专题04 基因工程（江苏专用）-【好题汇编】备战2024-2025学年高二生物下学期期末真题分类汇编（江苏专用）

专题04 基因工程 一、单选题 1．（23-24高二下·江苏南通·期末）下列有关实验操作的叙述，正确的是（    ） A．鉴定DNA时，待测样液中加入现配的双缩脲试剂后进行沸水浴 B．观察黑藻细胞质的流动时，低倍镜下找到叶肉细胞后换用高倍镜 C．提取绿叶中色素时，应一次性加入20mL无水乙醇并在光下研磨 D．用血细胞计数板计数酵母菌时，带有芽体的酵母菌应忽略不计 2．（23-24高二下·江苏南京·期末）下列关于现代生物工程技术的叙述，正确的是（　　） A．若检测出标记基因所表达的性状，说明重组质粒已经导入受体细胞 B．生物大分子RNA可用于鉴别蜥蜴与其他物种亲缘关系的远近 C．制备单克隆抗体时，用选择培养基筛选出产生所需抗体的杂交瘤细胞 D．要繁育高产奶牛，需要从原肠胚的滋养层细胞取材进行胚胎性别鉴定 3．（23-24高二下·江苏宿迁·期末）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（　　） A．可以用菜花、洋葱、猪血、猪肝等实验材料粗提取 DNA B．提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的研磨液，快速研磨 C．若选择动物细胞作为实验材料，实验中多次加入蒸馏水的目的均是为了析出DNA D．可利用DNA在酒精中溶解度较大的特点来提取DNA 4．（23-24高二下·江苏扬州·期末）葡萄糖异构酶在工业上应用广泛，科学家将其第138位甘氨酸替换为脯氨酸后，其最适温度提高了 10℃左右。下列相关叙述正确的是（    ） A．蛋白质工程首先要获取基因和蛋白质的结构数据 B．可用定点诱变技术直接将蛋白质中的甘氨酸替换为脯氨酸 C．利用蛋白质工程技术可以定向改变蛋白质的结构 D．改造后的葡萄糖异构酶的最适保存温度也提高了 10℃左右 5．（23-24高二下·江苏徐州·期末）基因工程需要三种工具：限制酶、DNA连接酶和载体。下列相关叙述错误的是（    ） A．不同限制酶切割后产生的DNA片段可能被某种DNA连接酶“缝合” B．T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端 C．质粒可以作为基因的载体使用，通常采用抗生素合成基因作为标记基因 D．某些病毒可作为基因工程的“分子运输车” 6．（23-24高二下·江苏徐州·期末）水蛭素可用于预防和治疗血栓。研究发现，将水蛭素第47位的天冬酰胺替换为赖氨酸，其抗凝血活性显著提高，可通过奶牛乳腺生物反应器批量生产活性高的水蛭素。下列相关叙述错误的是（    ） A．对水蛭素进行改造的直接操作对象为水蛭素基因 B．改造后的水蛭素为自然界不存在的蛋白质 C．需要将乳腺中特异表达的基因的启动子与目的基因重组在一起 D．水蛭素基因及其mRNA只能从转基因奶牛的乳腺细胞中提取并检测 7．（23-24高二下·江苏连云港·期末）下列关于生物学实验或实践的叙述错误的是（    ） A．探究植物生长调节剂对扦插枝条生根的影响时，清水组为对照组 B．在芦苇生长期合理使用人工合成的赤霉素可明显增加其纤维的长度 C．对于体积较大的土壤小动物，可采用标志重捕法调查其类群 D．DNA是一种核酸，因此可用碱性的二苯胺试剂进行鉴定 8．（23-24高二下·江苏泰州·期末）在利用新鲜洋葱进行DNA 粗提取与鉴定实验中，相关叙述错误的是（    ） A．研磨前用液氮冷冻处理洋葱有利于 DNA 释放 B．向研磨离心后的上清液中加入75%冷酒精可使DNA 大量析出 C．将析出白色丝状物的溶液再离心，弃去上清液留下沉淀物 D．向溶有丝状物的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后会出现蓝色 9．（23-24高二下·江苏无锡·期末）生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述合理的是（    ） A．要靠确凿的证据和严谨的逻辑来思考转基因技术的影响 B．运用基因编辑技术对基因进行敲除、插入等，可设计“完美试管婴儿” C．转基因微生物制成的生物武器杀伤力大于常规武器，可有选择地生产使用 D．生殖性克隆人能丰富人类基因的多样性，可在特定人群中进行相关实验 项目 试管婴儿 设计试管婴儿 目的 帮助不孕夫妇成功孕育胎儿 白血病、地中海贫血等疾病的治疗 特有技术手段 无 胚胎移植前，需进行基因检测 存在的主要的理论问题 多余的胚胎的处理问题 基因检测不符合的胚胎的处理问题、被利用设计婴儿性别 共同点 都属于有性生殖，技术手段都有精子、卵子的获取和培养、早期胚胎培养、胚胎移植等 10．（23-24高二下·江苏南通·期末）生物技术的进步在给人类带来福祉的同时，也引起了人们对它安全性的关注。相关叙述错误的是（    ） A．克隆人会冲击现有的婚姻、家庭和两性关系等传统伦理道德观念 B．生物武器等各类大规模杀伤性武器应全面禁止和彻底销毁 C．转基因作物被动物食用后，目的基因会整合到动物细胞的染色体DNA上 D．开展风险评估、预警跟踪和风险管理，是保障生物技术安全性的前提 11．（23-24高二下·江苏徐州·期末）下列关于生物技术安全与伦理问题的叙述正确的是（    ） A．如果有证据表明某种转基因食品有害，就应该禁止转基因技术的应用 B．利用转基因技术制造的新型致病菌具有极大的危害性，是因为人体不会对它们产生免疫反应 C．试管婴儿技术已经成熟，移植前可对胚胎进行遗传学诊断和基因改造 D．科学家将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，从而防止转基因花粉传播造成基因污染 12．（22-23高二下·江苏镇江·期末）关于还原糖、脂肪、蛋白质和DNA 的鉴定实验，下列叙述正确的是（    ） A．花生子叶切片用苏丹Ⅲ试剂染色后，洗去浮色，在显微镜下可见橘黄色颗粒 B．在黄豆种子匀浆液中，加入斐林试剂，液体由蓝色变成紫色 C．在鲜梨的组织样液中，加入双缩脲试剂，温水浴后液体由蓝色变成砖红色 D．将 DNA 粗提物加入二苯胺试剂，沸水浴后，液体由无色变成蓝色 13．（22-23高二下·江苏泰州·期末）某研究小组利用PCR技术扩增目的基因，并对扩增产物进行电泳，没有出现目的基因的扩增带，下列原因不可能的是（    ） A．变性温度设置太低 B．两种引物浓度不等 C．使用的Taq酶失活 D．退火温度设置太高 14．（22-23高二下·江苏无锡·期末）下列关于DNA相关实验的叙述，错误的是（    ） A．利用DNA在酒精中溶解度较大的特性提取DNA B．粗提取的DNA中可能含有蛋白质、脂质等杂质 C．用二苯胺试剂鉴定DNA时，沸水浴加热，冷却后呈蓝色 D．PCR产物一般可用琼脂糖凝胶电泳来鉴定 15．（22-23高二下·江苏扬州·期末）人体内的蛋白TPA能降解由血纤维蛋白凝聚而成的血栓，但为心梗患者注射大剂量的TPA会诱发颅内出血。研究证实，通过蛋白质工程，将TPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可制造出性能优异的改良TPA，进而显著降低出血副作用。下列关于该蛋白质工程的叙述正确的是（    ） A．制造改良TPA的过程不遵循中心法则 B．可利用X射线衍射技术分析TPA的晶体结构 C．该例中TPA蛋白的基因增添碱基时可使用基因定点诱变技术 D．需要在分子水平上直接对TPA进行定向改造 16．（22-23高二下·江苏徐州·期末）研究人员利用蛋白质工程将细菌纤维素酶的第137、179、194位相应氨基酸替换为赖氨酸后，纤维素酶热稳定性得到了提高。下列叙述错误的是（　　） A．改造纤维素酶也需要构建基因表达载体 B．对纤维素酶的改造是通过直接改造mRNA实现的 C．经改造后的纤维素酶热稳定性提高这一性状可遗传 D．蛋白质工程可以改造现有蛋白质或者制造新的蛋白质 17．（22-23高二下·江苏南京·期末）葡萄糖异构酶能将葡萄糖转化为果糖，其最适温度约为60℃，生产上常用于高果糖浆的生产。科学家将葡萄糖异构酶的第138位甘氨酸用脯氨酸替代，结果它的最适温度提高了约10℃。下列有关叙述正确的是（    ） A．蛋白质工程直接对蛋白质进行操作，从而改造或制造自然界没有的蛋白质 B．编码葡萄糖异构酶的基因的脱氧核苷酸序列会有相应的改变 C．经改造后的葡萄糖异构酶热稳定性提高这一性状不可遗传 D．改造后的葡萄糖异构酶在60℃时催化活性高于70℃时的 二、多选题 18．（23-24高二下·江苏苏州·期末）已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。下列相关叙述正确的是（　　） A．上述对蛋白质P的改造属于蛋白质工程 B．可以通过改造P基因或合成P1基因来获得P1基因 C．P1基因通过转录和翻译获得具有专一性的蛋白质P1 D．直接对蛋白质P的氨基酸序列进行改造来获得蛋白质P1 19．（23-24高二下·江苏宿迁·期末）有人饮用鲜牛奶后会导致肠胃不适、消化不良，原因可能是体内缺乏乳糖酶。“低乳糖奶牛”的诞生有望给乳糖不耐受症患者提供“放心奶”。下图是“低乳糖奶牛”的培育过程，相关叙述正确的是（　　） A．犊牛的核遗传物质全部来自黑白花奶牛 B．胚胎细胞核移植难度高于动物体细胞核移植 C．选用去核卵母细胞的主要原因是其可以激发重组细胞1的细胞核全能性表达 D．“低乳糖奶牛”的出生涉及到的技术有动物细胞培养、核移植、胚胎移植等 20．（23-24高二下·江苏宿迁·期末）红细胞生成素（EPO）是人体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，某科研团队采用基因工程培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成EPO。下列叙述正确的是（　　） A．用显微注射技术将含EPO基因的表达载体导入羊的乳腺细胞中，可得到乳腺生物反应器 B．构建基因表达载体时，需将EPO基因与乳腺蛋白基因的启动子重组在一起 C．该转基因羊中的EPO基因可在羊的乳腺细胞中表达 D．可通过PCR技术检测EPO基因是否插入山羊基因组 21．（22-23高二下·江苏南京·期末）下列关于目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定的叙述，错误的是（    ） A．农杆菌转化法或用微量注射器将含目的基因的DNA溶液注入子房中可获得种子，再经过筛选和鉴定获得稳定遗传的转基因植物 B．用乳腺生物反应器生产药物，需将目的基因导入雌性动物的乳腺细胞 C．利用显微注射技术将基因表达载体注入动物的受精卵中，这个受精卵可能发育成具有新性状的动物 D．可通过PCR和琼脂糖凝胶电泳技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因及目的基因是否表达 三、解答题 22．（23-24高二下·江苏淮安·期末）2023年“诺贝尔生理学或医学奖”被授予美国科学家卡塔林·卡里科和德鲁·魏斯曼，以表彰他们在核苷酸碱基修饰方面的发现。利用该成果使尿嘧啶转化为假尿嘧啶，可使合成的mRNA进入人体后引起的免疫反应强度降低，同时能增加其翻译效率，从而开发出有效的mRNA疫苗。mRNA疫苗在控制单链RNA病毒X（宿主为动物细胞）流行期间发挥了巨大的作用。下图是 mRNA疫苗工作原理。回答下列问题：    (1)树突状细胞将内环境中未经碱基修饰的mRNA识别为 ，进而被激活。树突状细胞被激活后，会吞噬并处理mRNA，将其呈递给 ，上述过程涉及人体免疫系统的第 道防线，体现了免疫系统的 功能。 (2)mRNA疫苗的制备的大致过程是：①获取病毒的单链RNA；②以病毒的RNA为模板合成cDNA；③切割cDNA以获取控制S蛋白的DNA片段；④以控制S蛋白的DNA 片段为模板合成mRNA；⑤碱基修饰；⑥脂质纳米粒包装；⑦成药。②过程需要的酶是 酶。合成控制S蛋白的基因片段时要注意保留基因前端的 片段，理由是该片段是 酶识别和结合的位点，便于驱动S蛋白基因的转录。 (3)制备X病毒灭活疫苗时，需要将提纯的X病毒接种在VERO细胞中，获得大量活病毒后对其进行灭活处理。VERO细胞一定来自动物，理由是 。在培养 VERO细胞时，与培养植物细胞不同的是培养液中要加入一定量的 ，培养的气体环境是 。 (4)科学家普遍认为针对RNA病毒的灭活疫苗很容易失效，不能起到预防病毒感染的目的，理由是 。 一、单选题 1．（23-24高二下·江苏无锡·期末）下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．将洋葱研磨的目的是使细胞破裂，释放DNA B．洋葱研磨液在4℃冰箱中放置几分钟，可降低DNA酶的活性 C．用玻璃棒沿一个方向快速搅拌卷起丝状物，可提高DNA的提取量 D．在溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后呈蓝色 2．（23-24高二下·江苏无锡·期末）经研究发现叶绿体相关基因ACM1的突变会导致拟南芥叶片白化，通过以下实验对该突变体植株进行研究，正确的是（    ） A．用光学显微镜观察突变体叶肉细胞中叶绿体内部结构的变化 B．用体积分数为95%冷酒精粗提取突变体DNA以观察ACM1基因的突变类型 C．用无水乙醇提取后分离突变体叶片中的色素分析其种类和含量变化 D．用琼脂糖凝胶电泳分离突变体的蛋白质，对应叶绿素的电泳条带缺乏 3．（23-24高二下·江苏南京·期末）如图是利用PCR技术对A、B两个跳虫的DNA进行分析的过程，下列相关叙述错误的是（　　） A．提取细胞DNA时加入蛋白酶有助于释放出DNA B．PCR不同循环过程中变性的温度及时间相同以使DNA充分解旋 C．用已知长度的DNA片段作为参考物，可估测样本DNA片段的大小 D．阴性对照是未加DNA模板但加入PCR扩增所需混合物，以监测试剂是否污染 4．（23-24高二下·江苏扬州·期末）DNA粗提取与鉴定的实验流程是“取材→研磨→过滤→分离→鉴定”。下列叙述正确的是（    ） A．大肠杆菌、洋葱和猪血细胞均可作为提取 DNA 的材料 B．将研磨液从冰箱中取出后，取沉淀物继续进行实验 C．滤液中加入冷酒精，用玻璃棒快速搅拌会使DNA的提取量增加 D．进行DNA 鉴定时，对照组不需要加入DNA 5．（23-24高二下·江苏扬州·期末）巢式PCR 是一种特殊的聚合酶链式反应，使用两组不同的引物实现目标DNA片段的扩增。第一组外引物扩增出的DNA片段(中间产物)长度超出目标区域，第二组内引物称为巢式引物，其结合部位在中间产物内部的目标区域，从而扩增出目标产物，具体过程如下图所示。下列说法错误的是（    ）    A．巢式PCR 的两轮扩增中所需的两对引物不同，但原料和酶相同 B．DNA的合成总是从子链的5′端向3′延伸与 TaqDNA 聚合酶的作用有关 C．用内引物进行 PCR时，扩增n次后理论上需要2ⁿ-2个引物 D．巢式PCR 技术相较于传统PCR 技术增强了扩增产物的特异性 6．（23-24高二下·江苏扬州·期末）检测和筛选是生物技术中的重要环节。下列叙述正确的是（    ） A．制备单克隆抗体过程中第一次和第二次筛选的原理相同 B．基因工程中利用含抗生素的培养基筛选出的受体细胞不一定含有重组质粒 C．检测目的基因能否稳定遗传的关键是看目的基因是否成功构建为基因表达载体 D．只要检测到目的基因成功表达出蛋白质，就证明基因工程取得成功 7．（23-24高二下·江苏扬州·期末）下列有关基因工程所需酶及载体的描述错误的是（    ） A．限制酶切割1个位点，破坏两个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团 B．T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，不具有专一性 C．DNA聚合酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 D．使用质粒作为载体可以避免目的基因在受体细胞内被分解 8．（23-24高二下·江苏淮安·期末）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述正确的是（　　） A．动、植物细胞DNA 的提取须在无菌条件下进行 B．为了 DNA 充分析出，搅拌时需快速搅拌 C．粗提取得到的白色丝状物中仍含有蛋白质等杂质 D．将DNA粗提物与二苯胺混合，沸水浴冷却后才能观察到呈蓝色 9．（23-24高二下·江苏徐州·期末）下列关于“DNA粗提取与鉴定”、“PCR扩增”、“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述，正确的是（    ） A．DNA粗提取过程中需使用预冷的体积分数75%的酒精溶液 B．将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，溶液即可变为蓝色 C．对1个双链DNA分子进行PCR扩增，第n次循环需要引物2n个 D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 10．（23-24高二下·江苏盐城·期末）在科学研究过程中，相关方法、试剂等原理、作用，下列叙述正确的是（　　） A．DNA在酒精中溶解度较大，蛋白质几乎不溶于酒精 B．自然生长的茎进行组织培养前须用适宜浓度的乙醇和次氯酸钠先后消毒 C．常用性激素进行超数排卵 D．可用乙醇、高Ca2+-高PH等处理激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程 11．（23-24高二下·江苏淮安·期末）下列有关“DNA粗提取与鉴定”“PCR扩增”“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述中，正确的是（　　） A．使用洋葱提取DNA时，先在切碎的洋葱中加入适量洗涤剂和食盐，充分研磨后过滤并弃去滤液 B．将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后沸水浴，溶液即可变为蓝色 C．PCR扩增反应体系中dNTP既可以为扩增提供原料，也可以为子链的合成提供能量 D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 12．（23-24高二下·江苏·期末）琼脂糖凝胶电泳是分离和鉴定PCR产物的常用方法，下列相关叙述正确的是（    ） A．待分离DNA片段越大，配制的琼脂糖溶液浓度越低 B．向凝固的凝胶中加入没过凝胶的电泳缓冲液后，小心拔出梳子 C．将PCR产物与电泳缓冲液混合，用微量移液器缓慢注入加样孔内 D．接通电源后，待核酸染料前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 二、多选题 13．（23-24高二下·江苏无锡·期末）下列关于实验安全的叙述正确的是（    ） A．在绿叶中色素的提取和分离实验过程中，必须要注意实验室的通风 B．在进行DNA片段扩增及电泳鉴定实验操作时，必须要戴一次性手套 C．将接种环在火焰上燃烧灭菌时，手持接种环的部位应低于酒精灯火焰 D．若实验者皮肤沾染了溶有重铬酸钾的浓硫酸溶液，应立即用医用酒精冲洗消毒 14．（23-24高二下·江苏淮安·期末）甲胎蛋白（AFP）是含有 609个氨基酸的肝脏特异性蛋白质。某实验小组使用cDNA文库，设计多组引物，通过 PCR 技术扩增甲胎蛋白基因（afp），并将扩增产物进行电泳分析，结果如下图所示。MW 为标准样品的电泳结果，1号泳道为扩增成功的电泳结果。下列相关叙述正确的有（　　） A．人的胰腺细胞中也含有afp，可选用胰腺细胞的cDNA文库为模板进行扩增 B．2 号泳道可能是退火温度较高所导致 C．3 号泳道可能是扩增时循环的次数过少所导致 D．4号泳道可能是引物过短所导致 15．（23-24高二下·江苏徐州·期末）OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（能引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法将其导入棉花细胞，在棉花叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了棉花的产量。下列相关叙述错误的有（    ）    A．使用Ca2+处理农杆菌，有利于多基因表达载体的导入 B．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞 C．OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的同一条单链为模板 D．四个基因都在棉花叶绿体内进行转录、翻译 16．（23-24高二下·江苏南京·期末）地球上纤维素含量丰富，其酶解产物利用广泛，但由于纤维素酶催化活性低下、持续催化能力较弱等，导致生产成本过高以至于影响了其实际应用，采用蛋白质工程技术对纤维素酶进行分子改造是避免上述问题的一种有效方式。下列相关叙述正确的是（    ） A．通过蛋白质工程技术改造纤维素酶不需要对基因进行操作 B．与基因工程相比，通过蛋白质工程可以生产自然界没有的纤维素酶 C．设计预期蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列是蛋白质工程的重要步骤 D．改变DNA序列可以改变纤维素酶的氨基酸序列，实现纤维素酶功能的改变 17．