一轮复习第52课时　基因工程的基本工具和基本操作程序②【思维精讲】 课件2026届高三一轮复习（全国通用）

第52课时　基因工程的基本工具和 基本操作程序② 专题9 生物技术与工程 第5部分 生物技术与工程 高考考情： 考 情 解 码 考点要求 真题展示 考点一：重组DNA技术的基本工具 2024·江西卷，12；2024·山东卷，5；2025·四川卷，19；2024·重庆卷，19；2024·湖南卷，21；2024·甘肃卷，24；2024·安徽卷，20；2024·河北卷，22；2024·全国甲卷，38；2024·山东卷，25；2023·湖北卷，4；2023·广东卷，20 考点二 ：基因工程的基本操作程序 考点定标 近年高考中该考点以非选择题为主，部分地区卷会搭配选择题。题目不仅考查知识记忆，更侧重科学思维和科学探究能力。命题聚焦基因工程核心技术的原理和操作细节，且常与 PCR、电泳、基因编辑等技术结合。例如考查 PCR 技术中变性、复性、延伸的温度参数及产物分析，电泳图谱的解读，基因表达载体中启动子、终止子的功能等。 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。　 2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。 　 考点一 重组DNA技术的基本工具 考点二 基因工程的基本操作程序 真题回顾 课标要求及考点预览： 思维预览： 二、基因工程的基本操作程序 1．目的基因的筛选与获取 （1）目的基因： 在基因工程的设计和操作中，用于改变________________或获得________________等的基因。 受体细胞性状 预期表达产物 （2）筛选合适的目的基因 ②利用 和序列比对工具进行筛选。 ①从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一 结构和功能清晰 序列数据库 (3)目的基因的获取 它主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子 方法Ⅰ： 目的基因； 方法Ⅱ：从 中获取目的基因； 方法Ⅲ：利用 获取和扩增目的基因。 人工合成 基因文库 PCR S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 方法Ⅰ：人工合成 目的基因的mRNA 单链DNA (cDNA） 双链DNA(即目的基因) 反转录 合成 反转录法： 根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 目的基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 ①前提： ②方法： 基因比较小、核苷酸序列已知 通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 方法Ⅱ：从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 ①基因文库： 基因组文库： cDNA文库： （部分基因文库） ②类型 将某种生物体内所有基因，与载体连接后储存在一个受体菌的群体中。（如大肠杆菌） 将生物的某个发育时期的mRNA逆转录产生的互补DNA(cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌的群体中。 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 有无非编码区 基因中内含子 基因多少 小 大 无 有 无 真核生物有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 使用cDNA文库获得目的基因更加高效，去除了不能编码蛋白质的序列（如非编码区、内含子） S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 如果要将人胰岛素基因导入到大肠杆菌中表达，从哪种基因文库获取目的基因较好？为什么？ 从cDNA文库获取目的基因较好。基因组文库的基因含内含子，大肠杆菌缺乏真核基因转录后加工机制（剪切、连接RNA），而cDNA文库不含内含子。 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 方法Ⅲ：利用PCR获取和扩增目的基因 全称： 原理： 操作环境： 目的： 优点： 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 PCR扩增仪 ①PCR的概念： 是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 模拟体内DNA复制过程 PCR由穆里斯等人于1985年发明，1993年获得诺贝尔化学奖 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 反应还需要其它条件： 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 无需解旋酶，用高温代替 DNA（目的基因）模板 4种脱氧核苷酸(dNTP) 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 引物（通常与两条模板链结合的2种短的单链DNA） 如缓冲液（一般添加Mg2+）和控温设备 dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP） 打开DNA双链，破坏氢键 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 功能：①提供原料；②提供能量 ②PCR的进行需要的条件： 激活Taq酶 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物（不切除） 细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物（后续被酶切除） 本质： 引物为DNA聚合酶提供了游离的3 ′端，使DNA聚合酶从3 ′端延伸子链。 作用： 拓展延伸：引物 概念: 一小段能与DNA模板链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 PCR扩增时至少需要____种引物，原因是__________________________ __________________。 2 DNA的两条链是反向平行 的（序列不同） S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 引物的5' 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入蛋白质结合DNA序列等。 引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。 （4）引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰 （1）引物长度： 20-30个核苷酸 （3）两种引物之间不能互补配对 （2）引物自身不能互补配对 引物不能太短，避免特异性不强。引物短可与模板链多处进行碱基互补配对 设计引物的要求： 防止引物之间配对，导致引物不能与模板链结合 防止引物自身配对折叠 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 ③PCR的过程： 当温度超过______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 变性： 氢键 单链DNA 变性 90 ℃ 待扩增的DNA片段 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ （不需要解旋酶） 思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是确切温度？ 因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ 当温度下降 到左右时， 种引物通过 与两条单链DNA结合。 复性： 碱基互补配对 50℃ 两 便于引物与互补DNA链结合 注意：长度相同，但C-G含量高的引物复性需要的温度就越高 思考：复性的温度都要保持在50℃吗？ ③PCR的过程： 变性 引物结合位点：模板链的________ 3 ′端 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 ③PCR的过程： 变性 复性 当温度上升到______左右时，溶液中的4种_______________在耐高温的________________________的作用下，根据_______________原则合成新的DNA链。 脱氧核苷酸 DNA聚合酶 72℃ 延伸： (Taq酶) 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ Taq酶 3’ Taq酶 3’ 72℃是Taq酶的最适温度 碱基互补配对 思考：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？ 为什么温度要上升至72℃？ Taq酶结合在引物的3’端 注意：复性和延伸都是从子链 方向进行。 5'端→3'端 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 ③PCR的过程： 第二轮循环的产物 第三轮的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 第一轮循环的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 【特别提示】PCR扩增过程中引物、原料需要源源不断的加入。 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物； 第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物； DNA扩增成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数） S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 ①DNA分子有_____个 ②总链数_____条 ③不含引物的链数：___ ④含引物的链数_____ ⑤含引物1或2的链数：______ ⑥仅含引物1的DNA数：______ ⑦仅含引物2的DNA数：______ ⑧引物1、2均含有的DNA数：_____ ⑨不含引物的DNA数：______ ⑩需要引物的总数：______ 2n 2n+1 2 2n+1-2 一个DNA，通过PCR扩增n次后： 2n-1 1 1 2n-2 0 2n+1-2 ★ S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 PCR过程可以在PCR扩增仪中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 思考1：用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不能直接扩增RNA，应先将RNA逆转录为cDNA后，再进行扩增。 ①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子； ②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA,即cDNA ③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。 （逆转录PCR，简称RT-PCR ） S z L w h 思考3：在扩增目的基因时，引物是根据什么来设计的？PCR进行的前提条件？ 二、基因工程的基本操作程序 一般不是；扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段； 思考2：PCR 扩增的是完整的模板 DNA 分子吗？ 目的基因的核苷酸序列 设计引物时必须依据： PCR进行的前提条件是： 已知目的基因的DNA序列 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 思考4：利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（即出现完整的目的基因）？ 【循环n次，获得等长的DNA有多少条？】 2n-2n S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端 B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因 D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 1.下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是( ) D 7/8 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 【探究.实验】DNA片段的扩增及电泳鉴定 （1）DNA体外扩增的原理： ①PCR利用了DNA的 ___________原理，通过 ____________ 来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够 ________________ 的仪器，一次PCR一般要经历 _______ 次循环； 热变性 调节温度 自动调控温度 30 ②PCR扩增DNA片段还利用了 _____________________的原理； DNA半保留复制 变性 90˚C 延伸 72˚C 复性 50˚C 1.实验原理 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 ①电泳：DNA分子具有_______________，在一定的 ________下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷________的电极移动，这个过程就是电泳。 可解离的基团 pH 相反 一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带 ，在电场中DNA便向 泳动。 负电荷 正极 磷酸电离形成的磷酸基团带负电 1.实验原理 （2）DNA片段电泳鉴定原理： S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 ②鉴定：PCR的产物一般通过____________________来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的_________和_________等有关。 琼脂糖凝胶电泳 大小 构象 琼脂糖凝胶浓度越大， 分离的DNA分子越_____，迁移速率越____。 快 小 ③ 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 1.用 按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书， 在 中依次加入各组分。 2.待所有组分都加入后，盖严 的盖子。 将微量离心管放入 里，离心约 ，使反应液集中在管的 。 3.参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入 中进行反应。 加样 离心 反应 2.方法步骤 实验一：DNA片段的扩增 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,10min 微量移液器 微量离心管 离心机 10s 底部 提高反应速率 PCR仪 离心管 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合。 问题1：预变性的目的是什么？ 问题2：为什么最后1次变性和延伸时间都延长了？ Taq 酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq 酶就脱落了。最后1次变性、延伸时间延长，让这些DNA打开，重新充分延伸。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,10min S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 实验二：DNA扩增产物的电泳鉴定 4.