2027届高三生物一轮复习课件第2讲：微生物的培养技术及应用

第十单元　生物技术与工程 第2讲　微生物的培养技术及应用 （一）培养基 一、微生物的基本培养技术 1、什么叫做选择培养基？ 允许特定种类微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 2、培养基必需的4类营养物质？ 水、碳源、氮源、无机盐。（pH、特殊营养物质、氧气）。 ①培养 时，需要在培养基中添加维生素； ②培养 时，需要将培养基调至酸性； ③培养 时，需要将培养基调至中性或弱碱性； ④培养 时，需要提供无氧的条件。 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧微生物 3、培养基有哪些用途？ 用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。 （二）无菌技术 获得纯净的培养物的关键是防止杂菌污染，主要包括消毒和灭菌。 1、消毒和灭菌的方法？ 灭菌方法：湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌等 消毒方法：煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒，紫外线等 （破坏DNA结构） 杀死绝大多数的微生物，同时营养物质损失较少。 2、巴氏消毒有什么优点？ 3、以下用到了哪种消毒或灭菌方法？ 巴氏消毒法 化学药剂消毒 紫外线消毒，化学药剂消毒 灼烧灭菌 干热灭菌 牛奶、啤酒、果酒等不宜进行高温灭菌的液体--- 酒精擦拭双手，氯气消毒水源--- 接种室、接种箱、超净工作台--- 涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，接种过程中试管口或瓶口等容易被污染的部位--- 玻璃器皿、金属用具等— 培养基---湿热灭菌（高压蒸汽灭菌） 3．微生物的纯培养 常用接种方法： 微生物在固体培养基的表面或内部生长，可以形成肉眼可见子细胞群体---菌落。 调节培养基的pH一般在灭菌前还是灭菌后？ 某同学使用高压蒸汽灭菌锅时，压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是什么？ 50℃ 固体培养基 逐步 单菌落 一个未接种的平板 28℃ 平板划线法、稀释涂布平板法 什么叫菌落，单菌落？ 灭菌前调节ph，未将锅内冷空气排尽 4 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 接种效果图 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到固体培养基的表面，进行培养，得到单菌落 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落 接种环 涂布器 从最后划线的区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落 平板划线法和稀释涂布平板法的比较 第1区划线 接种环灭菌，冷却 第2区划线 接种环灭菌，冷却 第3、4…..区划线 接种环灭菌，冷却 接种环灭菌 1 2 3 4 5 ①接种环只蘸一次菌液, 连续划线多次； ②第一次和最后一次划线不能相接； ③每次划线前接种环进行灭菌； ④划线后,培养皿倒置培养； ⑤整个操作要在酒精灯火焰旁进行 注意事项: ③杀死接种环上残留的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者 ①杀死接种环上原有微生物，防止外来杂菌污染 ②杀死上次划线结束后残留在接种环上的菌种 1、倒平板操作中，平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是? 2、怎么确定所倒平板未被杂菌污染？ 将所倒空白平板放入恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落。 3、在进行酵母菌的纯培养时，培养24或48小时后，记录实验结果的好处？ 菌落的大小、形状一般达到稳定，菌落颜色一般不再变化。 思考以下问题： ①防止冷凝水滴落在培养基上（污染培养基、破坏菌落） ②防止培养基水分过快蒸发。 4、操作时，接种环通过灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是什么？ 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。 7 例1．巴氏杀菌乳是以生牛(羊)乳为原料，经巴氏杀菌等工序制得的液体产品，杀灭了牛奶中有害菌群的同时也保存了营养物质和纯正口感。据国家标准每毫升合格巴氏杀菌乳中细菌总数不得超过50 000个。某兴趣小组进行了新鲜牛奶合适的消毒温度的探究，相关实验操作不合理的是(　　) A．配制牛肉膏蛋白胨培养基并在121 ℃、100 kPa条件下处理15～30 min B．将等量的新鲜牛奶分别置于60 ℃、70 ℃、 80 ℃、 90 ℃恒温水浴锅中处理30 min C．对处理后的牛奶进行梯度稀释后，利用涂布法接种平板并在37 ℃下培养24 h D．