（23-24高二下·江苏盐城·期末）如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径，下列有关叙述正确的是（　　）    A．将含目的基因的重组质粒导入植物受体细胞可用农杆菌转化法 B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA连接酶从引物a和引物b起始延伸子链 C．接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞不是乳腺细胞 D．基因表达载体的组成一般包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等 18．（23-24高二下·江苏泰州·期末）大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA会缠绕在细胞壁碎片上，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。分别用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如下图所示。下列关于质粒粗提取和鉴定的叙述，正确的是（    ） A．溶菌酶能溶解大肠杆菌的细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜 B．为排除RNA 对实验结果干扰，需用RNA 水解酶处理上清液 C．电泳鉴定时，被染色的质粒还需要在紫外灯下才能看到结果 D．根据电泳结果，质粒上一定各有一个限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点 19．（23-24高二上·江苏南京·期末）科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（LPG），可获得乳酸乙酯（白酒香味的主要来源）高产菌株，过程如图。下列分析合理的是（　　）    A．转入的LPG基因表达产物不能影响酿酒酵母的活性 B．LPG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段 C．标记基因Ampr可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株 D．可以利用PCR技术筛选含有LPG基因的受体细胞 三、实验题 20．（23-24高二下·江苏宿迁·期末）启动子可分为组成型启动子和诱导型启动子。组成型启动子能够持续、高效地启动目的基因在植物各种组织中表达，但往往也会阻碍植物的生长发育；诱导型启动子能与抗逆基因结合，从而使转基因植物更好地适应逆境。沙冬青脱水素基因（AmDHN基因）能使植株具有较强的抗旱作用。科研人员构建Rd29A启动子驱动AmDHN基因表达的载体，过程如下图，再利用某种方法转化“敖汉苜蓿”培育耐旱新品种，以期在干旱地区发展苜蓿产业。neo「是新霉素抗性基因，aadA是链霉素抗性基因。回答下列问题。 限制酶 BclI Sac I BamH I Pst I Sma I 识别序列和切割位点 T↓GATCA GAGCT↓C G↓GATCC CTGCA↓G CCC↓GGG (1)Rd29A启动子是 （填“组成型”或“诱导型”）启动子，其基本单位是 ，能识别Rd29A启动子的酶是 。 (2)下图是科研人员扩增Rd29A启动子所设计的引物，根据引物的碱基序列及限制酶的识别序列分析，构建载体2时选用的限制酶是 。 上游引物P1：5'-GACCCGGGTTTCCAAAGATTTTTTTC-3' 下游引物P2：5'-GAGAGCTCTGGGGTTTTGCTTTTGAATGT-3' (3)构建载体3时，选用 酶切割载体1、2成功率较高。 载体5需先转入 后再转化苜蓿，转化后应在培养基中添加 筛选转化成功的愈伤组织。 (4)为检测转基因苜蓿中AmDHN基因的转录水平，挑选10株转基因植株，平均分成2组，利用自来水和20%PEG（模拟干旱条件） 处理8h, 提取植株的 通过RT-PCR检测AmDHN基因和MtActin基因（一种骨架蛋白基因，在各种细胞中表达都相对恒定）的表达水平，扩增产物常用 技术进行检测，检测结果如下图： 该图中，自来水处理和20%PEG条件下的AmDHN基因表达水平的差异说明 。 21．（23-24高二下·江苏盐城·期末）牛的瘤胃中生活着多种微生物，其中一些微生物能分解尿素。这些微生物细胞中G蛋白参与激活脲酶，且G蛋白激活脲酶依赖于其与E蛋白结合。为探究G蛋白与E蛋白的结合位点，拟采用PCR定点突变的方法，获得第72位组氨酸被替换为丙氨酸的G蛋白，相关过程见图1。回答下列问题：    注：引物中^表示碱基突变位点。可能用到的密码子：起始密码子 （AUG）、组氨酸（CAU）、丙氨酸 （GCU）。 (1)从瘤胃分离出这些微生物时需用配制选择培养基，为证明该培养基具有选择作用，对照组的操作是 。 (2)为获得点突变G蛋白基因，PCR1 需要的引物是 （从图1引物中选择），PCR4需要的引物是 （从图1引物中选择），PCR3反应体系需加入 （从下列选项中选择）。 A．含Mg2+缓冲液 B．四种脱氧核苷酸 C．TaqDNA聚合酶 D．引物2和5 E.引物1和6 F.产物1和2 (3)据图1可知，G蛋白转录的模板链是 （填“a链”或“b链”），引物4中该突变位点碱基为 （按5'到3'方向）。 (4)改造后的G蛋白基因约有1600个碱基。PCR扩增结果如图2所示，则加样孔位于 （填“甲”或“乙”）端。由图2可知泳道1条带中的PCR产物长度为1600个碱基左右，由此推测PCR产物 （填“一定” “不一定”或“不”）是改造的G 蛋白基因，理由是 。 (5)据图3可知，为使点突变G蛋白基因与表达载体高效连接并正确表达，最好选用限制酶 获取目的基因。    22．（23-24高二上·江苏南通·期末）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。请回答下列问题。 (1)从枣树相关细胞中提取 ，通过逆转录获得枣树的MTcDNA，然后根据枣树MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），以通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为 ，这些引物的长度一般包含15～23个碱基，过短会导致 差。若1个MTcDNA扩增n次，则总共消耗引物 个。 (2)本实验中，PCR所用的 酶扩增出的MT基因，其末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。 ①选用 酶将载体P切开，再用 酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P'。 ②选用 酶的组合对载体P'和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用酶连接，将得到的混合物导入到用 离子处理的大肠杆菌，然后筛出MT工程菌。 (3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示，结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，以下叙述中能支持该观点的是 。 ①尚未对MT工程菌合成的MT蛋白的活性进行测定 ②尚未对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定 ③尚未在个体生物学水平进行抗原-抗体杂交 ④尚未对MT基因进行碱基序列的测定和比较 四、解答题 23．（23-24高二下·江苏徐州·期末）放线菌主要存在于土壤、空气和水中，还有部分存在于健康植物的各种组织和器官内部，称为植物内生放线菌。请回答下列问题： (1)放线菌能抑制病原菌的生长。研究人员利用两种不同类型的放线菌获得新型工程菌，过程如图所示。收集两种菌丝体，加入 （填“纤维素酶”或“溶菌酶”）处理，获得原生质体，将两种原生质体悬液等量混合，加入适量促融剂处理一段时间。终止反应并洗涤后，取一定量混合液接种于 （填“固体”或“液体”）培养基中培养。根据菌落特征，选出性状稳定的融合菌株。 (2)某真菌的W基因可编码一种高效降解纤维素的酶，已知乙链为W基因转录的模板链，为使放线菌产生该酶，以图中质粒为载体，进行转基因。 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ MfeⅠ KpnⅠ HindⅢ 识别序列和切割位点 G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT ①为了将W基因与质粒重组且避免质粒和W基因自身环化，最好选择用限制酶 处理质粒、 处理W基因。 ②研究人员欲对W基因的mRNA进行RT-PCR，已知其mRNA的序列为5'-UGAACGCUA…（中间序列）…GUCGACUCG-3'。为了便于将扩增后的基因和载体成功构建成重组质粒，用于PCR扩增的引物应为 。 A．5'-TGAACGCTA…   B．5'-GAATTCTGA… C．5'-CGAGTCGAC…   D．5'-AAGCTTCGA… ③除引物外，PCR反应体系中还应加入含Mg2+的缓冲液、 。扩增过程中预变性的目的为 ，子链的延伸方向为 。 ④除引物外，启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择 （从“植物”“真菌”“放线菌”中选填）启动子。为确定导入重组质粒的放线菌是否具有降解纤维素的能力，研究人员将导入了重组质粒的放线菌接种在含有纤维素和 的固体鉴别培养基上，若出现以菌落为中心的透明圈，则证明W基因成功表达。 24．（23-24高二下·江苏连云港·期末）为培育抗除草剂水稻新品种，科研人员将人工合成的草铵膦抗性基因（）转入水稻植株，流程如下图所示。请回答下列问题： (1)获取目的基因。人工合成添加了限制酶识别序列的目的基因，并用适当的限制酶切割，则图中两侧的序列为① 、② （写出单链碱基序列并标出端和端） (2)构建基因表达载体。作为表达载体，除图中结构外，未标注的结构为 ，潮霉素抗性基因的作用是 。 (3)将目的基因导入受体细胞。①取某品种水稻的幼胚，经消毒处理后接种到培养基，诱导形成愈伤组织，进而形成植物个体，该过程利用的原理是 。②用农杆菌侵染愈伤组织，Ti质粒上的 区段可转移到水稻细胞的基因组DNA中。 (4)目的基因的检测与鉴定。可采用PCR技术检测目的基因是否成功导入水稻细胞，在该反应体系中，应加入 、的特异性引物对、 、dNTP、缓冲液等，第 次循环后将出现等长的目的基因片段。已知目的基因一条链的部分序列为5´-TACAGGT…GGTTCAC-3´，则的特异性引物对应选择 。（只展示引物部分序列） A．5´-TACAGGT-3´   B．5´-GGTTCAC-3´ C．5´-ATGTCCA-3´   D．5´-GTGAACC-3´ (5)将扩增得到的DNA片段进行电泳，结果如图2，据图未成功导入目的基因的是 （填写数字）。除了要进行分子水平的检测外，还要进行个体水平的鉴定，即对植株进行 实验。 25．（23-24高二下·江苏南京·期末）人绒毛膜促性腺激素是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由a链和β链（hCGβ）结合而成。近年研究显示，hCGβ可表达于结肠癌等多种恶性肿瘤细胞，与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图1为其制备的基本方案。请分析回答下列有关问题：    注1：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔 注2：AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达 (1)图中hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是 。 (2)当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。同源切割是一种代替 将目的基因导入基因表达载体的方法。 (3)阶段Ⅱ将环化质粒导入用 处理的大肠杆菌，然后在含有 的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。 (4)鉴定基因表达载体。为了检验目的基因是否融合成功，提取大肠杆菌中的质粒为模板，设计相应的引物对融合基因进行PCR扩增，PCR反应体系中需加入模板、 、引物、Mg2+、缓冲液等，再将扩增产物进行电泳。电泳时需将待测样品与上样缓冲液混合后加入加样孔，缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂，以防 。电泳后得到图2所示结果，据图可判断 号样品最符合要求。    (5)阶段IV需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分？ （a.氨苄青霉素b.组氨酸c.无机盐d.琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。将此菌株扩大培养后，离心取上清液，用 方法进行检测。若上清液中能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因得以表达。 (6)从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是 。 26．（23-24高二下·江苏泰州·期末）无缝克隆技术是依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的基因较为紧密地连在一起，实现 DNA 片段无缝连接的技术。其基本原理及过程如下图 1 所示。请回答相关问题：    (1)图1中①过程通过 方法获得线性化质粒，引物A和B要依据 序列进行设计。 (2)从冰箱拿出②过程所需试剂，放在 上缓慢融化，在离心管中加入各种反应成分后，需进行 操作，使反应液集中于离心管底部。 (3)用In-Fusion酶沿5'→3'方向水解DNA，能形成 。该酶催化的最适温度为37℃，而过程③选择的温度为50℃，目的是降低酶活性， 。 (4)与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有 。 A．避免限制酶切割对质粒功能区的破坏 B．不会引入多余碱基 C．可把目的基因插入质粒的任何位点 D．操作时间短，成功率高 (5)不对称PCR 常用于制备DNA探针。其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物，在PCR 反应的早期10-15 个循环中，扩增产物主要是双链DNA，当数量较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA 单链。    ①若A链为所需的DNA分子探针，则非限制性引物应选用上图2中引物 ；如果体系中原有模板 DNA 的数量为m，最初10次循环产物为双链，后20次循环产物为单链，则最终获得的单链探针数为 。因为 DNA 单链与双链的分子量不同，可通过 将单链探针 DNA 分离出来。 ②为精确控制产物生成量，科学家尝试设计了较长的非限制性引物与较短的限制性引物，在进行一定的循环次数后，适当提高复性温度以避免残留限制性引物与模板结合。高复性温度条件下限制性引物不能结合模板链的原因是 。 27．（23-24高二下·江苏无锡·期末）磷酸吡哆醛（PLP）是多种酶的辅酶，广泛应用于各个领域。研究人员利用质粒pETDuet-1（5420bp）将合成PLP途径中的三个关键酶编码基因pdxj（732bp）、dxs（1864bp）和zwf（1476bp）转化到大肠杆菌BL21中，使PLP的产量提高了38.76倍。图1是表达载体pETDuet-1-pdxj- zwf-dxs的构建过程（Ampr为氨苄青霉素抗性基因，Ori为复制原点），图2是通过重叠延伸PCR构建zwf-dxs融合基因的示意图，表1是相关基因扩增所用引物的部分序列，表2是部分限制酶识别序列和切割位点。请回答下列问题：        表1 基因 引物1部分序列 引物2部分序列 pdxj 5′TCGCGAATTCCCATGATA 3′ 5′CTTCGAGCTCTTAGGTATGT3′ zwf 5′CTAAGAGCTCGAAGGAGATA 3′ 5′CCTTCTCTAGATTACCACCC3′ dxs 5′TCGCGGTACCAAGGAGATAT 3′ 5′CTTCGCGGCCGCTTAATTAGAA3′ 表2 限制酶 Eco RI SacⅠ NotⅠ 识别序列 G↓AATTC GAGCT↓C GCGGCCG↓C (1)通过PCR获取目的基因zwf和dxs的扩增反应体系中应添加模板DNA、引物、 、缓冲液等，反应程序为：95℃2min；98℃10s，55℃5s，72℃30s，30个循环；72℃3min。最后72℃3min的目的是 。 (2)图2中，引物P2与P3末端添加序列必须能够发生 ，添加序列所在端为目的链L、S的 （填5′或3′）端，步骤③ （填“需要”或“不需要”）添加引物。采用电泳的方法对重叠PCR产物进行鉴定，结果如图3，条带 最可能表示dxs-zwf融合基因片段。 (3)构建重组质粒时，先将pdxj和质粒pETDuet-1分别用限制酶 进行酶切，连接得到重组质粒pETDuet-1-pdxj。zwf-dxs融合基因与重组质粒pETDuet-1-pdxj连接时，需用限制酶 和DNA连接酶处理，最终得到重组质粒pETDuet-1-pdxj-zwf-dxs。 (4)用EcoRI和NotⅠ酶切后电泳，若得到大小为 bp的两种片段条带表明成功构建了重组质粒petduet-pdxj-zwf-dxs。 (5)将成功构建的表达质粒pETDuet-1-pdxj-zwf-dxs转化至大肠杆菌BL21中，用含 的固体培养基中筛选出成功转化的菌株（重组菌株），将其接种于发酵培养液中，适宜条件下发酵，检测PLP的产量和细胞光密度（OD600），相关结果如图4所示。PLP的浓度积累到高水平后略有下降，可能的原因是 。    28．（23-24高二下·江苏苏州·期末）虾青素(ASTA)因具有抗氧化、着色和提高免疫力等功能，被广泛应用在化妆品、饲料添加剂和医药等行业中，科学家通过基因工程改造并获得虾青素高表达红法夫酵母。请回答下列问题： (1)科研人员发现，黄叶菌中 crtS 基因编码的双功能酶 P450 可以催化β-胡萝卜素转化为虾青素，图1为构建crtS 基因表达载体过程示意图，据此分析：    ①图1 中的质粒还缺少的必备元件是 ，其上的 AmpR基因(氨苄青霉素抗性基因)的作用是 。 ②为方便构建重组质粒，在引物中需要增加 限制酶的识别序列。请在下列选项中选择合适的引物序列 。 A．5'GAGCTCAGCCTAACGTACAAGTTCGT B．5'AGCCTAACGTACAAGTTCGTCTCGAG C． 5'GGATCCGAATCGAACGATTAGCAACT D．5'GGATCCAGCCTAACGTACAAGTTCGT (2)进一步研究发现, crtR 基因编码的细胞色素还原酶可促进双功能酶 P450 的活性。来自病毒的2A基因控制合成的2A短肽，可以将其自身尾端甘氨酸和脯氨酸之间的肽键断开，形成两个独立蛋白。图2表示科研人员利用重叠延伸 PCR 技术实现了 crtS 基因和 crtR基因在酵母细胞内的共同表达，大大提高了虾青素的含量。据此分析：    ①在重叠延伸PCR 的反应体系中，除模板外还需添加缓冲液和 等组分。缓冲液中添加Mg²⁺的作用是 。 ②PCR1 和PCR2需要分开单独进行,原因是 。与PCR1和PCR2相比,PCR3最主要的特点是 。 ③融合基因表达的双功能酶P450的分子量较正常双功能酶P450大，依据该融合基因的结构和表达原理推测，原因可能是 。 29．（23-24高二下·江苏淮安·期末）抗菌肽具有抗菌谱广、不易产生耐药性等优点，有望成为抗生素替代品。下图1为构建拟穴青蟹抗菌肽（scy）和大黄鱼抗菌肽（hepc）共表达载体的部分示意图。ccdB 基因编码毒性蛋白，会导致细胞死亡。请据图回答问题： (1)为构建融合基因Scy-hepc需要进行PCR 扩增，反应体系中需加入模板、缓冲液（含Mg2+）、引物、 等。PCR1和PCR2在反应程序上最主要的区别是 。融合基因构建过程中发生的变异类型属于 。 (2)为鉴定PCR产物需进行电泳检测，根据检测结果，对含有单一目的片段的凝胶进行切割，目的是对 DNA进行 并回收，便于后续测序。 (3)构建基因表达载体过程中需使用BP和LR 重组酶，相当于传统酶切构建法中的 酶。与传统酶切中使用两种限制酶切割目的相同，重组前还需在 Scy序列的上游添加attBl序列,在hepc序列下游添加attB2序列的目的是 。载体PMDC85中 作为标记基因，可快速筛选转化成功的农杆菌。 (4)将重组植物表达载体导入用 处理的农杆菌，转化小球藻。转化前需用 酶对小球藻进行处理获得原生质体。可通过观察 初步检测融合基因是否成功表达。若要进一步确定表达的蛋白为Scy-hepc 可采用 技术检测。 (5)将鉴定阳性的小球藻和野生型小球藻总蛋白提取液分别加入嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌的培养基，结果如图2所示。通过比较 可知重组融合蛋白对两种菌都有一定的抑制效果。 30．