PCR和电泳（贺）

PCR 技术 贺老师 1 1 PCR的概念 全称： 原理： 操作环境： 目的： 优点： 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） DNA半保留复制 体外（PCR扩增仪/PCR仪） 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 PCR由穆里斯等人于1985年发明，1993年获得诺贝尔化学奖 PCR扩增仪 大量基因 模拟细胞内DNA的复制过程， 在体外快速扩增特定的DNA片段。 PCR 某基因 获取到一个Bt基因之后，是否就该立即开始准备转基因操作？ 2 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 反应还需要其它条件： 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 （通常为小的单链RNA） 无需解旋酶，用高温代替 DNA（目的基因）模板 4种脱氧核苷酸(dNTP) 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 引物（通常与两条模板链结合的2种短的单链DNA） 如缓冲液（一般添加Mg2+）和控温设备 dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP） 打开DNA双链，破坏氢键 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 功能：①提供原料；②提供能量 2 PCR的进行需要的条件 激活Taq酶 3 PCR技术 体内DNA复制 相同点 原则 碱基互补配对 条件 DNA母链作为模板、引物(体内引物RNA、体外引物DNA)、4种脱氧核苷酸为原料 延伸方向 新链都是从5′端向3′端延伸 不同点 解旋方式 90 ℃以上高温解旋 解旋酶催化 场所 PCR扩增仪 主要在细胞核 延伸用酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA聚合酶 温度 控制温度、需要在不同温度下进行 细胞内温和 条件过程 结果 大量的DNA片段(或目的基因) 形成完整的子代DNA 体内DNA复制与PCR技术的比较 4 当温度超过______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。 (1)变性： 氢键 单链DNA 变性 90℃ 待扩增的DNA片段 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 不需要解旋酶 思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？ 因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。 变性 复性 延伸 3 PCR的过程 5 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ 思考：为什么需要引物？ 引物结合在模板链的什么位置？ ①因为Taq酶不能从头开始添加核苷酸。 ②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。 当温度下降到 左右时， 种引物通过 与两条单链DNA结合。 (2)复性： 碱基互补配对 50℃ 两 便于引物与互补DNA链结合 变性 复性 延伸 3 PCR的过程 6 当温度上升到______左右时，溶液中的4种_____________在耐高温的______________ __________的作用下，根据_____________原则合成新的DNA链。 脱氧核苷酸 DNA聚合酶 72℃ (3)延伸： (Taq酶) 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ Taq酶 3’ Taq酶 3’ 思考1：为什么温度要上升至72℃？ 72℃是Taq酶的最适温度 碱基互补配对 思考1：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？ Taq酶结合在引物的3’端 变性 复性 延伸 3 PCR的过程 7 DNA解链为单链 高温(95℃)变性 低温(50℃)复性 中温(72℃)延伸 引物结合到互补DNA链 Taq酶从引物起始进行子链的合成 PCR过程可以在PCR扩增(PCR仪)中自动完成。 3 PCR的过程 1、一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的 。 模板 8 第二轮循环的产物 第三轮的产物 第一轮循环的产物 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 含引物的DNA分子数 含引物1的DNA分子数 同时含引物1和2的DNA分子数 消耗引物数量 2n 2n 2n-1 2n-2 2n+1-2 2 4 8 2 4 8 1 3 7 0 2 6 2 6 14 4 PCR中的数量关系 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物； 9 要求：1.写出互补链的碱基序列，并注明方向。 2.从①－④中选择2个合适的位置设计引物，写出引物的部分序列，并注明方向。 5’-ATG …… ATC GAG ACC GGT …… TAA-3’ 3’-TAC …… TAG CTC TGG CCA …… ATT-5’ ① ② ③ ④ 3’… ATT-5’ 5’-ATG… 3’ 问题1：根据查询的Bt基因编码链序列，尝试设计引物。 1、PCR扩增时至少需要____种引物，原因是________________________________________ 2 2、设计引物的要求： ①2种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：_______________________________。 ②同种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：_________________________ 防止引物自身配对折叠 防止引物之间配对， 导致引物不能与模板链结合 DNA的两条链是反向平行的（序列不同） 思考 · 讨论 同种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：防止引物自身折叠 2种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是防止引物之间配对，导致引物不能与模板链结合 10 一般不是； 扩增的是两种引物之间所对应的特定DNA片段； 问题2：PCR 扩增的是完整的模板 DNA 分子吗？ 思考 · 讨论 设计引物时必须依据： 目的基因的核苷酸序列 问题3：由此可知在扩增目的基因时，引物是根据什么来设计的？ PCR进行的前提条件是： 已知目的基因的DNA序列 PCR进行的前提条件是已知目的基因的DNA序列。两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。 11 问题4：利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？ 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 思考 · 讨论 12 引物A 引物B 第1轮产物 第2轮产物 第3轮产物 模板链 画出PCR扩增3轮的产物，注意标出方向(虚线内的为目的基因) 13 5’ 引物A 引物B 3’ 3’ 5’ 引物A 引物B 5’ 5’ 第1次 第2次 第3次 引物A 引物B 5’ 5’ 引物A 引物B 3’ 3’ 引物A 引物B 引物A 引物B 引物A 引物A 引物B 引物B 问题5：若想在DNA两侧添加限制酶识别序列，可利用PCR技术对DNA进行扩增时，在引物A、B的 端分别添加限制酶识别序列。 5’ 14 5 PCR定点突变——重叠延伸PCR技术 如何实现基因的定点突变？ 