2026届高三生物二轮复习课件微专题——PCR技术之引物

手术、化疗和放疗一直是癌症的常规治疗方式，但这些疗法也伴随着较大的副作用,靶向治疗利用抗体的选择性和特异性可以更有效地减少毒副作用。单克隆抗体类为常见的靶向药，但是面临着克隆抗体分子量较大，组织渗透性不足的局限性等问题。 通过基因工程，利用大肠杆菌生产纳米抗体分为几步骤？ 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 一种缺失轻链的特殊抗体，即重链抗体。和普通抗体相比，它只包含一个重链可变区（VHH）和两个常规的CH2与CH3区（图一）。克隆其可变区，可以得到只有重链可变区组成的单域抗体，称为纳米抗体（Nanobodies, Nbs）。 PCR技术之引物 1.全称： ； 2.原理： ； 3.条件： ①缓冲液：含有 ，目的是 ； ②模板：DNA双链； ③原料：4种 ，既作为 又作为 ； ④酶： 的 酶； ⑤引物： 种，使DNA聚合酶能从引物的 端开始连接脱氧核苷酸。 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 Mg2+ 激活DNA聚合酶 脱氧核苷酸（dNTP) 原料 能量 耐高温 DNA聚合 2 3’ PCR基础知识回顾 脱氧腺苷三磷酸（dATP） 腺嘌呤脱氧核苷酸 腺嘌呤 脱氧 核糖 P P P ~ ~ OH H 在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作原料，又能提供能量。 ——脱氧核苷三磷酸 一 第一步：目 拓展：dNTP 一、目的基因的筛选和获取 01 耐高温的DNA聚合酶 4种脱氧核苷酸（DNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶作用下合成新DNA链。 一、PCR反应过程 注意：复性温度过高会破坏引物与模板碱基互补配对。过低，会造成引物与模板结合位点增加，导致非特异性产物增加。 条件 一、PCR反应过程 2n 琼脂糖凝胶电泳 1、概念： 是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，体内DNA复制，引物一小段 ，PCR反应中，因为可以是 分子片段。 聚焦“引物” RNA RNA或单链DNA 2、作用： 使耐高温的DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。 3、结合部位： 引物结合在模板链的_________。 3’端 5’ 3’ 子链延伸方向： 问题1：扩增AnB1基因（编码纳米抗体)应选择哪两条序列作为引物？ AnB1基因 A B C D 5’ 3’ 5’ 3’ 1.（2011年江苏卷）请回答基因工程方面的有关问题；PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为____________________________________________________________________。 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。 对点训练 DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加至已有核酸链的游离3'-羟基上，而不能使脱氧核糖核苷酸自身发生聚合，即它需要引物链的存在。引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基互补配对。细胞内DNA复制以RNA作引物，从新合成的冈崎片段上发现含有一短暂存在的小的RNA片段附着在5'端这一事实，可说明DNA复制时需要RNA 引物，这些引物长5~10 bp，现已知RNA引物的合成是由一种特殊的RNA合成酶——引物酶所催化的。PCR反应以DNA作引物。 8 AnB1基因 A B C D 5’ 3’ 5’ 3’ 问题2：引物B和引物C序列是？ AnB1: 5’CATGTCCA--------------------------------------------------CCACAACC3’ 3’GTACAGGT--------------------------------------------------GGTGTTGG5’ 5’ CATGTCCA3’ 3’GGTGTTGG5’ PCR扩增时至少需要______种引物，原因是_________________________________________________________________________________ 2 DNA的两条链是反向平行的，用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增 5、种类： 根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物 4、PCR扩增的前提是： 聚焦“引物” 2.如图为 X 蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析： 扩增 X 蛋白基因所需的引物序列是________________；________________。 对点训练 5′­ATGCCGTAAGTCCTAC­3 5′­TGATCTACGGCTTACA­3′ 【资料2】纳米抗体蛋白（AnB1）基因如下，需将其正确插入到如图质粒中。 AnB1: 5’CATGTCCA--------------------------------------------------CCACAACC3’ 复制原点 启动子 抗性基因 终止子 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ 限制酶 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ 识别序列 G↓AATTC G↓GATCC 问题3:目的基因两端没有限制酶酶切位点，为便于目的基因插入载体，应如何改造目的基因？ 3’GTACAGGT--------------------------------------------------GGTGTTGG5’ 添加酶切位点的引物序列（ 5’- 3’ ） =限制酶切序列（5’- 3’）+该DNA非模板链序列（5’- 3’） 引物B’：5’GAATTCCATGTCCA3’ 引物C’：5’GGATCCGGTTGTGG3’ 12 3.为保证双功能醇醛脱氢酶基因(Adh)能通过双酶切以正确方向插入质粒,需设计引物1和引物2,其中引物1的序列为 5'-　　　　　 　　　　　　　-3'。  GGTACCGTACCTTTGT 对点训练 4.（2018年江苏卷）为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656个碱基对），利用基因工程大量制备α-淀粉酶。为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的____端加上限制性酶切位点，且常在2条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是_______________________________________________。 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连。 5' 对点训练 设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)是否合理(如下图)，请分别说明理由。 ①第1组：________________________________________________； ②第2组：________________________________________________。 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效　 引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 6、设计引物的要求： 引物的设计原则总结 ①引物能与DNA模板通过碱基互补配对结合,长度通常为20-30bp，引物过短导致引物特异性较低，过长影响引物与模版的结合 ; ②避免引物内部、引物之间4个碱基以上的互补; ③引物内GC含量不宜过高，导致复性温度过高， 同一反应的一对引物（A+T）/（G+C）值接近（两引物复性温差不宜过大）; ④需要在2种引物的5'端添加不同的限制酶的识别序列; 注意 由于引物延伸从3'端开始，3'端不能进行任何修饰，引物5'端对扩增特异性影响不大，因此，可给予修饰而不影响扩增特异性。引物5'端修饰包括加酶切位点、标记生物素、荧光等。为了使经 PCR扩增的目的基因能与运载体正常结合，需要在 2种引物的5'端添加不同的限制酶的识别序列。在 2种引物的5'端上添加不同的限制酶识别序列，是为了保证目的基因定向插入运载体并可避免目的基因自身环化。 16 5.PCR作为一种体外酶促反应，其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异性结合，二是DNA聚合酶对引物的延伸。引物设计的总原则是提高扩增的效率和特异性。下列有关叙述正确的是（　　） A．引物长度过短，特异性降低 B．两种引物之间可能发生碱基互补配对 C．引物的G—C含量越高，越利于目标DNA的扩增 D．可在引物的3′端添加特定限制酶的识别序列 A 题型剖析 6.（2021·湖北·高考真题）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（    ） A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间 C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度 D 题型剖析 聚焦“引物” 6、引物的选择： (2023·山东，25 节选)科研人员构建了可表达 J－V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中 V 5 编码序列表达标签短肽V5。 (1)构建重组质粒后，为了确定 J 基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行 PCR 检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知 J基因转录的模板链位于 b 链，由此可知引物 F1 与图甲中J基因的________(填“a 链”或“b 链”)相应 部分的序列相同。 F1和R2(或F2和R1) 　a链   为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物，结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp 片段，原因是___________________。 乙、丙　 目的基因反向连接 题型剖析 思考:PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 经过3次，可以产生两条单链等长的目的基因片段。 聚焦“引物” 复制次数 1 2 3 n DNA分子数         含引物的DNA分子数         DNA链数目 共消耗引物的个数         含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数         2 2 2 0 4 4 6 0 8 8 14 2 2n 2n 2n+1-2 2n-2n 4 8 16 2n+1 一 PCR扩增DNA规律 聚焦“引物” 1.（2024·河北邢台模拟）PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是（　　） A．PCR第5个循环，消耗了16对引物 B．脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到5′端 C．PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、Ca2＋等 D．用图中引物扩增至少四个循环后才能获得两端均添加限制酶切点的目的产物 对点训练 A 3′ Mg2＋ 两个循环 (2022·山东，25 节选)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白 UBC 可使 P 被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物 A 治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白 FLAG－P 和 FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG 是一种短肽，连接在P或PΔ的 氨基端，使融合蛋白能与含有 FLAG 抗体的介质结合，但不影响 P 或 PΔ的功能。 ①为构建重组载体，需先设计引物，通过 PCR 特异性扩增 P 基因。用于扩增 P 基因的引物需满足的条件是______________________________________________________________。 为使 PCR 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引 物的________________(填“3′端”或“5′端”)。 能与P基因模板链3′端的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 5′端 对点训练 为研究水稻D基因的功能，研究者将T-DNA插入到D基因中（图3），致使该基因失活，失活后的基因记为 d。为验证F2植株基因型（DD、Dd和dd），研究者根据D基因、T-DNA的序列，设计了3种引物，如图4所示。随机选取F2植株若干，提取各植株的总DNA，分别用引物“Ⅰ+Ⅲ”组合及“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，检测是否扩增（完整的T-DNA过大，不能完成PCR）。 如果引物“I+Ⅲ”组及“Ⅱ+Ⅲ”组进行PCR 均可完成扩增，则相应植株的基因型为____。 如果_____________________________________________， 则相应植株的基因型为_____； 如果_____________________________________________， 则相应植株的基因型为_____。 Dd 仅引物"Ⅰ+Ⅲ"组进行PCR能完成扩增，而"Ⅱ+Ⅲ"组不能完成扩增 dd 仅引物"Ⅱ+Ⅲ"组进行PCR能完成扩增，而"I+Ⅲ"组不能完成扩增 DD 对点训练 答案∶Dd；仅引物"Ⅰ+Ⅲ"组进行PCR能完成扩增，而"Ⅱ+Ⅲ"组不能完成扩增；dd；仅引物"Ⅱ+Ⅲ"组进行PCR能完成扩增，而"I+Ⅲ"组不能完成扩增；DD。 25 对点训练 DNA双链解聚为单链 50℃左右 使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 ②③ 引物②为5'-AGTTTCCC-3' 引物③为5'-AAGGGCGG-3' 236-2 $