（23-24高二下·江苏南通·期末）为筛选出宿主细胞中与某病毒S蛋白特异性结合的受体，研究人员在S蛋白末端添加TAP标签，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，过程如下图。请结合实验流程回答下列问题。    注：T7（20bp）：强启动子，能与病毒RNA聚合酶特异性结合；Kozak（K）因子结合位点编码序列；Ampr：氨苄青霉素抗性基因；TAP（543bp）：可被特异性抗体识别。 (1)S基因及TAP标签的体外扩增 ①通过PCR体外扩增S基因时，应该在S基因的上游引入 和 序列，并在S基因的下游去掉 。 ②为了防止PCR反应中发生突变，常选择高保真PyrobestDNA聚合酶，与一般Taq酶相比，它具有3'到5'核酸外切酶活性，PyrobestDNA聚合酶能防止发生突变的原因是 。 ③PCR一般要经历三十多次循环，在第一次循环之前，常进行预变性（95°5min），目的是 。 (2)重组质粒的构建 已知四种限制酶的识别序列及切割位点分别为XhoI：C↑TCGAG，SmaI：CCC↑GGG，EcoRI：G↑AATTC，BamHI：G↑GATCC。 由图可知TAP标签应该插入 酶切位点之间，经过限制酶消化后，为得到目标DNA片段，还需要通过 进行鉴定和纯化，再加入 完成质粒的环化。若用SmaI和BamHI酶切割质粒PCDNA3.1，切割后形成1.2kb（不含Amp'）和4.2kb（1kb=1000bp）两种片段，则S基因长度为 bp。 (3)细胞转染 使用特定转染试剂，将纯化后的重组质粒进行细胞转染，为保证实验的科学性，还需设置对照实验，具体做法为 。 (4)融合蛋白的表达 ①TAP标签含有特定氨基酸序列，可用异硫氰酸荧光素标记的 来检测融合蛋白的表达。 ②研究发现，转染质粒之后融合蛋白表达量较低，推测原因可能是S—TAP基因转录出的mRNA数量少，也可能是实验所使用的病毒敏感细胞与病毒原宿主细胞在翻译时不同密码子的使用频率（密码子的偏爱性）不同，导致翻译所需的tRNA数量不足。 ③转染质粒之前若受体细胞感染某重组痘苗病毒，则发出荧光的细胞数量明显增多，且荧光强度显著增强，原因可能是 。 31．（23-24高二下·江苏·期末）新霉素磷酸转移酶基因（neo）是转基因动物中常用的标记基因，但neo存在于动物细胞中会影响动物体生长和发育。为实现在敲除目的基因后，将neo基因从基因组中敲除，科研人员构建了基于Cre-loxP重组系统的通用型基因打靶载体，并转染小鼠受精卵获得了Flox工具鼠。图1为loxP序列的结构示意图，图2为Cre-loxP重组系统的作用机理示意图，图3为通用型基因打靶载体的构建及Flox鼠建立过程示意图。请回答下列问题：    (1)loxP位点是一段长为34bp的序列，具有方向性，结合图1，推测其方向性由区段 决定。Cre酶可同时识别2个loxP位点的a和c区段，并同时催化b区段箭头处 键水解。 (2)据图2分析，若同一个DNA分子上具有2个同向的loxP位点，经Cre酶作用后会得到一条链状DNA分子和一个环状DNA分子，从作用结果分析，Cre酶同时具有类似 酶的作用；同一个DNA分子上具有2个反向的loxP位点，Cre酶仅能导致2个loxP位点间的序列反转连接，不能产生环状DNA分子，原因是 。 (3)图3中，过程①可在限制酶和DNA连接酶等作用下，将同源臂1和同源臂2插入pAT质粒中的多克隆位点序列MCS中。作为通用型载体，pAT质粒的MCS中含有多个在基因组（待敲除基因所在DNA）中出现频率较低的酶切位点，其意义是 。 (4)两段存在同源序列（如同源臂）的DNA片段在重组酶的催化下，可发生同源重组，同源臂间的DNA序列可发生交换。为敲除特定基因，以待敲除基因两端的短小序列为依据设计引物，经PCR1和PCR2获得同源臂1和同源臂2，PCR1和PCR2不能在同一反应体系中进行的原因是 ；为将同源臂定向插入pAT的MCS中，设计引物时需要在引物的 端添加相应的限制酶切位点。 (5)过程②为重组pAT质粒转染小鼠受精卵的过程，该过程通常采用 法。过程③需将转染后的受精卵置于适宜培养液中，培养24h后，能存活的胚胎为成功转染并整合到染色体DNA上的胚胎，后续通过 等技术获得Flox小鼠。 (6)Flox小鼠中存在的neo基因，其两侧的2个LoxP位点的方向是 的，可利用Cre酶将其敲除，获得不含neo基因的基因敲除鼠。为实现在特定的时间对特定细胞中的neo基因进行敲除，可在Cre基因的cDNA一段添加 实现。 32．（23-24高二下·江苏扬州·期末）甜味蛋白具有高甜度、低热量、安全性高等优点，并且具有一定的营养价值。科研人员将甜味蛋白基因(G基因)转入普通的甜玉米细胞中，培育出了超量表达G蛋白的转基因甜玉米新品种，提高了玉米的商品价值。在超量表达G基因载体的构建中，所用DNA 片段和 Ti质粒及酶切位点如图1、2所示。    (1)图1中，强启动子是一段特殊序列的DNA片段。位于基因的 (填“上游”或“下游”或“上下游均可”)，强启动子能被 识别并驱动基因持续转录。该转录过程中模板链的5’端位于 (“M”或“N”) 端。 (2)利用T-DNA的 特性，最终使强启动子和G基因整合到玉米细胞染色体DNA上。为使DNA片段能定向插入T-DNA中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是 。构建G基因的超表达载体，还需用到DNA连接酶，其中DNA连接酶作用的底物为图3中的 (填“A”或“B”或“A和B”)。    (3)外植体经脱分化形成的愈伤组织放入农杆菌液浸泡后，进行植物组织培养时培养基中需加入 进行筛选。对获得的Y₁、Y₂、Y₃、Y₄四个玉米株系用G蛋白基因的探针作DNA分子杂交检测，结果均为阳性，但进一步对G蛋白表达量测定时，发现Y₄株系的表达量与野生型相近，原因可能是 。 (4)图4为淀粉合成酶基因片段，其转录后形成的前体RNA，需通过加工后方能用于翻译。科研人员希望通过降低淀粉合成酶基因的表达，进一步提高甜玉米中可溶性糖的含量，将吗啉反义寡核苷酸导入玉米受精卵中，发现淀粉合成酶基因表达受阻。其受阻机制可能存在两种假说。 假说1：吗啉反义寡核苷酸导致前体RNA上内含子1的对应序列不能被剪切； 假说2：吗啉反义寡核苷酸导致前体RNA上内含子1和外显子2的对应序列同时被剪切。    为验证上述假说，在受精卵发育后3天的胚细胞中，分别从实验组和对照组提取 ，逆转录形成cDNA。 ①若假说1成立，使用图示引物2和引物4进行PCR后电泳的结果为 。 A．实验组有目的条带                B．对照组有目的条带 C．实验组无目的条带                D．对照组无目的条带 ②若要证明假说2，需选择图示引物 进行PCR扩增后，进一步鉴定。 ③若某次实验电泳结果发现：实验组和对照组都没有任何条带，从PCR 操作过程角度解释可能的原因是 (至少写出两点)。 / 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题04 基因工程 一、单选题 1．（23-24高二下·江苏南通·期末）下列有关实验操作的叙述，正确的是（    ） A．鉴定DNA时，待测样液中加入现配的双缩脲试剂后进行沸水浴 B．观察黑藻细胞质的流动时，低倍镜下找到叶肉细胞后换用高倍镜 C．提取绿叶中色素时，应一次性加入20mL无水乙醇并在光下研磨 D．用血细胞计数板计数酵母菌时，带有芽体的酵母菌应忽略不计 【答案】B 【分析】对一支试管中的培养液中的酵母菌逐个计数是非常困难的， 可以采用抽样检测的方法：先将盖玻片放在血 细胞计数板的计数室上，用吸管吸取培养液， 滴于盖玻片边缘，让培养液自行渗入。多余的培养液用滤纸吸去。稍待片刻，待酵母菌全部沉降到计数室底部，将计数板放在载物台的中央，计数一个小方格内的酵母菌数量，再以此为根据，估算试管中的酵母菌总数。 【详解】A、鉴定DNA时，待测样液中加入二苯胺试剂后进行沸水浴加热，A错误； B、观察黑藻细胞质的流动时，低倍镜下找到黑藻叶肉细胞，然后换用高倍镜观察叶绿体随着细胞质流动的情况，B正确； C、提取绿叶中色素时，应加入5 ~ 10 mL无水乙醇，不能一次性加入过多的无水乙醇，尽量避光研磨，C错误； D、用血细胞计数板计数酵母菌时，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算，D错误。 故选B。 2．（23-24高二下·江苏南京·期末）下列关于现代生物工程技术的叙述，正确的是（　　） A．若检测出标记基因所表达的性状，说明重组质粒已经导入受体细胞 B．生物大分子RNA可用于鉴别蜥蜴与其他物种亲缘关系的远近 C．制备单克隆抗体时，用选择培养基筛选出产生所需抗体的杂交瘤细胞 D．要繁育高产奶牛，需要从原肠胚的滋养层细胞取材进行胚胎性别鉴定 【答案】B 【分析】1、胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。 2、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】A、标记基因在选用的载体质粒和重组质粒都含有，若检测出标记基因所表达的性状，不能说明重组质粒已经导入受体细胞，也可能导入的是普通质粒，A错误； B、某些生物大分子RNA具有物种特异性，故可用于鉴别蜥蜴与其他物种亲缘关系的远近，B正确； C、制备产生单克隆抗体的杂交瘤细胞先经过选择性培养基筛选出杂交瘤细胞，后在单孔培养板上进行克隆化培养和抗体检测，筛选产生单一抗体的杂交瘤细胞。故克隆化培养和抗体检测必须进行克隆化培养和抗体检测，C错误； D、要繁育高产奶牛，需要从囊胚的滋养层细胞取材进行胚胎性别鉴定，D错误。 故选B。 3．（23-24高二下·江苏宿迁·期末）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（　　） A．可以用菜花、洋葱、猪血、猪肝等实验材料粗提取 DNA B．提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的研磨液，快速研磨 C．若选择动物细胞作为实验材料，实验中多次加入蒸馏水的目的均是为了析出DNA D．可利用DNA在酒精中溶解度较大的特点来提取DNA 【答案】B 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14mol/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A 、猪血中的成熟红细胞没有细胞核和细胞器，不含 DNA，不能用于粗提取 DNA，A 错误； B、提取植物细胞的 DNA 时，加入一定量的研磨液快速研磨，可以破碎细胞，释放出 DNA，B 正确； C、若选择动物细胞作为实验材料，第一次加蒸馏水是为了使细胞吸水涨破，释放出核物质，后面多次加入蒸馏水不是为了析出 DNA，C 错误； D 、DNA 在酒精中的溶解度较小，利用这一特点可使 DNA 析出，而不是提取，D 错误。 故选B。 4．（23-24高二下·江苏扬州·期末）葡萄糖异构酶在工业上应用广泛，科学家将其第138位甘氨酸替换为脯氨酸后，其最适温度提高了 10℃左右。下列相关叙述正确的是（    ） A．蛋白质工程首先要获取基因和蛋白质的结构数据 B．可用定点诱变技术直接将蛋白质中的甘氨酸替换为脯氨酸 C．利用蛋白质工程技术可以定向改变蛋白质的结构 D．改造后的葡萄糖异构酶的最适保存温度也提高了 10℃左右 【答案】AC 【分析】1、蛋白质工程：通过设计和改造编码蛋白质的基因获得特定功能的蛋白质。 2、目的：改造现有蛋白质或者制造新的蛋白质。 3、蛋白质功能多样性的原因：氨基酸的种类、数目和排列顺序的不同，肽链的盘曲折叠方式及蛋白质的空间结构的多样性。 【详解】A、蛋白质工程要先获取基因和根据蛋白质的功能设计蛋白质的结构，A正确； B、为提高葡萄糖异构酶的热稳定性，将其第138号的甘氨酸替换为脯氨酸，应对葡萄糖异构酶的基因进行修饰，B错误； C、蛋白质工程通过设计和改造编码蛋白质的基因获得特定功能的蛋白质，因此可以定向改变蛋白质的结构，C错误； D、将葡萄糖异构酶第138位甘氨酸替换为脯氨酸后，其最适温度提高了10℃左右，其最适保存温度不一定提高了10℃，D错误。 故选AC。 5．（23-24高二下·江苏徐州·期末）基因工程需要三种工具：限制酶、DNA连接酶和载体。下列相关叙述错误的是（    ） A．不同限制酶切割后产生的DNA片段可能被某种DNA连接酶“缝合” B．T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端 C．质粒可以作为基因的载体使用，通常采用抗生素合成基因作为标记基因 D．某些病毒可作为基因工程的“分子运输车” 【答案】C 【分析】关于限制酶，考生可以从以下几方面把握：（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来。（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（3）结果：形成黏性末端或平末端。 【详解】A、不同限制酶切割后产生的DNA片段有可能会碱基互补配对，可能被某种DNA连接酶“缝合”，A正确； B、限制酶切割产生的DNA末端有黏性末端和平末端，其中T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，又可以连接平末端，具有特异性（专一性），B正确； C、质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子，可以作为基因的载体使用，通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因，C错误； D、“分子运输车”是基因进入受体细胞的载体（或运载体），常用的运载体包括质粒、动植物病毒、噬菌体等，某些病毒可作为基因工程的“分子运输车”，D正确。 故选C。 6．（23-24高二下·江苏徐州·期末）水蛭素可用于预防和治疗血栓。研究发现，将水蛭素第47位的天冬酰胺替换为赖氨酸，其抗凝血活性显著提高，可通过奶牛乳腺生物反应器批量生产活性高的水蛭素。下列相关叙述错误的是（    ） A．对水蛭素进行改造的直接操作对象为水蛭素基因 B．改造后的水蛭素为自然界不存在的蛋白质 C．需要将乳腺中特异表达的基因的启动子与目的基因重组在一起 D．水蛭素基因及其mRNA只能从转基因奶牛的乳腺细胞中提取并检测 【答案】D 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质） 【详解】A、对水蛭素的改造是通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，属于蛋白质工程的范畴，A正确； B、改造水蛭素的过程涉及蛋白质工程，这是一种能够生产自然界不存在的蛋白质的技术，改造后的水蛭素为自然界不存在的蛋白质，B正确； C、通过奶牛乳腺生物反应器批量生产活性高的水蛭素，因此需要需要将乳腺中特异表达的基因的启动子与目的基因重组在一起，C正确； D、转基因奶牛的所有细胞中都含有水蛭素基因，只是在乳腺细胞中进行选择性表达，D错误。 故选D。 7．（23-24高二下·江苏连云港·期末）下列关于生物学实验或实践的叙述错误的是（    ） A．探究植物生长调节剂对扦插枝条生根的影响时，清水组为对照组 B．在芦苇生长期合理使用人工合成的赤霉素可明显增加其纤维的长度 C．对于体积较大的土壤小动物，可采用标志重捕法调查其类群 D．DNA是一种核酸，因此可用碱性的二苯胺试剂进行鉴定 【答案】C 【分析】由人工合成的，对植物的生长、发育有调节作用化学物质，称为植物生长调节剂。 【详解】A、探究植物生长调节剂对扦插枝条生根的影响时，自变量为植物生长调节剂的浓度，因变量为扦插枝条生根数量或长度，以不同浓度的植物生长调节剂处理作为实验组，清水组为对照组，A正确； B、赤霉素具有促进细胞伸长的作用，所以在芦苇生长期合理使用人工合成的赤霉素可明显增加其纤维的长度，B正确； C、对于体积较大的土壤小动物，可采用记名计算法调查其类群，C错误； D、核酸包括DNA和RNA，容易被碱性染料染上颜色，因此可用碱性的二苯胺试剂进行鉴定，D正确。 故选C。 8．（23-24高二下·江苏泰州·期末）在利用新鲜洋葱进行DNA 粗提取与鉴定实验中，相关叙述错误的是（    ） A．研磨前用液氮冷冻处理洋葱有利于 DNA 释放 B．向研磨离心后的上清液中加入75%冷酒精可使DNA 大量析出 C．将析出白色丝状物的溶液再离心，弃去上清液留下沉淀物 D．向溶有丝状物的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后会出现蓝色 【答案】B 【分析】DNA的溶解性：（1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。（2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。 【详解】A、冷冻研磨可以从各种环境样本中获得高质量的 DNA，研磨前先用液氮冷冻处理洋葱，有利于DNA的释放，A正确； B、向研磨离心后的上清液中加入95%冷酒精可使DNA 大量析出，B错误； C、将出现白色丝状物（粗提取得到的DNA）的溶液倒入离心管中离心，弃上清液取沉淀，C正确； D、将DNA丝状物放入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液中，使其溶解，再加入二苯胺试剂，沸水浴加热出现蓝色，D正确。 故选B。 9．（23-24高二下·江苏无锡·期末）生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述合理的是（    ） A．要靠确凿的证据和严谨的逻辑来思考转基因技术的影响 B．运用基因编辑技术对基因进行敲除、插入等，可设计“完美试管婴儿” C．转基因微生物制成的生物武器杀伤力大于常规武器，可有选择地生产使用 D．生殖性克隆人能丰富人类基因的多样性，可在特定人群中进行相关实验 【答案】A 【分析】试管婴儿和设计试管婴儿的区别 项目 试管婴儿 设计试管婴儿 目的 帮助不孕夫妇成功孕育胎儿 白血病、地中海贫血等疾病的治疗 特有技术手段 无 胚胎移植前，需进行基因检测 存在的主要的理论问题 多余的胚胎的处理问题 基因检测不符合的胚胎的处理问题、被利用设计婴儿性别 共同点 都属于有性生殖，技术手段都有精子、卵子的获取和培养、早期胚胎培养、胚胎移植等 【详解】A、应多维度、多视角理性看待转基因技术，要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论，A正确； B、利用基因编辑技术对基因进行敲除、插入来设计完美试管婴儿，会造成生物技术安全和伦理问题，B错误； C、生物武器具有传染性强、作用范围广等特点，彻底销毁生物武器是大多数国家的共识，应严格禁止生产和使用，C错误； D、生殖性克隆人严重违反了人类伦理道德，我国政府不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验，D错误。 故选A。 10．（23-24高二下·江苏南通·期末）生物技术的进步在给人类带来福祉的同时，也引起了人们对它安全性的关注。相关叙述错误的是（    ） A．克隆人会冲击现有的婚姻、家庭和两性关系等传统伦理道德观念 B．生物武器等各类大规模杀伤性武器应全面禁止和彻底销毁 C．转基因作物被动物食用后，目的基因会整合到动物细胞的染色体DNA上 D．开展风险评估、预警跟踪和风险管理，是保障生物技术安全性的前提 【答案】C 【分析】1、引发人们对转基因生物安全性的争论主要体现在食物安全、生物安全、环境安全三个方面。 2、对克隆技术伦理问题的争论，中国政府的态度：禁止生殖性克隆人，坚持四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。但是，不反对治疗性克隆。 【详解】A、克隆人会冲击现有的婚姻、家庭和两性关系等传统伦理道德观念，A正确； B、生物武器致病能力强，致病范围广，生物武器等各类大规模杀伤性武器应全面禁止和彻底销毁，B正确； C、目的基因被消化分解后才能被吸收，不会整合到动物细胞的染色体DNA上，C错误； D、开展风险评估、预警跟踪和风险管理，是保障生物技术安全性的前提，D正确。 故选C。 11．（23-24高二下·江苏徐州·期末）下列关于生物技术安全与伦理问题的叙述正确的是（    ） A．如果有证据表明某种转基因食品有害，就应该禁止转基因技术的应用 B．利用转基因技术制造的新型致病菌具有极大的危害性，是因为人体不会对它们产生免疫反应 C．试管婴儿技术已经成熟，移植前可对胚胎进行遗传学诊断和基因改造 D．科学家将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，从而防止转基因花粉传播造成基因污染 【答案】D 【分析】转基因作为一项技术本身是中性的，由这项技术研发出来的产品需要经过一系列的安全性评估，符合相应标准后才能上市。 【详解】A、转基因技术本身是中性的，如果确实有证据表明某种转基因食品有害，就应该禁止产品的使用，不应该禁止转基因技术的应用，A错误； B、转基因技术制造的新型致病菌，致病能力和传染能力以及抗药能力等大幅度增加，因而导致具有极大的危害性，B错误； C、试管婴儿技术已经成熟，移植前可对胚胎进行遗传学诊断，不涉及基因改造，C错误； D、科学家将α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，不参与受精作用，从而防止转基因花粉传播造成基因污染，D正确。 故选D。 12．