专题26 基因工程（5年汇编）（全国通用）2022-2026年高考生物真题分类汇编

专题26基因工程 答案版 一、选择题（除注明为多选题外，其它题都为单选题） 考点01基因工程的工具（共6题） 题号 1 2 3 4 5 6 答案 B BD B B D B 考点02基因工程的基本操作程序（共14题） 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 ABD D C C D D A A AC A 题号 11 12 13 14 答案 B D B B 考点03基因工程的应用与蛋白质工程（共15题） 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 答案 D C D D C B B B D A 题号 11 12 13 14 15 答案 B D B B A 二、非选择题 考点01基因工程的工具（共7题） 1．（1）复制原点；终止子；终止目的基因的转录 （2）XhoⅠ；NcoⅠ （3）b；重组表达载体总长度为5129bp,双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；DNA分子越小电泳迁移速率越快，目的基因更小，迁移更远，因此条带b对应目的基因 （4）工程菌适应环境后进入快速增殖阶段，菌体数量大量增加，合成的4αGT总量升高 2．（1） 启动子   复制原点 （2）Kpn Ⅰ、Xho Ⅰ （3）DNA聚合酶、DNA连接酶 不需要 同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始 （4）抗原-抗体杂交 3．（1）复制原点；XbaⅠ；DNA聚合酶；SmaⅠ和SpeI；550 （2）4；环化；测序和序列比对 （3）不能 4．（1）①终止子或复制原点；P1和P3；782 ②重组菌没有裂解（或没有将蛋白A释放到细胞外或转速过高使蛋白A发生沉淀或蛋白A亲水性较差发生沉淀或蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解） （2）PEG融合法（或电融合法或灭活病毒诱导法）；抗体检测 5．（1）水解苏云金杆菌细胞膜上的蛋白质，使菌体释放DNA    初步分离DNA和蛋白质 （2）PCR技术    人工合成法 （3）RNA聚合酶识别和结合位点      促进目的基因更多的转录 （4）HygBR （5）F3      R2 （6）D 6．（1）稳定性差异    选择性表达 （2）C （3）各组织器官中G和H的mRNA （4） 7．（1）RNA聚合酶  标记基因、复制原点  （2）F1、R2（或F2、R1）  a链  （3）J蛋白和V5蛋白  不是 考点02基因工程的基本操作程序（共32题） 1．（1）感受态细胞/可导入外源DNA分子的农杆菌 EcoR Ⅰ和HindⅢ （2）超净工作台/无菌实验室/灭菌的操作台 （平板）划线法/稀释涂布平板法 单菌落 腐草霉素 （3）提高发酵液中甘油的含量；缩短发酵时间 T-DNA的插入导致重组菌株发生了变异 2．（1）延伸 （2）防止目的基因或质粒自身环化、防止目的基因与质粒反向连接（使目的基因与载体定向连接，保证插入方向正确） （3）防止工程菌（或重组质粒）扩散到环境中，造成基因污染 （4）庆大霉素；pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长；蔗糖； ②；测序（或电泳检测） 3．（1）磷酸二酯  便于FP蛋白的分离纯化与检测（或便于目的蛋白的鉴定、分离纯化）  （2）FP蛋白、PD-1抗体单独使用时均具有抗肿瘤的效果，两者联合使用时疗效更显著  （3）ATP  （4）E.coli-fp   大肠杆菌为兼性厌氧生物，能适应肿瘤内部的低氧环境而存活；在缺氧条件下，大肠杆菌能通过无氧呼吸获取能量，还可利用肿瘤区域丰富的代谢产物进行增殖     基因工程改造的His标签可被抗体识别，便于重组质粒的筛选可特异性富集在肿瘤低氧区域，并大量表达FP蛋白；FP蛋白能结合并消耗肿瘤细胞的ATP，切断肿瘤细胞的能量供给，最终使肿瘤细胞因能量匮乏而凋亡，实现靶向抗肿瘤效果 4．（1）固体  （2）碱基互补配对  5′SacⅠ； （3）标记  选择 （4）①抑制CreA基因的表达对黑曲霉的生长（生物量）无显著影响；②抑制CreA基因的表达可显著提高黑曲霉的淀粉酶活力 （5）①省去高温糊化、液化步骤，节约能源，简化工艺流程，降低生产成本；②酶促反应条件温和，副产物少，产物纯度更高 5．（1）抗体   使CAR基因编码序列在星形胶质细胞中特异性表达     KpnI、BamHⅠ （2）C （3）没有携带CAR基因的等量病毒    携带CAR基因的病毒能减少阿尔茨海默病模型小鼠大脑的Aβ聚集体，减轻神经元损伤 6．（1）BclⅠ和XbaⅠ （2）3+6；2500 （3）X；4；3和9 7．（1）人工合成法（化学合成法）；T4；未插入目的基因的pPK2空质粒；A；D；染色体DNA；B  （2）工程菌的引诱能力更强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，附着的孢子量更多，孢子附着量决定蚊子死亡速度，因此致死速度更快，半数致死时间LT50缩短，第7天死亡率更高  （3）安全性 8．（1）密码子；琼脂糖；更换微量移液器的枪头 （2）C （3）冷的95%乙醇；D；调控 （4）基因数据库；表达载体 9．（1）解旋酶     高温变性 （2）引物、脱氧核苷三磷酸 （3）作为对照（或答：鉴定反应体系是否有模板污染）    P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列     目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段 （4）提取酶X，催化相应底物（反应物）的反应，检测是否有产物生成。有产物生成，则证明酶X有活性 10．（1）F2、F4     保证载体在链霉菌细胞中能正常复制 （2）2     验证重组质粒是否构建成功（验证重组质粒是否包含目的基因或验证重组载体是否构建成功或验证目的基因成功导入质粒） （3）苯丙氨酸     翻译受阻，细菌无法合成蛋白质 （4）目的基因发生突变或变异       发酵条件优化（拉索西丁的分离纯化方法、工程链霉菌的生产稳定性、链霉菌的生物安全性、优化发酵条件、优化发酵培养基配方、改变菌体活性、提高产物合成效率、改变副产物产等，答案不唯一） 11．（1）稀释涂布平板法       分离不同条件下生长的内生放线菌 （2）大量扩增      ②重组质粒上的R-U（或R-D）与内生放线菌DNA的R-U（或R-D）互换后，重组质粒整合到了内生放线菌的基因组中 （3）设置三个培养基，甲和乙为正常培养基，丙为缺铁的正常培养基，并在三个培养基上均接种等量的稻瘟病致病菌，甲和丙不作处理，乙接种适量内生放线菌，培养相同时间后观察，可以看到乙和丙中的稻瘟病致病菌的菌落直径均小于甲。 12．（1）EcoRⅠ、NotⅠ （2）便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落 （3）肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养；肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等 （4）使用PD-1抗体或PD-L1抗体；编码PD-L1序列；终止子；溶解酶基因序列；多种酶基因序列 13．（1）引物；脱氧核苷酸；复性；PCR过程需要在高温下进行，普通DNA聚合酶在高温下会变性失活 （2）SmaⅠ和EcoRⅠ；磷酸二酯 （3）发出黄色荧光；高 （4）转基因衣藻细胞表面的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻细胞的毒害作用；镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，所以转基因衣藻和野生型衣藻都受到镉离子的毒害。 （5）①；③ 14．（1）4种脱氧核苷酸     延伸 （2）5'端     AGATCT     BamHⅠ、EcoRⅠ （3）栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上     2     再分化 15．（1）序列数据库（序列比对工具）；XhoⅠ；XbaⅠ；DNA连接酶 （2）试剂；1；目的基因N大小为2.3kb （3）GCC （4）香树脂醇 16．（1）低；256；GTTT；AAAC （2）卡那霉素；SacⅠ；④ （3） 17．（1）碳源、氮源 （2）PT7、PBAD、PBAD    基因2和3表达不具有活性的产物，被蓝光激活后再启动基因1表达 （3）抑制细菌生长，从而防止杂菌污染；去除丢失质粒的菌种 （4）该处细胞中T7RNAP被激活，合成酪氨酸酶进而合成黑色素 （5）将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶 18．（1）5′端     两端包含loxP序列的终止子     两端包含loxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列     电泳 （2）清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压 （3）cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM （4）添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性 19．（1）EcoRⅠ、HindⅢ  （2）CaCl2    卡那霉素      S-F、E-R  （3）启动子      C  （4）（ⅰ）与不加NaCl相比，加入NaCl后SOD-ELP50组沉淀中的SOD-ELP50蛋白相对含量显著升高，SOD组沉淀中蛋白含量很低  （ⅱ） 高温使蛋白变性  （ⅲ） 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 20．（1）水稻胚乳细胞特异表达的基因的     终止转录     HindⅢ；EcoRⅠ （2）农杆菌转化    r2HN基因转录产生的mRNA     抗原—抗体杂交 （3）    纯合体自交后代不发生性状分离 （4）体液     细胞 （5）不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高 21．（1）只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖  菌落产生的纤维素酶的活性和量有关 （2）耐高温的DNA聚合酶 （3）基因表达载体的构建  限制酶和DNA连接酶 （4）繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等 易于吸收环境DNA （5）降解时的温度不同、降解时的pH不同 22．（1）两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 （2）EcoRⅠ和NotⅠ；AgeⅠ和HindⅢ （3）超数排卵；桑葚胚易于在小鼠子宫着床 （4）排除PCR体系中外源DNA的污染 （5）该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染 23．（1）野生型 （2）运载体     启动子和终止子 （3）①DAI基因和卡那霉素抗性基因 ②75% ③自交     100% 24．（1）模板（片段F1、片段F2）、引物     退火（复性）温度    （2）C  （3）限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶  （4）BCD  （5）P3、P4  （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 25．（1）溶解度 （2）启动子     终止子    苹果酸酶基因（或“ME基因”） （3）碱基互补配对     对照     引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME基因序列整合到硅藻细胞基因组中”） （4）增加     细胞数量 （5）有氧呼吸生成的ATP增多 （6）节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”） 26．（1）逆转录    核酸探针 （2）抗原    载体    使腺病毒失去复制能力 （3）脾    动物血清 27．（1）显微注射 （2）监测灵敏度更高 （3）② D （4）激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡 （5）避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题 28．（1）两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补配对     5'端 （2）在转录得到的mRNA序列中，EcoRⅠ识别序列的后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致翻译时核糖体读取的密码子顺序发生改变，从而使翻译出的氨基酸序列改变          在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使融合基因中FLAG基因的碱基数目加上P基因的碱基数为3的倍数，从而保证翻译时P基因转录出的mRNA也能被正确读取 （3）促进UBC与FLAG-P的结合     P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列 （4）药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的 29．（1）引物  （2）作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞        使转录终止  （3）二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长  （4）废物的资源化        不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳 30．（1）阻断或减弱消化酶的作用，导致害虫无法对外来蛋白有消化作用而发育异常或死亡 （2）基因表达载体的构建 （3）T-DNA 农杆菌转化法适用于大多数双子叶植物和裸子植物，不适用单子叶植物 （4）DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原—抗体杂交技术/写出两点即可 （5）接种实验 NaPI+StPinlA 由于导入抗虫基因后，虫子不能消化棉花的叶片，故虫体质量越重，说明转基因棉花的抗虫效果越好 （6）定向改变 DNA分子中发生碱基对的替换、增添或缺失/写出两点即可 31．（1）7 aabb 1：5 （2）①③ （3）XbaⅠ、HindⅢ （4）通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞 （5）单倍体育种、诱变育种 32．（1）单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代不会发生性状分离       秋水仙素    胚状体 （2）cDNA文库是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入菌落而成的，基因工程中只需要转录出编码蛋白质的部分就可以，筛选比较简单易行         限制酶和DNA连接酶      抗生素          愈伤组织       DNA分子杂交技术 考点03基因工程的应用与蛋白质工程（共13题） 1．（1）简并；③ （2）诱导；RNA聚合；引导S-J*融合蛋白分泌到棉花细胞外，避免在细胞核内积累导致棉花不育 （3）EcoRⅠ和KpnⅠ；EcoRⅠ和SaIⅠ；从EcoRⅠ位点插入才能保证翻译正常进行，选择其余位点均会造成错误翻译 （4）增加培养液中的溶解氧，振荡使大肠杆菌与营养物质充分接触；农杆菌转化；抑制 2．（1）更高；突变体（ub1或UbLΔ）中磷转运蛋白T降解减少，磷吸收能力增强  （2）负；取生理状态一致的玉米植株，分为：对照组（野生型玉米）、实验组1（蛋白J基因敲除突变体）、实验组2（蛋白J基因过表达突变体）。将三组植株置于4℃低温条件下培养相同时间；测定并统计三组植株的相对存活率，同时检测各组植株中蛋白J的含量。预期结果：蛋白J含量越高，植株相对存活率越低，证明蛋白J含量与耐寒性呈负相关  （3）基因与性状不是简单的一一对应的关系，基因通过控制蛋白质的结构（或功能）直接控制生物体的性状  （4）降低低温对玉米生长的抑制，提高玉米产量 3．（1）蛋白质  （2）使ABE基因仅在心肌细胞中表达，避免影响其他细胞的正常生理功能  （3）C （4）sgRNA6；只有基因位点①和②的A转换成G，导致甲硫氨酸变为缬氨酸，才能抑制CaMKⅡδ的过度活化，以sgRNA6为向导的ABE对位点①和②均有较高的编辑效率，而以sgRNA1为向导的ABE仅对位点①有较高编辑效率，对位点②编辑效率极低  （5）控制血红蛋白合成的基因发生了基因突变；造血干细胞 4．（1）基因重组  反密码子 （2）诱导型启动子 使MM-CP仅在吸血后的雌蚊中表达，雄蚊和未吸血雌蚊不表达该基因，不会影响转基因按蚊的存活；即使吸血后雌蚊存活率降低，也可在死亡前完成繁殖，保证MM-CP基因能够传递给子代 从预期改造后抗菌肽的功能（仅抑制疟原虫发育，降低对按蚊存活的影响）出发，设计抗菌肽的空间结构，推测对应的氨基酸序列，进而改造MM-CP的基因序列，获得符合要求的抗菌肽 （3）以携带MM-CP的染色体为模板完成同源修复 （4）基因驱动会快速改变按蚊种群的基因频率，进而影响种群数量和种间关系，破坏生态平衡；也会对疟原虫起到定向选择作用，使疟原虫进化出抗性，引发新的风险 5．（1）启动子 （2）竞争 （3）分泌到细胞外 （4）减少串联的cH数日 （5）一种能与葡萄糖特异性结合的蛋白(类似R蛋白的功能) 6．（1）农杆菌转化法      T-DNA      潮霉素 （2）外植体      次氯酸钠（或氯化汞）       生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素 （3）PCR检测       病斑大小（或发病率） （4）感病基因SWEET的启动子区被定点“修改”，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻 7．（1）DNA序列     COXⅣ位于线粒体内膜，它的肽链序列X能引导GFP 定位到线粒体，从而通过GFP来观察线粒体的形态变化 （2）B     B位于启动子下游与终止子上游，目的基因插入B点才可能转录 （3）外植体     染色体DNA     生长素和细胞分裂素 8．（1）细胞坏死 （2）分化；增加Bt毒蛋白基因的导入数量，使其表达足量的Bt毒蛋白 （3）结构；数量 （4）具有抗药性的棉铃虫和不抗药的棉铃虫都会被保留下来，减小了具有抗性棉铃虫的生态位，使其不会成为优势群体，从而减缓棉铃虫对转基因棉花产生抗性。 9．（1）蛋白质 （2）③ （3）②③ （4）标记基因 （5）筛选导入目的基因的大肠杆菌 10．(1)自由扩散 (2)启动L蛋白表达引起AL菌短时间内大量裂解 (3) AL     ①④     ②或③ (4)注入瘤内的ALK菌群体裂解后释放的蛋白K与蛋白C结合，且释放的细菌产物激活巨噬细胞，从而增强了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，巨噬细胞加工呈递肿瘤抗原，激活细胞免疫，肿瘤细胞被特异性杀伤，因此有效抑制对侧肿瘤生长。 11．（1）DNA的一条链    RNA聚合酶    核孔 （2）基因突变    双链RNA （3）PCSK9蛋白 （4）利于mRNA药物进入组织细胞 （5）内质网和高尔基体    抗原 （6）可激发机体的二次免疫过程，能产生更多的抗体和记忆细胞 12．（1）氨基酸序列多肽链        mRNA       密码子具有简并性，使不同mRNA翻译出来的氨基酸序列相同 （2）从基因文库中获取目的基因 通过DNA合成仪人工合成         DNA双链复制 （3）种类         对水蛭蛋白进行酶解时的酶的种类不同，导致水蛭蛋白水解产物的空间结构不同 （4）取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；取同一种动物（如家兔）血液，将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，放在适宜条件下静置一段时间，观察统计三支试管中血液凝固情况 13．（1）翻译的过程中提前遇见终止密码子    GCC    密码子具有简并性 （2）促进DML2基因的转录过程    转录的mRNA量下降     延迟 （3）将RrHH×Rrhh的番茄杂交，获得基因型为RRHh、RrHh、rrHh的F1代，然后让RRHh、RrHh 分别去自交，基因型RRHh自交，获得RRH-、RRhh，从中选出RRhh红果且成熟期晚的就是RRhh；RrHh自交后，淘汰黄果rrHh,让红果野生型单株收获的种子再单独种植，选择只有红果的野生型 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题26基因工程 考点分类 五年考情（2022-2026） 命题规律 考点01基因工程的工具（限制性内切酶、DNA连接酶、载体） 共13考：2026·湖北卷18、2025·江苏卷19、2025·江西卷11、2024·湖南卷5、2023·湖北卷4、2023·重庆卷12、2026·河南卷21、2026·山东卷25、2025·山东卷25、2025·湖南卷21、2024·黑吉辽卷25、2024·北京卷20、2023·山东卷25 · 限制酶是本考点第一高频点：它识别特定的核苷酸序列并在特定位点切开磷酸二酯键，产生黏性末端或平末端。双酶切（用两种产生不同末端的限制酶同时切割目的基因与质粒）可防止质粒和目的基因自身环化、防止目的基因反向连接，从而保证定向插入；选酶的三条硬性约束常考——不能破坏目的基因内部结构、不能破坏必需的标记基因、不能破坏启动子与终止子（除非刻意插入标记基因做插入失活筛选）；识别序列不同但切出相同黏性末端的酶（BamHⅠ与BstⅠ、BclⅠ与XbaⅠ等互为同尾酶）不能用于双酶切定向克隆；质粒被甲基化修饰会使对其敏感的限制酶无法切割。 · DNA连接酶的种类与作用是辨析题的固定陷阱：E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端（平末端连接效率明显更低）；二者催化的都是磷酸二酯键的形成，而不是氢键（氢键靠碱基互补配对自发形成）。 · 基因表达载体的必备元件几乎每年设问：目的基因、启动子（RNA聚合酶识别与结合的位点，驱动转录）、终止子（终止转录）、标记基因（供筛选）、复制原点（保证在受体细胞中自主复制）、一至多个限制酶切割位点；启动子与终止子之间有严格的方向性，目的基因必须正向插入才能正常转录和翻译；改用组织特异性启动子或诱导型启动子（如胚乳特异表达、光控、四环素诱导）可实现定时、定点表达。 · 标记基因的筛选逻辑是选择题的常客：抗生素抗性基因（AmpR、TetR、卡那霉素、潮霉素、庆大霉素抗性基因）用于筛出导入了质粒的受体细胞；β-半乳糖苷酶基因（lacZ）因插入失活可用于蓝白斑筛选；GFP、YFP 等荧光蛋白基因既作报告基因又便于定位观察。命题最常设的坑是「能在含抗生素的培养基上生长」只说明导入了质粒，既不等于导入了重组质粒（可能只是空载体），也不等于成功表达了目标蛋白——是否表达还需抗原—抗体杂交或功能活性鉴定。 考点02基因工程的基本操作程序 共46考：2026·江西卷14、2025·全国卷6、2025·安徽卷15、2025·广东卷7、2024·安徽卷14、2024·山东卷5、2024·山东卷13、2024·江西卷12、2024·湖南卷15、2024·黑吉辽卷7、2023·6月浙江卷19、2023·广东卷11、2023·辽宁卷8、2022·辽宁卷12、2026·1月浙江卷25、2026·云南卷21、2026·四川卷19、2026·河北卷22、2026·湖南卷17、2026·贵州卷21、2026·黑吉辽蒙卷25、2025·1月浙江卷25、2025·全国卷7、2025·四川卷19、2025·安徽卷20、2025·广西卷21、2025·河北卷22、2025·青海卷21、2025·黑吉辽蒙卷25、2024·山东卷25、2024·广东卷21、2024·广西卷21、2024·江苏卷23、2024·河北卷22、2024·甘肃卷21、2024·福建卷18、2023·广东卷20、2023·江苏卷23、2023·河北卷23、2022·1月浙江卷31、2022·北京卷19、2022·山东卷25、2022·广东卷22、2022·河北卷20、2022·湖北卷22、2022·重庆卷26 · 目的基因的获取有四条路径，各有适用条件：PCR 扩增（引物分别与两条模板链 3' 端碱基序列互补、子链延伸方向为 5'→3'，引物的 5' 端可添加限制酶识别序列以便后续酶切连接，必须使用耐高温的 DNA 聚合酶）、逆转录（以 mRNA 为模板获得不含内含子的 cDNA）、从基因组文库或 cDNA 文库中获取（cDNA 文库筛选更简便）、依据氨基酸序列和密码子简并性人工合成；设计引物前通常需要从序列数据库（GenBank）查询并用 BLAST 比对。 · 导入方法必须与受体细胞匹配，这是送分也是失分点：导入植物细胞常用农杆菌转化法（Ti 质粒上的 T-DNA 可转移并整合到受体细胞的染色体 DNA 上，主要适用于双子叶植物和裸子植物），另有基因枪法与花粉管通道法；导入动物细胞最有效的是显微注射法（通常注入受精卵）；导入微生物细胞用感受态细胞法（Ca²⁺ 或 CaCl₂ 处理使细胞处于易于吸收周围 DNA 的感受态）。 · 检测与鉴定是本考点设问最多的一环：分子水平可用琼脂糖凝胶电泳判断 DNA 片段大小（片段越小迁移速率越快）、DNA 分子杂交或核酸探针检测目的基因是否导入、PCR 检测（常需设置空白对照以排除体系污染）、测序确定碱基序列是否正确；个体生物学水平则要用抗原—抗体杂交检测目标蛋白是否表达，并进一步做功能活性鉴定（催化底物产生产物、抗虫接种实验、统计病斑大小或死亡率先后的比较）。 · 基因表达载体的构建被公认为基因工程的核心步骤：除目的基因外必须装配好启动子、终止子、标记基因和复制原点；不同生物对密码子的偏好不同，可在不改变氨基酸序列的前提下重编编码序列（利用密码子简并性）以提高翻译效率；融合标签（His 标签、V5 短肽、GFP、ELP 等）便于目标蛋白的分离纯化与检测；实验误差类设问则集中于 PCR 体系被外源 DNA 污染、引物过短导致特异性降低、引物间的载体序列被一并整合进基因组等。 考点03基因工程的应用与蛋白质工程 共28考：2026·1月浙江卷10、2026·云南卷16、2026·江西卷2、2026·河南卷13、2026·湖北卷12、2026·湖南卷7、2026·安徽卷12、2026·北京卷13、2025·6月浙江卷3、2025·四川卷7、2025·湖北卷14、2023·1月浙江卷2、2023·海南卷2、2022·江苏卷6、2022·重庆卷3、2026·山陕青宁卷21、2026·湖北卷21、2026·湖北卷22、2026·广东卷20、2026·北京卷20、2025·甘肃卷21、2025·贵州卷18、2024·湖北卷20、2023·辽宁卷23、2022·北京卷18、2022·江苏卷21、2022·湖南卷22、2022·重庆卷23 · 蛋白质工程的流程是必考骨架：从预期蛋白质功能出发 → 设计蛋白质结构 → 推测应有的氨基酸序列 → 找到并改造（或人工合成）对应的脱氧核苷酸序列 → 再通过基因工程表达出目标蛋白。它被称为第二代基因工程，与基因工程的根本区别在于能创造自然界原本不存在的蛋白质；关键落点是「改造的是基因而不是直接拼接肽链」。 · 定向改造与基因编辑是近年命题热点：CRISPR-Cas9 由向导 RNA 引导核酸酶定点切割目的序列；碱基编辑器（如 ABE）可实现 A→G 的精确转换；基因敲除时缺失的碱基数若不是 3 的倍数会造成移码、提前出现终止密码子；基因敲入依赖同源修复。设问常落在 sgRNA 的编辑效率与脱靶风险、用组织特异性启动子限定编辑范围（如仅在心肌细胞表达）以减少对其他细胞的影响。 · 应用情境覆盖面极广，且常与免疫、代谢、农业交叉命题：转基因作物（Bt 抗虫棉、抗除草剂作物、抗白叶枯病水稻）、生物反应器（水稻胚乳表达疫苗、乳腺生物反应器）与口服疫苗、工程菌（益生菌表达肿瘤新抗原、靶向低氧肿瘤区的工程大肠杆菌）、基因治疗与 RNA 药物（siRNA 干扰、mRNA 疫苗）、DNA 信息存储等；设问多为「该设计的意图」「有何优势」「如何验证效果」「对照组如何设置」。 · 安全性与伦理是选择题的固定得分点：我国政府对生殖性克隆人的态度是不赞成、不允许、不支持、不接受，而治疗性克隆需要在有效监控和严格审查下实施；转基因技术并非一律禁止，而是要在严格监管下合理应用；生物武器的研发和使用被国际公约明令禁止；此外，转基因生物一旦逃逸可能造成基因污染，故工程菌与转基因生物常需配套防扩散设计（如敲除复制基因、设置诱导型裂解开关）。 一、选择题（除注明为多选题外，其它题都为单选题） 考点01基因工程的工具（共6题） 1．【2026·湖北卷18·高考真题】为了研究大肠杆菌中蛋白A的结构与功能，通过设计特异性引物F1、F2，用PCR技术从大肠杆菌DNA中扩增基因A，再用质粒P构建表达载体。基因A和质粒P的部分酶切图谱如图所示。 下列叙述正确的是（　　） A. F1、F2的5′-端分别含有HindⅢ、XhoⅠ酶切位点 B. F1、F2的5′-端分别含有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点 C. F1、F2的5′-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点 D. F1、F2的5′-端分别含有PvuⅠ、ScaⅠ酶切位点 【答案】B 【解析】解：A、XhoⅠ酶会破坏基因A内部结构，因此不能选用XhoⅠ酶来切割目的基因和质粒，而且F1的5'端含HindⅢ酶切位点、F2的5'端含XhoⅠ的酶切位点，会导致目的基因插入方向反转，A错误；  B、F1的5'端若含HindⅢ酶切位点、F2的5'端含XbaⅠ酶的酶切位点，会导致目的基因插入方向正确，且匹配基因A两端的位置，B正确；  C、F1的5'端含AccⅠ酶的酶切位点、F2的5'端含HindⅢ酶的酶切位点，不能保证目的基因按正确转录方向插入质粒启动子下游，C错误；  D、标记基因含有PvuⅠ和ScaⅠ酶的识别序列，若F1的5'端含PvuⅠ酶切位点、F2的5'端含 ScaⅠ酶的酶切位点，用这两个酶酶切的话，会破坏标记基因，且无法实现目的基因的定向插入，D错误。  故选：B。 由图示信息可知，XhoⅠ酶会破坏基因A内部结构，因此不能选用XhoⅠ酶来切割目的基因和质粒，为了保证目的基因的正向连接，引物F1和F2上应该含有相应限制酶的识别序列，目的基因需插入启动子的下游，图示质粒P有两个启动子，转录方向相反，复制原点左侧的启动子会转录标记基因，而且标记基因含有ScaⅠ酶和PvuⅠ酶的酶切位点，为了保证标记基因的完整性，不能选择ScaⅠ酶和PvuⅠ酶来切割质粒和目的基因，因此目的基因应插入复制原点右侧启动子的下游，此时只有HindⅢ酶、XbaⅠ酶和AccⅠ酶可供选择。根据质粒P的复制原点右侧启动子的转录方向可知，目的基因插入质粒后，其转录方向应该是从左往右进行，而图示基因A的转录方向是从右往左，因此为了保证正向连接目的基因，F1的5'端不能含HindⅢ酶酶切位点，F2的5'端不能含AccⅠ酶的酶切位点，因此F1的5'端含AccⅠ酶或XbaⅠ酶的酶切位点、F2的5'端含HindⅢ酶或XbaⅠ酶的酶切位点，能保证目的基因按正确转录方向插入质粒启动子下游。 本题考查了基因工程的相关知识，需要学生掌握限制酶的选择原则及规律，结合题图信息答题。 2．【2025·江苏卷19·高考真题】（多选题）如图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（　　） A. 基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B. 用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C. 用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D. 产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 【答案】BD 【解析】解：A、对比A基因和a基因的序列，A基因中“AAGCTT”变为a基因中“AAGCTG”，发生了碱基的替换（T→G），A错误； B、HindⅢ切割产生黏性末端，AluⅠ切割后产生的是平末端，二者末端类型不相同，B正确； C、观察图中a基因，HindⅢ有2个切割位点，切割后会产生3个片段，AluⅠ有3个切割位点，切割后会产生4个片段，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致，C错误； D、因为正常基因A和致病基因a的HindⅢ切割位点不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定，D正确。 故选：BD。 “分子手术刀”——限制酶：（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式，即黏性末端和平末端。 本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。 3．【2025·江西卷11·高考真题】为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒（如图），通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是（　　） A. 水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子 B. 在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达 C. 农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素 D. 愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株 【答案】B 【解析】解：A、只有D基因上游的U6启动子被水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别，将T-DNA整合到水稻愈伤组织的染色体DNA后，水稻植株才能表现出抗病性状，A错误； B、上述重组Ti质粒中的U6启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游，因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达，B正确； C、愈伤组织多指将植物体的某一组织、器官置于特定培养基中培养，诱导产生的无定形的组织团块，当农杆菌侵染愈伤组织后，T-DNA整合到水稻细胞染色体的DNA中，通常情况下，若D基因能表达，那么T-DNA上的潮霉素抗性基因也能表达，从而使得导入T-DNA的水稻愈伤组织具有潮霉素抗性基因；卡那霉素抗性基因不位于T-DNA上，不会发生上述生理过程。因此，在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入潮霉素，C错误； D、检测是否成功获得转基因品种一般需要经历两个阶段，首先是分子水平的检测，包括检测目的基因是否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的基因是否转录出mRNA或最终表达出蛋白质，其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。