2026届高三生物二轮复习课件基因工程中常见PCR方法分析及运用

PCR的类型 逆转录PCR（RT-PCR） 荧光定量PCR（qPCR） 重叠延伸PCR 大引物PCR 反向PCR 巢式PCR 不对称PCR 一、逆转录PCR（RT-PCR） 原理：利用逆转录酶将 RNA（通常为 mRNA）反转录为 cDNA，然后以 cDNA 为模板进 行 PCR 扩增。 特点：结合逆转录和 PCR 两种技术。一般应用于以 RNA 作为起始材料的 PCR 实验。 运用：RNA 病毒初筛、基因表达定性检测 基本原理： 操作步骤： 第一步(逆转录)：以 RNA(mRNA 、rRNA、 tRNA 或总 RNA)为模板在逆转录酶的作用下 合成 cDNA 第一链。 第二步(PCR 扩增)：将 cDNA 第一链作为模板， 进行传统的 PCR 扩增。 （2022 ·全国乙卷 · 高考真题）节选 新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。 (1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原 理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是 逆转录酶/反转录酶 ，再通过PCR技术扩增相 应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。 （2020 · 山东 · 高考真题）节选 水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因（Wx基因）启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。 （3）为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA （Wx mRNA）的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经 逆转录/反转录 过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的（ 或：引物能与Wx基因的cDNA特异性。结合） （4）各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为 品系3 ，原因是品系3的Wx mRN。A最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强 1.非特异性染料法 非特异性染料法 qPCR 原理： 热变性后引物与模板结合 ， 延伸过程中染料嵌入双链DNA 小沟后发出强荧光 ，荧光 强度与双链 DNA 量正相关。 二、荧光定量PCR（qPCR） 原理：扩增中加入荧光染料/探针，实时监测荧光信号，通过荧光信号实时反映 PCR扩增产物的量，实现对初始模板的定量分析。 特点：分染料法(低成本)/探针法(高特异性)，可相对/绝对定量。 运用：DNA 定量、病毒载量检测、基因拷贝数分析。 但由于会与任何双链DNA（如非特异性条带和引物二聚体） 结合 ， 因此特异性较差。 引物25’ 3’ 3’ 淬灭荧 光基团 3’ 5’引物1 特异性探针 报告荧 光基团 5’ 3’ 5’ 实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目标序列内部特异性结合，两端带有报告荧光基团和淬灭荧光基团)。 探针完整时，淬灭基团抑制报告基团荧光，不产生荧光； 2. 特异性探针法（如 TaqMan 探针） R Q 在该反应中TaqDNA聚合酶有两个作用： 一是催化DNA子链的延伸 ，二是具备 5'→ 3' 每扩增一次， 就有一个荧光分子产生。 因此特您性极高. 在PCR过程中，DNA双链变性后探针与目标序列结合，延伸时DNA聚合酶沿模板延伸， Taq 酶 5'→3' 外切 酶活性切断探针，报告基团与淬灭基团分离，报告基团发出荧光。 引物25’ 3’ R 外切酶活性。 5’ 报告荧 光基团 淬灭荧 光基团 特异性探针 3’ Q 通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓度越高。 荧光强度主要与扩增次数、病毒初始数量有关 荧光扩增曲线图中平台期出现的原因： 试剂盒中的原料、引物、探针数量有限 二、荧光定量PCR技术（qPCR） (4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经 逆转录 形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的 32 倍。 （2022 ·江苏 · 高考真题）节选 纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要 意义。请回答下列问题。 三、重叠延伸PCR 原理： 采用具有互补末端的引物， 形成具有重叠链的 PCR 产物， 通 过 PCR 产物重叠链的延伸， 从而将不同来源的任意 DNA 片段连接起来。 特点： 无缝拼接 DNA 片段， 无需限制酶/连接酶。 运用： 该技术广泛应用于融合基因的构建、 基因的定点突变等方面。 三、重叠延伸PCR 1.重叠延伸PCR——获得融合基因 基本原理： 图片来源：公众号 ·生物印记 操作步骤： 第一步(引物设计)：需要根据 A 片段和 B 片段需融合的部分分别设计引物 2 、3 ，引物 2 的末端与引物 3的 末端有部分序列互补。根据 A 片段和 B 片段非融合的 分分别设计常规引物 1 、4。 二步：在两个体系中分别 PCR 扩增 A 和 B 片段，到产物 A和 B。 三步：用第一次 PCR 的产物 A和 B进行融合 PCR，得到融合基因，此时 A和 B片段互为引物和模板。 第四步：以融合基因为模板，用引物 1 、引物 4 进行三次 PCR ，扩增出大量融合基因。 部 第 得 第 第 图片来源：公众号 ·浙考生物研学馆 ①融合PCR不用使用限制酶和DNA连接酶，不受酶切位点的限制，也可以不引 入额外的碱基序列。 ②与常规PCR相比，融合PCR在第二次扩增时，不需要额外加入引物。 与常规的基因融合方法的区别： 为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 模板（ 片段F1、 片段F2） 、引物 ，扩增程序中最主要的不同是 退火温度 。 (2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用 CD 。 例题1：（2023 ·江苏 ·高考真题）节选 A．ATGGTG------CAACCA C．GACGAG------CTGCAG B．TGGTTG------CACCAT D．CTGCAG------CTCGTC 例题2：2025南昌一模试题（节选） 赤藓糖醇具有抗氧化等作用。蓝细菌具有光合固碳能力，但缺乏合成赤藓糖醇所需的“赤藓糖还原酶G基因”和 “磷酸酶Y基因” ，研究者利用基因工程技术构建了一种生产高附加值产品赤藓糖醇的蓝细菌工程菌，以工业废气CO2 (温室气体)为原料实现了低碳减排，过程如图。回答下列问题： (2)在构建过程中发现，基因G与基因Y无同源序列且两端均缺乏与质粒T连接的限制酶切点，据图分析可知，为了准 确构建GY融合基因表达载体，在合成引物时，应注意的事项是 在引物4 的5'端添加HindⅢ 的识别序列,。在PCR融合基因扩增时系统中应添加的引物是引物 1和4 (填“1、2、3、4引”物)2和引物3的5'端添加部分互补序列 在引物1的5'端添加BamHI的识别序列， 2.重叠延伸PCR——实现基因定点突变 2.重叠延伸PCR——实现基因定点突变 引物2 ? ? 拟突变位点 ? ? 引物3 互补 突变前： 突变后： 引物4 互补 引物4 如何快速判断引物的碱基序列？ 引物2的序列和突变后的序列④ ① ③ ② ④ 引物1 引物1 完全相同 例题： 水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见下图。 拟突变位点:A—T 密码子: 基因: AAU A AAA T 或AAU 基因A: AAG C A T或C (1)若拟突变位点的碱基对为A—T，则需要让其突变为 T—A或C—G 才能达到目的。 引物2的突变位点 (突起处)应设计为 A或G (假设引物为单链DNA)。 (1)若拟突变位点的碱基对为A—T，则需要让其突变为 T—A或C—G_ 才能达到目的。引物2的突变位点 (突起处)应设计为 A或G (假设引物为单链DNA)。 (2)在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的 反应系统中均进行一次复制，共产生 3 种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应 系统中，这是因为 。 引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会发生碱基互补配对，导致引物失去作用。 产生 的DNA 分子 相同 水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从 而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见下图。 四、大引物PCR -----实现基因定点突变 原理： 两轮扩增， 第一轮产物作为第二轮 “大引物”， 引入突变位点。 特点： 可同时扩增+定点突变， 无需酶切连接 运用： 蛋白质工程、 酶基因改造 四、大引物PCR-----实现基因定点突变 大引物PCR需要用到三条引物进行两 轮PCR，这三条引物分别是常规上游 突变上游引物 PCR1 使用常规下游引物 引物、常规下游引物和突变上游引物。 和突变上游引物 3' 模板链（反义链） G G G T T C 拟突变位点 C C C A A G 常规下游引物 常规上游引物 编码链（有义链） A A G C C C 使用常规下游引物 和 常规下游引物 PCR1 第一次复制 3' 5' 常规下游引物 突变上游引物 拟突变位点 C C C A A G 突变上游引物 突变上游引物 常规上游引物 A A G A A G C C C A A G G G G T T C G G G T T C C C C C C C 第二次复制 常规下游引物 大引物是突变引物的互补链 作为下一轮PCR的大引物 PCR体系1得到不完整的含有突变位点的DNA片段 突变上游引物 常规下游引物 不选另一条链作为大引物的原因？ 突变上游引物 PCR1 A A G C T T C G G 第二次复制 ■ ■ ■ ■ 5' G 常规下游引物 C C C A A G 常规下游引物 T C G G G PCR2 用编码链的DNA作为模板使用 作为下一轮PCR的大引物 作为模板，另一条链作为大引物 常规上游引物 时无法延伸出新的子链。 第一次复制 大引物和 常规下游引物 突变上游引物 突变上游引物 A C 大引物 编码链 C C C A A G G G G T T C 以 A C C C C 第二次复制 大引物 大引物 常规下游引物 作为模板 得到完整的含有突变位点的DNA片段。 常规上游引物 PCR2 例题： IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKK基因编码区第1183位碱基 T突变为C,导致IKK上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制,研究人员利用纯合野生鼠应用大引物 (1)在PCR反应体系中，除需加入引物、 IKK基因、缓冲液、Mg2+等外，还需加入 。 耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷酸 PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠(纯合),主要过程如图甲、乙。分析回答下列问题: 引物A 5’ 5’ 5’ 3’ 引物B 5’ 引物C 大引物 IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKK基因编码区第1183位碱基T突变为C,导致IKK上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制,研究人员利用纯合野生鼠应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠(纯合),主要过程如图甲、乙。分析回答下列问题: (2)在图甲获取突变基因过程中，需要以下3种引物: 则PCR1中使用的引物有 引物A、引物B ，PCR2中使用的引物有 引物C 和图中大引物的_ ② (填“①” 或“② " )链。 操作步骤： ①利用限制酶剪切两端 ②DNA连接酶将DNA片段环化。 ③再利用已知序列的两个末端设计一对引物。 注意：因为是环形DNA，引物3和引物4相对于已知序列是反向配置的，但相对于两侧的未知序列，却是相向配置的。 ④利用这对引物做PCR扩增，那么它将会以未知序列为模板， 将未知序列和已知序列（部分）都扩增出来。 五、反向PCR 原理：酶切基因组DNA并环化，用已知序列反向引物扩增侧翼未知序列 特点：扩增已知序列两侧未知区域，无需基因组文库 运用：转座子插入位点分析、基因侧翼序列克隆 （2）为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T- DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 4 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段环化 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 测序和序列比对 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对” ）。 种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 例题1：（2025 · 山东 ·高考真题）节选 5’ 3’ 例题2： （2020 ·江苏 ·高考真题）节选 如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRI 酶切为例): (3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的-些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 ②④ (从引物①②③④中选择，填编号)。 5’-GCAATGCGTAGCCTCT-3’ 3’-TTGATACGCGAGTACT-5’ 原理：两轮扩增，外引物先扩增，内引物以第一轮产物为模板再扩增 特点：特异性/灵敏度极高，可检测单拷贝基因 运用：微量病原体检出、低丰度基因扩增 基本原理： 巢式 PCR需要设计两对 PCR 引物：一对引物（外引物）在目标扩增区域的侧翼。随后，巢式引物（内引物）用于第二轮 PCR ，并以第一轮 PCR 产物为模板。 如果第一对引物（外引物）的错配导致非特异性产物被扩增，相同的非特异性区域被第二对引物识别并继续扩增的可能性非常小，所以通过第二对引物的扩增，PCR 的特异性得到了提升。 进行两轮 PCR 的另一个优势在于：有助于从有限的起始 DNA 中扩增得到足量的产物。 六、巢式PCR （2024 ·浙江 ·高考真题）节选 阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。 1．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（D） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 七、不对称PCR 原理：设计一对引物，其中一个引物（限制性引物）的浓度远低于另一个引物（非 限制性引物）。引物的比例通常为1:50到1:100。 特点：可大量制备单链DNA(ssDNA)，引物比例是关键 实验步骤： 1.PCR反应：在PCR反应中，开始时两引物 都会与模板结合，引导DNA链的合成，产生双链产物。随着反应的进行，限制性引物会被消耗殆尽，而非限制性引物将继续引导单链DNA的合成。 2.产物分离：产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同可以在电泳中分开，从而得到纯ss-DNA 运用：DNA 探针制备、核酸杂交模板制备 A. 若A链为所需的DNA分子探针，则非限制性引物应选用引物 Ⅲ B. 进行最初10个循环的目的是为了将限制性引物消耗完，以保证获得大量的单链DNA探针 C. 设计较长的限制性引物与较短的非限制性引物，以便于后阶段通过提高温度来控制产物生成量 D. 如果体系中原模板 DNA的数量为a，共进行25次循环，则最终获得的单链探针数为15×210a 如果体系中原模板DNA的数量为a，最初10次循环产物为双链DNA分子为210×a个，其中有B链为210 ×a个，以这些链为模板，利用引物又进行了15次循环，每次循环生成的都是A链，不改变B链的数目，即B每次循环开始都是210 ×a个， 15次循环每次生成A也是210×a个，故最终获得的单链探针数共为15×210×a个， 例题： DNA 分子杂交时，常需要大量的单链 DNA 探针。不对称PCR 是一种常见的单链DNA 探针制备方法，其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物。假设在PCR 反应的早期10个循环中，扩增产物是双链DNA，当较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA 单链。下列说法正确的 引物越短，复性时可与模板链形成的氢键数越少，越容易被高温破坏，因此可设计较短的限制性引物与较长的非限制性引物，适当提高复性温度以避免残留限制性引物与模板结合，从而提高产物生成量 是（ D ） 是一种通过合并复性与延伸步骤优化反应效率的 PCR 技术，常用于比较小片段的扩增。与常规 PCR相比，显著缩短反应时间；与常规 PCR 相比，特异性稍弱。 9.递减PCR 在 PCR中，一般复性温度越高，引物的特异性越强。但温度过高会使引物无法与模板结合，过低则 会产生大量非特异扩增。 递减PCR通过在一个PCR 流程中，使复性温度在每个循环依次降温，以提高PCR特异性的方法。 10.热启动PCR 当PCR 体系配置完成的时候，扩增就开始了，并不是放进 PCR 仪运转程序才开始，这就可能会引起 非特异性扩增和引物二聚体的形成。为了避免非特异性扩增，可以通过延迟TaqDNA 聚合酶活性以提高聚合酶链式反应特异性的 PCR 技术。 11.多重PCR 多重 PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的 PCR 反应。 12.随机PCR 常规 PCR 问题：扩增片段两端的一小段碱基序列是已知的，用以构建扩增引物。有时候对模板顺序 一无所知的情况下，可以通过随意设计或选择一个非特异性引物进行 PCR 扩增的技术。 其它常见PCR 8.双温PCR $