（22-23高二下·江苏镇江·期末）关于还原糖、脂肪、蛋白质和DNA 的鉴定实验，下列叙述正确的是（    ） A．花生子叶切片用苏丹Ⅲ试剂染色后，洗去浮色，在显微镜下可见橘黄色颗粒 B．在黄豆种子匀浆液中，加入斐林试剂，液体由蓝色变成紫色 C．在鲜梨的组织样液中，加入双缩脲试剂，温水浴后液体由蓝色变成砖红色 D．将 DNA 粗提物加入二苯胺试剂，沸水浴后，液体由无色变成蓝色 【答案】A 【分析】生物组织中的化合物鉴定： 斐林试剂可用于鉴定还原糖，在水浴加热的条件下，溶液的颜色变为砖红色（沉淀）；蛋白质可与双缩脲试剂产生紫色反应，脂肪可用苏丹Ⅲ染液鉴定，呈橘黄色；淀粉遇碘变蓝色；二苯胺与DNA在水浴加热的条件下产生蓝色反应。 【详解】A、花生子叶切片用苏丹Ⅲ试剂染色后，洗去浮色后，在显微镜下可见橘黄色颗粒，A正确； B、在黄豆种子匀浆液中富含蛋白质，加入双缩脲试剂后，液体由蓝色变成紫色，B错误； C、在鲜梨的组织样液中有还原糖，加入斐林试剂，温水浴后液体由蓝色变成砖红色，C错误； D、将 DNA 粗提物溶解在2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴后，液体由无色变成蓝色，D错误。 故选A。 13．（22-23高二下·江苏泰州·期末）某研究小组利用PCR技术扩增目的基因，并对扩增产物进行电泳，没有出现目的基因的扩增带，下列原因不可能的是（    ） A．变性温度设置太低 B．两种引物浓度不等 C．使用的Taq酶失活 D．退火温度设置太高 【答案】B 【分析】1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】A、变性温度过低，则DNA双链不能充分解开，影响目的基因的扩增，A正确； B、两种引物浓度不等不会导致不出现目的基因的扩增带，B错误； C、使用的Taq酶失活会影响子链的合成，进而影响目的基因的扩增，C正确； D、PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键，退火温度设置太高会破坏模板与引物的碱基配对，导致目的基因扩增失败，D正确。 故选B。 14．（22-23高二下·江苏无锡·期末）下列关于DNA相关实验的叙述，错误的是（    ） A．利用DNA在酒精中溶解度较大的特性提取DNA B．粗提取的DNA中可能含有蛋白质、脂质等杂质 C．用二苯胺试剂鉴定DNA时，沸水浴加热，冷却后呈蓝色 D．PCR产物一般可用琼脂糖凝胶电泳来鉴定 【答案】A 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：(1)DNA的溶解性:DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaC溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。(2)DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理，可以将 DNA与蛋白质进一步的分离，A错误； B、粗提取的DNA纯度不高，可能含有没有分离彻底的蛋白质等杂质成分，C正确； C、用二苯胺试剂鉴定DNA时，沸水浴加热，冷却后呈蓝色，C正确； D、不同的DNA片段在电泳时移动的速率不同，可以将PCR产物的电泳结果与标准DNA样品的电泳结果进行比对，从而鉴定PCR的产物，常采用琼脂糖凝胶电泳，D正确。 故选A。 15．（22-23高二下·江苏扬州·期末）人体内的蛋白TPA能降解由血纤维蛋白凝聚而成的血栓，但为心梗患者注射大剂量的TPA会诱发颅内出血。研究证实，通过蛋白质工程，将TPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可制造出性能优异的改良TPA，进而显著降低出血副作用。下列关于该蛋白质工程的叙述正确的是（    ） A．制造改良TPA的过程不遵循中心法则 B．可利用X射线衍射技术分析TPA的晶体结构 C．该例中TPA蛋白的基因增添碱基时可使用基因定点诱变技术 D．需要在分子水平上直接对TPA进行定向改造 【答案】B 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【详解】A、制造改良TPA的过程属于蛋白质工程，蛋白质工程修饰或合成的基因在复制和表达时仍然遵循中心法则，A错误； B、X射线衍射分析是利用晶体形成的X射线衍射，对物质进行内部原子在空间分布状况的结构分析方法，X射线衍射技术可分析蛋白质的晶体结构 ，B正确； C、该实例中TPA基因不是增添碱基，而是替换碱基，C错误； D、该技术不是在分子水平上直接对TPA进行改造，而是对TPA的基因进行改造，D错误。 故选B。 16．（22-23高二下·江苏徐州·期末）研究人员利用蛋白质工程将细菌纤维素酶的第137、179、194位相应氨基酸替换为赖氨酸后，纤维素酶热稳定性得到了提高。下列叙述错误的是（　　） A．改造纤维素酶也需要构建基因表达载体 B．对纤维素酶的改造是通过直接改造mRNA实现的 C．经改造后的纤维素酶热稳定性提高这一性状可遗传 D．蛋白质工程可以改造现有蛋白质或者制造新的蛋白质 【答案】B 【分析】蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。 【详解】AB、蛋白质工程是对基因进行修饰改造或创造合成新基因（而不是直接改造mRNA实现的），然后进行表达，故必须构建基因表达载体，A正确，B错误； C、蛋白质工程是对基因进行修饰改造或创造合成新基因，然后进行表达，改造后的蛋白质的性状能遗传给子代，因此经蛋白质工程改造后的纤维素酶热稳定性提高这一性状可遗传，C正确； D、蛋白质工程获得的是自然界没有的蛋白质，蛋白质工程可以改造现有蛋白质或者制造新的蛋白质，D正确。 故选B。 17．（22-23高二下·江苏南京·期末）葡萄糖异构酶能将葡萄糖转化为果糖，其最适温度约为60℃，生产上常用于高果糖浆的生产。科学家将葡萄糖异构酶的第138位甘氨酸用脯氨酸替代，结果它的最适温度提高了约10℃。下列有关叙述正确的是（    ） A．蛋白质工程直接对蛋白质进行操作，从而改造或制造自然界没有的蛋白质 B．编码葡萄糖异构酶的基因的脱氧核苷酸序列会有相应的改变 C．经改造后的葡萄糖异构酶热稳定性提高这一性状不可遗传 D．改造后的葡萄糖异构酶在60℃时催化活性高于70℃时的 【答案】B 【分析】蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。 【详解】A、蛋白质工程不是通过改造蛋白质来实现的，而是通过对基因进行操作来实现对蛋白质的改造，A错误； B、编码葡萄糖异构酶的基因是DNA上的片段，故经改造后编码葡萄糖异构酶的基因的脱氧核苷酸序列会有相应的改变，B正确； C、葡萄糖异构酶热稳定性提高这一性状，是通过改变基因的序列获得的，可以遗传，C错误； D、改造后的葡萄糖异构酶最适温度约为70℃，在60℃时活性较低，生产高果糖浆的效率可能低于70℃时的，D错误。 故选B。 二、多选题 18．（23-24高二下·江苏苏州·期末）已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。下列相关叙述正确的是（　　） A．上述对蛋白质P的改造属于蛋白质工程 B．可以通过改造P基因或合成P1基因来获得P1基因 C．P1基因通过转录和翻译获得具有专一性的蛋白质P1 D．直接对蛋白质P的氨基酸序列进行改造来获得蛋白质P1 【答案】ABC 【分析】蛋白质工程的过程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因），蛋白质工程是指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。 【详解】A、根据上述分析可知题干中对蛋白质P的改造属于蛋白质工程，A正确； B、以P基因序列为基础，获得P1基因途进有两个：修饰P基因，合成P1基因，B正确； C、根据P1基因特定的碱基对的排列顺序，经过转录和翻译会获得具有专一性的蛋白质P1，C正确； D、不能直接对蛋白质P的氨基酸序列进行改造来获得蛋白质P1，蛋白质工程属于第二代基因工程，通过基因改造或基因修饰来完成，D错误。 故选ABC。 19．（23-24高二下·江苏宿迁·期末）有人饮用鲜牛奶后会导致肠胃不适、消化不良，原因可能是体内缺乏乳糖酶。“低乳糖奶牛”的诞生有望给乳糖不耐受症患者提供“放心奶”。下图是“低乳糖奶牛”的培育过程，相关叙述正确的是（　　） A．犊牛的核遗传物质全部来自黑白花奶牛 B．胚胎细胞核移植难度高于动物体细胞核移植 C．选用去核卵母细胞的主要原因是其可以激发重组细胞1的细胞核全能性表达 D．“低乳糖奶牛”的出生涉及到的技术有动物细胞培养、核移植、胚胎移植等 【答案】CD 【分析】分析题图：图示为“低乳糖奶牛”的培育过程，首先采用基因工程技术将“乳糖分解酶基因”导入受体细胞，再采用核移植技术、早期胚胎培养技术和胚胎移植技术获得转基因克隆动物。 【详解】A、犊牛的核遗传物质来自黑白花奶牛提供的细胞核，再加上导入的乳糖酶基因，所以犊牛的核遗传物质并非全部来自黑白花奶牛，A 错误； B 、胚胎细胞核移植难度低于动物体细胞核移植，因为胚胎细胞的分化程度低于体细胞，B 错误； C 、选用去核卵母细胞的主要原因是其细胞体积大、易操作，营养物质丰富，含有能激发细胞核全能性表达的物质，C 正确； D、观察图中信息可知，“低乳糖奶牛”的出生涉及到的技术有动物细胞培养、动物细胞核移植、胚胎移植等，D 正确。 故选CD。 20．（23-24高二下·江苏宿迁·期末）红细胞生成素（EPO）是人体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，某科研团队采用基因工程培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成EPO。下列叙述正确的是（　　） A．用显微注射技术将含EPO基因的表达载体导入羊的乳腺细胞中，可得到乳腺生物反应器 B．构建基因表达载体时，需将EPO基因与乳腺蛋白基因的启动子重组在一起 C．该转基因羊中的EPO基因可在羊的乳腺细胞中表达 D．可通过PCR技术检测EPO基因是否插入山羊基因组 【答案】BCD 【分析】转基因动物生产药物：(1)基因来源：药用蛋白基因+乳腺组织特异性表达的启动子(原理: 基因的选择性表达)；(2) 成果：乳腺生物反应器；(3)过程：将药物蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，导入哺乳动物的受精卵中，最终培育的转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌的乳汁生产所需要的药物。 【详解】A、用显微注射技术将含EPO基因的表达载体导入羊的受精卵中，可得到乳腺生物反应器，A错误； B、在构建基因表达载体时，需要将EPO基因和乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，这样才能使目的基因只在乳腺组织中表达，B正确； C、EPO基因与乳腺蛋白基因的启动子重组在一起，可以在羊的乳腺细胞中表达，其他细胞中不表达，C正确； D、目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。可通过PCR技术检测EPO基因是否插入山羊基因组，D正确。 故选BCD。 21．（22-23高二下·江苏南京·期末）下列关于目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定的叙述，错误的是（    ） A．农杆菌转化法或用微量注射器将含目的基因的DNA溶液注入子房中可获得种子，再经过筛选和鉴定获得稳定遗传的转基因植物 B．用乳腺生物反应器生产药物，需将目的基因导入雌性动物的乳腺细胞 C．利用显微注射技术将基因表达载体注入动物的受精卵中，这个受精卵可能发育成具有新性状的动物 D．可通过PCR和琼脂糖凝胶电泳技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因及目的基因是否表达 【答案】BD 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、用农杆菌转化法或花粉管通道法，即用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中可获得种子，再经过筛选和鉴定获得稳定遗传的转基因植物，A正确； B、用乳腺生物反应器生产药物蛋白，需将目的基因与乳腺蛋白基因相关调控组件重组在一起，将目的基因导入到受精卵中，B错误； C、利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中，如果目的基因成功表达，这个受精卵可发育成为具有新性状的动物，C正确； D、采用DNA分子杂交技术检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，检测目的基因是否表达可利用抗原—抗体杂交或个体水平的鉴定，D错误。 故选BD。 三、解答题 22．（23-24高二下·江苏淮安·期末）2023年“诺贝尔生理学或医学奖”被授予美国科学家卡塔林·卡里科和德鲁·魏斯曼，以表彰他们在核苷酸碱基修饰方面的发现。利用该成果使尿嘧啶转化为假尿嘧啶，可使合成的mRNA进入人体后引起的免疫反应强度降低，同时能增加其翻译效率，从而开发出有效的mRNA疫苗。mRNA疫苗在控制单链RNA病毒X（宿主为动物细胞）流行期间发挥了巨大的作用。下图是 mRNA疫苗工作原理。回答下列问题：    (1)树突状细胞将内环境中未经碱基修饰的mRNA识别为 ，进而被激活。树突状细胞被激活后，会吞噬并处理mRNA，将其呈递给 ，上述过程涉及人体免疫系统的第 道防线，体现了免疫系统的 功能。 (2)mRNA疫苗的制备的大致过程是：①获取病毒的单链RNA；②以病毒的RNA为模板合成cDNA；③切割cDNA以获取控制S蛋白的DNA片段；④以控制S蛋白的DNA 片段为模板合成mRNA；⑤碱基修饰；⑥脂质纳米粒包装；⑦成药。②过程需要的酶是 酶。合成控制S蛋白的基因片段时要注意保留基因前端的 片段，理由是该片段是 酶识别和结合的位点，便于驱动S蛋白基因的转录。 (3)制备X病毒灭活疫苗时，需要将提纯的X病毒接种在VERO细胞中，获得大量活病毒后对其进行灭活处理。VERO细胞一定来自动物，理由是 。在培养 VERO细胞时，与培养植物细胞不同的是培养液中要加入一定量的 ，培养的气体环境是 。 (4)科学家普遍认为针对RNA病毒的灭活疫苗很容易失效，不能起到预防病毒感染的目的，理由是 。 【答案】(1) 抗原 辅助性T细胞 三 免疫防御 (2) 逆转录酶/逆转录酶和DNA聚合酶 启动子 RNA聚合 (3) X病毒的宿主是动物细胞 血清 95%空气和5%CO2 (4)RNA病毒的遗传物质一般是单链RNA，容易发生变异，导致前期注射灭活疫苗产生的特异性抗体，不能与变异后的病毒抗原结合 【分析】疫苗通常是用灭活的或减毒的病原体制成的生物制品。接种疫苗后，人体内可产生相应的抗体，从而对特定传染病具有抵抗力。当给机体输入外源抗原时，免疫系统能够产生反应，而且这种反应具有特异性。mRNA疫苗通过疫苗中的mRNA进入人体细胞后表达出病原体的某种抗原蛋白，从而使机体产生产生强烈的免疫应答。 【详解】（1）树突状细胞会把内环境中未经碱基修饰的mRNA识别为抗原。树突状细胞吞噬抗原，并将抗原呈递给辅助性T细胞的过程，涉及第三道防线，体现了免疫系统免疫防御的功能。 （2）②过程以病毒的RNA为模板合成cDNA要用逆转录酶（和DNA聚合），扩增cDNA需要DNA聚合酶。③过程切割cDNA以获取控制S蛋白的基因片段时，要注意保留基因前端的启动子片段，启动子是RNA聚合酶的识别和结合位点，在转录时与RNA聚合酶结合。 （3） X病毒的宿主是动物细胞，所以培养X病毒所用的细胞也是动物细胞。培养动物细胞时添加牛血清的作用是提供细胞所需的目前尚未研究清楚的营养物质。培养时的气体环境是 95%空气和5%CO2的混合气体。 （4）针对RNA病毒的灭活疫苗很容易失效，不能起到预防病毒感染的目的，理由是RNA 病毒的遗传物质一般是单链RNA，容易发生变异，导致前期注射灭活疫苗产生的特异性抗体，不能与变异后的病毒抗原结合。 一、单选题 1．（23-24高二下·江苏无锡·期末）下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．将洋葱研磨的目的是使细胞破裂，释放DNA B．洋葱研磨液在4℃冰箱中放置几分钟，可降低DNA酶的活性 C．用玻璃棒沿一个方向快速搅拌卷起丝状物，可提高DNA的提取量 D．在溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后呈蓝色 【答案】C 【分析】DNA粗提取的原理： ①DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，从而初步分离DNA和蛋白质。 ②DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液，从而溶解DNA。 ③在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，从而鉴定DNA。 【详解】A、将洋葱研磨的目的是使细胞破裂，使蛋白质与DNA分离开来，从而充分释放DNA，A正确； B、洋葱研磨液在4℃冰箱中放置几分钟，可降低DNA水解酶的活性，防止DNA降解，B正确； C、用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌（快速搅拌会破坏DNA分子的完整性），能让DNA充分溶解于NaCl溶液中，可提高DNA的粗提取量，C错误； D、在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，故在溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后呈蓝色，D正确。 故选C。 2．（23-24高二下·江苏无锡·期末）经研究发现叶绿体相关基因ACM1的突变会导致拟南芥叶片白化，通过以下实验对该突变体植株进行研究，正确的是（    ） A．用光学显微镜观察突变体叶肉细胞中叶绿体内部结构的变化 B．用体积分数为95%冷酒精粗提取突变体DNA以观察ACM1基因的突变类型 C．用无水乙醇提取后分离突变体叶片中的色素分析其种类和含量变化 D．用琼脂糖凝胶电泳分离突变体的蛋白质，对应叶绿素的电泳条带缺乏 【答案】C 【分析】“酒精”在不同实验中的作用： （1）体积分数95%的酒精：与质量分数15%的HCl溶液按1∶1的体积比混合作解离液，用于观察根尖分生组织细胞有丝分裂的实验。 （2）体积分数50%的酒精：检测生物组织中（如花生子叶切片）脂肪实验中，用于洗去苏丹Ⅲ染色剂染色后切片上的浮色。 （3）无水乙醇：叶绿体中色素提取与分离实验中用作色素提取剂。 【详解】A、叶绿体的内部结构需要电子显微镜下才能观察到，高倍镜的光学显微镜下观察不到，A错误； B、用体积分数为95%的冷酒精粗提取突变体DNA，但无法观察ACM1基因的突变类型，B错误； C、无水乙醇能溶解色素，可以用无水乙醇提取后分离突变体叶片中的色素分析其种类和含量变化，C正确； D、琼脂糖凝胶电泳用于分离DNA片段，不能用于分离蛋白质，D错误。 故选C。 3．（23-24高二下·江苏南京·期末）如图是利用PCR技术对A、B两个跳虫的DNA进行分析的过程，下列相关叙述错误的是（　　） A．提取细胞DNA时加入蛋白酶有助于释放出DNA B．PCR不同循环过程中变性的温度及时间相同以使DNA充分解旋 C．用已知长度的DNA片段作为参考物，可估测样本DNA片段的大小 D．阴性对照是未加DNA模板但加入PCR扩增所需混合物，以监测试剂是否污染 【答案】B 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。 【详解】A、蛋白酶可以分解组织中的蛋白质而不能分解 DNA，在提取 DNA 时加入蛋白酶有助于释放出 DNA，A正确； B、PCR不同循环过程中变性的温度及时间不相同，B错误； C、将已知长度的 DNA 片段装到凝胶上作参照，在凝胶中 DNA 分子的迁移速率与凝胶的速度、DNA 分子的大小和构象等有关，可用于估测样本 DNA 片段的大小，C正确； D、阴性对照是未加 DNA 模板但加入 PCR 扩增过程所需的混合物，也完成 PCR 过程，通过凝胶电泳检测是否扩增出 DNA，以监测试剂是否污染，D正确。 故选B。 4．（23-24高二下·江苏扬州·期末）DNA粗提取与鉴定的实验流程是“取材→研磨→过滤→分离→鉴定”。下列叙述正确的是（    ） A．大肠杆菌、洋葱和猪血细胞均可作为提取 DNA 的材料 B．将研磨液从冰箱中取出后，取沉淀物继续进行实验 C．滤液中加入冷酒精，用玻璃棒快速搅拌会使DNA的提取量增加 D．