2026届高三生物二轮复习课件基因工程·引物的选则（1）引物书写+反向PCR中引物的选择

基因工程的高考高频考点——引物 【错题讲评】 考向一：引物的书写 第一步：确定引物的位置 引物与模板链的3‘端反向结合 第二步：书写引物序列 ①先看题目要求（要求写出几个碱基就写几个，没有要求的就把“暴露出来”的都写了） ②再通过碱基互补配对原则进行书写 【快速书写策略，“照抄”非模板链序列】 【必背积累】-OH端是3‘端，磷酸基团端是5‘端。 例1．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（    ） A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇ B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶 B错误 考向一：一般的引物书写 A．其中一个引物序列为5‘TGCGCAGT-3’（√） 【变式】另外一个引物序列为 。 5‘AGCTAGCA-3’ 第一步：确定引物的位置 引物与模板链的3‘端反向结合 第二步：书写引物序列 ①先看题目要求（要求写出几个碱基） ②再通过碱基互补配对原则进行书写 【快速书写策略，“照抄”非模板链序列】 5 【题型补充】“反推”限制酶的选择 第一步：将剪切后的黏性末端“补全”为双链 B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI（×） 第二步：将“切口”标注出来 第三步：代入题干给出的限制酶序列，进行“验证” 考向二：添加限制酶识别序列的引物书写 例2.(2022·山东，25节选) 为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。 5′端 [解析]DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。 若引物需被修饰，如增加限制酶的识别序列，这样的题目中引物该如何书写？ 例3.为使目的基因与质粒连接，在设计PCR引物 扩增Ers1基因时需添加限制酶XhoⅠ(识别序列为 5′—CTCGAG—3′) 的识别序列。已知Ers1基因左端①处的碱基序列 为—TTCCAATTTTAA—，则其中一种引物设计 的序列是5′______________________________3′。 —CTCGAGTTCCAATTTTAA— 考向一：一般的引物书写 【建立解题思路】 第一步：确定引物的位置，引物与模板链的3‘端反向结合。 第二步：书写引物序列 ①先看题目要求，确定书写碱基的数量 要求写出几个碱基就写几个，没有要求的就把“暴露出来”的都写了 ②再通过碱基互补配对原则进行书写 【快速、准确书写策略，“照抄”非模板链序列】 【必背】-OH端是3‘端，磷酸基团端是5‘端。 考向二：添加限制酶识别序列的引物书写 ①遵循上述步骤、方法不变，先写出对应序列； ②在已经写出的序列的5‘端，延长一段，此段“照抄”酶的识别序列（ 5‘ → 3‘ ） 【学情检测】 1. 如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析： 扩增X蛋白基因所需的引物序列是________________________________________；__________________________________。 5′-ATGCCGTAAGTCCTAC-3′ 5′-TGATCTACGGCTTACA-3′ 2大豆中转录调控因子Y蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y基因并将其下游终止密码子对应序列剔除，然后与载体上绿色荧光蛋白基因(GFP)进行拼接获得融合基因。成功表达的Y－GFP融合蛋白可用于Y蛋白调控机理的研究。研究中首先要对Y基因进行PCR扩增。PCR反应要在一定的缓冲液中进行，缓冲液中一般需要加入Mg2＋，其原因是______________________________。 DNA聚合酶需要Mg2＋激活 如图所示Y基因序列为转录的____________(填“模板链”或“非模板链”)。 非模板链 已知EcoRⅠ识别序列为5′－GAATTC－3′，BamHⅠ识别序列为5′－GGATCC－3′，这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y－GFP融合蛋白，Y基因下游扩增引物应为5′－__________________－3′(包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基)。 GGATCCATGTTC 【错题讲评】 考向三：反向PCR中引物的选择 1 3 2 4 分析：选择引物1、4，与选择引物2、3的扩增结果是否相同？ 【归纳】一对引物 其模板链是不同的 其方向是反向的 【归纳】反向PCR的常考要点 1、目的：通过环化，用已知序列的引物扩增出未知的序列 2、步骤：酶切 → 环化 → 引物设计 → PCR → 测序 使用：限制性核酸内切酶（限制酶） 注：该酶不可以破坏已知序列 使用：DNA连接酶 ①引物是根据已知序列设计的 ②选择1对反向引物，二者“背对背” 【学情检测】1.常见PCR只能扩增两引物之间的DNA序列，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是 A.酶切阶段，L中不能含有酶切 时所选限制酶的识别序列 B.环化阶段，可选用E.coli DNA 连接酶或T4 DNA连接酶 C.图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对 D.PCR扩增，将温度调至72 ℃的目的是使引物与模板链结合 √ 【学情检测】2.（2020·江苏·高考真题）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图（以EcoR I酶切为例）： 请据图回答问题： （1）步骤I用的EcoR I是一种 酶，它通过识别特定的 切割特定位点。 （2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成 ；PCR循环中，升温到95℃是为了获得 ；TaqDNA聚合酶的作用是催化 。 【答案】 （1）限制性核酸内切（或限制） 核苷酸序列 （2）磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 （3）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 （从引物①②③④中选择，填编号）。 名称 DNA序列(省略号处省略了部分核苷酸序列) 已知 序列 5′-AACTATGCGCTCATGA……GCAATGCGTAGCCTCT-3′ 3′-TTGATACGCGAGTACT……CGTTACGCATCGGAGA-5′ 引物 ①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′ ②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′ ③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′ ④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′ ②④ (4)对产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列单链序列中(省略号处省略了部分核苷酸序列)， 结果正确的是______。 A.5′-AACTATGCG……AGCCCTT-3′ B.5′-AATTCCATG……CTGAATT-3′ C.5′-GCAATGCGT……TCGGGAA-3′ D.5′-TTGATACGC……CGAGTAC-3′ B $