因此愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗不一定是抗病植株，D错误。 故选：B。 基因工程的基本操作程序： 第一步：目的基因的获取 1、目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2、原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。 3、PCR技术扩增目的基因。 第二步：基因表达载体的构建 1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2、组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来．常用的标记基因是抗生素抗性基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞 1、转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2、常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术．此方法的受体细胞多是受精卵。 将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 3、重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。 第四步：目的基因的检测和表达 1、首先要检测转基因生物的染色体 DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。 2、其次还要检测目的基因是否转录出了 mRNA，方法是采用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。 3、最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。 4、有时还需进行个体生物学水平的鉴定．如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。 本题考查了基因工程的相关知识，需要学生掌握基因工程的基本操作过程。 4．【2024·湖南卷5·高考真题】某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A. 限制酶失活，更换新的限制酶 B. 酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C. 质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D. 酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 【答案】B 【解析】解：A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确； B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，此时应有部分DNA被酶切，B错误； C、质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确； D、质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 故选：B。 1、酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数是蛋白质，少部分是RNA。 2、限制酶特异性识别并切割DNA上的特定位点。 本题主要考查基因工程中限制酶的相关知识，学生要掌握限制酶的作用特点，正确分析选项进行解答，本题难度适中。 5．【2023·湖北卷4·高考真题】用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　） A. 若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B. 若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C. 若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D. 若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 【答案】D 【解析】解：A、若只用HindⅢ一种酶切质粒和目的基因，则产生相同的黏性末端，可能导致目的基因正向连接或反向连接，故目的基因转录的产物可能不同，A正确； B、若用PvuⅠ酶切，则会破坏氨苄青霉素抗性基因（AmpR），而重组质粒和空质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确； C、若用SphⅠ酶切，则目的基因插入到四环素抗性基因（TetR）中，重组质粒的大小与空质粒不同，故可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确； D、若用SphⅠ酶切，则会破坏四环素抗性基因（TetR），氨苄青霉素抗性基因（AmpR）不受影响，则重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 故选：D。 据图分析可知，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有ScaⅠ和PvuⅠ的酶切位点，四环素抗性基因（TetR）内含有HindⅢ、SphⅠ和SalⅠ的酶切位点。 本题考查基因表达载体的构建过程中限制酶的选择原则等知识，意在考查考生对知识的理解和应用能力。 6．【2023·重庆卷12·高考真题】某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基且短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（如图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（　　）  A. 其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3' B. 步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ C. 用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D. 酶切片段和载体连接时，可使用E.coli连接酶或T4连接酶 【答案】B 【解析】解：A、由于引物只能引导子链从5'到3'，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5'TGCGCAGT-3'，A正确；  B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI切割形成的，B错误；  C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI和CfoI进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确；  D、图中形成的是黏性末端，而E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，D正确。  故选：B。 E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。 本题主要考查的是DNA片段的扩增与电泳鉴定的相关知识，意在考查学生对基础知识的理解掌握，难度适中。 考点02基因工程的基本操作程序（共14题） 1．【2026·江西卷14·高考真题】（多选题）研究人员按图示流程制备T基因编码的耐高温DNA聚合酶T。下列关于该流程的叙述，错误的是（　　） A. 需在72℃条件下培养基因工程菌 B. 添加高浓度的诱导物可获得高产量的T C. 可根据电泳结果初步评价T的纯度 D. 可根据PCR产物的多少计算T的活性 【答案】ABD 【解析】解：A、72℃是耐高温DNA聚合酶在PCR体外扩增过程中的最佳活性温度，用于催化子链DNA的合成。而图示耐高温的DNA聚合酶在大肠杆菌体内制备，普通大肠杆菌会因高温死亡或严重受损，A错误； B、诱导物浓度过高会抑制细胞生长或引发应激反应，不利于T的生成，B错误； C、可根据电泳时凝胶上显示的条带数量与强度，来评价T的纯度，目的条带单一、杂带少代表纯度高，杂带多说明杂蛋白多，C正确； D、酶活性是指单位时间内生成的产物的量，不能仅仅依赖产物的多少来界定T的活性，D错误。 故选：ABD。 1、PCR过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 2、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 本题考查了PCR以及凝胶电泳的相关知识，需要学生掌握耐高温的DNA聚合酶的作用以及凝胶电泳的原理，结合题干信息答题。 2．【2025·全国卷6·高考真题】琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（　　） A. 配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液 B. 该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷 C. 甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同 D. 据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物 【答案】D 【解析】解：A、在进行琼脂糖凝胶电泳时，需要使用合适的缓冲液来维持稳定的pH等实验条件，这有助于DNA分子在电场中的稳定迁移，A正确； B、在电泳过程中，DNA分子会向阳极移动，说明在实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷，因为带负电荷的分子在电场中会向正电极（阳极）移动，B正确； C、不同的DNA分子的长度（所含碱基对的数量）可能不同，从电泳结果中不同DNA分子的迁移速率不同可以推测，甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同，C正确； D、DNA分子量越大，在进行琼脂糖凝胶电泳时，迁移速度就越慢，样品3的两个条带的DNA分子量均大于甲，不可能是甲被酶R完全酶切后的产物，D错误。 故选：D。 1、PCR技术反应的条件：①稳定的缓冲溶液环境；②DNA模板；③合成引物；④四种脱氧核苷酸；⑤DNA聚合酶；⑥温控设备。 2、PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。 3、TaqDNA聚合酶的特点是：耐高温。 4、PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 本题考查琼脂糖凝胶电泳技术的相关内容，要求学生能运用所学的知识正确作答。 3．【2025·安徽卷15·高考真题】质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal,产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体。采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（　　） A. 使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B. 如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C. 因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D. 若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 【答案】C 【解析】解：A、使用氯化钙处理大肠杆菌可使大肠杆菌处于易于吸收周围DNA分子的感受态，提高转化效率，更多质粒K进入大肠杆菌，可增加筛选平板上蓝色菌落数，A正确； B、如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落是含有质粒的菌株，但不一定含有目的基因，B正确； C、因质粒K中含两个标记基因，目的基因的插入破坏了β-半乳糖苷酶基因，使其无法表达β-半乳糖苷酶，筛选平板中长出的白色菌落即为导入了重组质粒的菌株，但是否表达目标蛋白，还需要用抗原-抗体杂交技术检测，C错误； D、若筛选平板中蓝色菌落偏多，说明质粒上的β-半乳糖苷酶基因仍然保持完整并且成功表达出β-半乳糖苷酶，可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，D正确。 故选：C。 基因表达载体要包含启动子、终止子、标记基因、目的基因和复制原点。标记基因的作用是便于筛选重组DNA。 本题主要考查基因表达载体的构建，考查考生对标记基因、双标记法的理解能力及分析、解决问题的能力。 4．【2025·广东卷7·高考真题】Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（　　） A. 1′-碱基 B. 2′-氢 C. 3′-羟基 D. 5′-磷酸基团 【答案】C 【解析】解：A、1′-碱基主要参与碱基互补配对等过程，保护1′-碱基并不能阻止DNA的继续延伸，A错误； BC、DNA聚合酶催化形成磷酸二酯键从而使DNA链延伸，若保护底物中脱氧核糖结构上的3'-羟基，就无法形成新的磷酸二酯键，DNA就不能继续延伸，保护底物中脱氧核糖2′-氢并不能阻止DNA的继续延伸，B错误，C正确； D、5'-磷酸基团是参与形成磷酸二酯键的重要部分，但是DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸和DNA模板链的3′-羟基端完成聚合反应形成新的磷酸二酯键，保护5'-磷酸基团不会阻止延伸，D错误。 故选：C。 DNA分子复制的过程： ①解旋：在解旋酶的作用下，把两条螺旋的双链解开。 ②合成子链：以解开的每一条母链为模板，以游离的四种脱氧核苷酸为原料，遵循碱基互补配对原则，在有关酶的作用下，各自合成与母链互补的子链。 ③形成子代DNA：每条子链与其对应的母链盘旋成双螺旋结构．从而形成2个与亲代DNA完全相同的子代DNA分子。 本题考查了DNA复制相关的内容，考查考生的理解和判断能力，难度适中。 5．【2024·安徽卷14·高考真题】下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（      ） A. 实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B. 利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C. DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D. 将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 【答案】D 【解析】A、研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确； B、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确； C、DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。 故选D。 6．【2024·山东卷5·高考真题】制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ① 5′-GCCGATCTTTATA-3′ 3′-GACCGGCTAGAAA-5′ ② 5′-AGAGCCAATTGGC-3′ ③ 5′-ATTTCCCGATCCG-3′ 3′-AGGGCTAGGCATA-5′ ④ 5′-TTCACTGGCCAGT-3′ A. ①② B. ②③ C. ①④ D. ③④ 【答案】D 【解析】解：ABCD、分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有：③④。 故选：D。 多聚酶链式反应扩增DNA片段： 1、PCR原理：目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3'端，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即呈指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。 2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 3、结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。 本题考查PCR的相关知识，意在考查考生的理解能力、获取信息的能力和综合运用能力，进一步考查生命观念和科学思维。 7．【2024·山东卷13·高考真题】关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A. 整个提取过程中可以不使用离心机 B. 研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C. 鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D. 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 【答案】A 【解析】解：A、研磨后，可以用过滤的方法得到上清液，可以不使用离心机，A正确； B、研磨液在4℃冰箱中放置的目的是为了获得上清液，不应再充分摇匀，B错误； C、鉴定过程中的沸水浴加热可能使DNA双螺旋结构发生改变，C错误； D、该实验中，为排除二苯胺加热后可能变蓝对实验结果的干扰，设置加二苯胺不加DNA一个对照组即可，D错误。 故选：A。 DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；② DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；③在沸水浴的条件下 DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 本题考查“DNA的粗提取和鉴定”的相关知识，意在考查考生的理解能力和实验与探究能力，进一步考查生命观念、科学思维和科学探究等核心素养。 8．【2024·江西卷12·高考真题】γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E.coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是（　　） ​ A. 上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B. E.coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C. E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸 D. 可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 【答案】A 【解析】解：A、根据图示可知，运用PCR技术可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，A正确； B、L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸，E.coliB中表达L-谷氨酸脱羧酶（GadB），从而发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠是反应原料，而非起供能作用，B错误； C、题干中E.coliA和E.coliB均为产生γ-氨基丁酸的菌种，而不是高效降解γ-氨基丁酸的菌种，C错误； D、根据图示，利用NcoⅠ和KpnⅠ对质粒和目的基因进行双酶切，从而构建重组质粒，不一定可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒（视质粒和目的基因所在DNA分子中酶切位点的情况而定），D错误。 故选：A。 基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR检测等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR检测等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 本题考查基因工程的相关知识，要求考生理解识记有关技术的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能将教材中的知识结合题中信息进行迁移应用。 9．【2024·湖南卷15·高考真题】（多选题）最早的双脱氧测序法可在PCR反应体系中进行，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　）  A. 上述PCR反应体系中只加入一种引物 B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C. 5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列 D. 患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 【答案】AC 【解析】解：A、利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确；  B、电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误；  C、依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，C正确；  D、对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。  故选：AC。 1、PCR技术：  （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。  （2）原理：DNA复制。  （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。  （4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）。  （5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。  2、双脱氧测序法的原理：在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸（dNTP）存在的情况下，如果在四管反应系统中再分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），DNA链合成反应过程中ddNTP与dNTP处于一种竞争状态，即新合成DNA链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP并使新合成链终止延伸。这样在每个反应系统中形成的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物的5'端，但有不同的ddNTP终端。在结束反应后，用四个泳道进行电泳，分别分离各组反应体系中不同长度的DNA片段，检测DNA片段终止末端位置的碱基种类，从自显影图谱中直接读取到与模板相匹配的新的链序。 本题考查学生从题中获取DNA片段的电泳检测结果的信息，并结合所学PCR的知识做出正确判断，属于理解层次的内容，难度适中。 10．【2024·黑吉辽卷7·高考真题】关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（　　） A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 【答案】A 【解析】解：A、在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小，A正确； B、凝胶载样缓冲液中指示剂可起标记的作用，是指示DNA分子对应长度所出现位置，B错误； C、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，通常DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误； D、凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 故选：A。 PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA双链复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、ATP、一对引物、耐高温的DNA聚合酶。（5）过程：高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链。 本题考查了PCR技术的相关知识，意在考查考生理解所学知识要点，把握知识间内在联系的能力；能运用所学知识，对生物学问题作出准确的判断，难度适中。 11．【2023·6月浙江卷19·高考真题】某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示： ​​​​​​​ ​​​​​​​下列叙述正确的是（　　） A. Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B. 翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C. 2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D. 若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 【答案】B 【解析】【分析】 本题考查PCR扩增和基因表达相关的知识点，考查学生理解知识和正确识图的能力，题目较难。 【解答】 A.分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误； B.因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确； C.整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误； D.用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，不能更好地区分杂合子和纯合子，D错误。 故选B。 12．【2023·广东卷11·高考真题】“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（　　） A. 裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B. 分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C. 沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D. 鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 【答案】D 【解析】解：A、细胞吸水涨破，释放DNA等物质，A正确； B、DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，DNA在2mol/L的氯化钠中溶解度最高，依此原理可分离出其他杂质，B正确； C、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，反复多次可提纯DNA，C正确； D、加入二苯胺后，还需沸水浴处理才能出现蓝色，D错误。 故选：D。 DNA粗提取和鉴定的原理： 1、DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14mol/L的氯化钠中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。 2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。 3、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 本题主要考查DNA的粗提取与鉴定，要求学生有一定的理解分析能力，能够结合题干信息和所学知识进行分析应用。 13．【2023·辽宁卷8·高考真题】CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（       ） A. CD163基因中编码起始密码子的序列 B. CD163基因中编码终止密码子的序列 C. RFP基因中编码起始密码子的序列 D. RFP基因中编码终止密码子的序列 【答案】B 【解析】为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都需要被转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，ACD不符合题意。 故选B。 14．【2022·辽宁卷12·高考真题】抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（） A. 预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制 B. 后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分 C. 延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制 D. 转基因品种经检测含有目的基因后即可上市 【答案】B 【解析】【分析】 PCR过程为：①变性，当温度上升到90℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链；②复性，当温度降低到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸，温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在Taq酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【解答】 A、预变性是使引物完全变性解开，A错误； B、后延伸过程是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，B正确； C、延伸过程需要引物的参与，C错误； D、转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测是否表达，是否有安全性问题，D错误； 故选B。 考点03基因工程的应用与蛋白质工程（共15题） 1．【2026·1月浙江卷10·高考真题】利用转基因技术将口蹄疫病毒衣壳蛋白P1的基因导入水稻愈伤组织，获得了多个稳定表达P1的转基因水稻株系。转基因水稻的P1激活小鼠免疫反应的能力与大肠杆菌生产的P1相当，且给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应。下列叙述正确的是（） A. 将愈伤组织进行脱分化和再分化，获得转基因水稻植株 B. 不同株系转基因水稻P1蛋白的基因表达水平相同 C. 转基因水稻与大肠杆菌生产的P1蛋白分子量相等 D. 转基因水稻P1蛋白具备制成口服疫苗的潜力 【答案】D 【解析】A、水稻愈伤组织是已经完成脱分化的产物，要获得转基因水稻植株，只需对愈伤组织进行再分化（不需要再次脱分化）。植物组织培养的流程是：外植体→脱分化→愈伤组织→再分化→完整植株，A错误； B、转基因过程中，外源基因（P1基因）插入水稻染色体的位置是随机的（位置效应），不同株系的基因表达水平通常存在差异，B错误； C、水稻是真核生物，其细胞内的内质网和高尔基体可对表达的P1蛋白进行糖基化等修饰；而大肠杆菌是原核生物，缺乏这些细胞器，无法对蛋白质进行类似修饰。因此两者生产的P1蛋白分子量可能不同，C错误； D、题目明确指出“给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应”，说明口服P1蛋白可被小鼠免疫系统识别并引发免疫应答，具备制成口服疫苗的潜力，D正确。 故选D。 2．【2026·云南卷16·高考真题】内含肽（Int）可通过自我催化实现自我切除并无痕连接两侧肽链。构建编码“内含肽+X蛋白”和“内含肽+Y蛋白”的基因，将其导入真核细胞表达后，内含肽自我切除生成X+Y融合蛋白，如图。 下列说法正确的是（　　） A. 构建X+Y融合蛋白基因导入细胞，会因碱基序列相互影响而使蛋白功能异常 B. 内含肽序列需嵌入X蛋白的功能结构内，以保证获得的融合蛋白功能正常 C. 不同内含肽之间通过能匹配的结构相互识别，发挥特异性切除和连接作用 D. 为X+Y融合蛋白提供“内含肽+某蛋白”，可赋予X+Y融合蛋白新的结构 【答案】C 【解析】解：A、根据题意，构建编码“内含肽+X蛋白”和“内含肽+Y蛋白”的基因，将其导入真核细胞表达后，内含肽自我切除生成X+Y融合蛋白，即X+Y融合蛋白由两个独立基因表达后经自我切除并无痕连接两侧肽链形成，非直接构建融合基因，故不存在碱基序列相互影响问题，A错误； B、由图可知，内含肽序列并未嵌入X蛋白的功能结构内，而是在X蛋白的功能结构外侧，这样才能保证X蛋白功能结构的完整，最终融合蛋白功能正常，B错误； C、由图可知，图中内含肽的IntAN与IntAC、IntBC与IntBN通过能匹配的结构相互识别，进而发挥特异性切除和连接作用，C正确； D、由图可知，内含肽在反应后被完全切除，得到的X+Y融合蛋白不含内含肽结合部位，所以再为X+Y融合蛋白提供“内含肽+某蛋白”，也不能实现自我切除并无痕连接两侧肽链，不能赋予X+Y融合蛋白新的结构，D错误。 故选：C。 内含肽的IntAN与IntAC、IntBC与IntBN通过能匹配的结构相互识别，经自我切除并无痕连接两侧肽链形成X+Y融合蛋白。 本题主要考查基因工程的相关知识，学生需结合所学知识分析题图并解答。 3．【2026·江西卷2·高考真题】蛋白酶E被广泛用作洗涤剂的生产原料，但洗涤剂中的物质S能将E的第n位甲硫氨酸氧化，降低其活性。研究人员将上述甲硫氨酸替换为丝氨酸，提高了E对S的耐受性。下列叙述错误的是（　　） A. 第n位甲硫氨酸的氧化会影响E的空间结构，从而影响酶的活性 B. 将第n位的甲硫氨酸替换为丝氨酸可通过基因工程实现 C. 判断E的改造效果，需用S处理一段时间后测定酶活性 D. 甲硫氨酸的替换在提高E对S耐受性的同时，降低了E的专一性 【答案】D 【解析】解：A、蛋白质的功能由氨基酸的种类、数目、排列顺序和其空间结构决定，如果第n位甲硫氨酸的氧化会影响E的空间结构，从而影响酶的活性，A正确； B、将第n位的甲硫氨酸替换为丝氨酸，这属于蛋白质工程，蛋白质工程是第二代基因工程，所以将第n位的甲硫氨酸替换为丝氨酸可通过基因工程实现，B正确； C、将甲硫氨酸替换为丝氨酸，提高E对S的耐受性，所以判断E的改造效果，需用S处理一段时间后测定酶活性，C正确； D、甲硫氨酸的替换在提高E对S耐受性，从题干中没有看出降低了其专一性，D错误。 