进行DNA 鉴定时，对照组不需要加入DNA 【答案】D 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： 1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精； 2、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、猪为哺乳动物，成熟红细胞不含细胞核，不能用于DNA的粗提取，A错误； B、DNA提取的实验中，要将研磨液过滤到烧杯中，在冰箱放置一段时间后，由于上清液中含有DNA和蛋白质，故取上清液继续进行实验，B错误； C、DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精，因此在溶有DNA的滤液中加入体积分数为95%的冷酒精后，用玻璃棒轻缓搅拌，这样可以进一步纯化DNA，不会使DNA的提取量增加，C错误； D、进行DNA鉴定时，对照组不需要加入DNA，只加二苯胺试剂作为空白对照组，目的是与实验组进行颜色对照，以鉴定提取出的物质是DNA，D正确。 故选D。 5．（23-24高二下·江苏扬州·期末）巢式PCR 是一种特殊的聚合酶链式反应，使用两组不同的引物实现目标DNA片段的扩增。第一组外引物扩增出的DNA片段(中间产物)长度超出目标区域，第二组内引物称为巢式引物，其结合部位在中间产物内部的目标区域，从而扩增出目标产物，具体过程如下图所示。下列说法错误的是（    ）    A．巢式PCR 的两轮扩增中所需的两对引物不同，但原料和酶相同 B．DNA的合成总是从子链的5′端向3′延伸与 TaqDNA 聚合酶的作用有关 C．用内引物进行 PCR时，扩增n次后理论上需要2ⁿ-2个引物 D．巢式PCR 技术相较于传统PCR 技术增强了扩增产物的特异性 【答案】C 【分析】PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR反应包括变性、复性和延伸三个步骤。 【详解】A、第一轮所用引物为外引物，第二轮所用引物为内引物，两次所用原料均为dNTP（四种游离的脱氧核苷酸），酶均为TaqDNA聚合酶，A正确； B、TaqDNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3'端延伸子链，B正确； C、PCR为体外DNA复制，每合成一条子链即需要一个引物，扩增n次后一共有2n个DNA，新合成了2n×2-2=2n+1-2条新链，即需要2n+1-2个引物，C错误； D、巢式PCR可增强扩增的特异性，因为如果利用外引物扩增产生了错误片段，则内引物能在错误片段上进行配对的概率低，D正确。 故选C。 6．（23-24高二下·江苏扬州·期末）检测和筛选是生物技术中的重要环节。下列叙述正确的是（    ） A．制备单克隆抗体过程中第一次和第二次筛选的原理相同 B．基因工程中利用含抗生素的培养基筛选出的受体细胞不一定含有重组质粒 C．检测目的基因能否稳定遗传的关键是看目的基因是否成功构建为基因表达载体 D．只要检测到目的基因成功表达出蛋白质，就证明基因工程取得成功 【答案】B 【分析】基因工程中标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 【详解】 A、单克隆抗体制备过程中，在完成细胞融合后，第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选的目的是筛选出针对目标抗原的抗体为阳性的杂交瘤细胞，两次的原理不同，A错误； B、基因工程中利用含抗生素的培养基筛选出的受体细胞不一定含有重组质粒 ，有可能是只含有质粒的受体细胞，B正确； C、检测目的基因能否稳定遗传的关键是看目的基因有没有整合到受体细胞的染色体DNA上，C错误； D、在生物体内检测到了该基因对应的蛋白质且生物体表现出了相应的性状，才证明基因工程取得成功，D错误。 故选B。 7．（23-24高二下·江苏扬州·期末）下列有关基因工程所需酶及载体的描述错误的是（    ） A．限制酶切割1个位点，破坏两个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团 B．T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，不具有专一性 C．DNA聚合酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键 D．使用质粒作为载体可以避免目的基因在受体细胞内被分解 【答案】B 【分析】基因工程最基本的工具：①基因的“剪刀”---限制性核酸内切酶（简称限制酶）②基因的 “针线”---DNA连接酶③基因的运载体---质粒、噬菌体、动植物病毒等。 【详解】A、限制酶切割1个位点，使DNA双链断开，会有两个磷酸二酯键断裂，形成2个黏性末端或平末端，产生2个游离的磷酸基团，A正确； B、T4DNA连接酶可以连接黏性末端和平末端，但该酶具有专一性，B错误； C、DNA聚合酶的作用是在引物的作用下，将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键，C正确； D、单独的目的基因易被分解或丢失，用质粒作为载体可以避免目的基因在受体细胞内被分解，D正确。 故选B。 8．（23-24高二下·江苏淮安·期末）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述正确的是（　　） A．动、植物细胞DNA 的提取须在无菌条件下进行 B．为了 DNA 充分析出，搅拌时需快速搅拌 C．粗提取得到的白色丝状物中仍含有蛋白质等杂质 D．将DNA粗提物与二苯胺混合，沸水浴冷却后才能观察到呈蓝色 【答案】C 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理：①DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度变化而改变的．当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低．利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出；②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液．利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA；③洗涤剂能瓦解细胞膜但是对DNA没有影响；④蛋白质不能耐受较高温度，在80℃条件下会变性，而DNA对温度的耐受性较高；⑤DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 【详解】A、动、植物细胞DNA的粗提取与鉴定实验不需无菌条件下进行，A错误； B、玻璃棒应该用同一个方向轻缓搅拌，防止DNA被破坏，B错误； C、粗提取得到的白色丝状物中仍含有蛋白质等杂质，C正确； D、将提取的白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂沸水浴加热，溶液呈现蓝色，D错误。 故选C。 9．（23-24高二下·江苏徐州·期末）下列关于“DNA粗提取与鉴定”、“PCR扩增”、“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述，正确的是（    ） A．DNA粗提取过程中需使用预冷的体积分数75%的酒精溶液 B．将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，溶液即可变为蓝色 C．对1个双链DNA分子进行PCR扩增，第n次循环需要引物2n个 D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 【答案】C 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、DNA粗提取过程中需使用体积分数95%的酒精溶液，A错误； B、将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，在沸水浴的条件下，溶液可变为蓝色，B错误； C、PCR 技术大量扩增目的基因时，第n−1次生成2n−1个DNA分子，第n次复制形成2n个DNA，所以需要的引物数目为（2n−2n−1）×2=2n，C正确； D、DNA分子在凝胶载样缓冲液中带正电荷或负电荷，可用于电泳；凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，在波长为300nm的紫外灯下可以被检测出来，D错误。 故选C。 10．（23-24高二下·江苏盐城·期末）在科学研究过程中，相关方法、试剂等原理、作用，下列叙述正确的是（　　） A．DNA在酒精中溶解度较大，蛋白质几乎不溶于酒精 B．自然生长的茎进行组织培养前须用适宜浓度的乙醇和次氯酸钠先后消毒 C．常用性激素进行超数排卵 D．可用乙醇、高Ca2+-高PH等处理激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程 【答案】B 【分析】DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。 【详解】A、DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，可利用这一原理初步分离DNA与蛋白质，A错误； B、自然生长茎段的消毒属于外植体消毒，先用70%乙醇，再用无菌水清洗，再用5%次氯酸钠消毒处理，最后再用无菌水清洗，B正确； C、一般通过注射促性腺激素使性成熟的雌鼠超数排卵处理，C错误； D、激活重构胚的方法包括电刺激、Ca2+载体、蛋白酶合成抑制剂、乙醇等激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程，D错误。 故选B。 11．（23-24高二下·江苏淮安·期末）下列有关“DNA粗提取与鉴定”“PCR扩增”“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述中，正确的是（　　） A．使用洋葱提取DNA时，先在切碎的洋葱中加入适量洗涤剂和食盐，充分研磨后过滤并弃去滤液 B．将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后沸水浴，溶液即可变为蓝色 C．PCR扩增反应体系中dNTP既可以为扩增提供原料，也可以为子链的合成提供能量 D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 【答案】C 【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA时，需要先将DNA溶解在NaCl溶液中，再与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色。 【详解】A、使用洋葱提取DNA时，先在切碎的洋葱中加入适量洗涤剂和食盐，充分研磨后过滤，取滤液，A错误； B、将丝状物溶于2mol/L的5mL的NaCl溶液中，然后向试管中加入4mL的二苯胺试剂，沸水浴加热5min，试管冷却后溶液呈现蓝色，B错误； C、PCR扩增反应体系中dNTP既可以为扩增即DNA复制提供原料，也可以为子链的合成提供能量，C正确； D、用电泳缓冲液配制的琼脂糖溶液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 故选C。 12．（23-24高二下·江苏·期末）琼脂糖凝胶电泳是分离和鉴定PCR产物的常用方法，下列相关叙述正确的是（    ） A．待分离DNA片段越大，配制的琼脂糖溶液浓度越低 B．向凝固的凝胶中加入没过凝胶的电泳缓冲液后，小心拔出梳子 C．将PCR产物与电泳缓冲液混合，用微量移液器缓慢注入加样孔内 D．接通电源后，待核酸染料前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 【答案】A 【分析】PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 【详解】A、配制琼脂糖溶液浓度时，低浓度的胶用于分析大片段核酸，高浓度的胶可以进行小片段的胶，A正确； B、待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内，再将电泳缓冲液加入电泳槽中。先拔梳子再加电泳缓冲液，B错误； C、将扩增的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内涵指示剂）混合后，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。与凝胶载样缓冲液混合，不是与电泳缓冲液混合，C错误； D、接通电源后，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳，D错误。 故选A。 二、多选题 13．（23-24高二下·江苏无锡·期末）下列关于实验安全的叙述正确的是（    ） A．在绿叶中色素的提取和分离实验过程中，必须要注意实验室的通风 B．在进行DNA片段扩增及电泳鉴定实验操作时，必须要戴一次性手套 C．将接种环在火焰上燃烧灭菌时，手持接种环的部位应低于酒精灯火焰 D．若实验者皮肤沾染了溶有重铬酸钾的浓硫酸溶液，应立即用医用酒精冲洗消毒 【答案】AB 【分析】在多聚酶链式反应（PCR）扩增DNA片段的实验中，为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理。 【详解】A、在绿叶中色素的提取和分离实验过程中，会用到无水乙醇、碳酸钙、二氧化硅等化学试剂，可能会污染环境，所以要注意实验室的通风，A正确； B、进行DNA片段扩增及电泳鉴定实验操作时，必须要戴一次性手套，以防止污染，B正确； C、将接种环在火焰上燃烧灭菌时，手持接种环的部位应高于火焰，防止火焰伤及实验者，C错误； D、若实验者皮肤沾染了溶有重铬酸钾的浓硫酸溶液，应立即用大量清水冲洗并及时送医，D错误。 故选AB。 14．（23-24高二下·江苏淮安·期末）甲胎蛋白（AFP）是含有 609个氨基酸的肝脏特异性蛋白质。某实验小组使用cDNA文库，设计多组引物，通过 PCR 技术扩增甲胎蛋白基因（afp），并将扩增产物进行电泳分析，结果如下图所示。MW 为标准样品的电泳结果，1号泳道为扩增成功的电泳结果。下列相关叙述正确的有（　　） A．人的胰腺细胞中也含有afp，可选用胰腺细胞的cDNA文库为模板进行扩增 B．2 号泳道可能是退火温度较高所导致 C．3 号泳道可能是扩增时循环的次数过少所导致 D．4号泳道可能是引物过短所导致 【答案】CD 【分析】DNA分子的琼脂糖凝胶电泳 ：DNA分子中具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 【详解】A、cDNA是由RNA逆转录形成的，甲胎蛋白（AFP）是肝脏特异性蛋白质，说明甲胎蛋白基因（afp）在人的胰腺细胞中不会表达，故不能选用胰腺细胞的cDNA文库为模板进行afp扩增，A错误； BD、2 号泳道和4号泳道均出现非特异性条带，与实验的模板受到污染、引物的特异性不强、退火（复性）温度偏低等有关，故2 号泳道可能是退火温度较低所导致，4号泳道可能是引物过短、特异性低所导致，B错误，D正确； C、1号泳道为扩增成功的电泳结果，与1号泳道相比，3号泳道条带较小，说明扩增后的DNA含量较低，可能是扩增时循环的次数过少所导致，C正确。 故选CD。 15．（23-24高二下·江苏徐州·期末）OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（能引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法将其导入棉花细胞，在棉花叶绿体内构建了一条新的代谢途径，提高了棉花的产量。下列相关叙述错误的有（    ）    A．使用Ca2+处理农杆菌，有利于多基因表达载体的导入 B．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞 C．OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的同一条单链为模板 D．四个基因都在棉花叶绿体内进行转录、翻译 【答案】BCD 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、用Ca2+处理农杆菌使其处于感受态，有利于多基因表达载体的导入，A正确； B、卡那霉素抗性基因不在T-DNA上，没有转移到宿主细胞的染色体DNA上，因此应用潮霉素培养基筛选被农杆菌转化的棉花细胞，B错误； C、启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，图中OsGLO1、EcCAT基因启动子的位置和方向不同，且RNA链的延伸方向是由RNA的5’→3’，因而，OsGLO1、EcCAT基因转录时以DNA的不同单链为模板，C错误； D、四个基因在叶绿体外合成蛋白质，由叶绿体转运肽引导合成的蛋白质进入叶绿体，即这四个基因的转录和翻译过程都在叶绿体外完成，D错误。 故选BCD。 16．（23-24高二下·江苏南京·期末）地球上纤维素含量丰富，其酶解产物利用广泛，但由于纤维素酶催化活性低下、持续催化能力较弱等，导致生产成本过高以至于影响了其实际应用，采用蛋白质工程技术对纤维素酶进行分子改造是避免上述问题的一种有效方式。下列相关叙述正确的是（    ） A．通过蛋白质工程技术改造纤维素酶不需要对基因进行操作 B．与基因工程相比，通过蛋白质工程可以生产自然界没有的纤维素酶 C．设计预期蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列是蛋白质工程的重要步骤 D．改变DNA序列可以改变纤维素酶的氨基酸序列，实现纤维素酶功能的改变 【答案】BCD 【分析】与基因工程相比，蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产生活需要。 【详解】A、蛋白质工程就是通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或合成新蛋白，需要对基因进行操作，A错误； B、与基因工程相比，蛋白质工程对基因进行改造，可以生产自然界没有的蛋白质，B正确； C、蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，制造一种新的蛋白质，设计预期蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列是蛋白质工程重要步骤，C正确； D、结构决定功能，改变DNA序列可以改变纤维素酶的氨基酸序列，实现纤维素酶功能的改变，D正确。 故选BCD。 17．（23-24高二下·江苏盐城·期末）如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径，下列有关叙述正确的是（　　）    A．将含目的基因的重组质粒导入植物受体细胞可用农杆菌转化法 B．扩增目的基因时，利用耐高温的DNA连接酶从引物a和引物b起始延伸子链 C．接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞不是乳腺细胞 D．基因表达载体的组成一般包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等 【答案】ACD 【分析】基因工程技术的基本步骤是： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定： （1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。 （2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、将含目的基因的重组质粒导入植物受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和花粉管通道法，A正确； B、若利用PCR技术扩增目的基因时，利用耐高温的DNA聚合酶从引物a和引物b起始延伸子链，B错误； C、接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是受精卵，C正确； D、一个基因表达载体的组成除了目的基因外，还需具备启动子、终止子、复制原点、标记基因等，D正确。 故选ACD。 18．（23-24高二下·江苏泰州·期末）大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA会缠绕在细胞壁碎片上，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。分别用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如下图所示。下列关于质粒粗提取和鉴定的叙述，正确的是（    ） A．溶菌酶能溶解大肠杆菌的细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜 B．为排除RNA 对实验结果干扰，需用RNA 水解酶处理上清液 C．电泳鉴定时，被染色的质粒还需要在紫外灯下才能看到结果 D．