15 6 PCR定点突变——大引物PCR技术 16 7 反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列 问题：当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，如何解决？ ①用限制酶切割该DNA ②随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。 ③以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。 扩增未知序列 17 （1）若下表所列为已知的序列和设计的一些 引物,步骤 Ⅲ 选 用的 引物必须是_______（从引物①②③④中选择，填编号）。 已知序列 _______________________________________________________________________________ 引物 ② ④ 7 反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列 通过反向PCR得到的子链DNA无法连接起来（这是体外，没有相应的酶），因此得到的不是环状而是线型DNA分子 18 重组PCR技术是一项新的PCR技术，可将原来两个不相关的DNA连接起来，组成一个新的分子。实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB基因和ST1基因片段，用重组PCR技术构建了LTB-ST1融合基因。融合基因的制备过程如图所示。回答下列问题： (1)设计引物时，引物P1与引物P2的碱基序列        互补；引物P2与引物P3的碱基序列应 ，目的是        。 (2)为了使杂交链顺利延伸子链，至少需要经过2次循环才能得到用于杂交的目的链L、S，则第2次循环的目的是          。 (3)杂交链延伸生成LTB-ST1融合基因的过程中，        （填“需要”或“不需要”）加入引物。在图中标出杂交链两条母链的3′端和5′端。 8 重组（融合）PCR技术 部分互补 不能 使LTB基因与 STI基因的单链融合在一起 为杂交链延伸子链起始部位提供 3’端 不需要 3’ 3’ 5’ 5’ 问题：如何将两个不相关的DNA连接起来？ 延伸最重要是要漏出3’端 19 利用PCR在体外进行DNA片段扩增 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。提高反应速率 20 （1）电泳：DNA分子具有_______________，在一定的 ________下，这些基团可以带上正电荷或负 电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷________的电极移动，这个过程就是电泳。 可解离的基团 pH 相反 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 1 实验原理 一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带 ，在电场中DNA便向 泳动。 负电荷 正极 磷酸电离形成的磷酸基团带负电 样品点样孔应靠近 极。 负 问题1：PCR的产物是什么？ 问题2：如何鉴定PCR的产物？ DNA片段 琼脂糖凝胶电泳 21 （2）鉴定方法：PCR的产物一般通过 来鉴定。 琼脂糖来源于红藻的多糖，其主要成分为多聚半乳糖，琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶。 琼脂糖凝胶具有网络结构（孔径），孔径大小与琼脂糖凝胶浓度有关，浓度越高，孔径越 ，能够通过的核酸分子越 。 1 实验原理 琼脂糖凝胶电泳 在凝胶中DNA分子的迁移速率与_____________、_________________和______等有关 凝胶的浓度 DNA分子的大小 构象 小 小 DNA的迁移速率与其构象密切相关，超螺旋结构迁移最快，开环结构最慢。在实验中，可通过优化凝胶条件（如浓度、电压）和DNA构象（如酶切处理）来提高分辨率和分离效果。DNA的构象:迁移速率：双螺旋环状DNA＞双螺旋链状DNA＞单链DNA。 22 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 23 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 ①熔化： ②倒模: ③凝固: 3 方法步骤 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 24 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（marker）。 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待 前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 ①加液 ②加样 ③电泳 3 方法步骤 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 指示剂 ①常使用一种有颜色的标记物指示样品迁移的速率及方向；通过观察指示剂位置变化判断电泳是否完成 样品中包含哪些成分 ②使样品呈现颜色，便于加样。 25 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 取出凝胶置于 下观察和照相。 3 方法步骤 利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物 紫外灯 26 核酸染色剂 常用的核酸染色剂有EB（溴化乙锭）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的碱基对之间，导致EB与DNA结合。嵌入核酸碱基间的EB能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。 1 实验原理 【问题1】DNA本身没有颜色，怎么在结果中观察到？ 27 【问题2】如何监测电泳进程？ 样品密度小可能流入附近加样孔，造成交叉污染。缓冲液中含有甘油或蔗糖等成分增加样品密度，保证每个样品都容易沉入各自的加样孔中，防止飘散。 1 实验原理 ①利用指示剂如溴酚蓝，有颜色，使样品呈现颜色，便于加样。 ②分子量较小，指示样品迁移的速率及方向，移动到距凝胶前沿1-2cm时停止电泳。 【问题3】如何保证加样时DNA不会飘散到缓冲液中？ 【问题4】如何确定待测DNA分子的大小和含量？ DNA Marker是 ，在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计 。 样本DNA的大小 已知大小的DNA分子片段 28 一条条带（目的基因片段） 1.PCR后进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？ 2.如图所示，该片段大小约为 。 750bp 思考·讨论 0次 12次 12次 30次 30次 Marker 根据条带的 及 来评价扩增的结果 3.根据什么来评价扩增的结果？ 分布 粗细程度 估计DNA的大小 估计DNA的数量 29 未出现扩增条带可能的原因有： ①引物出现质量问题； ②变性时温度 ，变性时间 ，模板DNA链未打开。 ③Taq酶失活； ④Mg2+浓度过 。 出现非特异性扩增带可能的原因有： ①引物特异性不强 ②模板DNA出现污染 ③复性时的温度过低，引物随机连接到非目的基因片段 ④DNA聚合酶的浓度过高，即使引物与模板的结合并不完全匹配，酶仍可能催化延伸反应，生成非特异性扩增产物。 ⑤Mg2+浓度过高 低 低 短 思考·讨论 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ Taq酶 3’ Taq酶 3’ 30 引物A 引物B 第1轮产物 第2轮产物 第3轮产物 模板链 画出PCR扩增3轮的产物，注意标出方向(虚线内的为目的基因) 31 EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn EVCapture4.1.9软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn $