第1章 第2节 纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得-【新课程学案】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程配套练习word（浙科版）

第二节　纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得 |学|习|目|标| 1.概述微生物的分离和纯化的方法。2.概述微生物数量的测定方法。 3.举例说明通过调整培养基的配方，可以有目的地培养某种微生物。 [主干知识梳理] 一、微生物的分离和纯化 1.单菌落 在　　　　培养基上采用　　　　　　的方法接种，通过培养能获得由　　　个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定　　　　　　的子细胞集团，这样的细胞集团称为单菌落。  2.平板划线法 类型 操作方法 连续 平行划线 从培养基上的一点出发，向　　　　连续划平行线至覆盖整个培养基表面  扇形划线 从培养基的一点出发，向多方向多次划线。每划一条线，要将接种环在　　　　　　上灭菌，然后再次从　　　　起点变换方向划线  多次连续 平行划线 划线可分　　　　次进行，将培养皿旋转一定角度后，不需再次蘸取菌种，只需在上一次划线的　　　区域直接开始划线即可  3.稀释涂布平板法 (1)步骤：菌液的　　　　→各取不同稀释度的菌液0.1 mL加在固体培养基表面→用　　　　将菌液均匀涂布→培养。  (2)目标微生物的选择：根据　　　　的形状、大小、颜色、边缘或表面光滑与否等特征选取目标微生物。  二、测定微生物的数量的方法 1.稀释涂布平板法 (1)减小随机误差：一是在保证能　　　　的前提下减小稀释度；二是将相同稀释度下的多组数值取　　　　后再进行计算。  (2)计算方法：每毫升菌液中微生物细胞的数量=某一稀释倍数下至少　　　个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×稀释倍数。  2.显微镜计数法 (1)血细胞计数板 ①一个血细胞计数板含有　　　个计数区，每个计数区由　　　个大方格组成，以1 mm×1 mm×0.1 mm大方格为例，其液体体积为　　　　。  ②计数区正中间的大方格为　　　　计数区，四角的四个大方格是　　　　计数区。  (2)酵母细胞计数 三、有目的地培养某种微生物 1.依据和方法 依据 (1)不同自然环境中生活着的微生物　　　　类型不尽相同  (2)许多微生物的代谢方式并不唯一 方法 (1)调整培养基中营养物质的　　　　及比例  (2)有针对性地为目标微生物提供所需的　　　  2.选择培养基 概念 在培养基中添加(或减去)某种　　　　成分，使得只有某些特定的微生物能够生长，　　　　　　均不能生长的培养基  举例 添加青霉素——筛选对　　　　　有抗性的细菌；不添加氮源——筛选　　　　微生物  3.能分解尿素的微生物的分离与计数 (1)实验原理 ①在以尿素为唯一　　　　的选择培养基上生存的微生物能以尿素为　　　　。  ②细菌合成的　　　　能将尿素分解成NH3，致使pH升高，使酚红指示剂　　　　。  (2)培养基的对照：制备100 mL 　　　　　　和100 mL尿素固体培养基，分别培养土壤中的微生物，对菌落观察并计数。  (3)实验步骤 [预习效果自评] 1.判断下列说法的正误 (1)多次连续平行划线接种时，将培养皿旋转一定角度后，再次蘸取菌种，并沿上一次划线区域的末端开始划线。 (　　) (2)对酵母菌计数时，用滴管吸取静置的培养液滴满血细胞计数板的方格区。 (　　) (3)平板划线法简单并且可以用来计数，稀释涂布平板法使单菌落更易分开，但操作复杂些。 (　　) (4)在培养基中加入酚红指示剂就可以筛选分解尿素的微生物。 (　　) (5)用稀释涂布平板法接种时，应先在火焰上使涂布器上的酒精燃尽，此时手持涂布器的部位应低于火焰。 (　　) 2.微生物接种的方法很多，平板划线法是常用的一种。如图是平板划线示意图，划线的顺序为①②③④。下列相关叙述错误的是 (　　) A.划线操作时，将蘸有菌液的接种环插入培养基 B.平板划线后培养微生物时要倒置培养 C.不能将第④次的划线与第①次的划线相连 D.在第②~④次划线前都要对接种环进行灭菌 3.图1甲、乙、丙、丁四幅图是倒平板操作过程图，图2是两种接种方法接种后培养的效果图，请回答下列问题： (1)请用图1文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：　　　　　　　　。  (2)甲、乙、丙中的灭菌方法是　　　　　　。  (3)丁中的操作需要等待　　　　　　　　　　　才能进行。  (4)获得图2中图A效果和图B效果的接种方法分别是　　　　　　和　　　　　　。  (5)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么?应当怎样操作才可避免此种现象? [精要内容把握] 一、知识体系建一建 二、核心语句背一背 1.在固体培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种，通过培养能获得由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团。 