专题20 基因工程、细胞工程和胚胎工程 题组3-【区块练】2021-2025年五年高考真题分类汇编生物

色学科网书城四 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.ZXXk.c0m○ 您身边的互联网+教辅专家 专题20 题 班级： 基因工程、细胞工程和胚胎工程 组 姓名： 学号： 一、选择题 1.(2025浙江1月卷)某研究小组进行微型月季的快速繁殖研究，结果如表所示。下列叙述正确的 是() 流程 最佳措施或最适培养基 ①外植体腋芽消毒 75%乙醇浸泡30s十5%NaC1O浸泡6mim ②诱导出丛生苗 MS++3.0 mg L-1 6BA+0.05 mg L-I NAA ③丛生苗的扩增 MS+2.0 mg L-1 6BA+0.1 mg L-1 NAA ④丛生苗的生根 12MS+0.25 mg L-1 IBA+0.25 mg L-1 NAA 注：丛生苗为丛状生长的幼苗，BA(吲哚丁酸)为生长素类物质 A.流程①的效果取决于消毒剂浓度 B流程②不需要经过脱分化形成愈伤组织的阶段 C.与流程②相比，流程③培养基中细胞分裂素类与生长素类物质的比值更大 D.与流程③相比，提高流程④培养基的盐浓度有利于丛生苗的生根 2.(2025·黑吉辽蒙卷)利用植物组织培养技术获得红豆杉试管苗，有助于解决紫杉醇药源短缺问 题。下列叙述正确的是() A.细胞分裂素和生长素的比例会影响愈伤组织的形成 B培养基先分装到锥形瓶，封口后用干热灭菌法灭菌 C芽原基细胞由于基因选择性表达，不能用作外植体 D.紫杉醇不能通过细胞产物的工厂化生产来获取，植物组织培养优势明显 3.(2025·浙江1月卷)科学家将拟南芥的细胞分裂素氧化酶基因AtCKX1和AtCX2分别导入野生 型烟草(WT)中，获得两种转基因烟草Y1和Y2,培养并测定相关指标，结果如表所示。下列叙述正确 的是() 主根长 侧根 不定根 叶片 相对叶表 植株 度mm 数/条 数/条 数/片 面积/% WT 32.0 2.0 2.1 19.0 100 YI 50.0 6.6 3.5 8.2 13.5 Y2 52.0 5.6 3.5 12.0 23.3 独家授权侵权必究 色学科网书城画 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.ZxXk.com○ 您身边的互联网+教辅专家 注：表内数据为平均值 A.与WT相比，Y2光合总面积增加 B.Y1和Y2的细胞分裂素含量相同且低于WT C若对Y1施加细胞分裂素类似物，叶片数会增加 D.若对Y2施加细胞分裂素类似物，侧根和不定根数会增加 4.(2025·安徽卷)质粒K中含有阝半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可 分解X-gl,产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工 程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是() 启动子 BamH I 质粒K 导入 Od B半乳糖苷酶基因 卡那霉素抗性基因 大肠杆菌 表达活性β-半乳糖苷酶 蓝色菌落 筛选平板 (含Xgal和卡那霉素) A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B.如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D.若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 5.(2025黑吉辽蒙卷)（多选）下图是制备抗白细胞介素6IL6)单克隆抗体的示意图。下列叙述错误 的是() 骨髓瘤 细胞 ③ 多种 诱导融合细胞 正函小凤日 某类 淋巴细胞 ④筛选 抗IL-6 分泌特定抗体 ⑤杂交瘤 单克隆抗体 的杂交瘤细胞筛选细胞 A.步骤①给小鼠注射正6后，应从脾中分离筛选T琳巴细胞 B.步骤②在脾组织中加入胃蛋白酶，制成单细胞悬液 C.步骤③加入灭活病毒或PEG诱导细胞融合，体现了细胞膜的流动性 D.步骤④经过克隆化培养和抗体检测筛选出了杂交瘤细胞 6.(2024吉林卷)从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，在传代后的不同时间点检 测细胞数目，结果如图。下列叙述正确的是() ·独家授权侵权必究· 色学科网书城国 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.ZxXk.com● 您身边的互联网+教辅专家 指数增长期平台期 W3. 105 ②， 104 期① 23 44 5 时间d A传代培养时，培养皿需密封防止污染 B.选取①的细胞进行传代培养比②更合理 C.直接用离心法收集细胞进行传代培养 D.细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关 7.(2024吉林卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是() A琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C,在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 8.(2024江西卷)y-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L 谷氨酸脱羧是高效生产y-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨 酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coiA,构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产y-氨基丁酸的菌株 E.coB。下列叙述正确的是() NcoI和KpnI 双酶切 质粒 E.coli A (含多克隆位点) NcoI和KpnI PCR双酶切 重组质粒 gadB 酿酒酵母S E.coli B A.如图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gaB BE.coiB发酵生产y-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 CE.coli A和E.coiB都能高效降解y-氨基丁酸 D.可以用其他酶替代NcoI和KpnI构建重组质粒 9.