端 ⑤引入酶切位点：目的基因两端（或一端）加上限制酶识别序列，需要在引物的5'端添加限制酶序列（加启动子序列等） 限制酶a序列 限制酶a序列 ②PCR获取目的基因时，利用特定引物寻找目的基因 ④求n次复制扩增出的目的基因的个数，需要的引物个数；需要引物1的个数等 ①PCR获取目的基因；扩增目的基因；检测受体细胞染色体DNA上是否含有目的基因；检测目的基因是否转录； 33 设计引物序列，实现不同DNA的拼接 ⑦引入突变位点：引物特定位置碱基设定为突变碱基 ⑧选择特定引物，进行基因定位 $