2.稀释涂布平板法接种时，通常需要先将菌液进行梯度稀释，并在培养皿侧面或底面做好标记。 3.稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量。 提能点(一)　微生物的分离和纯化 [任务驱动] 　　某男性患者，发热伴寒战，入院进行B超及CT检查，疑似肝脓肿。其中细菌性肝脓肿的主要病原菌是大肠埃希菌、克雷伯杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌及一些厌氧菌等。为确定致病原因需要进行细菌的培养及药敏实验检查病原体种类。如图是医院进行的两种不同的微生物纯化操作。 (1)图A采用的何种分离方法，该方法利用的接种工具是什么? 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  (2)图B采用的何种分离方法，该方法的操作难度是什么? 　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  (3)医院采用图A所示方法分离患者体内的细菌时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是什么? 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  [生成认知] 一、平板划线法 1.平板划线操作流程 2.平板划线操作的注意事项 (1)蘸取菌液及每次划线之前都需要灼烧接种环，划线操作结束后仍需灼烧接种环，三种灼烧的目的不同。 项目 目的 蘸取菌液前灼烧 避免接种环上可能存在的微生物污染菌种 每次划线前灼烧 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端 划线操作结束后灼烧 及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者 (2)在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免温度过高杀死菌种。 (3)除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，这样能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 (4)划线时用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。 二、稀释涂布平板法 1.稀释涂布平板法的操作步骤 操作图示 相关说明 ①将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按10-1~10-6的顺序编号；②用移液管吸取1 mL培养的菌液，注入10-1倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸3次，使菌液与水充分混匀；③从10-1倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入10-2倍稀释的试管中，重复②步的混匀操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释 2.稀释涂布平板法的操作细节 (1)样品稀释的问题 稀释 原因 样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键 稀释 标准 选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数处于30~300，便于计数 (2)与涂布有关的问题 ①防止培养基外溅：在倒平板的过程中，不能将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 ②涂布器的灭菌：涂布器用75%酒精消毒，取出时，多余酒精在烧杯中滴尽，蘸有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃。 ③设置对照：可排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 三、培养酵母菌的分析 1.将未接种的培养基(或接种等量无菌水的培养基)放入25 ℃左右恒温箱中培养的目的：作为空白对照，若有菌落生长，说明培养基被污染或灭菌不彻底。 2.接种成功的标准：若培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小等基本一致，并符合酵母菌菌落的特点(表面光滑湿润、黏稠、多为乳白色的圆形菌落)，则说明接种操作是符合无菌要求的；若培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，重新实验。 3.培养24 h与48 h后的酵母菌菌落的大小会有明显不同，培养48 h后的菌落明显较大，菌落颜色加深，光泽度增强。 4.如果在培养基上观察到了不同形态的菌落，原因可能是菌种不纯、培养基灭菌不彻底或在实验操作过程中被杂菌污染。 　　[典例]　下图甲、乙是微生物接种常用的两种方式，回答相关问题： (1)图甲是利用　　　　　　法进行微生物接种的，图乙是利用　　　　　　法进行微生物接种的。