故选：D。 蛋白质工程是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表达性状，合成新的蛋白质，蛋白质工程从属于基因工程，蛋白质工程是第二代基因工程。 本题考查蛋白质工程相关知识，意在考查对蛋白质工程原理及工程菌应用的理解能力。 4．【2026·河南卷13·高考真题】胰蛋白酶可水解精氨酸与下一位氨基酸（脯氨酸除外）之间的肽键。抗体甲的第27、96位均为精氨酸。通过蛋白质工程将第27位替换为苯丙氨酸，第97位替换为脯氨酸。改造后的甲不被胰蛋白酶水解，并保持抗体活性。下列叙述错误的是（　　） A. 甲的设计改造需要遵循遗传信息传递的一般规律 B. 胰蛋白酶不能水解改造后的甲，体现了酶的专一性 C. 第96位氨基酸未被替换的原因可能是该位点与抗体功能相关 D. 由于密码子的简并性，改造后编码甲的基因序列不一定改变 【答案】D 【解析】解：A、甲的设计改造需要遵循遗传信息传递的一般规律：蛋白质工程改造基因，基因表达遵循中心法则（DNA→RNA→蛋白质），A正确； B、酶的专一性指酶只能催化一种或一类化学反应，胰蛋白酶仅能识别特定序列的肽键，改造后的甲无其可作用的位点因此不能被水解，体现了酶的专一性，B正确； C、改造后甲仍保持抗体活性，第96位精氨酸未被替换，推测该位点可能与抗体的功能密切相关，替换后可能导致抗体活性丧失，C正确； D、密码子简并性是指同一种氨基酸可对应多种密码子，但本次改造中第27位、97位的氨基酸种类发生了改变，不同氨基酸对应的密码子存在差异，因此改造后编码甲的基因序列一定发生改变，D错误。 故选：D。 1、蛋白质工程核心逻辑：蛋白质工程是先改蛋白质功能，反向改造基因，基因表达仍遵循中心法则（遗传信息传递规律）；直接改造蛋白质不能遗传，必须改造基因。 2、密码子的简并性：同一种氨基酸可对应多种密码子，仅氨基酸不变时，基因可能不变；若氨基酸种类发生改变，对应的密码子一定不同，基因碱基序列必然改变。 本试题把酶特性、蛋白质工程、分子遗传知识点串联，综合性强，同时渗透“结构决定功能”核心生物学思想。考查了蛋白质工程知识、酶专一性知识、氨基酸与基因的对应关系知识及蛋白质结构与功能统一观。 5．【2026·湖北卷12·高考真题】将患者肿瘤细胞特有的新抗原基因导入益生菌中获得的工程菌可在患者肠道内表达新抗原，从而激活患者的特异性免疫，精准杀伤肿瘤细胞，实现个性化的癌症免疫治疗。下列叙述错误的是（　　） A. 选用益生菌的原因是其对人体具有天然的安全性 B. 为实现个性化癌症免疫治疗，需针对患者筛选特定肿瘤新抗原 C. 工程菌可在体内长期存活，以维持工程菌对肿瘤的持续免疫监视 D. 树突状细胞将肿瘤新抗原加工后呈递给辅助性T细胞，激活特异性免疫 【答案】C 【解析】解：A、益生菌本身就是人体肠道固有有益微生物，对人体无毒无害，具备天然安全性，适合作为外源基因表达载体导入人体肠道使用，A正确； B、题干说明新抗原是患者肿瘤细胞特有，想要实现个性化癌症免疫治疗，就必须单独针对该患者筛选对应的特异性肿瘤新抗原，制备专属工程菌，B正确； C、工程菌属于外来微生物，进入人体后会被机体免疫细胞识别并逐步清除，无法在体内长期存活；且免疫监视是机体自身免疫系统的功能，并非工程菌直接执行对肿瘤的免疫监视，C错误； D、树突状细胞属于抗原呈递细胞，能够摄取工程菌表达的肿瘤新抗原，完成加工处理后将抗原呈递至辅助性T细胞表面，进而启动后续细胞免疫、体液免疫，激活整体特异性免疫应答，D正确。 故选：C。 免疫系统的三大基本功能是免疫防御、免疫自稳和免疫监视。其中，免疫监视是指机体识别和清除突变的细胞，防止肿瘤发生的功能。抗原呈递细胞能摄取和加工处理抗原，并且可以将抗原信息暴露在细胞表面，以便呈递给其他免疫细胞。 本题以前沿的个性化癌症免疫治疗为背景，巧妙融合了基因工程应用与免疫系统功能等核心知识，重点考查了学生对肿瘤新抗原特性、抗原呈递机制以及免疫监视概念的理解。 6．【2026·湖南卷7·高考真题】将物种A的启动子与物种B的生长激素基因编码序列重组，导入到鲤鱼受精卵，获得多条转基因鱼。与对照组相比，转基因鱼生长速率加快。下列叙述错误的是（　　） A. 来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合并表达 B. 不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平相同 C. 外源基因整合到染色体DNA上是其在受体细胞中稳定遗传的关键 D. 调控启动子活性可验证转基因鱼的生长速率与生长激素基因表达水平的关系 【答案】B 【解析】解：A、依题意，通过将物种A的启动子与物种B的生长激素基因编码序列重组形成的转基因鱼生长比对照组快，说明来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合并表达，A正确； B、分析题意可知，实验结果未提供不同转基因鱼间的生长状况的信息，无法得知不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达情况。外源基因随机整合到鲤鱼染色体不同位置，受染色体位置效应、拷贝数差异影响，不同转基因鱼体内重组基因转录翻译强度不同，表达水平存在差异，B错误； C、若外源基因游离在细胞质中，细胞分裂时易丢失。外源基因整合到染色体 DNA 上，可随染色体同步复制、分配，实现稳定遗传，C正确； D、启动子是RNA聚合酶结合位点，决定基因转录强弱。人为调控启动子活性，改变生长激素表达量，对比各组生长速度，就能验证二者的关联，D正确。 故选：B。 1、基因工程拼接原理：不同生物的DNA分子结构、碱基配对规则一致，异种启动子与目的基因编码区可重组，共用一套遗传密码，能跨物种表达。 2、转基因表达差异原因：外源基因随机插入染色体，插入位点、基因拷贝数不同，造成目的基因表达量个体间不均一。 3、外源基因稳定遗传条件：整合至受体细胞染色体DNA，随染色体复制传递给子代细胞，游离质粒难以稳定遗传。 4、启动子功能：作为转录调控元件，结合RNA聚合酶，控制基因转录效率，改变启动子活性可调控目的基因表达水平。 5、对照实验逻辑：通过调控自变量（基因表达量），观测因变量（生长速率），验证两者因果关系。 以转基因鲤鱼育种为情境，综合基因工程基础核心考点，陷阱在于忽略外源基因随机整合带来的表达差异，侧重考查转基因个体表达不均一这一易忽略细节。 7．【2026·安徽卷12·高考真题】为研究某种鱼中新发现的R基因的功能，对该种鱼的受精卵进行基因敲除，使R基因的编码序列缺失4个连续的碱基成为R-，获得1条能正常生长的F0代个体（RR-），经杂交培育获得了纯合突变体。与野生型相比，纯合突变体的体型变小，体色变为浅红色。下列叙述错误的是（　　） A. 选用受精卵进行基因敲除，目的是确保突变的基因可以遗传给子代 B. 用F0个体进行杂交培育，最早可以在F1获得纯合突变体 C. R-编码的氨基酸序列发生改变，纯合突变体可用于R基因功能的研究 D. 突变体有多种表型变异，说明一个基因的功能可能影响多个性状 【答案】B 【解析】【详解】A、由于受精卵具有全能性，可发育为动物个体，因此选用受精卵进行基因敲除，可保证该受精卵形成的个体每个性原细胞都含有R-，从而保证R-可通过生殖细胞传递给子代，A正确； B、由于经过基因敲除后只获得了1条能正常生长的F0代个体（RR-），因此第一次杂交只能选择野生型个体与F0代个体（RR-）杂交，再从子一代中选择RR-个体杂交，从子二代中筛选纯合突变体，或者让子一代RR-个体与F0代个体（RR-）杂交，从子二代中筛选纯合突变体，因此最早可以在F2获得纯合突变体，B错误； C、由于基因敲除使R基因的编码序列缺失4个连续的碱基成为R-，因此R-转录形成的mRNA中会缺失4个连续的碱基，由于mRNA上每3个连续的碱基决定一个氨基酸，因此R-编码的氨基酸序列会发生改变，纯合突变体中缺少正常的R基因，其对应的突变性状是由于R基因功能缺失导致的，因此纯合突变体可用于R基因功能的研究，C正确； D、纯合突变体中缺少正常的R基因，由题意可知，与野生型相比，纯合突变体的体型变小，体色变为浅红色，即突变体有多种表型变异，这些变异性状是由于R基因功能缺失导致的，说明一个基因的功能可能影响多个性状，D正确。 8．【2026·北京卷13·高考真题】MT是工业化生产海藻糖必需的酶，但天然MT热稳定性差。研究者将MT第216位的丙氨酸变为苏氨酸，获得热稳定性高的MT，提高了海藻糖生产效率。下列叙述错误的是（ ） A. 温度和pH会影响MT的催化活性 B. 第216位的丙氨酸对MT的专一性至关重要 C. 为筛选热稳定性高的MT，应在较高温度下测定酶活性 D. 对MT结构的改造属于蛋白质工程 【答案】B 【解析】 【详解】A、酶的活性受温度、pH等因素的影响，MT本质是酶，因此温度和pH会影响其催化活性，A正确； B、根据题干信息，将第216位的丙氨酸变为苏氨酸后，MT的热稳定性提高，并未改变其催化功能（仍可催化海藻糖合成），说明该位点的丙氨酸与MT的热稳定性有关，未体现对其专一性的作用，B错误； C、热稳定性高的酶在较高温度下仍能保持较高活性，因此筛选热稳定性高的MT时，应在较高温度下测定酶活性，C正确； D、通过改造氨基酸序列对蛋白质结构进行定向改造，以获得功能符合需求的蛋白质，该技术属于蛋白质工程，D正确。 9．【2025·6月浙江卷3·高考真题】下列关于生物技术安全和伦理问题的叙述，错误的是（　　） A. 反对设计完美婴儿 B. 反对人的生殖性克隆 C. 禁止生物武器的使用 D. 禁止转基因技术的应用 【答案】D 【解析】解：A、设计完美婴儿涉及基因编辑技术，可能引发基因歧视、破坏基因多样性等伦理问题，故反对是合理的，A正确； B、生殖性克隆会冲击现有伦理体系，且克隆人存在技术风险，国际社会普遍反对，B正确； C、生物武器具有大规模杀伤性，国际公约明确禁止其研发和使用，C正确； D、转基因技术并非完全禁止，需在严格监管下合理应用（如转基因作物、转基因动物等），D错误。 故选：D。 1、生殖性克隆 生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。 2、治疗性克隆 治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。 本题主要考查生物技术的安全性等知识，要求学生有一定的理解分析能力，能够结合题干信息和所学知识进行分析应用。 10．【2025·四川卷7·高考真题】为杀死蜜蜂寄生虫瓦螨，研究人员对蜜蜂肠道中的S菌进行改造，使其能释放特定的双链RNA（dsRNA）。进入瓦螨体内的dsRNA被加工成siRNA后，能与瓦螨目标基因的mRNA特异性结合使其降解，导致瓦螨死亡。下列叙述正确的是（　　） A. siRNA的嘌呤与嘧啶之比和dsRNA相同 B. dsRNA加工成siRNA会发生氢键的断裂 C. 瓦螨死亡的原因是目标基因的转录被抑制 D. 用改造后的S菌来杀死瓦螨属于化学防治 【答案】A 【解析】解：A、dsRNA为双链结构，嘌呤数等于嘧啶数，其嘌呤与嘧啶之比为1：1。siRNA是由dsRNA加工而来的双链小片段，其嘌呤与嘧啶之比仍为1：1，A正确； B、dsRNA加工成siRNA的过程是通过酶（如Dicer酶）切割磷酸二酯键，而非断裂氢键，B错误； C、根据题干信息，siRNA能与瓦螨目标基因的mRNA特异性结合使其降解，导致瓦螨死亡，所以siRNA直接抑制的是翻译过程，C错误； D、用改造后的S菌来杀死瓦螨属于生物防治，D错误。 故选：A。 进入瓦螨体内的dsRNA被加工成siRNA后，能与瓦螨目标基因的mRNA特异性结合使其降解，导致瓦螨死亡，这是抑制了翻译过程。 本题考查基因表达的知识，需要抓住题干中“siRNA能与瓦螨目标基因的mRNA特异性结合使其降解”，解读出抑制了翻译过程。 11．【2025·湖北卷14·高考真题】大数据时代，全球每天产生海量数据，预计2040年需一百万吨硅基芯片才能储存全球一年产生的数据。为解决这一难题，科学家尝试运用DNA来储存数据。我国科学家已经将汉代拓片、熊猫照片等文化数据写入DNA，实现数据长期保存。下列叙述中，DNA可以作为存储介质的优点不包括（　　） A. DNA具有可复制性，有利于数据的传播 B. 可通过DNA转录和翻译传递相应数据信息 C. DNA长链中碱基排列的多样化，为大量数据的存储提供可能 D. DNA作为存储介质体积小，为数据携带和保存节约了大量空间 【答案】B 【解析】解：A、DNA具有可复制性，这一特性使得数据能够在不同的个体或环境中进行传播，就像遗传信息可以传递给子代一样，有利于数据的广泛传播，A正确； B、DNA转录和翻译是生物体内合成蛋白质的过程，其目的是表达遗传信息合成蛋白质，而不是为了专门传递数据信息。在数据存储的情境下，这一过程与数据的存储和传播关联性不大，B错误； C、DNA长链中碱基排列具有多样化，不同的碱基排列顺序可以代表不同的信息，这种多样性为大量数据的存储提供了可能，如同不同的编码可以代表不同的内容一样，C正确； D、DNA作为存储介质体积小，相比传统的存储方式，能够为数据携带和保存节约大量空间，在大数据存储需求下，这是一个非常重要的优势，D正确。 故选：B。 1、DNA分子的多样性：构成DNA分子的脱氧核苷酸虽只有4种，配对方式仅2种，但其数目却可以成千上万，更重要的是形成碱基对的排列顺序可以千变万化，从而决定了DNA分子的多样性（n对碱基可形成4n种）。 2、DNA分子的特异性：每个特定的DNA分子中具有特定的碱基排列顺序，而特定的排列顺序代表着遗传信息，所以每个特定的DNA分子中都贮存着特定的遗传信息，这种特定的碱基排列顺序就决定了DNA分子的特异性。 本题将生物学中DNA的特性与大数据存储这一新颖场景结合。学生要学会把课本里DNA的结构、功能相关知识，迁移到数据存储这个新情境中；对于DNA转录和翻译，要明确其在生物体内的本质是合成蛋白质，不能混淆概念。 12．【2023·1月浙江卷2·高考真题】以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是（　） A. 试管婴儿技术应全面禁止 B. 治疗性克隆不需要监控和审查 C. 生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险 D. 我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 【答案】D 【解析】A、试管婴儿技术必须获得政府部门的相关批准证书，以防该技术的滥用，但不是全面禁止，A错误； B、治疗性克隆需在有效监控和严格审查下实施，B错误； C、生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念，存在伦理道德方面的风险，C错误； D、我国政府对生殖性克隆的态度是：不赞成、不允许、不支持、不接受，D正确。 故选：D。 1、生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。 2、治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。 本题考查生物技术引发的伦理问题，比较基础，只要考生识记我国政府对相关技术的态度即可正确答题。 13．【2023·海南卷2·高考真题】科学家将编码天然蜘蛛丝蛋白的基因导入家蚕，使其表达出一种特殊的复合纤维蛋白，该复合纤维蛋白的韧性优于天然蚕丝蛋白。下列有关该复合纤维蛋白的叙述，正确的是（　　） A. 该蛋白的基本组成单位与天然蜘蛛丝蛋白的不同 B. 该蛋白的肽链由氨基酸通过肽键连接而成 C. 该蛋白彻底水解的产物可与双缩脲试剂发生作用，产生紫色反应 D. 高温可改变该蛋白的化学组成，从而改变其韧性 【答案】B 【解析】解：A、该蛋白的基本组成单位是氨基酸，与天然蜘蛛丝蛋白的基本单位相同，A错误； B、氨基酸是组成蛋白质的基本单位，该蛋白的肽链由氨基酸经过脱水缩合反应通过肽键连接而成，B正确； C、该蛋白彻底水解的产物为氨基酸，不能与双缩脲试剂发生作用产生紫色反应，C错误； D、高温可改变该蛋白的空间结构，从而改变其韧性，但不会改变其化学组成，D错误。 故选：B。 构成蛋白质的基本单位是氨基酸，其结构通式是，即每种氨基酸分子至少都含有一个氨基和一个羧基，且都有一个氨基和一个羧基连接在同一个碳原子上，这个碳原子还连接一个氢和一个R基，氨基酸的不同在于R基的不同。 本题主要考查的是蛋白质分子的化学结构和空间结构以及蛋白质的检测等相关知识，意在考查学生对基础知识的理解掌握，难度适中。 14．【2022·江苏卷6·高考真题】采用基因工程技术调控植物激素代谢，可实现作物改良。下列相关叙述不合理的是（　　） A. 用特异启动子诱导表达iaaM（生长素合成基因）可获得无子果实 B. 大量表达ip（细胞分裂素合成关键基因）可抑制芽的分化 C. 提高ga2ox（氧化赤霉素的酶基因）的表达水平可获得矮化品种 D. 在果实中表达acs（乙烯合成关键酶基因）的反义基因可延迟果实成熟 【答案】B 【解析】解：A、生长素能促进果实发育，用特异启动子诱导表达iaaM（生长素合成基因）可获得无子果实，A正确； B、大量表达ipt（细胞分裂素合成关键基因）可诱导芽的分化，B错误； C、赤霉素能促进细胞伸长，从而引起茎秆伸长和植物增高，提高ga2ox（氧化赤霉素的酶基因）的表达水平，可促进赤霉素氧化分解，导致赤霉素减少，因而能获得矮化品种，C正确； D、乙烯有催熟作用，在果实中表达acs（乙烯合成关键酶基因）的反义基因，由于反义基因转录的反义RNA与原有基因转录的mRNA结合，使原有基因转录的mRNA不能翻译，因此抑制乙烯的合成，果实将会延迟成熟，D正确。 故选：B。 1、生长素类具有促进植物生长的作用，在生产上的应用主要有：（1）促进扦插的枝条生根；（2）促进果实发育；（3）防止落花落果。 2．赤霉素的生理作用是促进细胞伸长，从而引起茎秆伸长和植物增高。此外，它还有防止器官脱落和解除种子、块茎休眠促进萌发等作用。 3．细胞分裂素在根尖合成，在进行细胞分裂的器官中含量较高，细胞分裂素的主要作用是促进细胞分裂和扩大，此外还有诱导芽的分化，延缓叶片衰老的作用。 4．脱落酸在根冠和萎蔫的叶片中合成较多，在将要脱落和进入休眠期的器官和组织中含量较多。脱落酸是植物生长抑制剂，它能够抑制细胞的分裂和种子的萌发，还有促进叶和果实的衰老和脱落，促进休眠和提高抗逆能力等作用。 5．乙烯主要作用是促进果实成熟，此外，还有促进老叶等器官脱落的作用。植物体各部位都能合成乙烯。 本题以基因工程为背景考查植物激素的相关知识，意在考查考生能运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确的结论能力。 15．【2022·重庆卷3·高考真题】将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸，B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列关于该胰岛素的叙述，错误的是（    ） A. 进入人体后需经高尔基体加工 B. 比人胰岛素多了2个肽键 C. 与人胰岛素有相同的靶细胞 D. 可通过基因工程方法生产 【答案】A 【解析】A、人工长效胰岛素进入身体后作用于细胞表面的受体，不需要经高尔基体的加工，A错误； B、B链上多了两个精氨酸，多2个肽键，B正确； C、人工胰岛素和人胰岛素作用相同，靶细胞相同，C正确； D、人工长效胰岛素是对天然蛋白质的改造，需要通过基因工程生产，D正确。 故选：A。 本题考查蛋白质工程、基因工程等相关知识，考生要识记相关内容，综合判断。 二、非选择题 考点01基因工程的工具（共7题） 1．【2026·河南卷21·高考真题】4-α糖基转移酶（4αGT）在工业生产中发挥重要作用。为实现产业化生产，研究人员利用双酶切法，从重组克隆载体（仅用于目的基因的复制和保存）中获取目的基因，连入表达载体，构建了高效表达4αGT的工程菌，流程如图1所示。回答下列问题： （1）为确保目的基因正常复制，重组克隆载体和重组表达载体均应含有的元件为          。为确保目的基因正常表达，相较于重组克隆载体，重组表达载体目的基因两端的元件除启动子外，还有          ，作用为          。 （2）根据限制酶识别序列和切割位点，以及目的基因片段的黏性末端（图1），判断所使用的限制酶1是          ，限制酶2是          。 （3）琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子大小与迁移速率成反比。为检验重组表达载体是否构建成功，用限制酶1和限制酶2切割后，进行电泳鉴定。构建成功的重组表达载体酶切产物的电泳结果如图2所示，条带          （填“a”或“b”）对应目的基因片段，理由是          。 （4）将重组表达载体导入受体细胞，获得的工程菌接入液体培养基中培养。定时检测培养液中4αGT的含量，结果如图3所示。阶段2中4αGT含量迅速升高的原因可能是          （答出一点即可）。 【答案】（1）复制原点；终止子；终止目的基因的转录 （2）XhoⅠ；NcoⅠ （3）b；重组表达载体总长度为5129bp,双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；DNA分子越小电泳迁移速率越快，目的基因更小，迁移更远，因此条带b对应目的基因 （4）工程菌适应环境后进入快速增殖阶段，菌体数量大量增加，合成的4αGT总量升高 【解析】解：（1）复制原点是载体在宿主细胞中自主复制的起始位点，决定载体能否随细胞分裂稳定遗传给子代，是所有载体维持存在和扩增的基础。启动子、终止子等属于表达调控元件，仅表达载体必需，克隆载体无需具备；标记基因虽两者通常都有，但其核心功能是筛选而非直接保障“复制”过程。因此载体要保证目的基因正常复制，必须含有复制原点（DNA复制的起始位点）。基因表达过程中，启动子启动转录，终止子终止转录，重组克隆载体仅用于保存目的基因，不需要目的基因表达，因此重组表达载体比克隆载体多了启动子和终止子。 （2）结合目的基因两端黏性末端和限制酶切割序列分析：目的基因一端黏性末端为5'-TCGAG-3'，与XhoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶1为XhoⅠ；另一端黏性末端为5'-CATGG-3'，与NcoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶2为NcoⅠ。 （3）根据题意，DNA分子大小和迁移速率成反比，分子越小，迁移速率越快，距离点样孔越远。重组表达载体总长度为5129bp,双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；目的基因长度小于载体长度，因此迁移更远，更靠下的条带b对应目的基因。 （4）工程菌液体培养过程中，阶段1为调整期，菌体适应环境，增殖缓慢；阶段2菌体完成适应后进入对数快速增殖期，菌体数量大量增加，因此4αGT含量迅速升高。 故答案为： （1）复制原点；终止子；终止目的基因的转录 （2）XhoⅠ；NcoⅠ （3）b；重组表达载体总长度为5129bp,双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；DNA分子越小电泳迁移速率越快，目的基因更小，迁移更远，因此条带b对应目的基因 （4）工程菌适应环境后进入快速增殖阶段，菌体数量大量增加，合成的4αGT总量升高 1、复制原点是载体在宿主细胞中自主复制的起始位点，决定载体能否随细胞分裂稳定遗传给子代，是所有载体维持存在和扩增的基础。启动子、终止子等属于表达调控元件，仅表达载体必需，克隆载体无需具备；标记基因虽两者通常都有，但其核心功能是筛选而非直接保障“复制”过程。 2、由题干信息可知，重组表达载体总长度为5129bp,双酶切后得到3617bp的载体片段和1512bp的目的基因片段；DNA分子越小电泳迁移速率越快，目的基因更小，迁移更远，因此条带b对应目的基因，目的基因一端黏性末端为5'-TCGAG-3'，与XhoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶1为XhoⅠ；另一端黏性末端为5'-CATGG-3'，与NcoⅠ切割产生的黏性末端匹配，因此限制酶2为NcoⅠ。 本题考查了基因工程的相关知识，需要学生掌握基因表达载体的构建，结合题干信息答题。 2．【2026·山东卷25·高考真题】小鼠基因W编码的蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），该酶不需要模板，可在DNA的3´端随机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱氧核苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸，称为同聚物加尾。相关信息所示。 （1）载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是          ，载体上与其能自我复制相关的结构是          。 （2）研究人员选取2种限制酶切开载体，再用TdT分别对基因W和切开的载体进行同聚物加尾，然后将两者连接；若载体酶切后产生的黏性末端为5´端突出，则需先用DNA聚合酶补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下，据图分析，应选取的2种限制酶为          。 （3）基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重组载体需要的2种酶是          ，该过程中          （填“需要”或“不需要”）添加引物，原因是          。 （4）为检测基因W是否在酵母菌中表达出相应蛋白，在分子水平上的检测方法是          。 【答案】（1） 启动子   复制原点 （2）Kpn Ⅰ、Xho Ⅰ （3）DNA聚合酶、DNA连接酶 不需要 同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始 （4）抗原-抗体杂交 【解析】启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能够启动下游目的基因的转录过程，是目的基因表达的必需元件。复制原点位于载体，可以保证载体在受体细胞中能自我复制。 【小问2详解】 要保证重组载体中基因W可以被完整切下，需要选择两种限制酶，使得它们的识别序列在加尾后仍能被保留。由图可知，基因 W和载体上都有Sal Ⅰ的识别序列和切割位点，如果选用它会破坏W基因的结构，使W基因失活，因此不能选用。若选用Pst Ⅰ和Kpn Ⅰ ，酶切后产生的黏性末端为3´端突出，若要重新从重组载体上切下，Pst Ⅰ切割载体后要加同聚物G尾，Kpn Ⅰ切割载体后要加同聚物C尾，这样在重组载体中才能出现它们完整的识别序列而再次进行切割。若选用Xho Ⅰ，酶切后产生的黏性末端为5´端突出，可以先用DNA聚合酶补平，若要在重组载体中才能出现它们完整的识别序列而再次进行切割，则要加同聚物G尾。为了将质粒和基因W连接到一起，同聚物加尾间要能发生碱基互补配对，故应选择Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ。 【小问3详解】 由于用Xho Ⅰ进行切割会产生黏性末端为5´端突出，形成单链区，需要用DNA聚合酶进行补平，此外，W基因和载体形成重组载体时，中间有缺口，补全缺口后二者才能连接起来形成完整的重组载体，因此构建完整重组载体需要的2种酶：DNA聚合酶（补全单链区）和DNA连接酶（连接缺口）。该过程不需要添加引物，原因是：同聚物尾配对后存在可直接延伸的3'端，DNA聚合酶可直接从该末端延伸合成互补链，无需引物起始。 【小问4详解】 检测基因W是否表达出相应蛋白，由于基因表达的产物是蛋白质，分子水平检测蛋白质方法是抗原-抗体杂交。 3．【2025·山东卷25·高考真题】种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 （1）Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 ______。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和 ______对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 ______。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 ______进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 ______bp,则一定为正向重组质粒。 （2）为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 ______（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ______，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 ______（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 （3）通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，______（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 【答案】（1）复制原点；XbaⅠ；DNA聚合酶；SmaⅠ和SpeI；550 （2）4；环化；测序和序列比对 （3）不能 【解析】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaⅠ限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaⅠ酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，用BamHⅠ切割会破坏终止子，SpeⅠ切割会破坏抗除草剂基因，只有XbaⅠ产生的黏性末端可以用DNA聚合酶补齐（DNA合成方向为5′→3′）。重组的T-DNA片段上含有一个SmaⅠ和SpeⅠ酶切位点，可以选择用SmaⅠ和SpeⅠ进行酶切，经过两种酶的酶切后电泳呈现一长一短2种条带。若正向连接，较短的条带长度近似为550bp,若反向连接，较短的条带长度近似为200bp。 （2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。 （3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 故答案为： （1）复制原点；XbaⅠ；DNA聚合酶；SmaⅠ和SpeI；550 （2）4；环化；测序和序列比对 （3）不能 基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选和获取 从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建 基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选，是基因工程的核心步骤。 （3）将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。 将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 本题考查基因工程的相关内容，要求学生能结合所学知识正确作答。 4．【2025·湖南卷21·高考真题】非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： （1）制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和______等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物______对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为______bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是______（答出两点即可）。 （2）制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有______（答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和______，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 【答案】（1）①终止子或复制原点；P1和P3；782 ②重组菌没有裂解（或没有将蛋白A释放到细胞外或转速过高使蛋白A发生沉淀或蛋白A亲水性较差发生沉淀或蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解） （2）PEG融合法（或电融合法或灭活病毒诱导法）；抗体检测 【解析】（1）①重组质粒的必备元件包含目的基因（这里是基因 A ）、限制酶切割位点（用于插入目的基因等操作）、标记基因（便于筛选含有重组质粒的细胞）、启动子（驱动目的基因转录）和终止子（终止转录）或复制原点（保证质粒能在宿主细胞中复制）。要确定基因 A已连接到质粒中且插入方向正确，应选择能跨越基因A且方向合适的引物。观察可知，P1与基因上游的非编码区碱基互补配对，P3与基因下游且靠近启动子的区域碱基互补配对，P1和P3这对引物符合要求。从图中可知基因A长度为582bp,P1到启动子区域长度为200bp,所以预期扩增产物片段大小为582+200═782bp。②清液无蛋白A的原因：将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌后，培养重组菌诱导蛋白A合成，收集发酵液离心后上清液无蛋白A。可能是重组菌没有裂解，导致蛋白A无法释放到细胞外；也可能是没有将蛋白A释放到细胞外；或者转速过高使蛋白A发生沉淀；蛋白A亲水性较差发生沉淀；蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解等。 （2）用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有PEG融合法（利用聚乙二醇促进细胞融合）、电融合法（通过电刺激使细胞融合）或灭活病毒诱导法（利用灭活的病毒促使细胞融合）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测等多次筛选，目的是获得足够数量的能分泌所需抗体（抗蛋白 A抗体）的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，由于单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的特点，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 故答案为： （1）①终止子或复制原点；P1和P3；782 ②重组菌没有裂解（或没有将蛋白A释放到细胞外或转速过高使蛋白A发生沉淀或蛋白A亲水性较差发生沉淀或蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解） （2）PEG融合法（或电融合法或灭活病毒诱导法）；抗体检测 基因工程操作步骤： 1、目的基因的获取：从自然界已有的物种中分离，或人工合成。人工合成可通过反转录法（以mRNA为模板合成DNA）、化学合成法（已知目的基因核苷酸序列时直接合成）等。 2、基因表达载体的构建：这是基因工程的核心步骤。将目的基因与载体（如质粒）用限制酶切割，再用DNA连接酶连接，形成重组DNA分子。载体需具备限制酶切割位点、标记基因、启动子、终止子等元件，以保证目的基因在受体细胞中能稳定存在、复制和表达。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞类型选择合适方法。