根据电泳结果，质粒上一定各有一个限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点 【答案】AC 【分析】DNA的粗提取和鉴定：利用DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，以及DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，可以将DNA与蛋白质分离开；在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 【详解】A、溶菌酶能溶解大肠杆菌的细胞壁，洗涤剂能瓦解其细胞膜，但对DNA没有影响，A正确； B、细胞内有RNA水解酶，不需要加入RNA水解酶处理上清液，B错误； C、电泳鉴定时，被染色的质粒还需要通过紫外灯，会发出荧光，在特定的仪器下能看到结果，C正确； D、质粒的化学本质是环状的DNA，且由图可知，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有1个条带，可能是该质粒上有一个切割位点，也可能没有切割位点，即质粒上不一定含有限制酶I和Ⅱ的切割位点，但限制酶III切割后有2个条带，故一定有限制酶III的切割位点，D错误。 故选AC。 19．（23-24高二上·江苏南京·期末）科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（LPG），可获得乳酸乙酯（白酒香味的主要来源）高产菌株，过程如图。下列分析合理的是（　　）    A．转入的LPG基因表达产物不能影响酿酒酵母的活性 B．LPG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段 C．标记基因Ampr可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株 D．可以利用PCR技术筛选含有LPG基因的受体细胞 【答案】ABD 【分析】分析题图：图示是采用基因工程技术将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因(PD)替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因(L-PG)，从而获得乳酸乙酯高产菌株。 【详解】A、目的基因表达产物不能影响受体细胞的生存和活性，因此转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性，A正确； B、LPG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段，即相同的黏性末端，B正确； C、标记基因Ampr可筛选含有目的基因的受体细胞，但不能检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株，C错误； D、PCR技术是一项体外扩增基因的技术，依据碱基互补配对原则，可以用于筛选含有L-PG基因的受体细胞，D正确。 故选ABD。 三、实验题 20．（23-24高二下·江苏宿迁·期末）启动子可分为组成型启动子和诱导型启动子。组成型启动子能够持续、高效地启动目的基因在植物各种组织中表达，但往往也会阻碍植物的生长发育；诱导型启动子能与抗逆基因结合，从而使转基因植物更好地适应逆境。沙冬青脱水素基因（AmDHN基因）能使植株具有较强的抗旱作用。科研人员构建Rd29A启动子驱动AmDHN基因表达的载体，过程如下图，再利用某种方法转化“敖汉苜蓿”培育耐旱新品种，以期在干旱地区发展苜蓿产业。neo「是新霉素抗性基因，aadA是链霉素抗性基因。回答下列问题。 限制酶 BclI Sac I BamH I Pst I Sma I 识别序列和切割位点 T↓GATCA GAGCT↓C G↓GATCC CTGCA↓G CCC↓GGG (1)Rd29A启动子是 （填“组成型”或“诱导型”）启动子，其基本单位是 ，能识别Rd29A启动子的酶是 。 (2)下图是科研人员扩增Rd29A启动子所设计的引物，根据引物的碱基序列及限制酶的识别序列分析，构建载体2时选用的限制酶是 。 上游引物P1：5'-GACCCGGGTTTCCAAAGATTTTTTTC-3' 下游引物P2：5'-GAGAGCTCTGGGGTTTTGCTTTTGAATGT-3' (3)构建载体3时，选用 酶切割载体1、2成功率较高。 载体5需先转入 后再转化苜蓿，转化后应在培养基中添加 筛选转化成功的愈伤组织。 (4)为检测转基因苜蓿中AmDHN基因的转录水平，挑选10株转基因植株，平均分成2组，利用自来水和20%PEG（模拟干旱条件） 处理8h, 提取植株的 通过RT-PCR检测AmDHN基因和MtActin基因（一种骨架蛋白基因，在各种细胞中表达都相对恒定）的表达水平，扩增产物常用 技术进行检测，检测结果如下图： 该图中，自来水处理和20%PEG条件下的AmDHN基因表达水平的差异说明 。 【答案】(1) 诱导型 4种脱氧核苷酸 RNA聚合酶 (2)SmaⅠ和SacⅠ (3) BclⅠ和SacⅠ 农杆菌 新霉素 (4) （总）RNA 琼脂糖凝胶电泳 干旱条件诱导Rd29A启动子驱动AmDHN基因表达 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）根据题意，沙冬青脱水素基因属于抗旱基因，属于抗逆基因，诱导型启动子能与抗逆基因结合，使转基因植物更好地适应逆境，因此与AmDHN基因结合的Rd29A启动子属于诱导型启动子；启动子、终止子都是一段DNA序列，故其基本单位为4种脱氧核苷酸；在转录过程中，识别并结合启动子的酶是RNA聚合酶。 （2）分析引物的碱基序列和限制酶识别序列切割位点，引物5'端是SmaⅠ的识别序列CCCGGG和SacⅠ的识别序列GAGCTC，SmaI和 SacI能识别并切割质粒，故构建载体2时选用的限制酶是SmaⅠ和SacⅠ。 （3）构建载体3时要将35S启动子切掉，将Rd29A启动子连接在T-DNA上，故由载体1和2可得，选用BclⅠ酶和SacⅠ酶成功率较高；将目的基因导入植物细胞用的方法是农杆菌转化法，故载体5需先转入农杆菌后再转化苜蓿，载体5含有的neor是新霉素抗性基因，是标记基因，转化后应在培养基中添加新霉素筛选转化成功的愈伤组织。 （4）本实验目的是检测转基因苜蓿中AmDHN基因的转录水平，基因转录产物是RNA，因此需提取植株的RNA通过RT-PCR检测AmDHN基因和MtActin基因的表达水平；通过PCR扩增获得产物通常用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测，在相同浓度的凝胶中，DNA分子的大小和构象不同，迁移速率不同；自来水条件下AmDHN基因不转录，20%PEG条件下AmDHN基因转录，说明干旱条件能诱导Rd29A启动子驱动AmDHN基因表达。 21．（23-24高二下·江苏盐城·期末）牛的瘤胃中生活着多种微生物，其中一些微生物能分解尿素。这些微生物细胞中G蛋白参与激活脲酶，且G蛋白激活脲酶依赖于其与E蛋白结合。为探究G蛋白与E蛋白的结合位点，拟采用PCR定点突变的方法，获得第72位组氨酸被替换为丙氨酸的G蛋白，相关过程见图1。回答下列问题：    注：引物中^表示碱基突变位点。可能用到的密码子：起始密码子 （AUG）、组氨酸（CAU）、丙氨酸 （GCU）。 (1)从瘤胃分离出这些微生物时需用配制选择培养基，为证明该培养基具有选择作用，对照组的操作是 。 (2)为获得点突变G蛋白基因，PCR1 需要的引物是 （从图1引物中选择），PCR4需要的引物是 （从图1引物中选择），PCR3反应体系需加入 （从下列选项中选择）。 A．含Mg2+缓冲液 B．四种脱氧核苷酸 C．TaqDNA聚合酶 D．引物2和5 E.引物1和6 F.产物1和2 (3)据图1可知，G蛋白转录的模板链是 （填“a链”或“b链”），引物4中该突变位点碱基为 （按5'到3'方向）。 (4)改造后的G蛋白基因约有1600个碱基。PCR扩增结果如图2所示，则加样孔位于 （填“甲”或“乙”）端。由图2可知泳道1条带中的PCR产物长度为1600个碱基左右，由此推测PCR产物 （填“一定” “不一定”或“不”）是改造的G 蛋白基因，理由是 。 (5)据图3可知，为使点突变G蛋白基因与表达载体高效连接并正确表达，最好选用限制酶 获取目的基因。    【答案】(1)接种等量瘤胃微生物在牛肉膏蛋白胨培养基上在相同条件下培养一段时间 (2) 引物1和引物4 引物1和引物6 ABCF (3) b链 GC (4) 甲 不一定 因为改造的G 蛋白基因是通过G蛋白碱基替换得到的，基因的碱基个数没有发生改变 (5)EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ 【分析】聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。 【详解】（1）从瘤胃分离出分解尿素的微生物时需利用选择培养基，为证明该培养基具有选择作用，对照组的操作是接种等量瘤胃微生物在牛肉膏蛋白胨培养基上在相同条件下培养一段时间，若选择培养基上的菌落数少于对照组，则可证明。 （2）由图1可知，引物3和引物4处含有突变位点，且引物会与模板链的3'端结合，子链延伸方向是5'→3'，所以为获得点突变G蛋白基因，PCR1需要的引物是引物1和引物4，PCR4需要与G蛋白基因两端互补的引物，即引物1和引物6，PCR3扩增时，反应体系中应加入含Mg2+缓冲液，原料（四种脱氧核苷酸）、模板（PCR1的产物1的一条链和PCR2的产物2的一条链）、引物、TaqDNA聚合酶等，ABCF正确，DE错误。 故选ABCF。 （3）转录时，mRNA延伸的方向是5'→3'，图1中a链的3'端起始碱基是AGT，对应mRNA链中的是GCA，不是起始密码子，而b链的3'端起始碱基是TAC，对应mRNA链中的是AUG，是起始密码子，所以图1中，G蛋白转录的模板链是b链，采用PCR定点突变的方法，获得第72位组氨酸被替换为丙氨酸的G蛋白，而组氨酸的密码子为CAU，丙氨酸的密码子为GCU，按照碱基互补配对原则，对应引物4中该突变位点碱基为GC。 （4）分子量越小的DNA，在电泳时跑的越快，与加样端的距离越远，则加样孔位于甲端，由于改造的G 蛋白基因是通过G蛋白碱基替换得到的，基因的碱基个数没有发生改变，泳道1条带中的PCR产物长度为1600个碱基左右，由此推测PCR产物不一定是是改造的G 蛋白基因。 （5）为了防止点突变G蛋白基因与表达载体反向连接以及各自连，需要选择两种不同的限制酶进行切割，结合图2可知，使用Xho Ⅰ会破坏点突变G蛋白基因，而要将该基因切割下来，需要在其上下游进行切割，点突变G蛋白基因的左侧只能选择EcoR Ⅰ，而右侧的选择时需要结合表达载体上的酶切位点，右侧可以选择Sma Ⅰ和Sal Ⅰ，而Sma Ⅰ切割后形成的是平末端，连接效率较低，所以右侧只能选择Sal Ⅰ，故最好选用限制酶是EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ。 22．（23-24高二上·江苏南通·期末）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。请回答下列问题。 (1)从枣树相关细胞中提取 ，通过逆转录获得枣树的MTcDNA，然后根据枣树MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），以通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为 ，这些引物的长度一般包含15～23个碱基，过短会导致 差。若1个MTcDNA扩增n次，则总共消耗引物 个。 (2)本实验中，PCR所用的 酶扩增出的MT基因，其末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。 ①选用 酶将载体P切开，再用 酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P'。 ②选用 酶的组合对载体P'和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用酶连接，将得到的混合物导入到用 离子处理的大肠杆菌，然后筛出MT工程菌。 (3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示，结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，以下叙述中能支持该观点的是 。 ①尚未对MT工程菌合成的MT蛋白的活性进行测定 ②尚未对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定 ③尚未在个体生物学水平进行抗原-抗体杂交 ④尚未对MT基因进行碱基序列的测定和比较 【答案】(1) （总）RNA 引物1和引物4（或1和4） 特异性 2n+1-2 (2) Taq DNA聚合 EcoR V T4 DNA连接 Xho I和Pst  I 钙（或Ca或Ca2+） (3)①② 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）经mRNA获得DNA的技术是逆转录，为获得枣树的MTcDNA，需要从枣树相关细胞中提取（总）RNA；密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4；引物的长度一般包含15～23个碱基，过短会导致特异性差，若引物长度过长，则退火温度过高且导致碱基错配概率上升；PCR体外扩增DNA时，每条链均需要一个引物，循环n次，会产生2n个DNA，去除原来的模板，故一个DNA经PCR技术扩增n次，需要消耗引物2n+1-2个。 （2）PCR扩增时所需的酶是耐高温的DNA聚合酶，即TaqDNA聚合（酶）。 ①MT基因的末端为平末端，故需要用EcoR Ⅴ或Sma Ⅰ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′和载体E连接，故需将MT基因插入Xho I和Pst I两个酶切位点之间，故选EcoR Ⅴ将载体P切开；由于E·coli  DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶可以连接平末端，而MT基因的末端为平末端，故需要用T4DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。 ②载体P′是重组质粒，故不含有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有XhoI和PstI酶，故可选用XhoI和PstI酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。 （3）由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，①②正确，③④错误。 故选①②。 四、解答题 23．（23-24高二下·江苏徐州·期末）放线菌主要存在于土壤、空气和水中，还有部分存在于健康植物的各种组织和器官内部，称为植物内生放线菌。请回答下列问题： (1)放线菌能抑制病原菌的生长。研究人员利用两种不同类型的放线菌获得新型工程菌，过程如图所示。收集两种菌丝体，加入 （填“纤维素酶”或“溶菌酶”）处理，获得原生质体，将两种原生质体悬液等量混合，加入适量促融剂处理一段时间。终止反应并洗涤后，取一定量混合液接种于 （填“固体”或“液体”）培养基中培养。根据菌落特征，选出性状稳定的融合菌株。 (2)某真菌的W基因可编码一种高效降解纤维素的酶，已知乙链为W基因转录的模板链，为使放线菌产生该酶，以图中质粒为载体，进行转基因。 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ MfeⅠ KpnⅠ HindⅢ 识别序列和切割位点 G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT ①为了将W基因与质粒重组且避免质粒和W基因自身环化，最好选择用限制酶 处理质粒、 处理W基因。 ②研究人员欲对W基因的mRNA进行RT-PCR，已知其mRNA的序列为5'-UGAACGCUA…（中间序列）…GUCGACUCG-3'。为了便于将扩增后的基因和载体成功构建成重组质粒，用于PCR扩增的引物应为 。 A．5'-TGAACGCTA…   B．5'-GAATTCTGA… C．5'-CGAGTCGAC…   D．5'-AAGCTTCGA… ③除引物外，PCR反应体系中还应加入含Mg2+的缓冲液、 。扩增过程中预变性的目的为 ，子链的延伸方向为 。 ④除引物外，启动子通常具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择 （从“植物”“真菌”“放线菌”中选填）启动子。为确定导入重组质粒的放线菌是否具有降解纤维素的能力，研究人员将导入了重组质粒的放线菌接种在含有纤维素和 的固体鉴别培养基上，若出现以菌落为中心的透明圈，则证明W基因成功表达。 【答案】(1) 溶菌酶 固体 (2) MfeⅠ、HindⅢ EcoRⅠ、HindⅢ BD 耐高温的DNA聚合酶 解旋 5'3' 放线菌 刚果红 【分析】一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【详解】（1）放线菌的细胞壁主要成分为肽聚糖，能被溶菌酶水解。筛选是通过菌落特征进行的，所以接种于固体培养基上才能形成菌落。 （2）①根据题图信息，“已知乙链为W基因转录的模板链”，可知图中W基因转录方向是从左往右、放线菌质粒启动子到终止子方向为顺时针，故重组质粒的启动子应在W基因左侧，终止子应在W基因右侧，W基因右侧只能用HindⅢ切割，质粒中EcoRⅠ会将质粒切成片段，BamHⅠ会破坏质粒的启动子，KpnⅠ会导致W基因出现反向连接，故应使用限制酶MfeI、HindⅢ切割图中质粒，依据各种限制酶的识别序列可知，EcoRⅠ和MfeI可以产生相同的黏性末端，故使用限制酶EcoRI、HindⅢ切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。 ②已知mRNA的序列为5'-UGAACGCUA…(中间序列)…GUCGACUCG-3'，逆转录得到cDNA序列为5'-CGAGTCGAC…（中间序列）…TAGCGTTCA-3'，利用PCR技术对cDNA进行扩增，PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，并加入EcoRI、HindⅢ识别序列，在W基因左侧加入MfeI序列也可，故PCR扩增时所需引物的前12个碱基序列5'-GAATTCTGAACG-3'，5'-AAGCTTCGAGTC-3'，5'-CAATTGTGAACG-3'，BD正确，AC错误。 故选BD。 ③除引物外，PCR反应体系中还应加入含Mg2+的缓冲液、耐高温的DNA聚合酶。扩增过程中预变性的目的是解旋，子链的延伸方向是5'→3'。 ④根据题干信息“启动子通常具有物种特异性”，目标是使放线菌产生高效降解纤维素的酶，故应选择放线菌的质粒，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择放线菌启动子。纤维素与刚果红结合会出现红色，为确定导入重组质粒的放线菌是否具有降解纤维素的能力，可将导入了重组质粒的放线菌接种在含有纤维素和刚果红的固体鉴别培养基上，若出现以菌落为中心的透明圈，则证明W基因成功表达，产生了高效降解纤维素的酶。 24．（23-24高二下·江苏连云港·期末）为培育抗除草剂水稻新品种，科研人员将人工合成的草铵膦抗性基因（）转入水稻植株，流程如下图所示。请回答下列问题： (1)获取目的基因。人工合成添加了限制酶识别序列的目的基因，并用适当的限制酶切割，则图中两侧的序列为① 、② （写出单链碱基序列并标出端和端） (2)构建基因表达载体。作为表达载体，除图中结构外，未标注的结构为 ，潮霉素抗性基因的作用是 。 (3)将目的基因导入受体细胞。①取某品种水稻的幼胚，经消毒处理后接种到培养基，诱导形成愈伤组织，进而形成植物个体，该过程利用的原理是 。②用农杆菌侵染愈伤组织，Ti质粒上的 区段可转移到水稻细胞的基因组DNA中。 (4)目的基因的检测与鉴定。可采用PCR技术检测目的基因是否成功导入水稻细胞，在该反应体系中，应加入 、的特异性引物对、 、dNTP、缓冲液等，第 次循环后将出现等长的目的基因片段。已知目的基因一条链的部分序列为5´-TACAGGT…GGTTCAC-3´，则的特异性引物对应选择 。（只展示引物部分序列） A．5´-TACAGGT-3´   B．5´-GGTTCAC-3´ C．5´-ATGTCCA-3´   D．5´-GTGAACC-3´ (5)将扩增得到的DNA片段进行电泳，结果如图2，据图未成功导入目的基因的是 （填写数字）。除了要进行分子水平的检测外，还要进行个体水平的鉴定，即对植株进行 实验。 【答案】(1) 3，TCGAG-5´ 3，GTACG-5´ (2) 启动子 便于重组DNA分子的筛选 (3) 植物细胞的全能性 T−DNA (4) 耐高温的DNA聚合酶 模板DNA（或含有目的基因RePAT*的DNA） 3 AD (5) 2和7 喷洒草铵膦农药 【分析】基因工程的基本操作程序：第一步：目的基因的获取；第二步：基因表达载体的构建（核心）；第三步：将目的基因导入受体细胞；第四步：目的基因的检测和表达。 【详解】（1）据图分析可知，不能用BamHⅠ限制酶切割，因为会将Ti质粒的复制原点破坏，为防止目的基因自连及质粒的环化，可用SphⅠ和SacⅠ两种不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割，根据目的基因的转录方向和Ti质粒已标注的特点，目的基因的①端用SacⅠ限制酶进行切割形成的黏性末端为3，TCGAG-5´，目的基因的②端用SphⅠ限制酶进行切割形成的黏性末端为3，GTACG-5´。 （2）据图分析可知，构建的基因表达载体中已标注有复制原点、标记基因、终止子、目的基因，未标记的结构有启动子，潮霉素抗性基因作为标记基因，其作用为便于重组DNA分子的筛选。 （3）①取某品种水稻的幼胚，经消毒处理后接种到培养基，诱导形成愈伤组织，进而形成植物个体，该过程利用的原理是植物细胞的全能性。②用农杆菌侵染愈伤组织，Ti质粒上的T−DNA区段可转移到水稻细胞的基因组DNA中。 （4）利用PCR技术检测目的基因RePAT*时，在反应体系中应加入耐高温的DNA聚合酶、RePAT*的特异性引物对、基因RePAT*模板、dNTP、缓冲液等，第2次循环才会出现目的基因RePAT*片段，故经过3次循环后将出现等长的目的基因片段。已知目的基因一条链的部分序列为5´-TACAGGT…GGTTCAC-3´，则RePAT*的特异性引物对应为5´-GTGAACC-3´，而互补链序列为3´-ATGTCCA…CCAAGTG-5´,则RePAT*的特异性引物对应为5´-TACAGGT-3´，故选AD。 （5）据图2分析可知，M为Maker，P为阳性对照，在1-10组电泳中只有2和7未出现于阳性对照组相同的电泳结果，其他都与阳性对照电泳相同，故未成功导入目的基因的是2和7，对目的基因的检测与鉴定，除了要进行分子水平的检测外，还要进行个体水平的鉴定，即对植株进行一定浓度的草甘膦农药喷洒，在适宜环境条件下培养一段时间后，观测水稻的生长情况。 25．（23-24高二下·江苏南京·期末）人绒毛膜促性腺激素是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由a链和β链（hCGβ）结合而成。近年研究显示，hCGβ可表达于结肠癌等多种恶性肿瘤细胞，与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点，下图1为其制备的基本方案。请分析回答下列有关问题：    注1：甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔 注2：AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达 (1)图中hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是 。 (2)当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。同源切割是一种代替 将目的基因导入基因表达载体的方法。 (3)阶段Ⅱ将环化质粒导入用 处理的大肠杆菌，然后在含有 的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。 (4)鉴定基因表达载体。为了检验目的基因是否融合成功，提取大肠杆菌中的质粒为模板，设计相应的引物对融合基因进行PCR扩增，PCR反应体系中需加入模板、 、引物、Mg2+、缓冲液等，再将扩增产物进行电泳。电泳时需将待测样品与上样缓冲液混合后加入加样孔，缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂，以防 。电泳后得到图2所示结果，据图可判断 号样品最符合要求。    (5)阶段IV需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养，该培养基不需要添加以下哪些成分？ （a.氨苄青霉素b.组氨酸c.无机盐d.琼脂），可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。将此菌株扩大培养后，离心取上清液，用 方法进行检测。若上清液中能检测到hCGβ蛋白，则说明hCGβ基因得以表达。 (6)从生产控制的角度分析，选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是 。 【答案】(1)有利于hCGβ进入内质网加工 (2)限制酶 (3) Ca2+ 氨苄青霉素 (4) Taq DNA聚合酶、dNTP（4种脱氧核苷酸） 条带迁移出凝胶 3 (5) a、b 抗原—抗体杂交法 (6)可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来控制hCGβ基因表达 【分析】据图可知，图1中Ⅰ为基因表达载体的构建过程，Ⅱ是将重组DNA导入大肠杆菌，Ⅲ是提取并鉴定所需要的重组质粒，Ⅵ是将选择的重组质粒导入酵母菌内，Ⅴ是筛选符合要求的酵母菌，Ⅵ是提取目的基因的产物。 【详解】（1）甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔，因此hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因，其目的是有利于hCGβ进入内质网中加工，并分泌到细胞外。 （2）传统重组质粒构建过程需要使用限制酶和DNA连接酶，而该过程是运用同源切割的方式在hCGβ基因两端加上一组同源序列A、B，然后将hCGβ基因与线性质粒载体混合后，在重组酶和DNA连接酶的作用下可形成环化质粒，该过程没有使用限制酶，所以同源切割是一种代替限制酶将目的基因导入基因表达载体的方法。 （3）将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（钙离子处理法），即用Ca2+处理；由于线性质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此导入环化质粒的大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性，因此应在含有氨苄青霉素的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。 （4）计相应的引物对融合基因进行PCR扩增，PCR反应体系中需加入模板、Taq DNA聚合酶、dNTP（4种脱氧核苷酸）引物、Mg2+、缓冲液等；缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂，以防条带迁移出凝胶；据图分析可知，hCGβ基因的长度为630bp，甲序列长度是320bp，因此融合基因长度950bp，结合图2可知，3号样品电泳出现约1000（950bp）条带，故3号样品最符合要求。 （5）于环状质粒中含有组氨酸合成酶基因和氨苄青霉素抗性基因，且筛选重组质粒时大肠杆菌是在含有氨苄青霉素的培养基上培养的，因此为筛选导入重组质粒的酵母菌，培养基中不需要再加入b组氨酸和a氨苄青霉素，但需要加入无机盐和琼脂，形成固体培养基，以筛选目的菌体； hCGβ是一种分泌蛋白，可被分泌到细胞外，将培养物离心后分出细胞和培养液两部分，细胞经破碎处理后，再次离心取上清液，可获得较多的hCGβ，用抗hCGβ单克隆抗体分别进行检测，即抗原—抗体杂交法。 （6）AOXⅠ为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达，因此选用AOX1作为hCGβ基因启动子，可以通过控制培养液中甲醇的有无，来控制hCGβ基因的表达hCGβ蛋白的合成。 26．（23-24高二下·江苏泰州·期末）无缝克隆技术是依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的基因较为紧密地连在一起，实现 DNA 片段无缝连接的技术。其基本原理及过程如下图 1 所示。请回答相关问题：    (1)图1中①过程通过 方法获得线性化质粒，引物A和B要依据 序列进行设计。 (2)从冰箱拿出②过程所需试剂，放在 上缓慢融化，在离心管中加入各种反应成分后，需进行 操作，使反应液集中于离心管底部。 (3)用In-Fusion酶沿5'→3'方向水解DNA，能形成 。该酶催化的最适温度为37℃，而过程③选择的温度为50℃，目的是降低酶活性， 。 (4)与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有 。 A．避免限制酶切割对质粒功能区的破坏 B．不会引入多余碱基 C．可把目的基因插入质粒的任何位点 D．操作时间短，成功率高 (5)不对称PCR 常用于制备DNA探针。其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物，在PCR 反应的早期10-15 个循环中，扩增产物主要是双链DNA，当数量较少的限制性引物耗尽后，数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA 单链。    ①若A链为所需的DNA分子探针，则非限制性引物应选用上图2中引物 ；如果体系中原有模板 DNA 的数量为m，最初10次循环产物为双链，后20次循环产物为单链，则最终获得的单链探针数为 。因为 DNA 单链与双链的分子量不同，可通过 将单链探针 DNA 分离出来。 ②为精确控制产物生成量，科学家尝试设计了较长的非限制性引物与较短的限制性引物，在进行一定的循环次数后，适当提高复性温度以避免残留限制性引物与模板结合。高复性温度条件下限制性引物不能结合模板链的原因是 。 【答案】(1) PCR 质粒与目的基因 (2) 冰块 离心 (3) 黏性末端 防止过度水解DNA (4)ABCD (5) Ⅳ 20×210·m (琼脂糖凝胶）电泳 引物越短，复性时可与模板链形成的氢键数越少，越容易被高温破坏 【分析】1、PCR技术： (1)概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 (2)原理：DNA半保留复制。 (3)前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 (4)条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温的DNA聚合酶。 (5)过程：变性一复性一延伸。 2、无缝克隆区别于传统PCR产物克隆，唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基，依靠碱基间作用力互补配对成环，无需酶连即可直接用于转化宿主菌，进入宿主菌中的线性质粒（环状）依靠自身酶系将缺口修复。 【详解】（1）据图1可知，图中①过程获得线性化质粒时利用到了引物，故获得线性化质粒的方法为PCR技术。引物是一小段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，据图可知， 利用引物A和引物B扩增得到的DNA片段要含有目的基因，且能与线性化质粒连接，因此，引物A和B要依据质粒与目的基因序列进行设计。 （2）进行PCR扩增时，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。然后 用微量移液器按照PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在管的底部。 （3）由图可知，无缝克隆时，过程中用In-Fusion酶沿5'→3'方向水解DNA，形成黏性末端。温度能影响酶活性，该酶催化的最活温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，其目的是降低酶活性，防止过度水解DNA。 （4）无缝克隆与传统PCR产物克隆唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基，依靠碱基间作用力互补配对成环，无需酶连即可直接用于转化宿主菌，进入宿主菌中的线性质粒（环状）依靠自身酶系将缺口修复。无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片段的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体。因此，与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有：避免限制酶切割对质粒功能区的破坏、不会引入多余碱基、可把目的基因插入质粒的任何位点、操作时间短且成功率高等优点，因此，ABCD都符合题意。 故选ABCD。 （5）①DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链，引物Ⅱ和Ⅲ无意义；若A链为所需的DNA分子探针，则非限制性引物应选用引物Ⅳ，引物Ⅳ引导合成的序列和B互补和A相同。如果体系中原模板DNA的数量为m，最初10次循环产物为双链DNA分子为210×m个，其中有B链为210×m个，以这些链为模板，利用引物又进行了20次循环，每次循环生成的都是A，不改变B的数目，即B每次循环开始都是210×m个，20次循环每次生成A也是210×m个，共20×210×m个A。因为DNA单链与双链的分子量不同，可通过电泳将单链探针DNA分离出来。 ②限制性引物较短，引物越短，复性时可与模板链形成的氢键数越少，越容易被高温破坏。 27．（23-24高二下·江苏无锡·期末）磷酸吡哆醛（PLP）是多种酶的辅酶，广泛应用于各个领域。研究人员利用质粒pETDuet-1（5420bp）将合成PLP途径中的三个关键酶编码基因pdxj（732bp）、dxs（1864bp）和zwf（1476bp）转化到大肠杆菌BL21中，使PLP的产量提高了38.76倍。图1是表达载体pETDuet-1-pdxj- zwf-dxs的构建过程（Ampr为氨苄青霉素抗性基因，Ori为复制原点），图2是通过重叠延伸PCR构建zwf-dxs融合基因的示意图，表1是相关基因扩增所用引物的部分序列，表2是部分限制酶识别序列和切割位点。请回答下列问题：        表1 基因 引物1部分序列 引物2部分序列 pdxj 5′TCGCGAATTCCCATGATA 3′ 5′CTTCGAGCTCTTAGGTATGT3′ zwf 5′CTAAGAGCTCGAAGGAGATA 3′ 5′CCTTCTCTAGATTACCACCC3′ dxs 5′TCGCGGTACCAAGGAGATAT 3′ 5′CTTCGCGGCCGCTTAATTAGAA3′ 表2 限制酶 Eco RI SacⅠ NotⅠ 识别序列 G↓AATTC GAGCT↓C GCGGCCG↓C (1)通过PCR获取目的基因zwf和dxs的扩增反应体系中应添加模板DNA、引物、 、缓冲液等，反应程序为：95℃2min；98℃10s，55℃5s，72℃30s，30个循环；72℃3min。最后72℃3min的目的是 。 (2)图2中，引物P2与P3末端添加序列必须能够发生 ，添加序列所在端为目的链L、S的 （填5′或3′）端，步骤③ （填“需要”或“不需要”）添加引物。采用电泳的方法对重叠PCR产物进行鉴定，结果如图3，条带 最可能表示dxs-zwf融合基因片段。 (3)构建重组质粒时，先将pdxj和质粒pETDuet-1分别用限制酶 进行酶切，连接得到重组质粒pETDuet-1-pdxj。zwf-dxs融合基因与重组质粒pETDuet-1-pdxj连接时，需用限制酶 和DNA连接酶处理，最终得到重组质粒pETDuet-1-pdxj-zwf-dxs。 (4)用EcoRI和NotⅠ酶切后电泳，若得到大小为 bp的两种片段条带表明成功构建了重组质粒petduet-pdxj-zwf-dxs。 (5)将成功构建的表达质粒pETDuet-1-pdxj-zwf-dxs转化至大肠杆菌BL21中，用含 的固体培养基中筛选出成功转化的菌株（重组菌株），将其接种于发酵培养液中，适宜条件下发酵，检测PLP的产量和细胞光密度（OD600），相关结果如图4所示。PLP的浓度积累到高水平后略有下降，可能的原因是 。    【答案】(1) TaqDNA聚合酶、脱氧核苷酸（dNTP） 使子链充分延伸 (2) 碱基互补配对 3′ 不需要 3和4 (3) EcoRI和SacⅠ SacI和NotI (4)5419、4072 (5) 氨苄青霉素 部分PLP转化为其它物质 【分析】基因工程技术的基本步骤： ①目的基因的获取：利用PCR技术扩增和人工合成。 ②基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 ③将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 ④目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用PCR获取目的基因时，PCR反应体系需要加入缓冲液、模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等。PCR的过程为高温变性、低温复性、中温延伸，因此最后72℃3min的目的是使子链充分延伸。 （2）据图2可知，目的链L和目的链S中间需碱基互补配对，因此引物P2与P3末端添加序列必须能够发生碱基互补配对。由图可知，子链延伸的方向是5'→3'，需将添加序列所在端为目的链L、S的3'端，便于后期延伸。步骤③中两条链可直接根据碱基互补配对延伸，因此不需要添加引物。dxs（1864bp）、zwf（1476bp），再加上部分引物序列，因此dxs-zwf融合基因片段大约为3340bp，用电泳的方法对重叠PCR产物进行鉴定，条带3和4最可能表示dxs-zwf融合基因片段。 （3）由表1和表2可知，pdxj基因的引物序列中，存在限制酶EcoRI和SacⅠ的识别位点，因此构建重组质粒时，先将pdxj和质粒pETDuet-1分别用限制酶EcoRI和SacⅠ进行酶切，连接得到重组质粒pETDuet-1-pdxj。zwf基因中引物1上存在SacⅠ限制酶识别序列，dxs基因的引物2序列中存在限制酶NotⅠ识别序列，因此zwf-dxs融合基因与重组质粒pETDuet-1-pdxj连接时，需用限制酶SacI和NotI和DNA连接酶处理，最终得到重组质粒pETDuet-1-pdxj-zwf-dxs。 （4）用EcoRI和NotⅠ酶切后，切割后的片段包括pdxj基因和zwf-dxs融合基因的整体片段，以及质粒剩余部分，pdxj基因和zwf-dxs融合基因的整体片段大小为732bp+1864bp+1476bp=4072bp，以及质粒剩余片段为9491-4072=5419bp。 （5）重组质粒上存在氨苄青霉素抗性基因，因此用含氨苄青霉素的固体培养基中筛选出成功转化的菌株（重组菌株）。在发酵过程中，部分PLP转化为其它物质，导致PLP的浓度积累到高水平后略有下降。 28．（23-24高二下·江苏苏州·期末）虾青素(ASTA)因具有抗氧化、着色和提高免疫力等功能，被广泛应用在化妆品、饲料添加剂和医药等行业中，科学家通过基因工程改造并获得虾青素高表达红法夫酵母。请回答下列问题： (1)科研人员发现，黄叶菌中 crtS 基因编码的双功能酶 P450 可以催化β-胡萝卜素转化为虾青素，图1为构建crtS 基因表达载体过程示意图，据此分析：    ①图1 中的质粒还缺少的必备元件是 ，其上的 AmpR基因(氨苄青霉素抗性基因)的作用是 。 ②为方便构建重组质粒，在引物中需要增加 限制酶的识别序列。请在下列选项中选择合适的引物序列 。 A．5'GAGCTCAGCCTAACGTACAAGTTCGT B．5'AGCCTAACGTACAAGTTCGTCTCGAG C． 5'GGATCCGAATCGAACGATTAGCAACT D．5'GGATCCAGCCTAACGTACAAGTTCGT (2)进一步研究发现, crtR 基因编码的细胞色素还原酶可促进双功能酶 P450 的活性。来自病毒的2A基因控制合成的2A短肽，可以将其自身尾端甘氨酸和脯氨酸之间的肽键断开，形成两个独立蛋白。图2表示科研人员利用重叠延伸 PCR 技术实现了 crtS 基因和 crtR基因在酵母细胞内的共同表达，大大提高了虾青素的含量。据此分析：    ①在重叠延伸PCR 的反应体系中，除模板外还需添加缓冲液和 等组分。缓冲液中添加Mg²⁺的作用是 。 ②PCR1 和PCR2需要分开单独进行,原因是 。与PCR1和PCR2相比,PCR3最主要的特点是 。 ③融合基因表达的双功能酶P450的分子量较正常双功能酶P450大，依据该融合基因的结构和表达原理推测，原因可能是 。 【答案】(1) 复制原点 用来鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞选出来。（便于重组DNA分子的筛选。） BamH Ⅰ 和 Sac Ⅰ AC (2) 引物、dNTP(原料或脱氧核苷酸)和耐高温的DNA聚合酶 激活DNA聚合酶 利用重叠延伸PCR连接 crtS 基因和 crtR基因过程中引物甲和引物丁的部分序列是互补配对的，若置于同一反应体系，会发生结合而失去作用，不能扩增目的基因。 PCR3不需要引物。 同一对启动子和终止子之间，crtS 基因后面连接了2A序列，使crtS蛋白后面连接了2A肽的部分片段，使融合基因表达的双功能酶P450的分子量较正常双功能酶P450大。 【分析】基因工程技术的基本步骤: (1)目的基因的获取:方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 (2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 (3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 (4)目的基因的检测与鉴定 【详解】（1）①基因表达载体中需要由启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因，图1中含有启动子、终止子、目的基因，因此图中未标注出的元件还有复制原点。