这两种方法所用的接种工具分别是　　　　和　　　　；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是　　　　和酒精消毒。  (2)平板划线时，为保证微生物的数目随划线次数的增加而逐步减少，每次划线都要从　　　　　　　开始，平板划线结束后，最后一次划的线不能与第一次划的线　　　　　。  (3)接种操作为什么一定要在酒精灯火焰附近进行? 　。  (4)下图是接种后培养的效果图解，其接种方法是　　　　(填“图甲”或“图乙”)所示方法。  (5)假设用图乙所示方法接种培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是 　 　　　　　　　　　　　　。  [跟踪训练] 1.(2025·杭州第二中学月考)平板划线法接种酵母菌时，下列操作正确的是 (　　) A.每次划线时，接种环都需要蘸取菌液一次 B.划线分离时，需要把接种环深入到培养基中进行接种 C.在超净工作台上接种时要在酒精灯火焰旁进行 D.划线分离后将培养皿正放在恒温培养箱中培养 2.(2023·浙江1月选考)某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落。下列叙述正确的是 (　　) A.培养基pH需偏碱性 B.泡菜汁需多次稀释后才能划线接种 C.需在无氧条件下培养 D.分离得到的微生物均为乳酸菌 3.如图是两种不同接种方法所得的结果，下列叙述正确的是 (　　) A.Ⅰ、Ⅱ两种接种方法使用的接种工具在接种前都要在酒精灯火焰上灼烧，且处理方法完全相同 B.进行接种之前都要对操作者双手和培养基进行灭菌处理 C.Ⅰ方法划线时，是沿方向①②③进行，且在③区域看到有单个菌落，可直接计数 D.Ⅰ、Ⅱ所使用的培养基可以相同，且制作时要先调pH再灭菌最后倒平板 提能点(二)　微生物数量的测定 [任务驱动] 　　酵母菌是一种应用很早的单细胞真菌。据史料记载我国四千年前的殷商时代，劳动人民就用酵母菌酿酒。酵母菌的用途广泛，与人类关系十分密切，在酿造、食品、医药工业等方面占有重要地位。可广泛用于食品发酵、酿造啤酒和制造酒精等。某科研小组使用显微镜计数法对一个批次培养液的酵母菌数量进行检测计数。 (1)计数前，该科研小组用注射器反复抽取部分培养液冲击剩下的培养液，这样做的目的是什么? 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  (2)若用血细胞计数板计数细胞时，按下图所示的操作进行，统计出来的数据相比实际值有怎么样的变化?应该如何操作? 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  (3)如图a为血细胞计数板计数区，图b为一个中方格中酵母菌数。请思考：统计图b中的酵母菌数量时，遵循什么原则?图b中可统计到几个酵母菌?在图a中用方框标出抽样计数区域。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  [生成认知] 一、血细胞计数板及其使用 1.血细胞计数板：通常有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格又分成16个小方格。但无论哪种规格的计数板，每个大方格都有16×25=400(个)小方格。一个大方格长和宽各为1 mm，深度为0.1 mm，容积为0.1 mm3。 2.计数方法：对于16×25的计数板而言，计四角的4个中方格共计100个小方格中的个体数量；而对于25×16的计数板而言，计四角和正中间的(共5个)中方格共计80个小方格中的个体数量。(如下图所示) 3.计算方法 (1)16×25型的计数板：酵母细胞个数/mL=(100个小方格细胞总数/100)×400×10 000×稀释倍数。 (2)25×16型的计数板：酵母细胞个数/mL=(80个小方格细胞总数/80)×400×10 000×稀释倍数。 二、微生物计数的方法 微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如表所示： 项目 直接计数法 间接计数法 原理 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察计数，再计算一定容积的样品中微生物的数量 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 培养基 计数数据 菌体本身 培养基上的菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 缺点 死菌、活菌都计算在内 操作较复杂，有一定误差 计算公式 每毫升原液含菌数=每小格平均菌体数×400×10 000×稀释倍数 每毫升原液含菌数=培养基上平均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积 　　[例1]　(2025·浙江省名校协作体)血细胞计数板是酵母菌计数的常用工具，如图表示一个计数室及显微镜下一个中方格菌体分布情况。下列有关叙述错误的是 (　　) A.每次选取计数室四个角和中央的五个中格计数，目的是减小误差 B.需要先盖盖玻片再滴加样液，等酵母菌全部沉降后方可计数 C.