如导入植物细胞常用农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；导入动物细胞常用显微注射技术；导入微生物细胞常用感受态细胞法（用Ca2⁺处理细胞使其处于感受态）。 4、目的基因的检测与鉴定：分子水平检测包括DNA分子杂交（检测目的基因是否导入受体细胞）、DNA-RNA 杂交（检测目的基因是否转录）、抗原-抗体杂交（检测目的基因是否翻译）；个体水平鉴定如观察转基因生物是否表现出相应性状。 该题聚焦于非洲猪瘟病毒相关的生物技术应用，围绕基因工程和细胞工程展开，涵盖重组质粒的组成元件、引物的选择与产物大小计算、蛋白未在上清液出现的原因分析，以及单克隆抗体制备过程中的细胞融合方法与杂交瘤细胞筛选等重要知识点。综合考查学生对这两个领域基础知识的掌握与运用能力。学生要牢固掌握基因工程和细胞工程的基本概念与原理；学会从图中获取有效信息；牢记细胞融合等生物技术的常用方法及其原理，避免混淆。 5．【2024·黑吉辽卷25·高考真题】将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 ​ 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 （1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是 ______ 。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是 ______ 。 （2）本操作中获取目的基因的方法是 ______ 和 ______ 。 （3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是 ______ ，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是 ______ 。 （4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用 ______ 基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 （5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是 ______ 和 ______ 。 （6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是 ______ （单选）。 A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C.将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D.用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 【答案】（1）水解苏云金杆菌细胞膜上的蛋白质，使菌体释放DNA    初步分离DNA和蛋白质 （2）PCR技术    人工合成法 （3）RNA聚合酶识别和结合位点      促进目的基因更多的转录 （4）HygBR （5）F3      R2 （6）D 【解析】解：（1）从苏云金杆菌提取DNA时，加入蛋白酶的作用是水解苏云金杆菌细胞膜上的蛋白质，使菌体释放DNA。由于DNA不溶于酒精，有些蛋白质溶于酒精，提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精可初步分离DNA和蛋白质。 （2）由图示可知，本操作中获取目的基因的方法是PCR技术和人工合成法。 （3）启动子作用是RNA聚合酶识别和结合位点，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是促进目的基因更多的转录。 （4）由题干信息可知，T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置可知，HygBR基因在T-DNA（重组DNA）上，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 （5）PCR扩增目的基因时，引物应在目的基因的两端，所以为检测棉花植株是否导入目的基因，应选用的引物是F3和R2。 （6）蛋白质工程合成的蛋白质为自然界中没有的新蛋白质，本研究中用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，所以属于蛋白质工程，D正确。 故选：D。 .故答案为： （1）水解苏云金杆菌细胞膜上的蛋白质，使菌体释放DNA    初步分离DNA和蛋白质 （2）PCR技术    人工合成法 （3）RNA聚合酶识别和结合位点      促进目的基因更多的转录 （4）HygBR （5）F3      R2 （6）D 基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 本题考查了基因工程的相关知识，意在考查考生理解所学知识要点，把握知识间内在联系的能力；能运用所学知识，对生物学问题作出准确的判断，难度适中。 6．【2024·北京卷20·高考真题】学习以下材料，回答（1）～（4）题。  筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。   真核生物的基本启动子位于基因5′端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程中常用表达载体的基因表达调控序列，通常包含增强子和基本启动子。   很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。     获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。   研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。  （1）在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生           的过程称为细胞分化，分化是基因           的结果。  （2）对文中“增强子”的理解，错误的是           （单选）。  A.增强子是含有特定碱基序列的DNA片段  B.增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上  C.一个增强子只能作用于一个基本启动子  D.很多增强子在不同组织中的活性不同  （3）研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测           。  （4）真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称（略）。 【答案】（1）稳定性差异    选择性表达 （2）C （3）各组织器官中G和H的mRNA （4） 【解析】解：（1）细胞分化是指在个体发育中由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程，其实质是基因的选择性表达。 （2）AB、根据题干信息“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列”分析，增强子是含有特定碱基序列的DNA片段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上，AB正确； C、根据图C分析可知，一个增强子可作用于多个基因的基本启动子，如图中的报告基因与内源基因，C错误； D、根据题干信息“很多增强子具有组织特异活性”，很多增强子在不同组织中的活性不同，D正确。 故选：C。 （3）鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可以对其转录产物进行检测，即通过PCR等技术检测各组织器官中G和H的mRNA。 （4）“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列”，基因工程所用表达载体中的启动子，包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，因而不会造成基因突变。当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会造成该增强子所调控的基因发生突变。研究某目的基因的功能，需要将增强子插入到目的基因内部，改造后的载体如图：。 故答案为： （1）稳定性差异    选择性表达 （2）C （3）各组织器官中G和H的mRNA （4） 基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。 4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR检测等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR检测等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 本题考查基因工程的相关知识，要求考生理解识记有关技术的原理及操作步骤，还涉及细胞分化的概念等知识内容，要求学生能将教材中的知识结合题中信息进行迁移应用。 7．【2023·山东卷25·高考真题】科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    （1）与图甲中启动子结合的酶是  ______ 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有  ______ （答出2个结构即可）。  （2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物  ______ 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的  ______ （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。  （3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了  ______ ，条带2所检出的蛋白  ______ （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 【答案】（1）RNA聚合酶  标记基因、复制原点  （2）F1、R2（或F2、R1）  a链  （3）J蛋白和V5蛋白  不是 【解析】解：  （1）启动子是作用是与RNA聚合酶结合，启动基因转录，所以与图甲中启动子结合的酶是RNA聚合酶。除图甲中标出的启动子、终止子结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有标记基因、复制原点，标记基因用来筛选重组DNA，复制原点是质粒复制的起点。  （2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，启动子和终止子之间的片段的序列排序，进行PCR检测，需要一对引物分别位于插入片段内部和质粒载体骨架上，这样只有插入方向正确的重组质粒才能扩增出对应条带，应选择图甲中的引物F1、R2（或F2、R1）。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与a链互补，与图甲中J基因的a链相应部分的序列相同。  （3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中出现条带1证明细胞内表达了J蛋白和V5蛋白，条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的，是一种定位蛋白。  故答案为：  （1）RNA聚合酶  标记基因、复制原点  （2）F1、R2（或F2、R1）  a链  （3）J蛋白和V5蛋白  不是 表达载体上各序列的作用：启动子是作用是与RNA聚合酶结合，启动基因转录，终止子的作用是终止转录，标记基因用来筛选重组DNA，复制原点是质粒复制的起点。 本题考查了基因工程的相关知识，准确理解基因工程的四个步骤是解题的关键。 考点02基因工程的基本操作程序（共32题） 1．【2026·1月浙江卷25·高考真题】农杆菌能侵染真菌，介导真菌细胞的转基因。3-磷酸甘油脱氢酶是假丝酵母中甘油合成代谢途径的关键酶，将3-磷酸甘油脱氢酶基因（Gpd）构建到表达载体上，如图1所示。通过农杆菌介导法，转化假丝酵母野生型菌株，获得转Gpd的重组菌株。野生型菌株与某重组菌株分别进行发酵实验，生产甘油的结果如图2所示。 注：ZeoR是腐草霉素抗性基因，KanR是卡那霉素抗性基因 回答下列问题： (1)表达载体导入农杆菌细胞：用溶液处理农杆菌，制备          ，再用电击法将表达载体导入农杆菌细胞，经筛选获得阳性克隆。为验证阳性克隆是否为转化成功的农杆菌，从繁殖后的菌株细胞中提取质粒，经          限制酶酶切后电泳，若出现4条DNA条带，则表明转化成功。 (2)假丝酵母重组菌株的获得：在          中的酒精灯火焰旁，取野生型假丝酵母菌种，采用          方法接种在固体培养基上培养，适时挑选          再接种到液体培养基进行培养。取适量的假丝酵母与农杆菌进行共培养一段时间后，杀灭农杆菌，然后在含有          的选择培养基中筛选，最终获得重组菌株。 (3)重组菌株生产甘油能力的分析：根据图2可知，与野生型菌株相比，该重组菌株用于发酵生产甘油的2个优点是          。若某生长正常的重组菌株发酵液中甘油的含量显著低于野生型菌株，从引起变异的因素分析，可能的原因有：在培养过程中重组菌株发生了突变，或          ，导致甘油合成代谢受阻。 【答案】（1）感受态细胞/可导入外源DNA分子的农杆菌 EcoR Ⅰ和HindⅢ （2）超净工作台/无菌实验室/灭菌的操作台 （平板）划线法/稀释涂布平板法 单菌落 腐草霉素 （3）提高发酵液中甘油的含量；缩短发酵时间 T-DNA的插入导致重组菌株发生了变异 【解析】【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【详解】（1）用CaCl₂溶液处理农杆菌，目的是制备感受态细胞（可导入外源DNA分子的农杆菌）。感受态细胞是指处于能吸收周围环境中DNA分子状态的细胞，这种处理会使农杆菌细胞膜通透性增加，便于外源表达载体的导入。从图 1可知，质粒上有两个Hind Ⅲ酶切位点和两个EcoR Ⅰ酶切位点。用这两种酶同时酶切，会将质粒切成 4个大小不同的片段，电泳后就会出现4条 DNA 条带，以此证明农杆菌成功导入了重组质粒。 （2）为了营造一个无菌环境，避免杂菌污染实验材料，微生物接种应在超净工作台（或无菌实验室或灭菌的操作台）的酒精灯火焰旁进行。平板划线法和稀释涂布平板法是常用的微生物接种方法，这两种方法都可以将菌种分散，最终获得单菌落。单菌落是由单个细胞繁殖而来的，能保证后续培养的菌株遗传背景一致。质粒的 T-DNA区域带有腐草霉素抗性基因（Zeoᴿ）。当农杆菌将T-DNA 整合到假丝酵母基因组后，只有成功导入该基因的重组酵母才能在含有腐草霉素的选择培养基上存活，从而筛选出重组菌株。 （3）从图2的曲线对比可以看出：重组菌株的发酵液中甘油峰值明显高于野生型菌株；重组菌株的甘油含量上升速度更快，能在更短时间内达到产量高峰。若重组菌株甘油含量显著低于野生型，除了基因突变外，还可能是T-DNA 插入导致重组菌株发生了变异，破坏了假丝酵母自身甘油合成关键基因的功能。 2．【2026·云南卷21·高考真题】UW4菌株可表达ACC脱氨酶减少植物乙烯合成，促进植物生长，但定殖植物根部能力较弱。现欲将增强定殖能力的五肽整合到UW4中ACC趋化受体（ACCR）的羧基端。 回答下列问题： 第一步：构建pEX质粒（图a），复制原点（ori）不能在UW4菌株中启动复制（质粒不复制策略）。 （1）PCR每次循环一般可以分为变性、复性和          三步。 （2）构建pEX质粒时，用2种限制酶的目的是          （答出2点）。 第二步：将pEX质粒导入UW4菌株中，利用DNA同源区段可发生交换的原理，改造得到工程菌UW4-2（图b）。 （3）我国科学家将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，使花粉失活，防止转基因花粉传播；在UW4-2菌株构建中使用了质粒不复制策略。此类设计的主要目的是          。 （4）要获得UW4-2菌株，需筛选三次。第一次在培养基中添加          ，即可筛选出UW4-1菌株，筛选的原理是          ；在第二次筛选培养基中添加          。筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是          （填图c中序号）；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并          。 【答案】（1）延伸 （2）防止目的基因或质粒自身环化、防止目的基因与质粒反向连接（使目的基因与载体定向连接，保证插入方向正确） （3）防止工程菌（或重组质粒）扩散到环境中，造成基因污染 （4）庆大霉素；pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长；蔗糖； ②；测序（或电泳检测） 【解析】（1）PCR技术是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR每次循环一般可以分为变性（当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链）、复性（当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合）和延伸（当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链）三步。 （2）构建基因表达载体时，通常用两种限制酶切割，能使目的基因两端、质粒两端产生不同的黏性末端，这样可以防止目的基因自身环化，防止质粒自身环化，还能防止目的基因与质粒反向连接（或使目的基因与载体定向连接，保证插入方向正确）。 （3）在UW4-2菌株构建中使用质粒不复制策略可防止工程菌（或重组质粒）扩散到环境中，造成基因污染。 （4）据图可知，pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长，所以第一次在培养基中添加庆大霉素，可筛选出UW4-1菌株；根据DNA同源区段可发生交换的原理，pEX质粒上带有蔗糖致死基因，未发生第二次同源交换的菌株仍保留该基因，在含蔗糖的培养基中会被杀死，发生第二次同源交换的菌株会丢失蔗糖致死基因，在含蔗糖的培养基上能存活，故第二次筛选要在培养基中添加蔗糖；图示中给出的同源重组类型是切后端然后重组，另外一种类型应该是切前端重组，故筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是②；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并测序来鉴定（或进行电泳检测）。 故答案为： （1）延伸 （2）防止目的基因或质粒自身环化、防止目的基因与质粒反向连接（使目的基因与载体定向连接，保证插入方向正确） （3）防止工程菌（或重组质粒）扩散到环境中，造成基因污染 （4）庆大霉素；pEX质粒上含有庆大霉素抗性基因，导入pEX质粒的UW4-1菌株能在含庆大霉素的培养基上生长；蔗糖； ②；测序（或电泳检测） 基因工程主要分为四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。本题考查基因工程的相关知识，学生需正确分析题目信息，结合所学知识进行解答。 3．【2026·四川卷19·高考真题】肿瘤的快速增殖使其内部缺氧，有人将普拉梭菌fp基因转入兼性厌氧大肠杆菌（E.coli），构建工程菌E.coli-fp并评估其抗肿瘤效果，部分操作如图1。回答下列问题。 （1）DNA连接酶可催化fp基因与载体之间生成______ 键，连接形成重组质粒。工程菌E.coli-fp表达的产物中His标签可被抗体识别。将His标签置于fp基因后并融合表达，目的是______ 。 （2）PD-1抗体是一种抗癌药物。为分析FP蛋白对肿瘤的疗效，有人开展了相关实验，结果如图2，请评价FP蛋白和PD-1抗体对肿瘤的治疗效果______ 。 （3）色谱分析可区分不同的小分子，同一分子会在固定时间出现峰值。向ATP或GTP溶液中加入FP蛋白，反应后的色谱分析结果如图3。FP蛋白的反应底物是______ 。 （4）有人将E.coli或含厌氧启动子的工程菌E.coli-fp注射到小鼠尾静脉，证明E.coli-fp具有抗肿瘤作用。据图4分析，用His标签抗体杂交，检测到的组1是______ （填“E.coli”或“E.coli-fp”）；兼性厌氧大肠杆菌主要在肿瘤中存活并增殖，原因可能是______ 。综合分析，E.coli-fp能有效治疗肿瘤的作用机制是______ 。 【答案】（1）磷酸二酯  便于FP蛋白的分离纯化与检测（或便于目的蛋白的鉴定、分离纯化）  （2）FP蛋白、PD-1抗体单独使用时均具有抗肿瘤的效果，两者联合使用时疗效更显著  （3）ATP  （4）E.coli-fp   大肠杆菌为兼性厌氧生物，能适应肿瘤内部的低氧环境而存活；在缺氧条件下，大肠杆菌能通过无氧呼吸获取能量，还可利用肿瘤区域丰富的代谢产物进行增殖     基因工程改造的His标签可被抗体识别，便于重组质粒的筛选可特异性富集在肿瘤低氧区域，并大量表达FP蛋白；FP蛋白能结合并消耗肿瘤细胞的ATP，切断肿瘤细胞的能量供给，最终使肿瘤细胞因能量匮乏而凋亡，实现靶向抗肿瘤效果 【解析】（1）DNA之间通过磷酸二酯键连接，DNA连接酶可连接两个DNA片段，故可催化磷酸二酯键的形成；由题意可知，His标签置于fp基因后并融合表达便于FP蛋白的分离纯化与检测（或便于目的蛋白的鉴定、分离纯化）。  （2）结合图2曲线分析可知，与对照组相比，PD-1抗体组、FP蛋白组的肿瘤体积都更小，说明二者都有抗肿瘤效果；二者联合处理组肿瘤体积最小，说明联合用药抑癌效果最佳。  （3）结合图3分析可知，加入FP蛋白后，ATP的峰值消失，只产生AMP的峰值，说明FP可以催化ATP分解，而GTP加入FP后无变化，据此推测FP的反应底物是ATP。  （4）由题意可知，只有工程菌E.coli−fp含有His标签序列，能被His标签抗体检测到，故出现阳性杂交信号的组1是E.coli−fp；肿瘤因快速增殖内部形成缺氧环境，大肠杆菌为兼性厌氧生物，能适应肿瘤内部的低氧环境而存活；在缺氧条件下，大肠杆菌能通过无氧呼吸获取能量，还可利用肿瘤区域丰富的代谢产物进行增殖；基因工程改造的His标签可被抗体识别，便于重组质粒的筛选可特异性富集在肿瘤低氧区域，并大量表达FP蛋白；综合分析，E.coli-fp能有效治疗肿瘤的作用机制是：FP蛋白能结合并消耗肿瘤细胞的ATP，切断肿瘤细胞的能量供给，最终使肿瘤细胞因能量匮乏而凋亡，实现靶向抗肿瘤效果。  故答案为：  （1）磷酸二酯  便于FP蛋白的分离纯化与检测（或便于目的蛋白的鉴定、分离纯化）  （2）FP蛋白、PD-1抗体单独使用时均具有抗肿瘤的效果，两者联合使用时疗效更显著  （3）ATP  （4）E.coli-fp   大肠杆菌为兼性厌氧生物，能适应肿瘤内部的低氧环境而存活；在缺氧条件下，大肠杆菌能通过无氧呼吸获取能量，还可利用肿瘤区域丰富的代谢产物进行增殖     基因工程改造的His标签可被抗体识别，便于重组质粒的筛选可特异性富集在肿瘤低氧区域，并大量表达FP蛋白；FP蛋白能结合并消耗肿瘤细胞的ATP，切断肿瘤细胞的能量供给，最终使肿瘤细胞因能量匮乏而凋亡，实现靶向抗肿瘤效果 基因工程技术的基本步骤：  （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。  （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。  （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。  （4）目的基因的检测与鉴定：  分子水平上的检测：  ①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术。  ②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术。  ③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。  个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 本题主要考查基因工程的相关知识，意在考查考生理解所学知识要点、把握知识间内在联系的能力，能够运用所学知识，对生物学问题作出准确的判断。 4．【2026·河北卷22·高考真题】曲霉中的淀粉酶R能直接将不经高温处理的淀粉降解为葡萄糖。R基因的表达受CreA蛋白抑制。研究者利用基因工程手段，抑制了黑曲霉CreA基因的表达，并进行了相关检测。 回答下列问题： （1）黑曲霉菌种的分离纯化应选用______ （填“固体”或“液体”）培养基。 （2）细胞中具有特定结构的双链RNA可被相关酶识别并降解为小片段。RNA小片段可识别与自身序列互补的mRNA，引导该mRNA发生降解。如图1所示，为使含片段A和C的转录产物能按照______ 原则自身折叠形成双链，扩增CreA基因D片段时，可在两个引物的______ 端分别添加两个限制酶识别序列。一部分PCR产物用限制酶KpnⅠ和SpeⅠ酶切连接到载体中A所在的位置，另一部分再用限制酶①和②构建到载体中C所在的位置。因此可判断，限制酶①应该是______ 。 （3）构建的基因表达载体除含有启动子、终止子和目的基因外，还需具有______ 基因，以使表达载体转入受体细胞后可利用______ 培养基筛选出转基因成功的菌株。 （4）构建的表达载体转入菌株G获得G1，将G和G1在相同且适宜的条件下培养，对其生长状况和菌液的淀粉酶活力进行检测，实验结果（图2）表明______ 。（答出两点） （5）传统工艺中需对淀粉进行高温糊化、淀粉酶液化和糖化酶糖化等处理，才可获得葡萄糖。相较于传统工艺，对淀粉酶R的研发利用所体现的优势是______ 。（答出两点） 【答案】（1）固体  （2）碱基互补配对  5′SacⅠ； （3）标记  选择 （4）①抑制CreA基因的表达对黑曲霉的生长（生物量）无显著影响；②抑制CreA基因的表达可显著提高黑曲霉的淀粉酶活力 （5）①省去高温糊化、液化步骤，节约能源，简化工艺流程，降低生产成本；②酶促反应条件温和，副产物少，产物纯度更高 【解析】解：（1）微生物的分离纯化需要获得单菌落，只有固体培养基上才能形成单菌落，因此选用固体培养基。 （2）核酸折叠形成双链遵循碱基互补配对原则；PCR扩增时，引物与模板3'端互补，引物延伸的方向是5'端→3'端，额外的限制酶识别序列需要添加在引物的5′端；根据图1载体的酶切位点顺序：启动子-KpnⅠ-A-SpeⅠ-B-NcoⅠ-C-SacⅠ-终止子可知，A位点两侧是KpnⅠ和SpeⅠ，C位点两侧是NcoⅠ和SacⅠ，结合题意可知，该过程需要使含片段A和C的转录产物自身折叠形成双链，图1可知，PCR扩增CreA基因D片段时，分别在5'端添加了A片段和C片段对应的限制酶，要使A片段和C片段插入的D片段转录产物互补，则需要将C位点插入的D片段与A位点插入的D片段反向，结合图中载体上的限制酶对应关系可知，限制酶①应为SacⅠ。 （3）基因表达载体的结构包括启动子、终止子、目的基因，还需具有标记基因，标记基因的作用是筛选成功转入载体的受体细胞；在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基是选择培养基，可利用选择培养基筛选出转基因菌株。 （4）分析图2曲线，G（原菌株）和G1（抑制CreA表达的菌株）的生物量曲线几乎重合，说明CreA表达抑制对黑曲霉生长无显著影响；G1的淀粉酶活力远高于G，说明抑制CreA表达可以显著提高淀粉酶活力。 （5）传统工艺需要高温处理淀粉，而淀粉酶R可直接降解生淀粉，因此优势为：①省去高温糊化、液化步骤，节约能源，简化工艺流程，降低生产成本；②酶促反应条件温和。副产物少，产物纯度更高。 故答案为： （1）固体  （2）碱基互补配对  5′SacⅠ； （3）标记  选择 （4）①抑制CreA基因的表达对黑曲霉的生长（生物量）无显著影响；②抑制CreA基因的表达可显著提高黑曲霉的淀粉酶活力 （5）①省去高温糊化、液化步骤，节约能源，简化工艺流程，降低生产成本；②酶促反应条件温和，副产物少，产物纯度更高 1、培养基分类：固体培养基与液体培养基的功能差异； 2、微生物分离纯化原理：平板划线法、稀释涂布平板法分离单菌落必须使用添加凝固剂的固体培养基；液体培养基仅用于扩大培养，无法实现菌种分离。 3、完整表达载体必备元件：启动子、终止子、目的基因、复制原点、标记基因； 4、生物实验图表分析： 双坐标曲线图解读：区分横坐标（培养时间）、左纵坐标（生物量，反映菌株生长繁殖能力）、右纵坐标（淀粉酶活力，反映目的基因表达水平）； 5、对照实验结果归纳：设置野生菌株G为对照组、转基因菌G1为实验组，对比两组生长指标与产物活性，得出双重实验结论； 6、生长曲线与酶活变化规律：微生物生长趋势、次级代谢相关酶活力随培养时间的动态变化。 本试题串联微生物培养、RNA干扰、基因工程、基因调控、发酵工程五大模块，符合新高考“大情境综合设问”命题趋势；分层设问：基础识记（1、3）→逻辑推导（2）→图表分析（4）→应用评价（5），难度循序渐进，区分度良好。 5．【2026·湖南卷17·高考真题】阿尔茨海默病患者大脑中β-淀粉样蛋白（Aβ）异常聚集，损伤神经元。为了探索治疗该疾病的新方法，研究人员合成了一种嵌合抗原受体（CAR）基因，使其在星形胶质细胞中特异性表达，形成CAR-A细胞，并鉴定了这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力。回答下列问题： （1）CAR基因和病毒载体的部分结构（含限制酶切割位点）分别如图a、b所示。 ①胞外识别区应选用Aβ聚集体的______ （填“抗原”或“抗体”）特定片段编码序列。 ②采用特异性启动子的目的是______ 。同时，为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白（GFP）示踪其成功导入星形胶质细胞，应选用的两种限制酶是______ 。 （2）为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解Aβ聚集体，可用含Aβ聚集体的培养基培养CAR-A细胞，一段时间后更换不含Aβ聚集体的培养基继续培养，______ （单选）的Aβ聚集体含量。 A.24h检测细胞内 B.24h检测细胞外 C.0h和24h检测细胞内 D.0h和24h检测细胞外 （3）给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降。该实验对照组应注射______ ；该实验结论是______ 。 【答案】（1）抗体   使CAR基因编码序列在星形胶质细胞中特异性表达     KpnI、BamHⅠ （2）C （3）没有携带CAR基因的等量病毒    携带CAR基因的病毒能减少阿尔茨海默病模型小鼠大脑的Aβ聚集体，减轻神经元损伤 【解析】解：（1）①CAR-A细胞能特异性识别、吞噬和降解Aβ（β-淀粉样蛋白）聚集体，据此可推知，图a中CAR基因编码序列中胞外识别区表达产物能特异性识别Aβ聚集体，此时Aβ聚集体作为抗原，所以胞外识别区应选用AP聚集体的抗体特定片段编码序列，这样细胞才能识别Aβ聚集体。 ②分析图a,特异性启动子能启动CAR基因编码序列表达，使用特异性启动子能确保CAR基因编码序列只在星形胶质细胞内表达，避免CAR基因在其他类型细胞中表达，减少非特异性提伤。为使CAR基因正确插入病毒载体，应使用双酶切，可避免自身环化，同时需要通过绿色荧光蛋白示踪CAR基因成功导入星形胶质细胞，故病毒载体需保留GFP基因，因此不能选择HindⅢ切割病毒载体；为保证CAR基因在星形胶质细胞中特异性表达，需将特异性启动子和CAR基因编码序列同时插入病载体，并且破坏病毒载体上的非特异性启动子，则应选择限制酶KpnI和BamHⅠ构建基因表达载体。 （2）用含AB聚集体的培养基培养CAR-A细胞，让细胞吞噬并降解Aβ聚集体，一段时间后更换不含Aβ聚集体的培养基准续培养，为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解AB聚集体，应检测0h和24h细胞内的Aβ聚集体合量，检测0h细胞内Aβ聚集体含量的目的是确认CAR-A细胞是否吞噬了AB聚集体并提供初始对照数据，检测24h细胞内Aβ聚集体含量，与0h的对照，以确定细胞是否降解AB聚集体，C正确，ABD错误。 故选：C。 （3）该实验组的处理为给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，为遵循单一变量原则，对照组的处理应为给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射没有携带CAR基因的病毒；该实验结果为实验组模型小鼠大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白相对表达量下降，说明携带CAR基因的病毒可减少阿尔茨海默病模型小鼠大脑内AB聚集体，减轻神经元损伤，对阿尔茨海默病具有治疗效果。 故答案为： （1）抗体   使CAR基因编码序列在星形胶质细胞中特异性表达     KpnI、BamHⅠ （2）C （3）没有携带CAR基因的等量病毒    携带CAR基因的病毒能减少阿尔茨海默病模型小鼠大脑的Aβ聚集体，减轻神经元损伤 基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 本题考查神经调节和基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。 6．【2026·贵州卷21·高考真题】高粱是酿酒的优质原料，虫害严重影响高粱产量和品质。将外源抗虫基因导入高粱植株，可培育具有抗虫性状的新品种。回答下列问题： （1）科研人员拟将抗虫基因V连接到图甲中的质粒上，为避免错误连接，应选用图甲中的           对质粒进行酶切。 （2）将重组质粒导入受体细胞并获得高粱植株，为检测目的基因是否正确导入，以叶片基因组DNA为模板，设计如图乙所示的引物进行PCR及电泳鉴定。其中引物组合为           的扩增产物电泳迁移速率最快；抗虫基因V的长度约为           bp。 （3）科研人员发现转基因高粱中V基因的表达量未达到预期，推测与启动子部分序列5'-ATCGCGAACG-3'的胞嘧啶甲基化有关。用亚硫酸氢盐（能使未甲基化的碱基C转变为U）处理高粱DNA，将处理后的样品进行PCR扩增等操作获得上述片段的互补链。将所得互补链的5'末端用32P标记，再分别用四种化学试剂处理，使识别的核苷酸的3'端磷酸二酯键断裂，并通过控制反应时间使断裂反应不充分进行，然后对四组反应产物进行电泳并检测放射性，化学试剂对碱基的识别情况及检测结果如图丙（只显示含有32P的条带）。③中加入的是           试剂；a和b两片段长度相差           个核苷酸；启动子的该序列从5'端到3'端第           位核苷酸发生了甲基化。 【答案】（1）BclⅠ和XbaⅠ （2）3+6；2500 （3）X；4；3和9 【解析】解：（1）若只用单酶切会出现质粒自连、目的基因反向连接等问题，因此需用两种不同黏性末端的酶，防止错误连接，由图甲可知，BamHⅠ与BstⅠ识别相同序列（5′-GGATCC-3′），切割后黏性末端一致，因此不能同时选用这两种酶，而且BstⅠ酶的识别序列位于启动子与终止子的外边，因此不能选用BamHⅠ酶与BstⅠ酶。由图示可知，位于启动子与终止子之间的可用限制酶只有BclⅠ酶和XbaⅠ酶，二者酶切末端不同，可定向插入V基因，避免质粒自连、目的基因反向连接。 （2）在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段分子量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。表格各组合长度：引物组合1+4扩增产物长度2000bp、引物组合1+5扩增产物长度2800bp、引物组合1+6扩增产物长度4750bp、引物组合2+6扩增产物长度1550bp、引物组合3+6扩增产物长度250bp。其中引物组合3+6扩增产物长度最短，迁移速率最快。抗虫基因V的长度=引物组合1+6扩增产物长度-引物组合1+4扩增产物长度-引物组合3+6扩增产物长度=4750-2000-250=2500bp。 （3）启动子片段为5'-ATCGCGAACG-3'（共10个核苷酸，5'→3'编号为1～10），互补链的5'端被P标记，四种试剂会在识别的碱基处切断3'端磷酸二酯键；电泳后，条带位置代表片段长度，条带缺失说明该位点未被切断（即该位点C发生了甲基化，未被转化为U，无法被识别C/T的试剂切断）。根据条带位置匹配试剂识别的碱基类型：1组：条带位置对应C/T位点一Y试剂（识别C、T）；2组：条带位置仅对应C位点一Z试剂（识别C）；3组：条带位置对应A/G位点X试剂（识别G、A）；4组：条带位置仅对应G位点一W试剂（识别G）。电泳迁移速率与片段长度成反比，条带位置越靠下，片段越短。从图丙可见，a和b两条带之间间隔了4个核苷酸的位置差，因此二者长度相差4个核苷酸。又由题意可知其序列定位为5'-A1T2C3G4C5G6A7A8C9G10-3'，其中C位于第3、5、9位。对比1（Y）和2（Z）的电泳条带，发现第3位C和第9位C处无断裂条带，说明这两个C发生了甲基化，即第3位和第9位核苷酸发生了甲基化。 故答案为： （1）BclⅠ和XbaⅠ （2）3+6；2500 （3）X；4；3和9 1、在构建抗虫棉的基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。需用两种不同黏性末端的酶，防止错误连接，以及质粒自连、目的基因反向连接等问题。 2、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段分子量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。 本题考查了基因工程及电泳的相关知识，需要学生掌握限制酶的选择以及电泳的原理，结合题干信息答题。 7．【2026·黑吉辽蒙卷25·高考真题】平沙绿僵菌是一种昆虫病原真菌，通过分生孢子侵染蚊子，对蚊子致死率高，但引诱能力弱。利用松树长叶烯合酶基因（Tps）改造平沙绿僵菌，增强其引诱能力，据此研发“诱杀一体”的灭蚊剂。回答下列问题。 （1）为提高Tps基因在平沙绿僵菌中的表达效率，重新设计了长叶烯合酶编码序列，该序列与天然基因序列存在较大差异，但编码的氨基酸序列不变，获取该目的基因的方法是           。 注：质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽略不计；kb：千碱基对。 实验如上图，用限制酶EcoRⅤ切割pPK2质粒，然后与Tps基因连接，用           （填“E.coli”或“T4”）DNA连接酶可获得更高的连接效率。 经卡那霉素筛选得到的农杆菌中，除含有目的基因的重组质粒外，还可能存在           。为鉴定重组质粒是否正确连接，利用限制酶切割并电泳检测，下列限制酶组合和片段大小，属于正确连接的是           和           。 A.BamHⅠ/EcoRⅠ、0.7kb+6.1kb B.BamHⅠ/EcoRⅠ、1.1kb+5.7kb C.HindⅢ/EcoRⅠ、0.7kb+6.1kb D.HindⅢ/EcoRⅠ、1.1kb+5.7kb 农杆菌转化后，重组质粒上的T-DNA会转移并整合到平沙绿僵菌的           上。 为筛选工程化平沙绿僵菌，用PCR技术进行鉴定。Tps基因的转录模板链部分序列为：5′-ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC-3′，下列引物对可用于扩增该片段的是           。 A.5′-ATGTC…-3′、5′-CCTCG⋯-3′ B.5′-ATGTC⋯-3′、5′-GGAGC⋯-3′ C.5′-TACAG…-3′、5′-CCTCG…-3′ D.5′-TACAG⋯-3′、5′-GGAGC⋯-3′ （2）研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程菌培养物对蚊子的诱杀效果，如下表。 相关指标 培养物 访问次数（次/小0） 停留时间（分钟/小时） 2小时感染率（%） LT50（天） 第7天死亡率（%） 平沙绿僵菌 0.9 1.1 100 5.84 62.4 工程菌 2.4 5.9 100 4.04 84.3 注：感染率：感染孢子的蚊子比例；LT50（半数致死时间）：导致50%蚊子死亡所需的平均时间。 已知孢子附着量决定蚊子死亡速度，结合表中数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显著缩短且第7天死亡率更高的原因是           。 （3）该工程菌制剂在推广前，需经过严格的           评价，符合标准后方可推广。 【答案】（1）人工合成法（化学合成法）；T4；未插入目的基因的pPK2空质粒；A；D；染色体DNA；B  （2）工程菌的引诱能力更强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，附着的孢子量更多，孢子附着量决定蚊子死亡速度，因此致死速度更快，半数致死时间LT50缩短，第7天死亡率更高  （3）安全性 【解析】解：（1）重新设计的长叶烯合酶编码序列与天然基因序列存在较大差异，但编码的氨基酸序列不变，因此可以利用遗传密码的简并性（即多种密码子可编码同一种氨基酸），在不改变蛋白质氨基酸序列的前提下，重新编码mRNA的碱基序列，然后反转录重新设计DNA编码序列，这是人工合成的方法（化学合成法）。限制酶EcoRⅤ切割产生平末端，T4DNA连接酶连接平末端的效率高于E.coliDNA连接酶，因此选T4DNA连接酶来连接pPK2质粒与Tps基因。卡那霉素抗性基因是其标记基因，经卡那霉素筛选后，所有含有卡那霉素抗性基因的农杆菌均会被筛选出来，而除重组质粒外，还可能存在未插入目的基因的pPK2空质粒。由图示载体可知，用限制酶EcoRⅤ切割pPK2质粒，然后与Tps基因连接，则目的基因插入到BamHⅠ酶识别序列与EcoRⅠ酶识别序列之间，用限制酶切割并电泳，原质粒长度为5.0kb,目的基因总长度为0.7+1.1=1.8kb,因此重组质粒总长度为5.0+1.8=6.8kb。由图示可知，基因顺时针转录，如果目的基因正向插入，则目的基因的5'端应靠近载体上顺时针方向的启动子侧，由于质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽略不计，则BamHⅠ与EcoRⅠ之间的片段长度=目的基因长度，因此如果用BamHⅠ酶和EcoRⅠ酶进行双酶切，会得到0.7kb（被EcoRⅠ酶切割的左半部分目的基因片段）和6.8（重组质粒）−0.7=6.1kb两个长度的片段；如果用HindⅢ和EcoRⅠ酶切，会得到1.1kb（被EcoRⅠ酶切割的右半部分目的基因片段）和6.8−1.1=5.7kb两个长度的片段，因此正确组合是A和D。农杆菌转化法中，T-DNA会转移并整合到受体真菌的染色体DNA上。PCR引物需要与DNA两端的3'端互补，子链的延伸方向为5'→3'。转录模板链为5′−ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC−3′，左侧引物序列为5′−ATGTC…−3′，右侧引物与模板右侧的序列5′…GCTCC−3′反向互补，序列为5′−GGAGC…−3′，因此选B。  （2）根据题干和表格数据，转入Tps基因后工程菌引诱能力增强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，孢子附着量更高；而孢子附着量决定死亡速度，因此致死更快，LT50更短，最终第7天死亡率更高。  （3）转基因工程菌推广前，需要进行严格的生物安全性评价，确认不会对生态、人体造成风险后才可推广。  故答案为：  （1）人工合成法（化学合成法）；T4；未插入目的基因的pPK2空质粒；A；D；染色体DNA；B  （2）工程菌的引诱能力更强，蚊子访问次数更多、停留时间更长，附着的孢子量更多，孢子附着量决定蚊子死亡速度，因此致死速度更快，半数致死时间LT50缩短，第7天死亡率更高  （3）安全性 1、基因表达载体的构建：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的组成包括目的基因+启动子+终止子+标记基因。  （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。  （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。  （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，常用的标记基因是抗生素抗性基因。  2、农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 本题考查了基因工程的相关知识，需要学生掌握目的基因的获取以及基因表达载体的构建和目的基因导入受体细胞的方法，结合题干信息答题。 8．【2025·1月浙江卷25·高考真题】3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示。回答下列问题： （1）分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的 ______ ，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用 ______ 凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 ______ 。 （2）若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是 ______ 。 A.DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B.每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C.在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D.在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 （3）为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚—氯仿抽提除去杂质，最后加入 ______ 沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 ______ （A.P1和P2 B.P3和P4 C.P1和P4 D.P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有 ______ 功能。 （4）为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 ______ 进行比对。将Gpd基因的编码区与 ______ 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 【答案】（1）密码子；琼脂糖；更换微量移液器的枪头 （2）C （3）冷的95%乙醇；D；调控 （4）基因数据库；表达载体 【解析】解：（1）分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的密码子，根据碱基互补配对，确定DNA序列，进而设计1对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目标DNA片段。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要更换微量移液器的枪头，以避免交叉污染。 （2）A、DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染，可能扩增出其他DNA，从而出现另外一条条带，A错误； B、每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点，从而扩增出不同的DNA片段，从而出现另外一条条带，B错误； C、在基因组中Gpd基因有2个拷贝，扩增出的DNA是相同DNA，电泳时只会出现一个条带，C正确； D、在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因，可能将相似的基因扩增出来，从而出现另外一条条带，D错误。 故选：C。 （3）DNA在冷的95%乙醇中溶解度较低，可通过将酶切后的DNA经苯酚-氯仿抽提除去杂质，在加入冷的95%乙醇中沉淀，得到环形DNA。PCR过程中，子链的延伸方向为5′→3′，结合图示可知，应选择P2和P3引物进行第二次扩增。启动子可启动转录，终止子可终止转录，即启动子和终止子具有调控功能。 （4）为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二者相同，则说明克隆获得的Gpd基因准确。将Gpd基因的编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，使之进行表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 故答案为： （1）密码子；琼脂糖；更换微量移液器的枪头 （2）C （3）冷的95%乙醇；D；调控 （4）基因数据库；表达载体 基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质一抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 本题考查基因工程的相关知识，属于对理解和应用层次的考查。 9．【2025·全国卷7·高考真题】为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因（目的基因）插入质粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1～4结合位置如图所示，→表示引物5'→3'方向）。回答下列问题： （1）PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是 ______，而PCR过程中解开双链的方法是 ______。 （2）PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有 ______。 （3）该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是：______；②无扩增产物，原因是 ______；③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是 ______。 管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 模板 无 P0 Px 无 P0 Px 引物对 引物1和引物2 引物3和引物4 （4）设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期结果 ______。 【答案】（1）解旋酶     高温变性 （2）引物、脱氧核苷三磷酸 （3）作为对照（或答：鉴定反应体系是否有模板污染）    P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列     目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段 （4）提取酶X，催化相应底物（反应物）的反应，检测是否有产物生成。有产物生成，则证明酶X有活性 【解析】（1）在细胞中，DNA复制时解开双链的酶是解旋酶。而在PCR过程中，是通过高温变性（加热至90-95℃）的方法使DNA双链解开。 （2）PCR过程中，参与合成反应且不断消耗的组分有引物和dNTP（脱氧核苷三磷酸）。引物用于引导DNA聚合酶合成新的DNA链，dNTP脱去两分子磷酸，产生dAMP，进而为合成新的DNA链提供原料。 （3）实验中①和④的作用是作为对照。①无模板且引物对与③④相同，④无模板且引物对与⑤⑥相同，可对比说明模板对扩增的影响。②之所以无扩增产物，是因为P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列，无法扩增出子链DNA序列。③以Px为模板，引物1和引物2扩增出的是含目的基因的DNA片段；⑤以P0为模板，引物3和引物4扩增出的是质粒P0上一段DNA片段；⑥以Px为模板，引物3和引物4扩增出的是含目的基因和部分质粒序列的DNA片段。 （4）实验思路：将大肠杆菌培养后，提取酶X，设置一组含有酶X的反应体系和一组不含酶X的反应体系（作为对照），在适宜条件下，加入酶X的底物，检测底物的消耗情况或产物的生成情况。预期结果：含有酶X的反应体系中底物减少或有产物生成，而不含酶X的反应体系中底物无明显变化或无产物生成。 故答案为： （1）解旋酶     高温变性 （2）引物、脱氧核苷三磷酸 （3）作为对照（或答：鉴定反应体系是否有模板污染）    P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列     目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段 （4）提取酶X，催化相应底物（反应物）的反应，检测是否有产物生成。有产物生成，则证明酶X有活性 PCR（聚合酶链式反应）技术扩增基因的原理是DNA半保留复制。在适宜的温度、引物、DNA聚合酶、脱氧核苷酸等条件下，以目的基因的两条链为模板，按照碱基互补配对原则（A-T、G-C配对），通过变性（高温使DNA双链解开）、退火（低温使引物与模板结合）、延伸（中温下DNA聚合酶催化脱氧核苷酸连接到引物上延伸成新链）三个步骤循环往复，实现目的基因的大量扩增，每一轮循环后DNA分子数量呈指数增长。 本题主要考查的是基因工程的操作的相关知识，意在考查学生对基础知识的理解掌握的能力，难度适中。 10．【2025·四川卷19·高考真题】杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如图。回答下列问题。 注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5′-3′方向。②密码子对应的氨基酸：AAA—赖氨酸；AUG—甲硫氨酸（起始）；UUC—苯丙氨酸；ACA—苏氨酸；UCG—丝氨酸。 （1）用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用 ______引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是 ______。 （2）采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 ______条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是 ______。 （3）由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带 ______（填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致 ______，最终引起细菌死亡。 （4）重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是 ______。若运用发酵工程来生产拉素西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有 ______（答出1点即可）。 【答案】（1）F2、F4     保证载体在链霉菌细胞中能正常复制 （2）2     验证重组质粒是否构建成功（验证重组质粒是否包含目的基因或验证重组载体是否构建成功或验证目的基因成功导入质粒） （3）苯丙氨酸     翻译受阻，细菌无法合成蛋白质 （4）目的基因发生突变或变异       发酵条件优化（拉索西丁的分离纯化方法、工程链霉菌的生产稳定性、链霉菌的生物安全性、优化发酵条件、优化发酵培养基配方、改变菌体活性、提高产物合成效率、改变副产物产等，答案不唯一） 【解析】（1）引物需要结合到模板的3'端，且与目的基因的部分碱基序列互补配对，子链延伸方向为5'端→3'端，因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点，是为了保证保证载体在链霉菌细胞中能正常复制，使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。 （2）采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒，会得到载体片段和目的基因片段，共2条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是验证重组质粒是否构建成功（验证重组质粒是否包含目的基因或验证重组载体是否构建成功或验证目的基因成功导入质粒），若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带，说明酶切成功，重组质粒构建可能成功。 （3）拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。因为位点2对应的密码子是UUC，编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点，会导致翻译受阻，细菌无法合成蛋白质，最终引起细菌死亡。 （4）重组链霉菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是目的基因发生突变或变异，导致其表达的产物结构改变，从而失去杀菌活性。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有发酵条件的优化，如：拉索西丁的分离纯化方法、工程链霉菌的生产稳定性、链霉菌的生物安全性、优化发酵条件、优化发酵培养基配方、改变菌体活性、提高产物合成效率、改变副产物产等。 故答案为： （1）F2、F4     保证载体在链霉菌细胞中能正常复制 （2）2     验证重组质粒是否构建成功（验证重组质粒是否包含目的基因或验证重组载体是否构建成功或验证目的基因成功导入质粒） （3）苯丙氨酸     翻译受阻，细菌无法合成蛋白质 （4）目的基因发生突变或变异       发酵条件优化（拉索西丁的分离纯化方法、工程链霉菌的生产稳定性、链霉菌的生物安全性、优化发酵条件、优化发酵培养基配方、改变菌体活性、提高产物合成效率、改变副产物产等，答案不唯一） 基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选和获取 从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建 基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选，是基因工程的核心步骤。 （3）将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。 将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。 （4）目的基因的检测与鉴定 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 本题考查基因工程的相关内容，要求学生能结合所学知识正确作答。 11．【2025·安徽卷20·高考真题】稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 （1）采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用 ______（填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是 ______。 （2）经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的 ______。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落 ______（填序号），出现菌落④的可能原因是 ______。 （3）内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路。 ______ 【答案】（1）稀释涂布平板法       分离不同条件下生长的内生放线菌 （2）大量扩增      ②重组质粒上的R-U（或R-D）与内生放线菌DNA的R-U（或R-D）互换后，重组质粒整合到了内生放线菌的基因组中 （3）设置三个培养基，甲和乙为正常培养基，丙为缺铁的正常培养基，并在三个培养基上均接种等量的稻瘟病致病菌，甲和丙不作处理，乙接种适量内生放线菌，培养相同时间后观察，可以看到乙和丙中的稻瘟病致病菌的菌落直径均小于甲。 【解析】（1）根据题意，要观察菌落的生长情况，可用等量的研磨液进行稀释涂布。由于水稻叶片有不同的内生放线菌，在不同选择培养基，不同温度下培养内生放线菌，可分离不同条件下生长的内生放线菌。 （2）PCR是通过半保留复制对DNA进行大量扩增。若R基因被敲除，引物1和2只能扩增出R-U和R-D片段，长度为1000bp；出现菌落④的可能原因是重组质粒上的R-U与内生放线菌DNA的R-U互换后，形成了一个含R基因和重组质粒的长链DNA，导致引物1和2扩增后得到了7000bp的片段。 （3）实验思路是：设置三个培养基，甲和乙为正常培养基，丙为缺铁的正常培养基，并在三个培养基上均接种等量的稻瘟病致病菌，甲和丙不作处理，乙接种适量内生放线菌，培养相同时间后观察，可以看到乙和丙中的稻瘟病致病菌的菌落直径均小于甲。 故答案为： （1）稀释涂布平板法       分离不同条件下生长的内生放线菌 （2）大量扩增      ②重组质粒上的R-U（或R-D）与内生放线菌DNA的R-U（或R-D）互换后，重组质粒整合到了内生放线菌的基因组中 （3）设置三个培养基，甲和乙为正常培养基，丙为缺铁的正常培养基，并在三个培养基上均接种等量的稻瘟病致病菌，甲和丙不作处理，乙接种适量内生放线菌，培养相同时间后观察，可以看到乙和丙中的稻瘟病致病菌的菌落直径均小于甲。 1、PCR原理：目的基因受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3'端，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即呈指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。 2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 本题综合考查了微生物培养、基因工程等内容，旨在考查考生对知识的综合应用能力，以及实验设计能力。 12．【2025·广西卷21·高考真题】CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： （1）构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是______。 （2）将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是______。 （3）将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有______，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有______（至少写出2点）。 （4）研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及______。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是______，②是______，③是______，④是______。 【答案】（1）EcoRⅠ、NotⅠ （2）便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落 （3）肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养；肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等 （4）使用PD-1抗体或PD-L1抗体；编码PD-L1序列；终止子；溶解酶基因序列；多种酶基因序列 【解析】（1）构建含CAR基因的重组质粒，为了避免质粒和目的基因自连、目的基因反向插入，常采用双酶切法；目的基因CAR基因需要插入质粒的启动子和终止子区域，而限制酶ClaⅠ和HindⅢ位于启动子和终止子区域之外，且CAR基因片段中间含有BamHⅠ识别序列，故应该选用EcoRⅠ和NotⅠ分别切割CAR基因和质粒。 （2）固体培养基通常是在液体培养基中添加一定量的凝固剂制成的。在固体培养基上，人们可以清楚地观察到在培养基表面由单个细胞生长繁殖成的菌落，质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养的目的是便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落，方便后续筛选出重组质粒。 （3）研究目的是探究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，自变量为是否含有CAR基因的T细胞，而因变量抗肿瘤效果，即肿瘤细胞凋亡率的检测指标为肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等；实验组为CAR-T与肿瘤细胞共同培养，对照组为肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养。 （4）肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制，为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合，使用PD-1抗体、PD-L1抗体分别与PD-1、PD-L1的结合；根据题干信息：与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子，可知新的重组质粒中①是编码PD-L1序列；溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率，且P启动子是双向启动子，可知②是终止子，③是溶解酶基因序列，④是多种酶基因序列。 故答案为： （1）EcoRⅠ、NotⅠ （2）便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落 （3）肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞（正常T细胞）与肿瘤细胞共同培养；肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等 （4）使用PD-1抗体或PD-L1抗体；编码PD-L1序列；终止子；溶解酶基因序列；多种酶基因序列 1、基因工程的工具：①限制酶，能识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；②DNA连接酶，连接两个核苷酸之间的磷酸二酯键；③运载体，质粒是最常用的运载体，除此之外，还有λ噬菌体衍生物、动植物病毒。 2、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有利用PCR技术扩增和人工合成等。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法等；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 本题考查了基因工程的相关知识，需要学生掌握限制酶的选择方法以及培养基的配制。 13．【2025·河北卷22·高考真题】为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： （1）在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是 ______和 ______。模板与引物在PCR反应的 ______阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为 ______。 （2）载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GP1两端应添加 ______（填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成 ______键。 （3）若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为 ______，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量 ______，则表明融合蛋白能结合镉离子。 （4）将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是 ______。240μmol•L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是 ______。 （5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是 ______和 ______。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖 ②衣藻生长速率受镉离子浓度影响 ③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质 ④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 【答案】（1）引物；脱氧核苷酸；复性；PCR过程需要在高温下进行，普通DNA聚合酶在高温下会变性失活 （2）SmaⅠ和EcoRⅠ；磷酸二酯 （3）发出黄色荧光；高 （4）转基因衣藻细胞表面的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻细胞的毒害作用；镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，所以转基因衣藻和野生型衣藻都受到镉离子的毒害。 （5）①；③ 【解析】（1）在PCR反应中，引物与模板链结合后，在DNA聚合酶的作用下，以脱氧核苷酸为原料合成新的DNA链。随着反应的进行，引物会结合到新合成的DNA链上，数量逐渐减少；脱氧核苷酸作为合成DNA的原料，不断被消耗，分子数量也逐渐减少。PCR反应包括变性、复性和延伸三个阶段。在复性阶段，温度降低，引物与模板DNA单链的互补序列通过碱基互补配对原则结合。PCR过程需要在高温下进行（如变性阶段需90-95℃高温使DNA双链解开），普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，这样才能在高温条件下保持活性，催化DNA子链的合成。 （2）观察可知，为避免错误连接，GP1基因两端添加SmaⅠ和EcoRⅠ的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体，用这两种限制酶切割载体和GP1基因后，可产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。又因为NbeⅠ和XbaⅠ限制酶切割后产生相同的黏性末端，按照连接的顺序在将GP1连接到载体时应用SmaⅠ和EcoRⅠ。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基因连接起来。 （3）因为构建的载体中有黄色荧光蛋白YFP编码序列，若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为只有融合蛋白成功表达，才会有黄色荧光蛋白产生。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，由于转基因衣藻能合成并分泌定位于细胞壁的融合蛋白（含镉离子结合蛋白CADR ），若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高，则表明融合蛋白能结合镉离子。 （4）转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻，原因可能是转基因衣藻细胞表面的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻细胞的毒害作用。在240μmol/L镉离子浓度下，镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，大量镉离子仍然会对衣藻细胞产生毒害作用，所以转基因衣藻和野生型衣藻生长都被明显抑制。 （5）与施加化学药物法相比，转基因衣藻用于水体镉污染治理，衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖（①），能够持续发挥吸附镉离子的作用；衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质（③），在治理镉污染的同时，对水体的富营养化也有一定的改善作用。而衣藻生长速率受镉离子浓度影响（②）不是其环境治理优势；衣藻吸附的镉可沿食物链传递（④）会带来潜在风险，也不是优势。 故答案为： （1）引物；脱氧核苷酸；复性；PCR过程需要在高温下进行，普通DNA聚合酶在高温下会变性失活 （2）SmaⅠ和EcoRⅠ；磷酸二酯 （3）发出黄色荧光；高 （4）转基因衣藻细胞表面的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻细胞的毒害作用；镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，所以转基因衣藻和野生型衣藻都受到镉离子的毒害。 （5）①；③ 基因工程操作一般有以下四步： 1、目的基因的获取：从自然界已有的物种中分离，或人工合成。人工合成可通过反转录法（以mRNA为模板合成DNA）、化学合成法（已知目的基因核苷酸序列时直接合成）等。 2、基因表达载体的构建：这是基因工程的核心步骤。将目的基因与载体（如质粒）用限制酶切割，再用DNA连接酶连接，形成重组DNA分子。载体需具备限制酶切割位点、标记基因、启动子、终止子等元件，以保证目的基因在受体细胞中能稳定存在、复制和表达。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞类型选择合适方法。如导入植物细胞常用农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；导入动物细胞常用显微注射技术；导入微生物细胞常用感受态细胞法（用Ca2⁺处理细胞使其处于感受态）。 4、目的基因的检测与鉴定：分子水平检测包括PCR检测、抗原-抗体杂交（检测目的基因是否翻译）；个体水平鉴定如观察转基因生物是否表现出相应性状。 本题涵盖基因工程（PCR技术、限制酶与DNA连接酶应用、载体构建）、蛋白质表达检测以及生物对环境胁迫的响应等多个高中生物重点知识模块，既考查学生对基础知识的记忆，又考查分析推理能力。对基因工程、细胞代谢、生物与环境关系等基础知识，学生要准确记忆和理解；要学会从图表中提取关键信息；对于分析原因类问题，要结合所学知识，进行合理、严谨的逻辑推导。 14．【2025·青海卷21·高考真题】马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 限制酶 识别序列及切割位点 BglⅡ 5′-A↓GATCT-3′ 3′-TCTAG↑A-5′ NdeⅠ 5′-CA↓TATG-3′ 3′-GTAT↑AC-5′ XhoⅠ 5′-C↓TCGAG-3′ 3′-GAGCT↑C-5′ EcoRⅠ 5′-G↓AATTC-3′ 3′-CTTAA↑G-5′ BamHⅠ 5′-G↓GATCC-3′ 3′-CCTAG↑G-5′ SalⅠ 5′-G↓TCGAC-3′ 3′-CAGCT↑G-5′ XbaⅠ 5′-T↓CTAGA-3′ 3′AGATC↑T-5′ （1）PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、______、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 ______步骤中起作用。 （2）图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的 ______（填“5′端”或“3′端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5′-______-3′，切割载体时应选用的两种限制酶是 ______。PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 （3）用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到 ______，抗性基因 ______可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经 ______形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 【答案】（1）4种脱氧核苷酸     延伸 （2）5'端     AGATCT     BamHⅠ、EcoRⅠ （3）栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上     2     再分化 【解析】（1）PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。PCR一般分为变性、复性和延伸三步，其中DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用。 （2）扩增目的基因时，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。在载体的启动子和终止子之间有BamHI、EcoRI和XbaI的识别序列，而S基因内部含有XbaI、NdeI和BamHI的识别序列，使用上述限制酶会切割基因，结合各种限制酶的识别序列及切割位点，需要用BamHI、EcoRI切割载体，用BamHI的同尾酶BglⅡ和EcoRI切割S基因，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'。 （3）T-DNA属于可转移DNA，用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上，抗性基因1位于T-DNA外部，用于筛选含有重组载体的农杆菌，而抗性基因2位于T-DNA内部，可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 故答案为： （1）4种脱氧核苷酸     延伸 （2）5'端     AGATCT     BamHⅠ、EcoRⅠ （3）栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上     2     再分化 1、基因工程的步骤：目的基因的提取、目的基因与运载体结合、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 2、对限制酶选择条件：不能破坏目的基因和启动子、终止子，以便于目的基因和载体正确连接。 本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。 15．【2025·黑吉辽蒙卷25·高考真题】香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 （1）可从 ______中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入 ______和 ______限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 ______连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 ______的污染。初步判断实验组 ______（从“1～4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 ______。 （3）为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 ______。 a：5′-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3′ b：5′-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3′ c：5′-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3′ d：5′-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3′ （4）进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 ______含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 【答案】（1）序列数据库（序列比对工具）；XhoⅠ；XbaⅠ；DNA连接酶 （2）试剂；1；目的基因N大小为2.3kb （3）GCC （4）香树脂醇 【解析】（1）序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等可以帮助我们获取基因N的编码序列，设计特定引物。为保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用SpeⅠ和XhoⅠ酶切，由于目的基因N含有SpeⅠ识别序列，故N基因不能使用SpeⅠ酶切，XbaⅠ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用XbaⅠ替换SpeⅠ，即N基因两端应该含有XbaⅠ和XhoⅠ识别序列；N基因a链为转录模板链，扩增后的目的基因转录模板链上含有引物1，编码链上含有引物2，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5'端添加XbaⅠ、引物1的5'端添加XhoⅠ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段。 （2）在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检验PCR反应中是否有试剂污染。重组质粒的大小约9.5kb,而质粒pYL本身7.2kb,可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N。 （3）a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，根据a引物5 '-端首位GCA为240位，则c引物5 '-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。 （4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 故答案为： （1）序列数据库（序列比对工具）；XhoⅠ；XbaⅠ；DNA连接酶 （2）试剂；1；目的基因N大小为2.3kb （3）GCC （4）香树脂醇 PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 本题考查基因工程的相关内容，要求学生能运用所学的知识正确作答。 16．【2024·山东卷25·高考真题】研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 ​ （1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越           （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有           种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′-           -3′和5′-           -3′。 （2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素           筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是           ，其中纯合的突变植株是           （填序号）。 （3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为           ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 【答案】（1）低；256；GTTT；AAAC （2）卡那霉素；SacⅠ；④ （3） 【解析】解：（1）引物通过碱基互补配对与目标基因结合，若引物越短，可能的结合位点越多，特异性越低。根据题意，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，由图中可知，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，产生的黏性末端有4个碱基，并且可以是任意碱基，因此理论上可以产生的黏性末端有44=256种。载体经BsaⅠ酶切后，切口两侧各有一个黏性末端，根据BsaⅠ酶识别的序列及酶切位点可知，载体上保留的黏性末端序列应为5′-GTTT-3′和5′-AAAC-3′。 （2）观察载体信息，T-DNA片段内只有抗卡那霉素抗性基因，而且农杆菌侵染植物时，T-DNA能整合到宿主细胞的染色体DNA上，随染色体DNA复制、转录、翻译，因此可以使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。观察目标序列及突变序列，突变后，多了一个SacⅠ的酶切位点，即使用限制酶SacⅠ，在目标序列上没有酶切位点，电泳后只有一个条带；在突变序列上有一个酶切位点，酶切后电泳，可以看到两个条带，故只看到两个条带的电泳结果④表示纯合突变植株。 （3）用L'表示T-DNA插入成功的染色体，则该植株基因型可记为LL'，其自交子代基因型为LL：LL'：L'L'=1：2：1，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株L'L'占。 故答案为： （1）低；256；GTTT；AAAC （2）卡那霉素；SacⅠ；④ （3） 1、基因工程的基本操作步骤主要有：目的基因的筛选和获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 2、PCR技术的原理是DNA复制。PCR技术实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链。 本题结合电泳图考查了PCR及限制酶的特性及功能，还考查了基因工程的应用，旨在考查考生对基因工程相关知识的掌握情况，及对所学知识的理解能力及相互联系的能力。 17．【2024·广东卷21·高考真题】驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 ​ 回答下列问题： （1）研究者优化了培养基的           （答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和BC膜的复合物）。 （2）研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a,载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子PBAD（被工程菌RNA聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为           ，理由是           。 （3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为           （答两点）。 （4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是           。 （5）有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：           。 【答案】（1）碳源、氮源 （2）PT7、PBAD、PBAD    基因2和3表达不具有活性的产物，被蓝光激活后再启动基因1表达 （3）抑制细菌生长，从而防止杂菌污染；去除丢失质粒的菌种 （4）该处细胞中T7RNAP被激活，合成酪氨酸酶进而合成黑色素 （5）将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶 【解析】解：（1）培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等。 （2）根据图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP的N端（nMag）与T7RNAP的C端（m-MAg）结合，从而激活T7RNAP。再根据图一分析，蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1表达出酪氨酸酶，酪氨酸酶催化染色液中酪氨酸形成黑色素。可见基因2和3表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达。综上可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD、PBAD。 （3）光控表达载体携带大观霉素抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，抗生素可以抑制细菌生长，从而防止杂菌污染，还可以起到去除丢失质粒的菌种的作用。 （4）由（2）中分析可知，细胞中T7RNAP激活，合成酪氨酸酶进而合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。 （5）根据上述分析，题干中的设计思路最终BC膜被染成黑色，要生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶。 故答案为： （1）碳源、氮源 （2）PT7、PBAD、PBAD    基因2和3表达不具有活性的产物，被蓝光激活后再启动基因1表达 （3）抑制细菌生长，从而防止杂菌污染；去除丢失质粒的菌种 （4）该处细胞中T7RNAP被激活，合成酪氨酸酶进而合成黑色素 （5）将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶 培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；根据物理性质分为固体培养基和液体培养基，培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质和氧气的要求。 本题考查微生物培养与分离、基因工程的相关知识，要求考生理解识记有关技术的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能将教材中的知识结合题中信息进行迁移应用。 18．【2024·广西卷21·高考真题】M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题： 注：基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条，即可表示为Aa；两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。 （1）在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物 ______ （选填“3′端”或“5′端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是 ______ ；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是 ______ 。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行 ______ 。 （2）培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是 ______ （至少答2方面）。 （3）为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为 ______ 实验模型小鼠。 （4）为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是 ______ 。 【答案】（1）5′端     两端包含loxP序列的终止子     两端包含loxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列     电泳 （2）清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压 （3）cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM （4）添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性 【解析】解：（1）PCR扩增DNA时，子链的合成方向是5'→3'，故应在引物的5'端添加被限制酶识别的序列。终止子：使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。转录是以DNA为模板合成RNA的过程。从转录水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的终止子。终止密码子：蛋白质翻译过程中终止肽链合成的mRNA上的三联体碱基序列。从翻译水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列。为鉴定载体2是否构建成功，需利用限制酶切割载体后进行电泳，观察是否出现预期大小的目标条带。 （2）细胞培养液需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。此外，定期更换培养液还能维持细胞生存适宜的pH和渗透压、确保细胞获得充足的营养，保证细胞的健康生长和繁殖。 （3）实验的目的是制备M基因表达可控的实验模型小鼠，对M基因的控制是通过蛋白A激活诱导型T启动子来调控的。为了便于追踪，构建了带绿色荧光蛋白基因的M基因，方便观察M基因的表达情况，而自身所带的M基因则需要被敲除，已知两端添加LoxP位点的M基因可被Cre重组酶敲除，所以需要构建两端添加了LoxP位点的M基因纯合小鼠，相关基因型为foxM/1oxM。该小鼠体内需要有Cre重组酶来切除自身的M基因，同时还要有表达蛋白A的基因以及融合了绿色荧光蛋白基因的M基因来替换被敲除的M基因。综上分析，需进行如下杂交： 最终获得基因型为cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM的实验模型小鼠。 （4）添加四环素与未添加相比，添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。 故答案为： （1）5′端     两端包含loxP序列的终止子     两端包含loxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列     电泳 （2）清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压 （3）cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM （4）添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性 基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定： （1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原—抗体杂交技术。 （2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 本题主要考查基因工程的内容，要求考生识记相关知识，并结合所学知识准确答题。 19．【2024·江苏卷23·高考真题】为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：    （1）步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是  ______ 。  （2）步骤②转化时，科研人员常用  ______ 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有  ______ 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是  ______ 。  （3）步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与  ______ 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa,将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是  ______ （从图2的“A～D”中选填）。  （4）步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。  （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是  ______ 。  （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是  ______ 。  （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有  ______ 。 【答案】（1）EcoRⅠ、HindⅢ  （2）CaCl2    卡那霉素      S-F、E-R  （3）启动子      C  （4）（ⅰ）与不加NaCl相比，加入NaCl后SOD-ELP50组沉淀中的SOD-ELP50蛋白相对含量显著升高，SOD组沉淀中蛋白含量很低  （ⅱ） 高温使蛋白变性  （ⅲ） 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 【解析】解：（1）由图示可知，限制酶a和限制酶b切割ELP50的片段需要与SOD片段相连接，所以二者需要形成一个相同的黏性末端，根据二者连接后的位置关系，应选择EcoRⅠ（限制酶a）；限制酶b需要同时能将SOD的左侧和ELP50的右侧切开，应选择HindⅢ，所以步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是EcoRⅠ、HindⅢ。  （2）步骤②转化时，常用CaCl2处理大肠杆菌，使细胞处于感受态（容易吸收周围环境DNA分子的状态）；基因表达载体上有卡那霉素的抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。由图示可知，S-F为SOD的左侧引物、S-R为SOD的右侧引物、E-F为ELP50的左侧引物、S-R为ELP50的右侧引物。用PCR技术扩增融合基因，需要在融合基因的两侧选择引物，应选用的一对引物是S-F、E-R。  （3）启动子是RNA聚合酶的识别和结合位点，步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与启动子结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa,SOD为462bp、ELP50为750bp,则形成的SOD-ELP50蛋白质大约含有（462+750）÷3=404个氨基酸，则SOD-ELP50蛋白相对分子质量为0.11×404=44.44，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是C。  （4）（ⅰ）由图示可知，20℃时，与不加NaCl相比，加入NaCl后SOD-ELP50组沉淀中的SOD-ELP50蛋白相对含量显著升高，SOD组沉淀中蛋白含量很低。  （ⅱ）100℃时，由于高温使蛋白变性，导致各组中所有蛋白都沉淀。  （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点为低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。  故答案为：  （1）EcoRⅠ、HindⅢ  （2）CaCl2    卡那霉素      S-F、E-R  （3）启动子      C  （4）（ⅰ）与不加NaCl相比，加入NaCl后SOD-ELP50组沉淀中的SOD-ELP50蛋白相对含量显著升高，SOD组沉淀中蛋白含量很低  （ⅱ） 高温使蛋白变性  （ⅲ） 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 基因表达载体包括目的基因、标记基因、启动子和终止子等；启动子是一段由特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出蛋白质；终止子位于基因的下游，作用是终止转录，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。 本题考查了基因工程的相关知识，意在考查考生理解所学知识要点、把握知识间内在联系的能力；能运用所学知识，对生物学问题作出准确的判断。 20．【2024·河北卷22·高考真题】新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： （1）实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为           启动子。Nos为终止子，其作用为           。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶           和           对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 （2）利用           方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测           ，通过           技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 （3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为           。选择纯合体进行后续研究的原因是           。 （4）制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8+T细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的           免疫和           免疫。 （5）利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是           。（答出两点即可） 【答案】（1）水稻胚乳细胞特异表达的基因的     终止转录     HindⅢ；EcoRⅠ （2）农杆菌转化    r2HN基因转录产生的mRNA     抗原—抗体杂交 （3）    纯合体自交后代不发生性状分离 （4）体液     细胞 （5）不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高 【解析】（1）利用水稻细胞培育能表达r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器，需要使用在水稻胚乳细胞中特异性表达的基因的启动子。Nos为终止子，终止子所起作用为终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点，KpnⅠ会破坏启动子序列，因而不能选用；SacⅠ位于终止子序列之外，因而不能选用。故为了将目的基因插入到载体的启动子和终止子之间，需要选用HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。 （2）获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌转化的方法使目的基因进入水稻细胞。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测转录所产生的相应的mRNA，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。 （3）单一位点插入目的基因的植株，相当于杂合子，其自交后代含有r2HN基因的纯合子为。由于纯合体自交后代不发生性状分离，所以选择纯合体进行后续研究。 （4）据图可知，实验组的抗体水平和CD8+T细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞，即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。 （5）通过水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高等优点。 故答案为： （1）水稻胚乳细胞特异表达的基因的     终止转录     HindⅢ；EcoRⅠ （2）农杆菌转化    r2HN基因转录产生的mRNA     抗原—抗体杂交 （3）    纯合体自交后代不发生性状分离 （4）体液     细胞 （5）不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高 基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能将教材中的知识结合题中信息进行迁移应用。 21．【2024·甘肃卷21·高考真题】源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。 （1）过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是 ______ 。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了 ______ 。 （2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是 ______ 。 （3）过程⑤在基因工程中称为 ______ ，该过程需要的主要酶有 ______ 。 （4）过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 ______ 。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种 ______ 的生理状态。 （5）课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是 ______ （答出两点）。 生物质原料 降解率（%） 协同系数 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2 小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64 玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02 玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34 注：混1和混2表示三种酶的混合物 【答案】（1）只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖  菌落产生的纤维素酶的活性和量有关 （2）耐高温的DNA聚合酶 （3）基因表达载体的构建  限制酶和DNA连接酶 （4）繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等 易于吸收环境DNA （5）降解时的温度不同、降解时的pH不同 【解析】解：（1）选择培养基只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长，在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖；刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色，当纤维素被纤维素酶分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，这个透明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力：透明圈越大，说明纤维素分解菌分解纤维素的能力越强，即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。 （2）扩增目的基因片段在PCR仪中进行，由于PCR过程中所需温度较高，而酶活性的发挥需要适宜温度，因此需要耐高温的DNA聚合酶。 （3）据图可知，酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒，则⑤为基因表达载体的构建，该过程需要限制酶和DNA连接酶。 （4）大肠杆菌是原核生物，作为受体细胞的优点繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等；将目的基因导入微生物细胞时，先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，即处于感受态。 （5）不同酶的最适温度、最适pH不同，当温度和pH改变时，酶促反应速率也会受到影响，故表中协同系数存在差异的原因是降解时的温度不同、降解时的pH不同。 故答案为： （1）只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖  菌落产生的纤维素酶的活性和量有关 （2）耐高温的DNA聚合酶 （3）基因表达载体的构建  限制酶和DNA连接酶 （4）繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等 易于吸收环境DNA （5）降解时的温度不同、降解时的pH不同 1、在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。 2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 本题考查微生物培养、酶的应用和基因表达的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。 22．【2024·福建卷18·高考真题】病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： （1）利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是           。 （2）将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是           。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用           限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 （3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a,使其           。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是           。 （4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是           。 （5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是           。 【答案】（1）两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 （2）EcoRⅠ和NotⅠ；AgeⅠ和HindⅢ （3）超数排卵；桑葚胚易于在小鼠子宫着床 （4）排除PCR体系中外源DNA的污染 （5）该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染 【解析】解：（1）PCR技术包括：高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链，即复性温度下发生的扩增过程是两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合。 （2）结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotⅠ的识别序列，且这两个序列位于启动子和终止子之间，因此，将CD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotⅠ（SacⅠ会破坏目的基因，不能选）。由于AgeⅠ和HindⅢ这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段，因此为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 （3）为获取大量胚胎用于移植，用促性腺激素处理小鼠a使其超数排卵，这样可以得到更多的卵子用于受精和胚胎发育。将胚胎移植到小鼠c的子宫中时，由于桑葚胚易于在小鼠子宫着床，因此应选用桑葚胚。 （4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是排除PCR体系中外源DNA的污染，从而保证检测结果的准确性。 （5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，进而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR无法表达，因而干扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。 故答案为： （1）两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 （2）EcoRⅠ和NotⅠ；AgeⅠ和HindⅢ （3）超数排卵；桑葚胚易于在小鼠子宫着床 （4）排除PCR体系中外源DNA的污染 （5）该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染 PCR技术： （1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制。 （3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。 （4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）。 （5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 本题主要考查PCR技术、基因工程的相关知识，意在考查考生理解所学知识要点、把握知识间内在联系的能力，能够运用所学知识，对生物学问题作出准确的判断，难度适中。 23．【2023·广东卷20·高考真题】种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。 回答下列问题： （1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与 ______ 植株的种子大小相近。 （2）用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和 ______ 进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备 ______ 。 （3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（图1）。用于后续验证突变基因与表型的关系。​ ①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 ______ 。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 ______ %的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性植株 ______ （填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 ______ %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。 为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见图2，在图2电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。 【答案】（1）野生型 （2）运载体     启动子和终止子 （3）①DAI基因和卡那霉素抗性基因 ②75% ③自交     100% 【解析】解：（1）由题干信息可知，突变体是野生型DAI基因发生隐性突变产生的，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因（显性基因）转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近，即表现显性性状。 （2）构建基因表达载体时，通过PCR扩增的DAI基因和运载体需要用限制酶进行切割，然后用DNA连接酶将两者连接起来。其中在DAI基因的上游序列添加启动子，在DAI基因的下游序列添加终止子，以利于DAI基因可以正常表达。 （3）①由图1可知，T0代植株用农杆菌转化法（T-DNA携带DAI基因和卡那霉素抗性基因）进行了处理，若自交产生的T1代种子播种在含有卡那霉素的选择培养基上出现能够正常生长的个体，说明其基因组中插入了DAI基因和卡那霉素抗性基因。 ②T1代阳性植株细胞中染色体上含有DAI基因，由于题干“选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株”，因此T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性：阴性=3：1，故选择阳性率约75%（）的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性植株自交所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择单株种植在选择性培养基上阳性率达到100%的幼苗作为目标转基因植株，因为这时所有的幼苗都含有DAI基因。 分析图2可知，突变型基因是由野生基因中某一位置的碱基G替换为碱基A造成的，因此其基因长度都是150bp,由于野生型基因中没有限制酶X的切割位点，而突变型基因中含有限制酶X的切割位点，会将突变型基因切割成50bp和100bp两个片段，即电泳图中野生型基因只有150bp一个条带，而突变型基因有50bp和100bp两个条带。图示如下： 故答案为： （1）野生型 （2）运载体     启动子和终止子 （3）①DAI基因和卡那霉素抗性基因 ②75% ③自交     100% 1、基因突变包括显性突变和隐性突变。 2、基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤： 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，其作用使转录终止。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。 3、农杆菌转化法： 本题结合图形，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。 24．【2023·江苏卷23·高考真题】为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：    （1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有  ______ ，扩增程序中最主要的不同是  ______ 。  （2）有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用  ______ 。    A.ATGGTG-----CAACCA  B.TGGTTG----CACCAT  C.GACGAG---CTGCAG  D.CTGCAG-----CTCGTC  （3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有  ______ 。  （4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有  ______ 。  A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落  B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高  C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落  D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化  （5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有  ______ 。    （6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是  ______ 。 【答案】（1）模板（片段F1、片段F2）、引物     退火（复性）温度    （2）C  （3）限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶  （4）BCD  （5）P3、P4  （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 【解析】解：（1）PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是退火（复性）温度 。  （2）引物需要与目的基因模板链的3'端互补，据图可知，引物F2-F需要与基因AnB1的模板链互补，而基因AnB1的上游序列与基因EGFG的下游序列存在部分相同的碱基序列，所以需要引物F2-F的5'端部分序列能与EGFG的下游部分序列存在碱基互补配对，结合图2中基因AnB1和基因EGFG的碱基序列可知，5'-CTGCAG-3'与所给的基因AnB1一条链中上游靠后的序列相同，说明该部分引物序列能与基因AnB1的未给出的另一条链发生碱基互补，同理5'-GACGAG-3'与所给基因EGFG的一条链下游靠前的位置部分碱基序列相同，因此该部分引物序列能与基因EGFG的未给出的另一条链发生碱基互补，因此引物F2-F的序列为5'-GACGAG……CTGCAG-3'，即C符合题意，ABD不符合题意。 （3）传统重组质粒构建需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）和、DNA连接酶。  （4）A、用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，应选择有30～300菌落数的平板，A正确；  B、抗性平板未长出菌落的一般原因是转化失败（如感受态失活、质粒未转入、抗生素浓度过高等），而非培养基温度过高，B错误；  C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；  D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，稀释涂布得到的单菌落可能为多个细胞共同形成，并非绝对纯克隆，需要进一步划线纯化，D错误。  故选：BCD。  （5）EGFP为720bp,AnBI为390bp,二者的总大小为720bp+390bp=1100bp,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。  （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。  故答案为：  （1）模板（片段F1、片段F2）、引物     退火（复性）温度    （2）C  （3）限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶  （4）BCD  （5）P3、P4  （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 基因工程技术的基本步骤：  （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。  （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。  （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。  （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 本题结合图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能正确分析题图，再结合所学的知识准确答题。 25．【2023·河北卷23·高考真题】单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。 回答下列问题： （1）根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的            差异获得硅藻粗提DNA，PCR扩增得到目的基因。 （2）超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、            和            等。本研究中目的基因为            。 （3）PCR扩增时引物通过            原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物，对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1为本实验的            组，样品2有特异性扩增产物，结果表明            。 （4）利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析，相对于品系A，品系B的胞内脂质含量平均水平明显            。同时，还需测定            以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。 （5）胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析，ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高，            ，最终促进胞内脂质合成。 （6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为            。（答出两点即可） 【答案】（1）溶解度 （2）启动子     终止子    苹果酸酶基因（或“ME基因”） （3）碱基互补配对     对照     引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME基因序列整合到硅藻细胞基因组中”） （4）增加     细胞数量 （5）有氧呼吸生成的ATP增多 （6）节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”） 【解析】解：（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。因此，根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的溶解度差异可以得到硅藻的粗提DNA。以此方法得到的粗提DNA可以作为PCR扩增目的基因的模板。 （2）基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子和终止子均为一段有特殊序列结构的DNA片段。它们分别位于目的基因的上下游。本研究中的目的基因是来源于硅藻的苹果酸酶（ME）基因。 （3）PCR是一项根据DNA半保留复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。对照实验一般要设置对照组和实验组。本实验的对照组中以非转基因的硅藻细胞基因组DNA作为PCR模板，而在实验组中以转ME基因的硅藻细胞基因组DNA作为模板。如此比较两个实验扩增结果可以判定引物间的载体序列是否整合到硅藻细胞的基因组中，从而推测ME基因序列是否整合到硅藻细胞基因组中。 （4）硅藻细胞内的脂质含量和繁殖速率是利用单细胞硅藻生产生物柴油的两个重要影响因素。据图3分析可知，相对于非转基因硅藻细胞品系A，转基因硅藻细胞品系B的胞内脂质含量平均值显著提高。在测定硅藻细胞内脂质含量的同时，还需测定在相同发酵条件下品系A与B的硅藻细胞数量，从而可筛选获得高产生物柴油的优良硅藻细胞品系。 （5）细胞内脂质的合成需要大量ATP。苹果酸酶（ME）可催化苹果酸生成NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析可知，ME基因的超表达导致线粒体中的NADH水平升高，NADH进一步通过有氧呼吸产生大量ATP，最终促进细胞内脂质的合成。 （6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势为：能够通过发酵大量生产、不受季节和气候限制、节约土地资源、节约淡水以及节约粮食资源等。 故答案为： （1）溶解度 （2）启动子     终止子    苹果酸酶基因（或“ME基因”） （3）碱基互补配对     对照     引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中（或“ME基因序列整合到硅藻细胞基因组中”） （4）增加     细胞数量 （5）有氧呼吸生成的ATP增多 （6）节约土地资源、不受季节和气候限制（或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”） 1、PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在生物体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 2、PCR原理：DNA半保留复制。 3、PCR基本条件：DNA模板、4种脱氧核苷三磷酸、2种引物、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液。 本题考查PCR技术的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。 26．【2022·1月浙江卷31·高考真题】我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。回答下列问题： （1）新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用_________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的____________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 （2）接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的__________基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是__________________________________________。 （3）单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的_______细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和____________。 【答案】（1）逆转录    核酸探针 （2）抗原    载体    使腺病毒失去复制能力 （3）脾    动物血清 【解析】解：（1）RNA做模板合成DNA，利用逆转录酶；PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针，检测新冠病毒核酸。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 （2）腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的抗原基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的载体。将腺病毒复制基因敲除的目的是使腺病毒失去复制能力。 （3）单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和动物血清。 故答案为： （1）逆转录    核酸探针 （2）抗原    载体    使腺病毒失去复制能力 （3）脾    动物血清 1、无菌操作包括灭菌和消毒两种方式。消毒的方法有巴氏消毒法、酒精消毒、煮沸消毒法；灭菌的方法有干热灭菌、灼烧灭菌和高压蒸汽灭菌。 2、微生物接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。 3、平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。 本题考查微生物的分离与培养等相关知识，要求考生识记培养基的成分、无菌技术、微生物分离的过程，能正确理解图形和表格中隐含的知识和结论，难度适中。 27．【2022·北京卷19·高考真题】生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。 （1）将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是          。 （2）为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。 ​​​​​​​ 与方案1相比，方案2的主要优势是          ，因而被用于制备监测鱼（MO）。 （3）现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。 Ⅰ．启动子：          。 ①ERE    ②UAS    ③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生） ④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌） Ⅱ．基因：          。 A．GFP                B．Gal4                C．雌激素受体基因（ER） D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg） （4）SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后          造成不育。 （5）使拟用于实际监测的SM不育的目的是          。 【答案】（1）显微注射 （2）监测灵敏度更高 （3）② D （4）激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡 （5）避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题 【解析】【分析】 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【解答】 （1）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。 （2）由图可知，方案1E物质-受体复合物激活ERE，使GFP基因表达，方案2 E物质-受体复合物先激活ERE获得Gal4蛋白，然后Gal4蛋白激活UAS启动子，使GFP基因表达，方案2GFP蛋白表达量大，更灵敏。 （3）MO和另一亲本（X）杂交获得SM，MO是方案2获得，所以亲本X启动子选择UAS。要获得SM是不育个体，MO是可育的所以X必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）。 （4）成体SM自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活ERE诱导Gal4表达，Gal4与UAS启动子结合诱导dg表达，使生殖细胞凋亡。 （5）监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要SM不育。 ​​​​​​​ 28．【2022·山东卷25·高考真题】某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 （1）为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 ______。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 ______（填“3′端”或“5′端”）。 （2）PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 ______。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 ______。 （3）融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ______；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 ______。 （4）根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 ______。 【答案】（1）两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补配对     5'端 （2）在转录得到的mRNA序列中，EcoRⅠ识别序列的后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致翻译时核糖体读取的密码子顺序发生改变，从而使翻译出的氨基酸序列改变          在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使融合基因中FLAG基因的碱基数目加上P基因的碱基数为3的倍数，从而保证翻译时P基因转录出的mRNA也能被正确读取 （3）促进UBC与FLAG-P的结合     P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列 （4）药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的 【解析】解：（1）引物是能够与DNA母链特定的碱基序列互补配对的单链核酸片段，由于扩增目的基因时有两条模板链，设计引物时，两种引物要分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。 （2）根据题意，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明翻译P基因相应的序列时出错。由图甲分析可知，在转录得到的mRNA序列（与DNA编码链序列一致）中，EcoRⅠ识别序列的后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致翻译时核糖体读取的密码子顺序发生改变，从而使翻译出的氨基酸序列改变。要解决这个问题，可以在PCR扩增时在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使融合基因中FLAG基因的碱基数目加上P基因的碱基数为3的倍数，从而保证翻译时P基因转录出的mRNA也能被正确读取。 （3）根据图乙分析可知，①组仅添加UBC，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，检测出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。②④组未添加药物A，两组的差异在于添加FLAG-P或FLAG-P△；③⑤组添加了药物A，两组的差异也在于添加FLAG-P或FLAG-P△；结合图丙可知，②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。 （4）根据（3）的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。 