统计培养基上全部菌落数，以菌落数最少组的处理温度作为牛奶最适消毒温度 D D　[配制的牛肉膏蛋白胨培养基需使用高压蒸汽灭菌法灭菌，即在121 ℃、100 kPa条件下处理15～30 min，将培养基彻底灭菌，以避免培养基上的微生物影响实验结果，A正确；新鲜牛奶应使用巴氏消毒法消毒，为了探究新鲜牛奶合适的消毒温度，可将等量的新鲜牛奶分别置于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃恒温水浴锅中处理30 min，并检测不同温度处理下的牛奶中微生物的数量进行比较，B正确；若要统计消毒后的牛奶中微生物的数量，可用稀释涂布平板法接种，即可对处理后的牛奶进行梯度稀释后，利用涂布法接种平板并在37 ℃下培养24 h，C正确；由于温度过高会破坏牛奶中的营养成分，所以菌落数最少的组对应的温度不一定是最适的消毒温度，因为还需要考虑牛奶的营养价值不被破坏，D错误。] 8 例2．营养缺陷型菌株就是在人工诱变或自发突变后，微生物细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，使代谢过程中的某些合成反应不能进行的菌株。这种菌株能积累正常菌株不能积累的某些代谢中间产物，为工业生产提供大量的原料产物。以下是实验人员利用影印法初检氨基酸缺陷型菌株的过程。下列说法正确的是(　　) A．过程①的接种方法为稀释涂布平板法，过程②两种培养基的成分相同 B．进行过程②培养时必须先将丝绒布转印至基本培养基上，顺序不能颠倒 C．统计菌落种类和数量时要每隔24 h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止培养时间不足导致菌落数目偏大 D．营养缺陷型菌株细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，可能与核孔复合体的蛋白质空间结构发生改变有关 B B　[过程①得到的菌落均匀分布，接种方法为稀释涂布平板法，过程②两种培养基的成分不同，基本培养基中缺乏某种氨基酸，A错误；进行过程②培养时先将丝绒布转印至完全培养基上，可能会携带某种氨基酸进入基本培养基，因此顺序不能颠倒，B正确；统计菌落种类和数量时要每隔24 h观察统计一次，直到各类菌落数目稳定，以防止培养时间不足导致菌落数目偏小，C错误；若该菌株为原核细胞，则不存在核孔复合体，营养缺陷型菌株细胞代谢调节机制中的某些酶被破坏，应是控制该酶合成的基因发生突变，D错误。] 9 例3．为了探究从重组大肠杆菌中提取质粒的适宜培养时间，科研人员通过培养大肠杆菌并抽样计数、提取质粒进行电泳分析，得到如下结果。相关叙述不正确的是(　　) A．培养大肠杆菌时需设置空白对照，以检测实验过程是否有杂菌污染 B．培养大肠杆菌过程中，摇床培养的主要目的是可防止大肠杆菌聚沉、减少菌体间的质粒转化 C．涂布平板培养大肠杆菌时，倒置培养有利于减少水分蒸发，减少杂菌污染 D．在0～28 h培养液中大肠杆菌种群数量呈“S”形增长，16 h左右提取质粒较为适宜 B B　[为了检测实验过程中是否有杂菌污染，需设置空白对照组，即不接种大肠杆菌的培养液，A正确；培养大肠杆菌过程中，摇床培养的目的是提供充足氧气，并使细菌与营养物质充分接触，扩大培养，B错误；涂布平板培养大肠杆菌时，倒置培养既可以防止培养基表面的水分更快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染，C正确；由曲线图分析可知，在0～28 h培养液中大肠杆菌种群数量呈“S”形增长，其中在16 h时菌体数量的相对值最高；而观察电泳图可知，培养时间在10 h后才能够看到明显的电泳带，其中16 h时的电泳带亮度最高，由此推测16 h左右提取质粒较为适宜，D正确。] 10 1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 ①土壤取样 ②制备培养基 ③等比稀释 ④涂布平板 ⑤培养观察 中性、潮湿、去表土，装信封（灭菌） 以尿素为唯一氮源的选择培养基。 二、微生物的“选择培养”和“计数” 将10 g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 10 g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 (4)培养观察 ①待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入______ ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。 ②在涂布有合适浓度菌液的平板上可以观察到分离的______。 ①培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养________和培养________。细菌一般在_____________的温度下培养________d。 ②观察：每隔________h统计一次__________，最后选取菌落数目________时的记录作为结果。 11 每个梯度分别涂布 个平板（排除偶然因素对实验结果得干扰）； 两种对照 ①1个不涂布的 作空白对照 ②用 接种后在相同的条件下培养，判断选择培养基是否起到了选择作用 ①土壤取样 ②制备培养基 ③等比稀释 ④涂布平板 ⑤培养观察 培养观察 ①待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中培养1～2 d。 ②在涂布有合适浓度菌液的平板上可以观察到分离的单菌落。 