每天的取样时间可任意选择，但取样前要摇匀培养液，目的是使酵母菌均匀分布，减小误差 D.若五个中格酵母菌平均数为上图所示，稀释104倍，则估算培养液中酵母菌的密度为6×1010个/mL 尝试解题： 　　[例2]　下图为土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验中样品稀释示意图。据图分析，下列叙述正确的是 (　　) A.3号试管的稀释倍数为103倍 B.4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为5号试管的10倍 C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个 D.该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要多 尝试解题： [归纳拓展] 用稀释涂布平板法计数微生物的方法 (1)稀释涂布平板操作要求：按照平行重复原则，同一稀释度下的菌液应涂布3个或3个以上的平板。 (2)计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。 (3)选择可用于计数的平板：选择菌落数在30~300的平板(相同稀释度的平板均符合该特点)进行计数，然后取平均值。 (4)每克样品中的菌株数=某一稀释度下平板上生长的平均菌落数÷涂布平板时所用的稀释液的体积×稀释倍数。 [跟踪训练] 1.(2025·宁波十校适应性考)用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，对该实验有关叙述正确的是 (　　) A.涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233 B.涂布了一个平板，统计的菌落数是230 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中测试因素和非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数估计值 2.稀释涂布平板法是微生物培养的一种常用的纯化方法。下列相关叙述错误的是 (　　) A.操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释 B.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落 C.需将不同稀释浓度的菌液分别涂布到固体培养基表面 D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理 3.某兴趣小组按如图方法对没有加工的鲜奶进行细菌检测。有关叙述正确的是 (　　) A.进行检测之前需要对鲜奶进行高压蒸汽灭菌处理 B.若培养基需要调节pH，应该在灭菌后进行 C.对鲜奶中细菌计数，常采用稀释涂布平板法，统计的结果往往比实际值偏高 D.若3个培养皿中菌落数为35、33、34，则鲜奶中细菌数为3.4×106个/mL 提能点(三)　有目的地培养某种微生物 [任务驱动] 　　某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。 (1)培养基中加入化合物A的目的是什么?该培养基属于哪种类型的培养基? 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  (2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的何种物质? 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  (3)若实验需要振荡培养，请推测“目的菌”的代谢类型。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  [生成认知] 一、选择培养基及其使用方法 1.利用选择培养基筛选菌株的原理 根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。 2.利用不同方法筛选目标微生物 方法一：加入某种特定物质 原理 依据微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以“促进”所需要微生物的生长，“抑制”不需要的微生物的生长 举例 ①培养基中加入高浓度的食盐，可抑制多种细菌生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可达到将该菌分离出来的目的；②在培养基中加入青霉素，可抑制细菌、放线菌生长，从而分离出酵母菌和霉菌等真菌 方法二：改变培养基的营养成分 培养基中缺乏碳源 异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物 培养基中缺乏氮源 可分离出自生固氮微生物 方法三：利用“特定”成分分离 以尿素为唯一 氮源的培养基 可抑制不能利用尿素的微生物的生长，使能利用尿素的微生物生长，从而分离出分解尿素的微生物 以石油为唯一 碳源的培养基 可抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生长，从而分离出能消除石油污染的微生物 方法四：通过某些“特殊环境” 高盐环境 可分离出耐盐菌，其他微生物在高浓度环境中易失水而死亡 高温环境 可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而不能生存 二、土壤中分解尿素的微生物的分离实验整体思路 1.