其上的 AmpR基因作为标记基因，用来鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞选出来（便于重组DNA分子的筛选）。 ②图1质粒中有四种限制酶酶切位点，若将 crtS 基因（目的基因）连接在启动子和终止子之间，且保留完整的标记基因，不能选择Hind Ⅲ进行切割，否则会破坏标记基因，又因为 crtS 基因（目的基因）中含有Xba Ⅰ的酶切位点，故不能选择Xba Ⅰ进行切割，否则会破坏 crtS 基因（目的基因）。选择BamH Ⅰ 和 Sac Ⅰ两种酶切位点添加在目的基因两端，为保证目的基因的正向连接，BamH Ⅰ应添加在 crtS 基因左边，Sac Ⅰ添加在 crtS 基因右边，设计引物时，左边的引物包含BamH Ⅰ限制酶识别序列且与下方模板链互补，选C；右边的引物包含Sac Ⅰ限制酶识别序列且与上方模板链互补，选A，故选AC。 （2）①重叠延伸PCR的实验材料同普通PCR相似，即含Mg²⁺的缓冲液、引物、dNTP(原料或脱氧核苷酸)和TaqDNA聚合酶，缓冲液中添加Mg²⁺的作用是激活DNA聚合酶。 ②利用重叠延伸PCR连接 crtS 基因和 crtR基因过程中引物甲和引物丁的部分序列是互补配对的，若置于同一反应体系，会发生结合而失去作用，不能扩增目的基因，因此PCRI体系与PCR2体系应分别独立进行；由图可知，与PCR1和PCR2相比，PCR3最主要的特点是，PCR3不需要引物。 ③由图可知，同一对启动子和终止子之间，crtS 基因后面连接了2A序列，使crtS蛋白后面连接了2A肽的部分片段，因此该技术表达的酶P450的分子量较正常酶P450的分子量大。 29．（23-24高二下·江苏淮安·期末）抗菌肽具有抗菌谱广、不易产生耐药性等优点，有望成为抗生素替代品。下图1为构建拟穴青蟹抗菌肽（scy）和大黄鱼抗菌肽（hepc）共表达载体的部分示意图。ccdB 基因编码毒性蛋白，会导致细胞死亡。请据图回答问题： (1)为构建融合基因Scy-hepc需要进行PCR 扩增，反应体系中需加入模板、缓冲液（含Mg2+）、引物、 等。PCR1和PCR2在反应程序上最主要的区别是 。融合基因构建过程中发生的变异类型属于 。 (2)为鉴定PCR产物需进行电泳检测，根据检测结果，对含有单一目的片段的凝胶进行切割，目的是对 DNA进行 并回收，便于后续测序。 (3)构建基因表达载体过程中需使用BP和LR 重组酶，相当于传统酶切构建法中的 酶。与传统酶切中使用两种限制酶切割目的相同，重组前还需在 Scy序列的上游添加attBl序列,在hepc序列下游添加attB2序列的目的是 。载体PMDC85中 作为标记基因，可快速筛选转化成功的农杆菌。 (4)将重组植物表达载体导入用 处理的农杆菌，转化小球藻。转化前需用 酶对小球藻进行处理获得原生质体。可通过观察 初步检测融合基因是否成功表达。若要进一步确定表达的蛋白为Scy-hepc 可采用 技术检测。 (5)将鉴定阳性的小球藻和野生型小球藻总蛋白提取液分别加入嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌的培养基，结果如图2所示。通过比较 可知重组融合蛋白对两种菌都有一定的抑制效果。 【答案】(1) dNTP(脱氧核苷酸)和耐高温DNA聚合酶 复性温度不同（或延伸时间不同） 基因突变 (2)纯化(或提纯) (3) 限制酶和 DNA 连接酶 使融合基因(目的基因)定向插入载体 ccdB/ccdB 基因 (4) Ca2+（CaCl2） 纤维素酶和果胶酶 小球藻细胞内是否出现绿色荧光 抗原-抗体杂交 (5)抑菌圈的大小 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因便于目的基因的筛选； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因或目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术；②检测目的基因是否翻译出蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR1和PCR2两个反应体系中的引物和模板不同，所以在反应程序上最主要的区别是复性温度不同或延伸时间不同。融合基因构建过程中发生的变异类型属于基因突变。 （2）为鉴定PCR产物需进行电泳检测，根据检测结果，对含有单一目的片段的凝胶进行切割，目的是对DNA进行提纯并回收，便于后续测序。 （3）由图可知，融合基因Scy-hepc与载体1在BP重组酶的作用下构建了载体2，载体2和植物表达载体PMDC85在LR重组酶的作用下构建了PMDC85-Scy-hepc，该过程使用的BP和LR 重组酶，相当于传统酶切构建法中的限制酶和 DNA 连接酶。与传统酶切中使用两种限制酶切割目的相同，重组前还需在Scy序列的上游添加attBl序列,在hepc序列下游添加attB2序列，目的是使融合基因和载体1中含有同源序列，便于融合基因定向插入载体。ccdB基因编码毒性蛋白，会导致细胞死亡，因此，在载体PMDC85中ccdB基因作为标记基因，可快速筛选转化成功的农杆菌。 （4）将目的基因导入农杆菌时，可用Ca2+处理农杆菌，使其处于容易吸收周围DNA分子的状态。转化前需用纤维素酶和果胶酶酶对小球藻进行处理获得原生质体。PMDC85-Scy-hepc中含有GFP，相当于标记基因，因此，可通过观察小球藻细胞内是否出现绿色荧光初步检测融合基因是否成功表达。在基因工程中若要检测目的基因是否表达成功，在分子水平上可用抗原-抗体杂交技术检测。 （5）由图2可知，嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌的培养基上，加入鉴定阳性小球藻总蛋白提取液后都出现了明显的抑菌圈，说明重组融合蛋白对两种菌都有一定的抑制效果。 30．（23-24高二下·江苏南通·期末）为筛选出宿主细胞中与某病毒S蛋白特异性结合的受体，研究人员在S蛋白末端添加TAP标签，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，过程如下图。请结合实验流程回答下列问题。    注：T7（20bp）：强启动子，能与病毒RNA聚合酶特异性结合；Kozak（K）因子结合位点编码序列；Ampr：氨苄青霉素抗性基因；TAP（543bp）：可被特异性抗体识别。 (1)S基因及TAP标签的体外扩增 ①通过PCR体外扩增S基因时，应该在S基因的上游引入 和 序列，并在S基因的下游去掉 。 ②为了防止PCR反应中发生突变，常选择高保真PyrobestDNA聚合酶，与一般Taq酶相比，它具有3'到5'核酸外切酶活性，PyrobestDNA聚合酶能防止发生突变的原因是 。 ③PCR一般要经历三十多次循环，在第一次循环之前，常进行预变性（95°5min），目的是 。 (2)重组质粒的构建 已知四种限制酶的识别序列及切割位点分别为XhoI：C↑TCGAG，SmaI：CCC↑GGG，EcoRI：G↑AATTC，BamHI：G↑GATCC。 由图可知TAP标签应该插入 酶切位点之间，经过限制酶消化后，为得到目标DNA片段，还需要通过 进行鉴定和纯化，再加入 完成质粒的环化。若用SmaI和BamHI酶切割质粒PCDNA3.1，切割后形成1.2kb（不含Amp'）和4.2kb（1kb=1000bp）两种片段，则S基因长度为 bp。 (3)细胞转染 使用特定转染试剂，将纯化后的重组质粒进行细胞转染，为保证实验的科学性，还需设置对照实验，具体做法为 。 (4)融合蛋白的表达 ①TAP标签含有特定氨基酸序列，可用异硫氰酸荧光素标记的 来检测融合蛋白的表达。 ②研究发现，转染质粒之后融合蛋白表达量较低，推测原因可能是S—TAP基因转录出的mRNA数量少，也可能是实验所使用的病毒敏感细胞与病毒原宿主细胞在翻译时不同密码子的使用频率（密码子的偏爱性）不同，导致翻译所需的tRNA数量不足。 ③转染质粒之前若受体细胞感染某重组痘苗病毒，则发出荧光的细胞数量明显增多，且荧光强度显著增强，原因可能是 。 【答案】(1) Kozak序列 Smal识别序列 终止密码子编码序列 能切除不正确掺入的单核苷酸，并将其替换成正确的核苷酸 增加模板DNA分子彻底变性的概率 (2) EcoRI和BamHI 琼脂糖凝胶电泳 T4（E.coli和T4）DNA连接酶 4948 (3)使用PCDNA3.1空载体转染细胞，其余操作相同 (4) 特定抗体 重组痘苗病毒感染细胞后，细胞中合成了能与T7特异性结合的RNA聚合酶 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）①根据构建的重组质粒图示可分析，在S基因的上游加入了Kozak序列，为了使目的基因和质粒连接，根据启动子的方向、质粒上的酶切位以及S基因内部存在XhoI序列进行分析，上游不能用XhoI酶，故应在S基因的上游加入Smal识别序列；因为S基因和TAP序列需要同步表达才能利用TAP作为S蛋白的标签，二者共用一个启动子，故应去除S基因下游的终止密码子编码序列。 ②Pyrobest DNA聚合酶具有3'到5'核酸外切酶活性，能切除不正确掺入的单核苷酸，并将其替换成正确的核苷酸，故而可防止发生突变。 ③变性是利用高温使DNA解旋，第一次循环之前，常进行预变性可增加模板DNA分子彻底变性的概率，增大PCR成功率。 （2）由图可知TAP标签上游具有EcoRI序列，下游具有BamHI，质粒上也具有EcoRI和BamHI序列，但实际上用EcoRI切割后TAP直接与目的基因下游相连接，故应插入EcoRI和BamHI之间。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。DNA连接酶可将限制酶切割后形成的末端连接，根据酶切位点分析图中SmaI形成了平末端，BamHI形成了黏性末端，故利用T4（E.coli和T4）DNA连接酶可完成质粒的环化过程。若用SmaI和BamHI酶切割质粒PCDNA3.1，切割后形成1.2kb和4.2kb两种片段，重组质粒的长度是9.7kb，说明目的基因和TAP共有9.7-4.2=5.5kb，TAP的长度是543bp，目的基因的上游引入了Smal识别序列，经切割后相当于多了3kb，目的基因与TAP在连接的时候，二者之间多了一个EcoRI序列，共6kp，故目的基因的长度是5.5kb（5500bp）-543bp-6bp-3bp=4948bp。 （3） 对照组是为了排除空质粒的影响，故应使用PCDNA3.1空载体转染细胞，其余操作相同。 （4）①TAP标签含有特定氨基酸序列，可利用抗原-抗体结合原理，利用异硫氰酸荧光素标记的特定抗体对TAP标签进行检测，从而检测融合蛋白的表达。 ②tRNA的数量与密码子的使用频率呈正相关，实验所使用的病毒敏感细胞与病毒原宿主细胞在翻译时，若不同密码子的使用频率不同，会导致翻译的tRNA数量不足，导致蛋白表达量低。 ③T7是强启动子，能与病毒RNA聚合酶特异性结合，若重组痘苗病毒感染细胞后，细胞中合成了能与T7特异性结合的RNA聚合酶，转染质粒之前若受体细胞感染某重组痘苗病毒，则发出荧光的细胞数量明显增多，且荧光强度显著增强。 31．（23-24高二下·江苏·期末）新霉素磷酸转移酶基因（neo）是转基因动物中常用的标记基因，但neo存在于动物细胞中会影响动物体生长和发育。为实现在敲除目的基因后，将neo基因从基因组中敲除，科研人员构建了基于Cre-loxP重组系统的通用型基因打靶载体，并转染小鼠受精卵获得了Flox工具鼠。图1为loxP序列的结构示意图，图2为Cre-loxP重组系统的作用机理示意图，图3为通用型基因打靶载体的构建及Flox鼠建立过程示意图。请回答下列问题：    (1)loxP位点是一段长为34bp的序列，具有方向性，结合图1，推测其方向性由区段 决定。Cre酶可同时识别2个loxP位点的a和c区段，并同时催化b区段箭头处 键水解。 (2)据图2分析，若同一个DNA分子上具有2个同向的loxP位点，经Cre酶作用后会得到一条链状DNA分子和一个环状DNA分子，从作用结果分析，Cre酶同时具有类似 酶的作用；同一个DNA分子上具有2个反向的loxP位点，Cre酶仅能导致2个loxP位点间的序列反转连接，不能产生环状DNA分子，原因是 。 (3)图3中，过程①可在限制酶和DNA连接酶等作用下，将同源臂1和同源臂2插入pAT质粒中的多克隆位点序列MCS中。作为通用型载体，pAT质粒的MCS中含有多个在基因组（待敲除基因所在DNA）中出现频率较低的酶切位点，其意义是 。 (4)两段存在同源序列（如同源臂）的DNA片段在重组酶的催化下，可发生同源重组，同源臂间的DNA序列可发生交换。为敲除特定基因，以待敲除基因两端的短小序列为依据设计引物，经PCR1和PCR2获得同源臂1和同源臂2，PCR1和PCR2不能在同一反应体系中进行的原因是 ；为将同源臂定向插入pAT的MCS中，设计引物时需要在引物的 端添加相应的限制酶切位点。 (5)过程②为重组pAT质粒转染小鼠受精卵的过程，该过程通常采用 法。过程③需将转染后的受精卵置于适宜培养液中，培养24h后，能存活的胚胎为成功转染并整合到染色体DNA上的胚胎，后续通过 等技术获得Flox小鼠。 (6)Flox小鼠中存在的neo基因，其两侧的2个LoxP位点的方向是 的，可利用Cre酶将其敲除，获得不含neo基因的基因敲除鼠。为实现在特定的时间对特定细胞中的neo基因进行敲除，可在Cre基因的cDNA一段添加 实现。 【答案】(1) b 磷酸二酯 (2) 限制酶和DNA连接 两个loxP序列方向相反 (3)使目的基因准确连接到质粒上 (4) 防止同源臂间的DNA序列发生交换 5' (5) 显微注射 胚胎移植 (6) 相反 带有loxP位点的编码终止密码子的序列 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）loxP位点是一段长为34bp的序列，具有方向性，结合图1，推测其方向性由区段b决定；Cre酶可同时识别2个loxP位点的a和c区段，并同时催化b区段箭头处磷酸二酯键水解。 （2）据图2分析，若同一个DNA分子上具有2个同向的loxP位点，经Cre酶作用后会得到一条链状DNA分子和一个环状DNA分子，从作用结果分析，Cre酶同时具有类似限制酶和DNA连接酶的作用；同一个DNA分子上具有2个反向的loxP位点，Cre酶仅能导致2个loxP位点间的序列反转连接，不能产生环状DNA分子，原因是两个loxP序列方向相反； （3）作为通用型载体，pAT质粒的MCS中含有多个在基因组（待敲除基因所在DNA）中出现频率较低的酶切位点，其意义是使目的基因准确连接到质粒上。 （4）为敲除特定基因，以待敲除基因两端的短小序列为依据设计引物，经PCR1和PCR2获得同源臂1和同源臂2，PCR1和PCR2不能在同一反应体系中进行的原因是防止同源臂间的DNA序列发生交换；为将同源臂定向插入pAT的MCS中，设计引物时需要在引物的5'端添加相应的限制酶切位点。 （5）过程②为重组pAT质粒转染小鼠受精卵的过程，该过程通常采用显微注射法；过程③需将转染后的受精卵置于适宜培养液中，培养24h后，能存活的胚胎为成功转染并整合到染色体DNA上的胚胎，后续通过胚胎移植等技术获得Flox小鼠。 （6）Flox小鼠中存在的neo基因，其两侧的2个LoxP位点的方向是相反的，可利用Cre酶将其敲除，获得不含neo基因的基因敲除鼠。为实现在特定的时间对特定细胞中的neo基因进行敲除，可在Cre基因的cDNA一段添加带有loxP位点的编码终止密码子的序列实现，Cre酶会对loxP位点进行切开，终止密码子不发挥作用来实现。 32．（23-24高二下·江苏扬州·期末）甜味蛋白具有高甜度、低热量、安全性高等优点，并且具有一定的营养价值。科研人员将甜味蛋白基因(G基因)转入普通的甜玉米细胞中，培育出了超量表达G蛋白的转基因甜玉米新品种，提高了玉米的商品价值。在超量表达G基因载体的构建中，所用DNA 片段和 Ti质粒及酶切位点如图1、2所示。    (1)图1中，强启动子是一段特殊序列的DNA片段。位于基因的 (填“上游”或“下游”或“上下游均可”)，强启动子能被 识别并驱动基因持续转录。该转录过程中模板链的5’端位于 (“M”或“N”) 端。 (2)利用T-DNA的 特性，最终使强启动子和G基因整合到玉米细胞染色体DNA上。为使DNA片段能定向插入T-DNA中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是 。构建G基因的超表达载体，还需用到DNA连接酶，其中DNA连接酶作用的底物为图3中的 (填“A”或“B”或“A和B”)。    (3)外植体经脱分化形成的愈伤组织放入农杆菌液浸泡后，进行植物组织培养时培养基中需加入 进行筛选。对获得的Y₁、Y₂、Y₃、Y₄四个玉米株系用G蛋白基因的探针作DNA分子杂交检测，结果均为阳性，但进一步对G蛋白表达量测定时，发现Y₄株系的表达量与野生型相近，原因可能是 。 (4)图4为淀粉合成酶基因片段，其转录后形成的前体RNA，需通过加工后方能用于翻译。科研人员希望通过降低淀粉合成酶基因的表达，进一步提高甜玉米中可溶性糖的含量，将吗啉反义寡核苷酸导入玉米受精卵中，发现淀粉合成酶基因表达受阻。其受阻机制可能存在两种假说。 假说1：吗啉反义寡核苷酸导致前体RNA上内含子1的对应序列不能被剪切； 假说2：吗啉反义寡核苷酸导致前体RNA上内含子1和外显子2的对应序列同时被剪切。    为验证上述假说，在受精卵发育后3天的胚细胞中，分别从实验组和对照组提取 ，逆转录形成cDNA。 ①若假说1成立，使用图示引物2和引物4进行PCR后电泳的结果为 。 A．实验组有目的条带                B．对照组有目的条带 C．实验组无目的条带                D．对照组无目的条带 ②若要证明假说2，需选择图示引物 进行PCR扩增后，进一步鉴定。 ③若某次实验电泳结果发现：实验组和对照组都没有任何条带，从PCR 操作过程角度解释可能的原因是 (至少写出两点)。 【答案】(1) 上游 RNA 聚合酶 M (2) 可转移 NotI和SacI B (3) 潮霉素 Y₄株系玉米中目的基因未表达 (4) 总 RNA A、D 3和4 退火温度太高、引物自连或互连(合理即可) 【分析】基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因、终止子和复制原点组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因等产物能显色的基因。 【详解】（1）强启动子是一段特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可以驱动基因转录。在基因表达载体构建时，G基因位于启动子的下游，转录时RNA聚合酶和启动子结合，N端是DNA链的3’端，子链延伸的方向是5’端到3’端，因此模板链的5’端位于M端。 （2）当农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上，利用T-DNA的可转移特性，最终使强启动子和G基因整合到玉米细胞染色体DNA上。构建基因表达载体时，应确保强启动子和G基因不被破坏，所以不能选用EcoRⅠ、BamHⅠ和HindⅢ切割质粒，应选用NotⅠ和SacⅠ酶切割质粒；且G基因应位于强启动子和终止子之间，为保证强启动子和G基因能与质粒正确连接，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是NotⅠ和SacⅠ酶，然后再用DNA连接酶将两者进行连接。3’端为-OH端，5’端为磷酸基团端，因此DNA连接酶作用的底物为图3中的B。 （3）由图2可知潮霉素抗性基因位于Ti质粒的T-DNA上，随T-DNA整合到玉米细胞的染色体DNA上，所以将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养后，在培养基中需加入潮霉素进行筛选。对获得的Y1、Y2、Y3、Y4四个玉米株系用G蛋白基因的探针作DNA分子杂交检测，结果均为阳性，说明目的基因已成功导入这4个玉米株系，但进一步对G蛋白表达量测定时，发现Y4株系的表达量与野生型相近，原因可能是Y4株系玉米中目的基因未表达。 （4）为验证上述假说，分别从受精卵发育后3天的实验组和对照组胚细胞中提取总RNA逆转录形成cDNA。 ①根据引物2和引物4在淀粉酶合成基因片段上的位置，通过PCR扩增能得到内含子1的序列，若假说1成立，即吗啉反义寡核苷酸导致RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切，故实验组中应含有内含子1的序列，而对照组的该片段被切除了，因此用引物2和引物4进行PCR反应，其结果为实验组中有杂交带，而对照组中无杂交带。AD正确，BC错误。 故选AD。 ②若要证明假说2成立，即RNA前体上外显子2的对应序列同时被剪切下去，则可以选择图示引物3和引物4进行PCR，观察是否有杂交带出现，如果RNA前体上外显子2的对应序列同时被剪切下去，PCR后电泳不会出现杂交带。 ③若某次实验电泳结果发现：实验组和对照组都没有任何条带，从PCR 操作过程角度解释可能的原因是复性温度太高、引物自连或互连。 / 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$