(2023·广东卷)科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎，并将其移植到长角羚羊体内，使后者 成功妊娠并产仔，该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及的操作是() A超数排卵 B.精子获能处理 独家授权侵权必究 色学科网书城国 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.ZxXk.com○ 您身边的互联网+教辅专家 C细胞核移植 D.胚胎培养 10.(2023·浙江卷6月)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠 Gta3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期 获得Gata3一GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引 物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 Gata3 启动子区 编码区 非编码区 插入前3 -5' 编码引物配非编鸭区3 GFP 启动子区 插入后 3' 51 引物3 引物2 图甲 1234 大片段 一一 小片段 图乙 下列叙述正确的是() A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3一GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子 二、非选择题 11.(2025·陕晋宁青卷)马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。 我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中 可显著增强其抗寒能力。回答下列问题： ·独家授权侵权必究· 色学科网书城四 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.zxXk.com● 您身边的互联网+教辅专家 BamH I EcoR I Xba I 5' 13 3 5'终止子启动子 生子 启动子 T-DNA 1 抗性基因2 终止子 载体 抗性基因1 复制原点 S基因转录方向 Xba I Nde I BamH I 5' S基因 3 3 限制酶 识别序列及切割位点 ↓ 5′-AGATCT-3' BgllI 3'-TCTAGA-5' ↑ ↓ 5'-CATATG-3' Nde I 3'-GTATAC-5 ↓ 5'-CTCGAG-3 Xho I 3'-GAGCTC-5' ↑ 5-GAATTC-3' EcoR I 3'-CTTAAG-5' ↑ ↓ 5'-GGATCC-3' BamHI 3-CCTAGG-5' ↑ Sal I ↓ 独家授权侵权必究 色学科网书城画 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.zxxk.com 您身边的互联网+教辅专家 5'-GTCGAC-3' 3'-CAGCTG-5' ↑ ↓ 5′-TCTAGA-3' Xba I 3'-AGATCT-5' ↑ (1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、 、含Mg2+的缓冲液和耐高温 的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 步骤中起作用 (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因 时需在引物的 (填“5端”或“3端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加 的碱基序列是5 3,切割载体时应选用的两种限制酶是 。PCR扩增产物和载体分别 被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中TDW4进入愈伤组织细 胞，将S基因整合到 抗性基因 可用于筛选成功转化的 愈伤组织。该愈伤组织经 形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 12.(2024重庆卷)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究 人员发现，基因S在大豆品种D(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因（两 品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 ①表达载体 限制酶识别位点 (indⅢ，SpeL,EcoR I,XhaI) 终止子 ②启动子D十基因S 5.…TAGAATTCCA3 3…ATCTTAAGGT-…5 ③四种限制酶识别序列及切割位点 Hind Ill Spe I: EcoR I: Xba I: 5AAGCTT3'5ACTAGT3'5GAATTC3' 5TCTAGA3' 3TTCGAA5' 3TGATCA5'3CTTAAG5' 3'AGATCT5 注：箭头表示酶的切割位置。 ·独家授权侵权必究 色学科网书城国 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.zxXk.com● 您身边的互联网+教辅专家 (1)基因S启动子的基本组成单位是 (2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D十基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。 根据题图所示信息（不考虑未标明序列判断构建重组表达载体时，为保证月标序列的完整性，不宜使 用的限制酶是 此外，不宜同时选用酶SpeI和XbaI。原因是 (3)为验证“启动子D十基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行 电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测 转入是否成功的技术是 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从T江克隆的“启动 子T+基因S”序列成功导入Z,所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ1。