3 选择培养基 完全培养基（牛肉膏蛋白胨培养基） 2、用稀释涂布平板法进行活菌计数----间接计数法 ①计数原则： 一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数； 在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。 统计的菌落数与实际活菌数相比是偏大还是偏小，为什么？ 偏小。两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此，统计的结果一般用菌落数来表示。 ②计算公式： 每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)； M代表稀释倍数。 13 内容 显微镜直接计数法 (活菌)稀释涂布平板法 主要用具 显微镜、血细胞计数板(细菌计数板) 涂布器 计数依据 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 缺点 死菌、活菌都统计在内 操作较复杂且有一定误差 “两种计数方法”的比较 菌体本身（死/活） 培养基上菌落数 1．筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源(　　) 2．刚果红与纤维素形成红色复合物，可以通过是否产生透明圈来分离纤维素分解菌(　　) 3．用细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数(　　) √ √ √ 4．刚果红染液能与纤维二糖、葡萄糖等糖类物质结合形成红色复合物（ ） × 判断 5. 用牛肉膏蛋白胨培养基接种后在相同条件下与选择培养基同时培养, 可判断选择培养基是否起到了筛选的作用( ) √ 6．若分离纤维素分解菌，需将土壤浸出液接种到仅含有纤维素作为唯一碳源的培养基进行培养，培养2天后可“浓缩”纤维素分解菌（ ） √ 7.判断培养基“是否被污染”，将未接种的培养基同时进行培养（ ） √ 例1．一次性口罩的主要成分是聚丙烯纤维,某科研团队欲筛选出能高效降解一次性口罩的细菌，设计了如图所示的流程，鉴别培养基加入了能与之结合的显色染色剂。设不同菌种的菌落面积为s,菌落周围透明圈的面积为S, 下列有关叙述错误的是（ ） A．土壤样品的采集地应选择口罩腐烂程度大的地点 B．实验中所用鉴别培养基可以用聚丙烯纤维作为唯一碳源 C．图中的“甲”是指选择培养 D．s/S的比值最大的菌落就是能高效降解一次性口罩的目的菌群 D 1、B　[根据题干信息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”，说明甲可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，因此甲菌属于解脂菌，A正确；乙菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌落不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌落也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B错误；可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，更加直观，C正确；可以利用该平板来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，观察指标可以是菌落周围深蓝色圈的大小，D正确。故选B。] 2、C　[为避免杂菌污染干扰，需对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌，A正确；葡萄球菌需从人体皮肤的微生物中分离，为避免杂菌污染，故需要使用无菌棉拭子从皮肤表面取样，B正确；棉拭子上的微生物需要用平板划线法在培养基上进行接种，C错误；根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别，D正确。] 16 (1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用______________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。 (2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。 高压蒸汽灭菌　 琼脂 选择 104 例2．某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。 [解析]　(1)实验过程中，对盛有水或培养基的摇瓶进行灭菌时，常采用高压蒸汽灭菌法。据题图分析可知，乙培养基为固体培养基，与甲培养基相比，其特有的组分Y物质应是凝固剂琼脂。甲、乙培养基均只允许能利用物质S作为氮源和碳源的微生物生长，因此均为选择培养基。 (2)据题意，假设至少将摇瓶M中的菌液稀释X倍，才能保证稀释后的100 μL菌液中细菌细胞数不超过200个，初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，则稀释之前100 μL菌液中有2×106个细菌，可得2×106×(1/X)＝200，则X＝104，因此至少应将摇瓶M中的菌液稀释104倍。 17 例2．