筛选过程 先将土壤样品稀释液接种在以尿素为唯一氮源的选择培养基上进行培养，再挑取选择培养基上形成的单菌落接种到加入酚红指示剂的鉴别培养基上培养，鉴别该菌株是否能产生脲酶。 2.过程分析 理论上，以尿素为唯一氮源的选择培养基能够筛选出分解尿素的微生物；但实际上固氮微生物、以尿素分解产物(氨)为氮源的微生物也可以在该培养基上生存；因此选择培养基上的菌落不一定是分解尿素的微生物，挑取单菌落后仍需进一步鉴别。 三、常见实验现象分析 内容 实验现象 结论分析 有无杂菌污 染的判断 用于对照的空白培养基中无菌落生长 培养基制备过程中未被杂菌污染 接种过的培养基中菌落数偏高，菌种的菌落形态多样 接种操作等过程中被杂菌污染 选择培养基 的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用 样品的 稀释操作 某稀释度下得到3个或3个以上菌落数目在30~300的平板 操作成功 重复组 的结果 若选取同一种土样，统计结果应接近。若结果相差太远，则需要从各项操作过程中去分析、寻找可能的原因 　　[例1]　(2024·浙江6月选考)脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是 (　　) A.镍是组成脲酶的重要元素 B.镍能提高尿素水解反应的活化能 C.产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖 D.以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌 尝试解题： 　　[例2]　从自然菌样中筛选较理想的生产菌种的一般步骤：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。请回答下列问题： (1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养嗜盐菌的菌样应从　　　　(填“高盐”或“低盐”)环境中采集，培养厌氧菌的菌样应从　　　　(填“有氧”或“无氧”)环境中采集。  (2)富集培养指创设仅适应于该条件的微生物旺盛生长的特定的环境条件，使待分离微生物在群落中的数量大大增加，从而达到从自然界中分离到所需的特定微生物目的的培养方法。对嗜盐菌富集培养的培养基应是　　　　培养基；对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择　　　　　　　　　　　的培养基，并在　　　　条件下培养。  (3)实验室最常用的灭菌方法是高温处理。高温灭菌的原理是高温使微生物的蛋白质和核酸等物质发生　　　　。　　　　　灭菌法是微生物研究和教学中应用较广、效果较好的湿热灭菌法。  (4)纯化微生物培养的两种接种方法分别是　　　　　　　　　、　　　　　　　　　。  [跟踪训练] 1.(2025·杭州九校期中联考)下列对微生物进行选择培养或鉴定的叙述，不合理的是 (　　) A.在热电厂排污口周围的水体中容易筛选到耐热菌 B.筛选土壤中的真菌时需要在培养基中加入抗生素 C.向选择培养基中加入特定指示剂可以对筛选的菌落进行鉴定 D.从土壤中筛选尿素分解菌所用的培养基中只有尿素一种碳源 2.(2025·浙考联盟改编)为提高一种石油降解菌净化能力，将其涂布于以石油为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90%的辐照剂量诱变处理，下列叙述不合理的是 (　　) A.将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率 B.用于对照的空白培养基中无菌落生长，说明培养基未被杂菌污染 C.需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间 D.挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析 3.(2025·9+1联盟高三测评)下表是关于对四种生物能源、碳源、氮源的来源和新陈代谢类型的描述，其中正确的一组是 (　　) 项目 硝化细菌 乳酸菌 根瘤菌 衣藻 能源 NH3 乳酸 N2 光能 碳源 CO2 糖类 糖类 CO2 氮源 NH3 N2 N2 N 代谢类型 自养需氧型 异养厌氧型 自养需氧型 自养需氧型 A.硝化细菌与乳酸菌　　 B.乳酸菌与根瘤菌 C.根瘤菌与衣藻 D.硝化细菌与衣藻 科学思维——运用归纳法比较平板划线法和稀释涂布平板法 比较项目 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散 将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以形成单细胞菌落(标准菌落) 接种工具 接种环 涂布器 单细胞菌 落的获得 单细胞菌落从最后划线的区域挑取 只有合适的稀释度，才能得到单细胞菌落 用途 分离纯化菌种，获得单细胞菌落 ①分离纯化菌种，获得单细胞菌落；②用于计数 操作难 易程度 操作较简便，细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，细菌逐步分散开 操作比较复杂，需将菌液进行一系列的梯度稀释和涂布培养，需涂布多个平板 共同点 ①都能分离纯化菌种； ②都是在固体培养基上进行的； ③都需要在酒精灯火焰旁进行接种 [素养评价] 1.