根据待分离DNA片段的大小，用 配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为 的琼脂糖溶液。 在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。 稍冷却后，加入适量的 混匀。 5.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的 梳子，以形成 。 6.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子， 取出凝胶放入 内。 制备凝胶 融化 倒模 凝固 电泳缓冲液 0.8%～1.2% 核酸染料 加样孔 电泳槽 增加导电性；维持pH 溴化乙锭，简称EB S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 实验二：DNA扩增产物的电泳鉴定 10.取出凝胶置于 下观察和照相。 7.将 加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶 为宜。 8.将扩增得到的PCR产物与 (内含指示剂) 混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的 内。 留一个加样孔加入 。 9.接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为 V/cm。待 迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 电泳缓冲液 1mm 凝胶载样缓冲液 加样孔 指示分子大小的标准参照物（Marker） 1～5 指示剂前沿 进行电泳 加液 加样 电泳 观察鉴定 300nm 紫外灯 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 3.注意事项 （1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 （2）该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 （3）在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 （4）在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 （5）PCR扩增不能随意加大试剂用量。 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 4. 结果 如图所示： 进行电泳鉴定的结果为 条条带，该片段大小约为 bp(碱基对)。 一 750 分布 成功扩增出DNA片段的判断依据是： 紫外灯下直接观察到DNA条带的 ① (代表扩增DNA的大小); ② (代表扩增DNA数量的多少)。 粗细程度 DNA分子越____，迁移速度越快。 小 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 思考：如果无条带或不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？ 未出现扩增条带可能的原因有： ①引物出现质量问题； ②变性时温度 ，变性时间 ，模板DNA链未打开。 ③TaqDNA聚合酶失活； ④Mg2+浓度过 。 出现非特异性扩增带可能的原因有： ①引物设计特异性不强，易聚合成二聚体 ②复性时的温度过低，引物随机连接到非目的基因片段 ③TaqDNA聚合酶的浓度过高，即使引物与模板的结合并不完全匹配，酶仍可能催化延伸反应，生成非特异性扩增产物。 ④Mg2+浓度过高 ⑤模板DNA出现污染 低 低 短 S z L w h 2.(2024·黑吉辽卷，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　) A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 A 二、基因工程的基本操作程序 S z L w h 解析　琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率，因此琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小，A正确； 凝胶载样缓冲液指示剂的作用是指示电泳进度，B错误； 在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段是向正极迁移的，且在同一电场作用下，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误； 琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 A.凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长 为300 nm的紫外灯下被检测出来 B.染色质中的蛋白质可能对DNA具有保护作用 C.构成核小体的基本单位是脱氧核糖核苷酸 和氨基酸 D.当DNA分子处于不同构象时，其在琼脂糖凝胶中的移动速率是一样的 3.染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的。将大鼠肝细胞中分离出的染色质用非特异性核酸酶水解后去除染色质蛋白，对得到的DNA片段进行凝胶电泳，结果如图所示。若先将染色质中的蛋白质去掉，后用同样的非特异性核酸酶处理，则得到长度随机的DNA片段。据此分析，下列有关叙述错误的是(　　) D 二、基因工程的基本操作程序 S z L w h 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关， 二、基因工程的基本操作程序 2．基因表达载体的构建 ——基因工程的核心 （1）构建基因表达载体的目的： （2）基因表达载体的组成 ①使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代； ②使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 各个元件有什么作用？ S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 复制原点： DNA复制的起始位点 标记基因：作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 启动子： 本质：有特殊序列结构的 片段 位置：基因的 。 功能： 识别和结合的部位，驱动基因转录出 。 DNA 上游 RNA聚合酶 mRNA 终止子： 本质：有特殊序列结构的 片段 位置：基因的 。 功能：终止 。 DNA 下游 转录 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状 必须插到 和 之间 启动子 终止子 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 功能 DNA片段 DNA片段 mRNA上 三个相邻的碱基 mRNA上 三个相邻的碱基 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 终止转录 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（不编码氨基酸） 辨析：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 （3）基因表达载体构建的过程 DNA分子 （含目的基因） 限制酶处理 带有黏性末端或平末端的切口 带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子 （重组质粒） 同种 载体 （质粒） 目的基因 限制酶 切割位点 标记基因 启动子 限制酶切割位点 终止子 复制原点 限制酶 限制酶 DNA连接酶 重组 DNA分子 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 [思考]如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？（单酶切法） 载体 目的基因 自连 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 1 1’ 2 2’ 反向连接 2 1’ 1 2’ 1 2 2’ 1’ 正向连接 缺点：质粒重新环化、目的基因自身环化、质粒与目的基因、反向连接 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 双酶切法：选择两种不同的限制酶同时对含目的基因的DNA片段和载体切割。 限制酶a切割 a b DNA连接酶 连接 限制酶b切割 限制酶a切割 限制酶b切割 a b 双酶切法的优点: 防止质粒、目的基因自身环化和质粒与目的基因反向连接 S z L w h 思考: 从本质粒中寻找适宜的目的基因插入位点 二、基因工程的基本操作程序 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接 D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 4.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是( ) D S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 3．将目的基因导入受体细胞 受体细胞 基因表达载体 导入 动物 植物 微生物 农杆菌转化法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——Ca2+处理法 我国科学家独创 （常用） 将目的基因导入受体细胞的方法，因为受体细胞的不同而有所区别。 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 ——花粉管通道法（我国独创） （1）导入植物细胞 适用生物：开花植物 方法一：子房注射法 用微量注射器将含目的基因的DNA 溶液直接注入子房中 含目的基因的DNA 溶液 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 1.受体细胞： 受精卵 方法二： 柱头处理法 在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 2.特点： 简便经济，但要求花朵较大 ——花粉管通道法（我国独创） （1）导入植物细胞 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 农杆菌特点： a. 农杆菌是生活在土壤中的微生物, 能在自然条件下侵染_____________和___________，而对大多数单子叶植物没有侵染能力； b. 农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞后，能将________上的________（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到________________________； 双子叶植物 裸子植物 Ti质粒 Ti质粒 T-DNA 该细胞的染色体DNA上 转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 将目的基因插入__________________中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入_____________。 利用农杆菌进行转化的思路： Ti质粒的T-DNA 植物细胞 ——农杆菌转化法（常用） （1）导入植物细胞 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 第一次拼接 将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上。 第二次拼接 (非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上。 第一次导入 第二次导入 (非人工操作)含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。 将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。 过程：（2次拼接、2次导入） 注意：可优先选择受伤的叶片与重组质粒的农杆菌培养，叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 思考：农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？ T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，将目的基因插入T-DNA中，可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。 随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 方法一：可将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。 方法二：可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 受体细胞为体细胞 受体细胞为受精卵 具体转化方法： S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 （2）导入动物细胞 受体细胞: 受精卵 过程： 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 体积大，易操作； 全能性高，易培养成完整个体。 ——显微注射法（常用） 特点： S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 科学家也可以用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如慢病毒载体、腺病毒载体等。 （2）导入动物细胞 ——病毒介导法 重组病毒载体作为疫苗。 目的：使人体产生病毒的S蛋白（抗原），诱发免疫反应。 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 （2）导入微生物细胞 ——Ca2+处理法 原因：生理结构和遗传物质简单，生长繁殖快，对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作。（教材P101） 受体细胞： 常用原核细胞（其中以大肠杆菌应用最为广泛） 过程： 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 Ca2+处理细胞 将重组的基因表达载体导入其中 Ca2+的作用： 增加细胞膜的通透性。 这种细胞称为感受态细胞 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 4.目的基因的检测与鉴定 检测水平 检测目的 检测方法 分子水平 个体水平 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否导入受体细胞 目的基因是否翻译出蛋白质 转基因生物是否表现出相应的特性 PCR扩增、 DNA分子杂交技术 抗原-抗体杂交技术 RT-PCR扩增、 RNA分子杂交技术 如抗虫、抗病的接种实验 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 转基因生物 提取DNA DNA作为模板 用与目的基因相关的引物进行PCR扩增 琼脂糖凝胶电泳鉴定 (1)是否插入目的基因 转基因生物 提取mRNA mRNA cDNA作为模板 逆转录 (2)目的基因是否转录出mRNA 用与目的基因相关的引物进行PCR扩增 琼脂糖凝胶电泳鉴定 是否扩增出目的基因 是否扩增出目的基因 —— RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应） PCR扩增技术 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 碱基互补配对原则 原理： 探针 待测基因 问题1 ：探针的本质是什么？与待测目的基因的关系是什么？ 