某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照如图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。 (3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是______ ___ ___(答出1点即可) (4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：______________________________________________________ _。 (5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即___ _____________。 S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长　 取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数 水、碳源、氮源和无机盐 (3)在筛选过程中，若培养基中S浓度过高，可能会导致细胞失水，进而抑制菌株的生长。 (4)将含有能降解S的细菌的淤泥加入无菌水中，进行适当稀释后，利用稀释涂布平板法，取适量的菌液涂布到乙培养基上，在适宜条件下进行培养，一段时间后，统计菌落数，即可估算出淤泥中能降解S的细菌细胞数。 (5)本实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供的营养物质是水、碳源、氮源和无机盐。 18 例3．(广东选择考适应性测试)几丁质广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的外骨骼和真菌的细胞壁中。某些微生物能合成几丁质酶(胞外酶)，使几丁质降解为N­乙酰氨基葡萄糖，然后进一步转化利用。科研人员试图从土壤中筛选出能高效降解几丁质的菌株，通过微生物培养获得几丁质酶，用于生物防治。回答下列问题： (1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以________为唯一碳源的固体选择性培养基上筛选目标菌株。 (2)培养所筛选出的目标菌株，计算各单菌落周围的“水解圈直径/菌落直径”的比值，比值大小反映了______________________ (3)科研人员筛选出了产几丁质酶的菌株A。将菌株A发酵产生的几丁质酶粗提液加入盛有马铃薯培养基的培养皿中，涂布均匀后分别接种4种病原真菌，以__________代替几丁质酶粗提液作为对照，结果见图，几丁质酶粗提液对________(填病原菌编号)的抑菌效果最强。推测几丁质酶的抑菌机理是_______________。 几丁质是真菌细胞壁的组成成分，几丁质酶水解了几丁质导致真菌细胞壁不能合成，抑制了真菌的繁殖。 几丁质 微生物（菌体）的降解（几丁质）　能力 等量的不含几丁质酶的提取液　 d [解析]　(1)筛选过程中，将土壤样品稀释液接种于以几丁质为唯一碳源的选择培养基上，在该培养基上只有可以利用几丁质的微生物可以生存，其他不能利用几丁质的微生物被淘汰而达到筛选的作用。 (2)水解圈直径/菌落直径的值可以反映水解能力的大小，水解圈直径/菌落直径的值越大，说明该菌降解几丁质的能力越强，反之越弱。 (3)对照组实验应满足单一变量原则，实验组添加几丁质酶，对照组加入不含几丁质酶粗提液的等量的无菌水，对4组实验进行观察比较，d组水解圈直径/菌落直径最大，即抑制效果最强，几丁质是真菌细胞壁的组成成分，几丁质酶水解了几丁质导致真菌细胞壁不能合成，抑制了真菌的繁殖。 19 例4、一次性口罩的主要成分为聚丙烯纤维(PP)，某科研团队准备从土壤中筛选出高效降解一次性口罩的细菌。图甲表示PP分解菌分离与计数的过程，6号试管涂布的三个平板的菌落数为550、601、688；7号试管涂布的三个平板的菌落数为58、73、97；8号试管涂布的三个平板的菌落数为8、15、28。图乙表示在培养基中加入能与PP结合而显色的染色剂，目的菌落周围出现透明圈的情况。下列说法不正确的是(　　) D A．图甲、图乙所用培养基分别为选择培养基和鉴别培养基，都以PP作为唯一碳源 B．图甲、图乙所用接种方法分别为稀释涂布平板法，都需在酒精灯火焰旁进行 C．1 g土壤样品中含有PP分解菌的估算数目是7.6×1010个，此数值一般偏小 D．可选择图乙培养基中d/D比值大的PP分解菌作为目的菌种推广使用 D　[图甲是筛选PP分解菌的过程，培养基为选择培养基，图乙表示在培养基中加入能与PP结合而显色的染色剂，鉴别PP分解菌的过程，所以图乙所用培养基为鉴别培养基，都以PP作为唯一碳源，A正确；图甲、图乙所用接种方法都是稀释涂布平板法，都需在酒精灯火焰旁进行，B正确；由于平板计数范围为30～300，故取7号试管中的数量，7号试管的稀释倍数为108，则[(58＋73＋97)÷3]÷0.1×108＝7.6×1010，即1 g 土壤样品中含有PP分解菌的估算数目是7.6×1010个，此数值一般偏小，因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，C正确；可选择图乙培养基中D/d比值较大的菌株(降解圈直径D、菌落直径d)，因为这一指标越大说明单个菌株分解PP的能力越强，所以可作为目的菌种推广使用，D错误。] 20 小结 $