(2025·宁波效实中学月考)微生物的接种方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。下列关于两者区别的说法，正确的是 (　　) 类别 平板划线法 稀释涂布平板法 ① 需要接种环(灼烧灭菌) 需要涂布器(只需酒精消毒) ② 无需对菌液梯度稀释 对菌液系列梯度稀释 ③ 能纯化微生物，不可计数 既能纯化微生物，又能计数 ④ 最后的划线区域一定出现单菌落 稀释倍数足够大的菌液，涂布的平板才会出现单菌落 A.②④　　　　　　　 B.③④ C.①④ D.②③ 2.为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题： (1)通常培养基采用　　　　　　　　法灭菌；待平板冷却至　　　　左右时进行倒平板操作，待平板冷却凝固后，应将平板倒过来放置，这样做的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  (2)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是　　　　　　　　　　　　　；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37，据此可得出每升水样中的活菌数为　　　　　　。  (3)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过　　　　　灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是 　。  (4)示意图A和B中，　　　　表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。  (5)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养，结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因：振荡培养能提高培养液中　　　　的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高　　　　的利用率。  课下请完成课时跟踪检测(二) 第二节　纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得　 落实必备知识 [主干知识梳理] 一、1.固体　划线或稀释涂布　一　形态构造　2.左右　酒精灯的火焰　同一　3~4　末端　3.(1)梯度稀释　涂布器 (2)菌落 二、1.(1)准确计数　平均值　(2)3　2.(1)①2　9　0.1 mm3　②红细胞　白细胞　(2)盖玻片　计数区　气泡　随机取样　上方　左侧　80个小方格细胞总数/80×400×10 000×稀释倍数 三、1.代谢　浓度　生长条件　2.化学　其他微生物　青霉素　固氮　3.(1)①氮源　氮源　②脲酶　变红　(2)LB固体培养基 (3)G6玻璃砂漏斗　涂布器　37 [预习效果自评] 1.(1)×　提示：多次连续平行划线接种时，将培养皿旋转一定角度后，不需再次蘸取菌种，只需在上一次划线的末端区域直接开始划线即可。 (2)×　提示：吸取培养液之前需要将培养液振荡以使酵母菌分布均匀，用滴管在盖玻片边缘滴加，让菌液渗满计数区。 (3)×　提示：平板划线法只能用来分离细菌，不能用来计数。 (4)×　提示：能否实现筛选，与培养基中是否添加或控制特定物质有关，酚红为指示剂，只是用于鉴别分解尿素的微生物利用尿素的能力。 (5)×　提示：手持涂布器的部位应高于火焰，以免酒精沿器具流下，烧伤手指。 2.选A　划线时不能将接种环插入培养基，而是在培养基表面划线，A错误；用平板培养基培养微生物时，为防止水蒸气凝集滴入培养基造成干扰或污染，应将平板倒置培养，B正确；划线时要避免最后一次的划线与第一次的划线相连，否则有可能影响单个菌落的分离效果，C正确；在第②~④次划线前都要对接种环进行灼烧灭菌，保证每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，D正确。 3.(1)丙→乙→甲→丁　(2)灼烧灭菌法　(3)平板冷却凝固　(4)稀释涂布平板法　平板划线法　(5)最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌。应采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌 融通关键能力 提能点(一) [任务驱动] (1)提示：平板划线法，接种工具为接种环。 (2)提示：稀释涂布平板法，该方法需要对菌液进行梯度稀释。 (3)提示：将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。 [生成认知] [典例]　解析：(1)分析题图可知，图甲和图乙分别是利用平板划线法和稀释涂布平板法进行微生物接种的，这两种方法所用的接种工具分别是接种环和涂布器。对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是灼烧灭菌和酒精消毒。 (2)平板划线时，每次划线前都要从上一次划线的末端区域开始，最后一次的划线不能与第一次的划线相连。 (3)在酒精灯火焰附近存在着无菌区域，因此接种常在酒精灯火焰附近进行。 (4)分析题图可知，培养基上的菌落分布均匀，则其接种方法为稀释涂布平板法。 (5)采用稀释涂布平板法进行菌种分离时，稀释度要足够高，否则会导致微生物不能分散成单个细胞。 答案：(1)平板划线　稀释涂布平板　接种环　涂布器　灼烧灭菌　(2)上一次划线的末端区域　相连(或相接、相交、交叉等)　(3)酒精灯火焰附近存在着无菌区域　(4)图乙　(5)稀释倍数不够，菌液的浓度太高 [跟踪训练] 1.选C　划线分离时，菌液只需蘸取一次，A错误；划线分离时，接种环在培养基表面进行划线操作，B错误；微生物培养的关键是无菌操作，在超净工作台上接种时，需要在酒精灯火焰旁进行，以防止空气中微生物的污染，C正确；划线分离结束后，培养皿应倒置于恒温培养箱中培养，D错误。 2.选C　培养乳酸菌的培养基应偏酸性，A项错误；划线接种时，泡菜汁无需进行多次稀释，B项错误；乳酸菌是厌氧菌，需在无氧条件下培养，C项正确；泡菜汁中还有酵母菌等，因此分离得到的微生物不只有乳酸菌，D项错误。 3.选D　图Ⅰ使用的工具是接种环，接种前需在酒精灯火焰上灼烧灭菌，冷却后再进行划线操作；图Ⅱ使用的接种工具是涂布器，涂布器的处理方法是将蘸有少量酒精的涂布器在酒精灯上引燃，燃尽且冷却后即可涂布，A错误。操作者的双手应进行酒精消毒处理，B错误。平板划线法不能对细菌计数，C错误。Ⅰ、Ⅱ所使用的培养基可以相同，且制作时要先调pH再灭菌最后倒平板，D正确。 提能点(二) [任务驱动] (1)提示：促使培养液中的酵母菌均匀分布，减少误差。 (2)提示：统计出来的数值比实际值偏大。正确的操作应该是先盖上盖玻片，然后在盖玻片一侧滴细胞悬液。 (3)提示：遵循原则：数上不数下，数左不数右。图b中可计数10个酵母菌。图a的抽样计数区如下： [生成认知] [例1]　选C　每次选取计数室四个角和中央的五个中格计数，目的是取样计数并求平均值，以减小误差，A正确；制片时，应先将盖玻片盖上，再将培养液滴在计数板的一侧，等酵母菌全部沉降后方可计数，B正确；每天计数酵母菌数量的时间要固定，防止由于取样时间不同造成实验误差，C错误；酵母菌在计数时，计数原则为“计上不计下，计左不计右”，因此计数相邻两边，如果计数的中格酵母菌平均数为题图右侧所示的24个，则培养液中酵母菌的密度=24÷16×400×104×104=6×1010 个/mL，D正确。 [例2]　选C　分析题图可知，3号试管的稀释倍数为104倍，A错误；4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数不一定恰好为5号试管的10倍，B错误；5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为(168+175+167)÷3÷0.1×106=1.7×109(个)，C正确；在固体培养基上可能存在两个或多个菌体形成一个菌落的情况，因此用稀释涂布平板法得到的结果往往会比实际活菌数目少，D错误。 [跟踪训练] 1.选A　用稀释涂布平板法测定同一样品中的细菌数时，为了保证结果准确，在每一个梯度浓度内，至少要涂布3个平板，确定对照组无菌后，进行计数，求其平均值，再通过计算得出土壤中的细菌总数，A正确，B、D错误；设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度，C错误。 2.选B　稀释涂布平板法的操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释，当稀释度足够高时，可在培养基表面形成单个的菌落，若稀释度不够高，细胞聚集在一起，得不到单个的菌落，A正确，B错误；需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面，C正确；操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理，以防杂菌污染，D正确。 3.选D　实验的目的是检测鲜奶中的细菌数，若使用高压蒸汽灭菌处理鲜奶，则鲜奶就不含有细菌了，A错误；若培养基需要调节pH，应该在灭菌前进行，B错误；使用稀释涂布平板法对微生物计数，数值往往偏小，原因是两个或多个细胞连在一起时，在平板上只能观察到一个菌落，C错误；从图中可以看出涂布时添加的0.1 mL的鲜奶共稀释了10×10×10×100=105(倍)，所以鲜奶中细菌数为(35+33+34)÷3×105=3.4×106(个/mL)，D正确。 提能点(三) [任务驱动] (1)提示：加入化合物A的目的是筛选能降解有机化合物A的菌种，这种培养基属于选择培养基。 (2)提示：根据培养基成分可知，“化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素”，其中磷酸盐、镁盐以及微量元素均属于无机盐，因此有机化合物A为目的菌提供了生长所需的氮源和碳源。 (3)提示：异养需氧型。 [生成认知] [例1]　选B　根据题意，脲酶被去除镍后失去活性，说明镍是组成脲酶的重要元素，A正确；脲酶催化尿素水解的机理为降低化学反应所需的活化能，镍作为脲酶的重要组成元素，应该与降低尿素水解反应的活化能有关，B错误；产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖，C正确；产脲酶细菌能利用脲酶催化尿素水解产生的氨作为氮源，不能产脲酶的细菌则无法分解尿素获得氮源，因此以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌，D正确。 [例2]　解析：(1)在长期自然选择的作用下，生物与其生活环境相适应，培养嗜盐菌的菌样应从高盐环境中采集，培养厌氧菌的菌样应从无氧环境中采集。 (2)对嗜盐菌富集培养的培养基应是加盐培养基，对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择以淀粉为唯一碳源的培养基且在高温条件下培养。 (3)高温能使蛋白质和核酸发生不可逆转的变性，高压蒸汽灭菌法是应用较广、效果较好的湿热灭菌法。 (4)纯化微生物的两种接种方法分别是稀释涂布平板法和平板划线法。 答案：(1)高盐　无氧　(2)加盐　以淀粉为唯一碳源　高温　(3)变性　高压蒸汽　(4)稀释涂布平板法　平板划线法 [跟踪训练] 1.选D　筛选耐热菌时需要在温度较高的环境中取样，故热电厂排污口周围的水体中容易筛选到耐热菌，A合理；抗生素可以杀灭或抑制细菌的生长，因此筛选土壤中的真菌时需要在培养基中加入抗生素，B合理；对筛选的菌落进行鉴定时可以向选择培养基中加入特定指示剂，比如对筛选的尿素分解菌进行鉴定时可以向选择培养基中加入酚红指示剂，C合理；从土壤中筛选尿素分解菌所用的培养基只有尿素一种氮源，D不合理。 2.选A　培养基应该先灭菌，再在超净工作台上分装到培养皿中，A错误；用于对照的空白培养基中无菌落生长，说明培养基未被杂菌污染，B正确；可通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间，C正确；结合题干信息分析可知，石油降解菌能分解石油获得碳源，维持生长，形成菌落，菌落越大说明降解能力越强，故挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析，以获得能高效降解石油的菌种，D正确。 3.选D　硝化细菌能将NH3氧化成亚硝酸和硝酸，并利用该过程释放的化学能，将CO2和水合成有机物，属于自养需氧型生物，其氮源和能源都是NH3，碳源是CO2；乳酸菌是异养厌氧型生物，不能直接利用N2，氮源是N等，碳源和能源为糖类；根瘤菌是能固氮的异养需氧型生物，进行生命活动所需要的能量来自糖类等有机物的氧化分解，氮源是N2，碳源和能源是糖类；衣藻是低等植物，能利用光能进行光合作用制造有机物，属于自养需氧型生物，其能源是光能，碳源是CO2，氮源是N等。 浸润学科素养和核心价值 1.选D　稀释涂布平板法中，用到的涂布器进行酒精浸泡消毒后要在涂布平板前进行灼烧去除表面残留少量酒精且有利于灭菌，①错误；平板划线法不需要对菌液梯度稀释，稀释涂布平板法需要对菌液进行系列梯度稀释，②正确；平板划线法不能计算菌液中的活菌数，稀释涂布平板法可计算菌液中的活菌数，③正确；如果划线操作不规范，平板划线的最后划线区域也不一定出现单菌落，④错误。 2.解析：(1)微生物培养过程应该进行无菌操作，配制的培养基要进行高压灭菌；倒平板操作的适宜温度为培养基冷却至60 ℃左右，将平板倒置的作用是防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 (2)为了检测培养基灭菌是否彻底，应该取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间。根据题意分析，3个平板的菌落数分别是39、38和37，且水样稀释了100倍，体积为0.1 mL，因此每升水样中的活菌数为(39+38+37)÷3÷0.1×100×1 000=3.8×107(个)。 (3)在采用平板划线法分离菌种的过程中，对接种环常用的灭菌方法是灼烧灭菌；在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，目的是将聚集的菌体逐渐稀释分散以便获得由单个细胞繁殖而来的单菌落。 (4)据图分析可知，图A表示的是用平板划线法接种培养后得到的结果，图B表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。 (5)根据题意分析，振荡培养不仅提高了培养液中溶解氧的含量，还可使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率，使细菌生长速度加快。 答案：(1)高压灭菌　60 ℃　防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染　(2)检测培养基平板灭菌是否合格　3.8×107　(3)灼烧　将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落　(4)B　(5)溶解氧　营养物质 1 / 17 学科网（北京）股份有限公司 $