综合分析，大豆品 种DN较TL种子大的原因是 13.(2021·全国卷I)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生 物产品。在此过程中需要使用多种工具酶.其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。回答下 列问题： GAATTC CCCGGG CTGCAG GATATC CTTAAG GGGCCC GACGTC CTATAG 限制酶：EcoR I Sma I Pst I EcoR V (I)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和TDNA连接酶。上图中 酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中 酶切割后的 DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 (3)DWA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质 粒在受体细胞中能；质粒DNA分子上有 便于外源DNA插入；质粒DNA 分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 (④)表达载体含有启动子，启动子是指 独家授权侵权必究 色学科网书城画 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.ZxXk.com○ 您身边的互联网+教辅专家 ·独家授权侵权必究· 专题20　题组三 1.解析　流程①是对外植体腋芽消毒，消毒的效果取决于消毒剂的种类、浓度和处理时间等，A错误；由于腋芽中含有分生组织，可以不经过脱分化形成愈伤组织的阶段，直接萌生成幼苗，B正确；分析比较表格数据可知，与流程②相比，流程③培养基中细胞分裂素类与生长素类物质的比值更小，C错误；据表分析，与流程③相比，流程④中NAA浓度提高并添加了IBA，即提高生长素类物质的含量，并使用MS培养基降低了盐浓度，从而有利于诱导丛生苗生根，D错误。 答案　B 2.解析　在植物组织培养中，生长素和细胞分裂素的比例直接影响细胞的分化方向。当二者比例适中时，促进愈伤组织的形成；比例过高时促进生根，比例过低时促进生芽，A正确；培养基含大量水分，需用高压蒸汽灭菌法灭菌(121 ℃，15～20分钟)；干热灭菌法适用于耐高温且干燥的物品(如玻璃器皿)，不能用于培养基灭菌，B错误；外植体可以是植物的任何活细胞、组织或器官，只要具有全能性。芽原基细胞是分生组织的一部分，全能性高，可作为外植体。基因选择性表达是细胞分化的基础，不影响其作为外植体的能力，C错误；细胞产物的工厂化生产正是通过植物组织培养技术实现的，如大量培养红豆杉细胞，从培养液中提取紫杉醇。因此，紫杉醇可通过此方法获取，植物组织培养的优势(如快速增殖、大量生产细胞产物)在此体现，D错误。 答案　A 3.解析　与WT相比，Y2叶片数较少，相对叶表面积较小，因此Y2光合总面积减小，A错误；Y1和Y2转入的是不同的细胞分裂素氧化酶基因，该基因表达的产物会使植株内的细胞分裂素的含量低于WT，但由于无法确定Y1和Y2的细胞分裂素氧化酶的活性等情况，故无法比较Y1和Y2的细胞分裂素含量，B错误；据表可知，细胞分裂素可抑制主根生长、侧根和不定根分化，促进叶片数目增多，故若对Y1施加细胞分裂素类似物，其不受细胞分裂素氧化酶的影响，可以促进叶片数增加，C正确；Y2的侧根和不定根数量均高于WT，因此对Y2施加细胞分裂素类似物后，其侧根和不定根数量将减少，D错误。 答案　C 4.解析　使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒(可能形成白色菌落)还是未重组的质粒K(形成蓝色菌落)，都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；如果筛选平板中仅含卡那霉素，能生长出的菌落都具有卡那霉素抗性，白色菌落可能是导入了重组质粒(含目的基因)，也可能是其他情况导致β半乳糖苷酶基因不能正常表达而呈现白色，所以不可判定为含目的基因的菌株，B正确；因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落应为含目的基因的菌株，能否表达相应蛋白，需进一步检测，C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β半乳糖苷酶，分解X­gal形成蓝色菌落，D正确。 答案　C 5.解析　步骤①给小鼠注射IL6后，应从小鼠的脾中获取B淋巴细胞，A错误；步骤②需要在组织中加入胰蛋白酶或胶原蛋白酶，使其成为单细胞，进而制成悬液，B错误；步骤③是诱导细胞融合过程，该过程可加入灭活病毒或PEG诱导，细胞融合的过程体现了细胞膜的流动性，C正确；步骤④是在选择培养基上筛选得到的杂交瘤细胞，该过程得到的杂交瘤细胞不一定能产生所需抗体，步骤⑤经过克隆化培养和抗体检测筛选出了杂交瘤细胞，D错误。 答案　ABD 6.解析　动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2，O2是细胞代谢所必需的。传代培养时，培养皿不能密封，A错误。处于指数增长期的细胞形态和生理特性相对稳定，适合进行传代培养，离体培养的细胞生命力比较脆弱，需要适应培养基的环境，传代最好在细胞生长覆盖瓶底80%～90%进行，选取②的细胞进行传代培养比①更合理，B错误。题干显示从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集，C错误。悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻，因此，细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关，D正确。 答案　D 7.解析　应根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，A正确；凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳的进度，而不是指示DNA分子的具体位置，B错误；在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，在同一电场作用下，DNA片段(带负电)越长，DNA向正极迁移的速率越慢，C错误；凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm 的紫外灯下被检测出来，D错误。 