探针是一段核酸片段（通常结合放射性同位素或荧光蛋白等）， 探针的序列应与目的基因高度互补，避免与其他基因发生非特异性结合 变性 碱基互补配对原则 放射性自显影技术、荧光显微镜等 分子杂交技术 ——DNA分子杂交技术、RNA分子杂交技术 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 抗原-抗体杂交技术 抗原与抗体的特异性结合 原理： 注射小鼠体内 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt抗虫蛋白 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 转基因生物 放射性检测 （杂交带） 例：检测转基因抗虫棉是否翻译产生了Bt抗虫蛋白 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 个体水平鉴定：抗性以及抗性程度 S z L w h 二、基因工程的基本操作程序 5.下图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是( ) A.过程A需要限制酶和DNA聚合酶的参与 B.过程B需要用CaCl2处理，以提高番茄细胞细胞壁的通透性 C.抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达 D.转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定 D S z L w h 真题重现 1.（2025·天津卷）老师检查同学们的生物实验报告时，发现其中有误的是（     ） A．电泳分离DNA片段时，需用缓冲液配制琼脂糖凝胶 B．检测酵母是否产生酒精时，需向培养液滤液中加入酸性重铬酸钾 C．提取和分离菠菜叶中的色素时，用层析液进行提取，用无水乙醇进行分离 D．为维持有丝分裂样品最佳观察状态，需在分裂旺盛时剪取根尖，用卡诺氏液固定 C S z L w h 【答案】C 【详解】A、电泳分离 DNA 片段时，缓冲液可维持电泳环境的 pH 稳定，保证 DNA 片段正常分离，需用缓冲液配制琼脂糖凝胶，A正确； B、酸性重铬酸钾与酒精反应会由橙色变为灰绿色，检测酵母是否产生酒精时，需向抽取的培养液滤液中加入酸性重铬酸钾，B正确； C、提取菠菜叶中的色素时用无水乙醇，分离色素时用层析液，C错误； D、有丝分裂旺盛的根尖细胞便于观察有丝分裂过程，卡诺氏液可固定细胞形态，为维持有丝分裂样品最佳观察状态，需在分裂旺盛时剪取根尖，用卡诺氏液固定，D正确。 故选C。 真题重现 2.（2025·江西卷）为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图)，通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是（ ) A．水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子 B．在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达 C．农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素 D．愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株 B S z L w h 【答案】B 【详解】A、将T - DNA整合到水稻愈伤组织的染色体DNA后，若要使D基因表达并使水稻植株表现出抗病性状。那么D基因上游的U6启动子需被水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别， A错误； B、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，并能够驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质。由图得出，上述重组Ti质粒中的U6启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游，因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达， B正确； C、愈伤组织多指将植物体的某一组织、器官置于特定培养基中培养，诱导产生的无定形的组织团块，当农杆菌侵染愈伤组织后，T - DNA整合到水稻细胞染色体的DNA中 ，通常情况下，若D基因能表达，那么T - DNA上的潮霉素抗性基因也能表达，从而使得导入T - DNA的水稻愈伤组织具有潮霉素抗性基因；卡那霉素抗性基因不位于T - DNA上，不会发生上述生理过程。因此，在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入潮霉素， C错误； D、 检测是否成功获得转基因品种一般需要经历两个阶段，首先是分子水平的检测，包括检测目的基因是否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的基因是否转录出mRNA或最终表达出蛋白质，其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。因此愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗不一定是抗病植株， D错误。 故选B。 真题重现 3.（2023·湖北卷）用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物 可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养 基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技 术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 D S z L w h D　若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 真题重现 4.（2025·福建卷）质粒P含有2个EcoRⅠ、1个SacⅠ和1个BamHⅠ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间，用上述3种酶切割该质粒，酶切产物的凝胶电泳结果如图，其中泳道①条带是未酶切的质粒P，泳道②③④条带为3种单酶切产物，泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是（     ） A．DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极 B．可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物 C．泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 D．泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数 C S z L w h 【答案】C 【详解】A、因为DNA分子带负电，在凝胶中会向电源正极迁移，所以其迁移方向是从电源负极到正极，并非从电源正极到负极，A错误； B、P质粒有两个EcoRI限制酶的切割位点，单酶切后的产物最小，电泳时迁移速度较快，可推知③条带可能是EcoR Ⅰ的单酶切产物（单酶切产生2个片段大小相同），泳道②条带和泳道④条带位置一致，无法区分泳道②条带是SacI还是BamHI的单酶切产物，B错误； C、EcoR I有2个酶切位点，单酶切会产生2个片段，Sac I有1个酶切位点，单酶切会产生1个线性片段。Sac I和EcoR I双酶切，会产生3个片段，观察电泳图谱，泳道⑤有3个条带，可推测泳道⑤为Sac I和EcoR I酶切产物，C正确； D、酶切只是将质粒的环状结构切开，变成线性等结构，碱基总数不会改变，D错误。 故选C。 结语：感谢观看！ 眼泪无法给出答案， 拼搏才是正确选择！ Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm 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