答案　A 8.解析　由图可知，酿酒酵母S中含有目的基因gadB，该基因是通过PCR获取的，而不是从酿酒酵母S中分离得到的，A错误；由题意可知，E.coli B发酵生产γ­氨基丁酸时，L­谷氨酸钠的作用是作为底物，B错误；由题意可知，E.coli A和E.coli B都不能高效降解γ­氨基丁酸，C错误；因为不同的限制酶可以产生相同的黏性末端，所以可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D正确。 答案　D 9.解析　由题干信息可知，该过程通过体外受精获得胚胎，再通过胚胎移植，使长角羚羊成功妊娠并产仔，因此需要进行超数排卵、精子获能处理，并对获得的受精卵进行胚胎培养；由于该过程为有性生殖，因此不需要涉及细胞核移植，C正确，A、B、D错误。 答案　C 10.解析　由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知两基因能正常表达出相关蛋白质，A错误；由于启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，由于转录和翻译的方向均是沿mRNA的5′→3′，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；由图乙可知，大片段包含GFP基因编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，则2号小鼠是Gata3­GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3­GFP基因纯合子均能扩出条带，仅有Gata3基因时无法扩出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。 答案　B 11.解析　(1)PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。(2)为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要在引物的5′端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BamHⅠ、EcoRⅠ和XbaⅠ的识别序列，而S基因内部含有XbaⅠ、NdeⅠ和BamHⅠ的识别序列，要用BamHⅠ、EcoRⅠ或XbaⅠ切割载体，又不能用XbaⅠ、NdeⅠ或BamHⅠ切割S基因，再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BamHⅠ、EcoRⅠ切割载体，用BamHⅠ的同尾酶BglⅡ和EcoRⅠ切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5′AGATCT3′。(3)TDNA属于可转移DNA，用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中TDNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上，抗性基因1位于TDNA外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2位于TDNA内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 答案　(1)4种脱氧核苷酸　延伸 (2)5′端　AGATCT　BamHⅠ、EcoRⅠ (3)马铃薯细胞的染色体DNA上　2　再分化 12.解析　(1)启动子的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸。(2)根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏；根据题图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化以及无法保证目的基因片段与载体片段正确连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。(3)DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有启动子D＋基因S片段，还有酶切后的空载体片段；在分子水平上，可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。(4)由题可知，再生植株YZ­1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ­2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测，品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 答案　(1)脱氧核糖核苷酸(或脱氧核苷酸) (2)EcoRⅠ　酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向连接 (3)酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段　PCR (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 13.解析　(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶Sma Ⅰ和EcoR V切割形成的是平末端，E. coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcoR V切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。(3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。 答案　(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、PstⅠ、 SmaⅠ和EcoR V　(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　一至多个限制酶切位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞　(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程 学科网（北京）股份有限公司 $