故答案为： （1）两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补配对     5'端 （2）在转录得到的mRNA序列中，EcoRⅠ识别序列的后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致翻译时核糖体读取的密码子顺序发生改变，从而使翻译出的氨基酸序列改变          在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使融合基因中FLAG基因的碱基数目加上P基因的碱基数为3的倍数，从而保证翻译时P基因转录出的mRNA也能被正确读取 （3）促进UBC与FLAG-P的结合     P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列 （4）药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的 PCR过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，DNA解旋为单链；②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA结合；③延伸：再将温度上升到72℃左右，反应体系中的4种脱氧核苷酸在耐高温的TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 本题考查基因工程与PCR技术的相关知识，要求考生识记有关的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能将教材中的知识结合题中信息进行迁移应用。 29．【2022·广东卷22·高考真题】“绿水透迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 回答下列问题： （1）研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对 ______，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 （2）研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是 ______，终止子的作用是 ______。 （3）培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是 ______，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。 （4）这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了 ______，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于 ______，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 【答案】（1）引物  （2）作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞        使转录终止  （3）二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长  （4）废物的资源化        不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳 【解析】解：（1）利用PCR技术扩增目的基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物分别与两条模板链互补配对，而后Taq酶才能从引物的3’端延伸子链。  （2）基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞；终止子是转录的终点，可以使转录终止。  （3）根据题图可知，重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，CO2和H2经过一系列反应生成丙酮，而后排出细胞，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致生长迟缓。  （4）根据题意可知，这种新技术，以工业废气（含CO2等一碳温室气体）为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。  故答案为：  （1）引物  （2）作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞        使转录终止  （3）二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长  （4）废物的资源化        不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳 1、PCR技术的原理是DNA分子的半保留复制，是在体外大量复制DNA的技术。因为DNA聚合酶不能从头开始合成子链，只能从引物的3’端开始连接核苷酸，所以在PCR中需要两种引物。PCR一般要经历30多次循环，每次循环分为变性、复性（退火）、延伸三步，每次循环实际就是完成了一次DNA复制。  2、减缓温室效应，一方面要减少二氧化碳的排放，另一方面通过植树造林等措施增加大气中二氧化碳的消耗。 本题以生物技术在实际问题中的应用为背景材料，引起学生关注生态环境，考查PCR技术、基因工程、“碳中和”等内容，要求学生掌握相关技术的原理，能够分析题干和题图获取关键信息，再将所学知识和题中信息进行分析作答。 30．【2022·河北卷20·高考真题】蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。 回答下列问题： （1）蛋白酶抑制剂的抗虫机制是           。 （2）          是实施基因工程的核心。 （3）利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的           上，此方法的不足之处是           ​​​​​​​​​​​​​​。 （4）为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有           （写出两点即可）。 （5）确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的           以鉴定其抗性程度。图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析           （填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI+StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是           。 （6）基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生           。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。据此推测，被蛋白抑制剂基因作物长期选择后，某些昆虫具有了抗蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是          ​​​​​​​（写出两点即可）。 【答案】（1）阻断或减弱消化酶的作用，导致害虫无法对外来蛋白有消化作用而发育异常或死亡 （2）基因表达载体的构建 （3）T-DNA 农杆菌转化法适用于大多数双子叶植物和裸子植物，不适用单子叶植物 （4）DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原—抗体杂交技术/写出两点即可 （5）接种实验 NaPI+StPinlA 由于导入抗虫基因后，虫子不能消化棉花的叶片，故虫体质量越重，说明转基因棉花的抗虫效果越好 （6）定向改变 DNA分子中发生碱基对的替换、增添或缺失/写出两点即可 【解析】（1）胰蛋白酶扣制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂为两种消化酶，蛋白酶抑制剂的抗虫机制是阻断或减弱消化酶，导致害虫无法对外来蛋白有消化作用而发育异常或死亡。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。 （3）农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。 （4）为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原—抗体杂交技术。 （5）欲确定抗虫基因在虫体内是否表达，在个体水平上需要做抗虫接种实验。由于导入抗虫基因后，虫子不能消化棉花的叶片，故虫体质量越重，说明转基因棉花的抗虫效果越好，故在三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果中，NaPI+StPinlA组，虫体的质量最大。 （6）在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生定向改变。该昆虫产生了可遗传变异（基因突变），基因突变是指DNA分子中发生碱基对的替换、增添或缺失，而引起的基因结构的改变，基因突变具有不定向性，可产生多种相对性状，但蛋白抑制剂会对昆虫进行定向选择作用，从而增大抗蛋白抑制剂基因的基因频率，使某些昆虫具有了抗蛋白酶抑制剂的能力。 1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 2、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 本题主要考查基因工程的相关内容，意在考查考生的识图能力和理解所学知识要点，把握知识间内在联系的能力，能够运用所学知识，对生物学问题作出准确的判断，难度适中。 31．【2022·湖北卷22·高考真题】“端稳中国碗，装满中国粮”，为了育好中国种，科研人员在杂交育种与基因工程育种等领域开展了大量的研究。二倍体作物M的品系甲有抗虫、高产等多种优良性状，但甜度不高。为了改良品系甲，增加其甜度，育种工作者做了如下实验； 【实验一】遗传特性及杂交育种的研究 在种质资源库中选取乙、丙两个高甜度的品系，用三个纯合品系进行杂交实验，结果如下表。 杂交组合 F1表现型 F2表现型 甲×乙 不甜 1/4甜、3/4不甜 甲×丙 甜 3/4甜，1/4不甜 乙×丙 甜 13/16甜、3/16不甜 【实验二】甜度相关基因的筛选 通过对甲、乙、丙三个品系转录的mRNA分析，发现基因S与作物M的甜度相关。 【实验三】转S基因新品系的培育 提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培有出转S基因的新品系。 根据研究组的实验研究，回答下列问题： （1）假设不甜植株的基因型为AAbb和Aabb,则乙、丙杂交的F2中表现为甜的植株基因型有           种。品系乙基因型为           。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中甜：不甜比例为           。 （2）如图中，能解释（1）中杂交实验结果的代谢途径有           。 （3）如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用           酶切割S基因的cDNA和载体。 （4）用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，其目的是          ​​​​​​​。 （5）除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方法还有           （答出2点即可）。 【答案】（1）7 aabb 1：5 （2）①③ （3）XbaⅠ、HindⅢ （4）通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞 （5）单倍体育种、诱变育种 【解析】【分析】 农杆菌转化法：取$ 专题26基因工程 考点分类 五年考情（2022-2026） 命题规律 考点01基因工程的工具（限制性内切酶、DNA连接酶、载体） 共13考：2026·湖北卷18、2025·江苏卷19、2025·江西卷11、2024·湖南卷5、2023·湖北卷4、2023·重庆卷12、2026·河南卷21、2026·山东卷25、2025·山东卷25、2025·湖南卷21、2024·黑吉辽卷25、2024·北京卷20、2023·山东卷25 · 限制酶是本考点第一高频点：它识别特定的核苷酸序列并在特定位点切开磷酸二酯键，产生黏性末端或平末端。双酶切（用两种产生不同末端的限制酶同时切割目的基因与质粒）可防止质粒和目的基因自身环化、防止目的基因反向连接，从而保证定向插入；选酶的三条硬性约束常考——不能破坏目的基因内部结构、不能破坏必需的标记基因、不能破坏启动子与终止子（除非刻意插入标记基因做插入失活筛选）；识别序列不同但切出相同黏性末端的酶（BamHⅠ与BstⅠ、BclⅠ与XbaⅠ等互为同尾酶）不能用于双酶切定向克隆；质粒被甲基化修饰会使对其敏感的限制酶无法切割。 · DNA连接酶的种类与作用是辨析题的固定陷阱：E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端（平末端连接效率明显更低）；二者催化的都是磷酸二酯键的形成，而不是氢键（氢键靠碱基互补配对自发形成）。 · 基因表达载体的必备元件几乎每年设问：目的基因、启动子（RNA聚合酶识别与结合的位点，驱动转录）、终止子（终止转录）、标记基因（供筛选）、复制原点（保证在受体细胞中自主复制）、一至多个限制酶切割位点；启动子与终止子之间有严格的方向性，目的基因必须正向插入才能正常转录和翻译；改用组织特异性启动子或诱导型启动子（如胚乳特异表达、光控、四环素诱导）可实现定时、定点表达。 · 标记基因的筛选逻辑是选择题的常客：抗生素抗性基因（AmpR、TetR、卡那霉素、潮霉素、庆大霉素抗性基因）用于筛出导入了质粒的受体细胞；β-半乳糖苷酶基因（lacZ）因插入失活可用于蓝白斑筛选；GFP、YFP 等荧光蛋白基因既作报告基因又便于定位观察。命题最常设的坑是「能在含抗生素的培养基上生长」只说明导入了质粒，既不等于导入了重组质粒（可能只是空载体），也不等于成功表达了目标蛋白——是否表达还需抗原—抗体杂交或功能活性鉴定。 考点02基因工程的基本操作程序 共46考：2026·江西卷14、2025·全国卷6、2025·安徽卷15、2025·广东卷7、2024·安徽卷14、2024·山东卷5、2024·山东卷13、2024·江西卷12、2024·湖南卷15、2024·黑吉辽卷7、2023·6月浙江卷19、2023·广东卷11、2023·辽宁卷8、2022·辽宁卷12、2026·1月浙江卷25、2026·云南卷21、2026·四川卷19、2026·河北卷22、2026·湖南卷17、2026·贵州卷21、2026·黑吉辽蒙卷25、2025·1月浙江卷25、2025·全国卷7、2025·四川卷19、2025·安徽卷20、2025·广西卷21、2025·河北卷22、2025·青海卷21、2025·黑吉辽蒙卷25、2024·山东卷25、2024·广东卷21、2024·广西卷21、2024·江苏卷23、2024·河北卷22、2024·甘肃卷21、2024·福建卷18、2023·广东卷20、2023·江苏卷23、2023·河北卷23、2022·1月浙江卷31、2022·北京卷19、2022·山东卷25、2022·广东卷22、2022·河北卷20、2022·湖北卷22、2022·重庆卷26 · 目的基因的获取有四条路径，各有适用条件：PCR 扩增（引物分别与两条模板链 3' 端碱基序列互补、子链延伸方向为 5'→3'，引物的 5' 端可添加限制酶识别序列以便后续酶切连接，必须使用耐高温的 DNA 聚合酶）、逆转录（以 mRNA 为模板获得不含内含子的 cDNA）、从基因组文库或 cDNA 文库中获取（cDNA 文库筛选更简便）、依据氨基酸序列和密码子简并性人工合成；设计引物前通常需要从序列数据库（GenBank）查询并用 BLAST 比对。 · 导入方法必须与受体细胞匹配，这是送分也是失分点：导入植物细胞常用农杆菌转化法（Ti 质粒上的 T-DNA 可转移并整合到受体细胞的染色体 DNA 上，主要适用于双子叶植物和裸子植物），另有基因枪法与花粉管通道法；导入动物细胞最有效的是显微注射法（通常注入受精卵）；导入微生物细胞用感受态细胞法（Ca²⁺ 或 CaCl₂ 处理使细胞处于易于吸收周围 DNA 的感受态）。 · 检测与鉴定是本考点设问最多的一环：分子水平可用琼脂糖凝胶电泳判断 DNA 片段大小（片段越小迁移速率越快）、DNA 分子杂交或核酸探针检测目的基因是否导入、PCR 检测（常需设置空白对照以排除体系污染）、测序确定碱基序列是否正确；个体生物学水平则要用抗原—抗体杂交检测目标蛋白是否表达，并进一步做功能活性鉴定（催化底物产生产物、抗虫接种实验、统计病斑大小或死亡率先后的比较）。 · 基因表达载体的构建被公认为基因工程的核心步骤：除目的基因外必须装配好启动子、终止子、标记基因和复制原点；不同生物对密码子的偏好不同，可在不改变氨基酸序列的前提下重编编码序列（利用密码子简并性）以提高翻译效率；融合标签（His 标签、V5 短肽、GFP、ELP 等）便于目标蛋白的分离纯化与检测；实验误差类设问则集中于 PCR 体系被外源 DNA 污染、引物过短导致特异性降低、引物间的载体序列被一并整合进基因组等。 考点03基因工程的应用与蛋白质工程 共28考：2026·1月浙江卷10、2026·云南卷16、2026·江西卷2、2026·河南卷13、2026·湖北卷12、2026·湖南卷7、2026·安徽卷12、2026·北京卷13、2025·6月浙江卷3、2025·四川卷7、2025·湖北卷14、2023·1月浙江卷2、2023·海南卷2、2022·江苏卷6、2022·重庆卷3、2026·山陕青宁卷21、2026·湖北卷21、2026·湖北卷22、2026·广东卷20、2026·北京卷20、2025·甘肃卷21、2025·贵州卷18、2024·湖北卷20、2023·辽宁卷23、2022·北京卷18、2022·江苏卷21、2022·湖南卷22、2022·重庆卷23 · 蛋白质工程的流程是必考骨架：从预期蛋白质功能出发 → 设计蛋白质结构 → 推测应有的氨基酸序列 → 找到并改造（或人工合成）对应的脱氧核苷酸序列 → 再通过基因工程表达出目标蛋白。它被称为第二代基因工程，与基因工程的根本区别在于能创造自然界原本不存在的蛋白质；关键落点是「改造的是基因而不是直接拼接肽链」。 · 定向改造与基因编辑是近年命题热点：CRISPR-Cas9 由向导 RNA 引导核酸酶定点切割目的序列；碱基编辑器（如 ABE）可实现 A→G 的精确转换；基因敲除时缺失的碱基数若不是 3 的倍数会造成移码、提前出现终止密码子；基因敲入依赖同源修复。设问常落在 sgRNA 的编辑效率与脱靶风险、用组织特异性启动子限定编辑范围（如仅在心肌细胞表达）以减少对其他细胞的影响。 · 应用情境覆盖面极广，且常与免疫、代谢、农业交叉命题：转基因作物（Bt 抗虫棉、抗除草剂作物、抗白叶枯病水稻）、生物反应器（水稻胚乳表达疫苗、乳腺生物反应器）与口服疫苗、工程菌（益生菌表达肿瘤新抗原、靶向低氧肿瘤区的工程大肠杆菌）、基因治疗与 RNA 药物（siRNA 干扰、mRNA 疫苗）、DNA 信息存储等；设问多为「该设计的意图」「有何优势」「如何验证效果」「对照组如何设置」。 · 安全性与伦理是选择题的固定得分点：我国政府对生殖性克隆人的态度是不赞成、不允许、不支持、不接受，而治疗性克隆需要在有效监控和严格审查下实施；转基因技术并非一律禁止，而是要在严格监管下合理应用；生物武器的研发和使用被国际公约明令禁止；此外，转基因生物一旦逃逸可能造成基因污染，故工程菌与转基因生物常需配套防扩散设计（如敲除复制基因、设置诱导型裂解开关）。 一、选择题（除注明为多选题外，其它题都为单选题） 考点01基因工程的工具（共6题） 1．【2026·湖北卷18·高考真题】为了研究大肠杆菌中蛋白A的结构与功能，通过设计特异性引物F1、F2，用PCR技术从大肠杆菌DNA中扩增基因A，再用质粒P构建表达载体。基因A和质粒P的部分酶切图谱如图所示。 下列叙述正确的是（　　） A. F1、F2的5′-端分别含有HindⅢ、XhoⅠ酶切位点 B. F1、F2的5′-端分别含有HindⅢ、XbaⅠ酶切位点 C. F1、F2的5′-端分别含有AccⅠ、HindⅢ酶切位点 D. F1、F2的5′-端分别含有PvuⅠ、ScaⅠ酶切位点 2．【2025·江苏卷19·高考真题】（多选题）如图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有（　　） A. 基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B. 用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C. 用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致 D. 产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 3．【2025·江西卷11·高考真题】为了获得抗白叶枯病的水稻品种，研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒（如图），通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织，最终获得抗病植株。下列叙述正确的是（　　） A. 水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子 B. 在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达 C. 农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素 D. 愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株 4．【2024·湖南卷5·高考真题】某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　　） A. 限制酶失活，更换新的限制酶 B. 酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C. 质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D. 酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 5．【2023·湖北卷4·高考真题】用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　） A. 若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B. 若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C. 若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D. 若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 6．【2023·重庆卷12·高考真题】某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基且短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（如图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（　　）  A. 其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3' B. 步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ C. 用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D. 酶切片段和载体连接时，可使用E.coli连接酶或T4连接酶 考点02基因工程的基本操作程序（共14题） 1．【2026·江西卷14·高考真题】（多选题）研究人员按图示流程制备T基因编码的耐高温DNA聚合酶T。下列关于该流程的叙述，错误的是（　　） A. 需在72℃条件下培养基因工程菌 B. 添加高浓度的诱导物可获得高产量的T C. 可根据电泳结果初步评价T的纯度 D. 可根据PCR产物的多少计算T的活性 2．【2025·全国卷6·高考真题】琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示（“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（　　） A. 配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液 B. 该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷 C. 甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同 D. 据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物 3．【2025·安徽卷15·高考真题】质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal,产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体。采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（　　） A. 使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B. 如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C. 因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D. 若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 4．【2025·广东卷7·高考真题】Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中，DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后，DNA链不继续延伸，应保护底物中脱氧核糖结构上的（　　） A. 1′-碱基 B. 2′-氢 C. 3′-羟基 D. 5′-磷酸基团 5．【2024·安徽卷14·高考真题】下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（      ） A. 实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B. 利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C. DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D. 将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 6．【2024·山东卷5·高考真题】制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（　　） 反应管 加入的单链DNA ① 5′-GCCGATCTTTATA-3′ 3′-GACCGGCTAGAAA-5′ ② 5′-AGAGCCAATTGGC-3′ ③ 5′-ATTTCCCGATCCG-3′ 3′-AGGGCTAGGCATA-5′ ④ 5′-TTCACTGGCCAGT-3′ A. ①② B. ②③ C. ①④ D. ③④ 7．【2024·山东卷13·高考真题】关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A. 整个提取过程中可以不使用离心机 B. 研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C. 鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D. 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 8．【2024·江西卷12·高考真题】γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E.coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是（　　） ​ A. 上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B. E.coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C. E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸 D. 可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 9．【2024·湖南卷15·高考真题】（多选题）最早的双脱氧测序法可在PCR反应体系中进行，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（　　）  A. 上述PCR反应体系中只加入一种引物 B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C. 5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列 D. 患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 10．【2024·黑吉辽卷7·高考真题】关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（　　） A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 11．【2023·6月浙江卷19·高考真题】某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示： ​​​​​​​ ​​​​​​​下列叙述正确的是（　　） A. Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B. 翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C. 2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D. 若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 12．【2023·广东卷11·高考真题】“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（　　） A. 裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B. 分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C. 沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D. 鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 13．【2023·辽宁卷8·高考真题】CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（       ） A. CD163基因中编码起始密码子的序列 B. CD163基因中编码终止密码子的序列 C. RFP基因中编码起始密码子的序列 D. RFP基因中编码终止密码子的序列 14．【2022·辽宁卷12·高考真题】抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（） A. 预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制 B. 后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分 C. 延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制 D. 转基因品种经检测含有目的基因后即可上市 考点03基因工程的应用与蛋白质工程（共15题） 1．【2026·1月浙江卷10·高考真题】利用转基因技术将口蹄疫病毒衣壳蛋白P1的基因导入水稻愈伤组织，获得了多个稳定表达P1的转基因水稻株系。转基因水稻的P1激活小鼠免疫反应的能力与大肠杆菌生产的P1相当，且给小鼠饲喂转基因水稻的P1也能激活免疫反应。下列叙述正确的是（） A. 将愈伤组织进行脱分化和再分化，获得转基因水稻植株 B. 不同株系转基因水稻P1蛋白的基因表达水平相同 C. 转基因水稻与大肠杆菌生产的P1蛋白分子量相等 D. 转基因水稻P1蛋白具备制成口服疫苗的潜力 2．【2026·云南卷16·高考真题】内含肽（Int）可通过自我催化实现自我切除并无痕连接两侧肽链。构建编码“内含肽+X蛋白”和“内含肽+Y蛋白”的基因，将其导入真核细胞表达后，内含肽自我切除生成X+Y融合蛋白，如图。 下列说法正确的是（　　） A. 构建X+Y融合蛋白基因导入细胞，会因碱基序列相互影响而使蛋白功能异常 B. 内含肽序列需嵌入X蛋白的功能结构内，以保证获得的融合蛋白功能正常 C. 不同内含肽之间通过能匹配的结构相互识别，发挥特异性切除和连接作用 D. 为X+Y融合蛋白提供“内含肽+某蛋白”，可赋予X+Y融合蛋白新的结构 3．【2026·江西卷2·高考真题】蛋白酶E被广泛用作洗涤剂的生产原料，但洗涤剂中的物质S能将E的第n位甲硫氨酸氧化，降低其活性。研究人员将上述甲硫氨酸替换为丝氨酸，提高了E对S的耐受性。下列叙述错误的是（　　） A. 第n位甲硫氨酸的氧化会影响E的空间结构，从而影响酶的活性 B. 将第n位的甲硫氨酸替换为丝氨酸可通过基因工程实现 C. 判断E的改造效果，需用S处理一段时间后测定酶活性 D. 甲硫氨酸的替换在提高E对S耐受性的同时，降低了E的专一性 4．【2026·河南卷13·高考真题】胰蛋白酶可水解精氨酸与下一位氨基酸（脯氨酸除外）之间的肽键。抗体甲的第27、96位均为精氨酸。通过蛋白质工程将第27位替换为苯丙氨酸，第97位替换为脯氨酸。改造后的甲不被胰蛋白酶水解，并保持抗体活性。下列叙述错误的是（　　） A. 甲的设计改造需要遵循遗传信息传递的一般规律 B. 胰蛋白酶不能水解改造后的甲，体现了酶的专一性 C. 第96位氨基酸未被替换的原因可能是该位点与抗体功能相关 D. 由于密码子的简并性，改造后编码甲的基因序列不一定改变 5．【2026·湖北卷12·高考真题】将患者肿瘤细胞特有的新抗原基因导入益生菌中获得的工程菌可在患者肠道内表达新抗原，从而激活患者的特异性免疫，精准杀伤肿瘤细胞，实现个性化的癌症免疫治疗。下列叙述错误的是（　　） A. 选用益生菌的原因是其对人体具有天然的安全性 B. 为实现个性化癌症免疫治疗，需针对患者筛选特定肿瘤新抗原 C. 工程菌可在体内长期存活，以维持工程菌对肿瘤的持续免疫监视 D. 树突状细胞将肿瘤新抗原加工后呈递给辅助性T细胞，激活特异性免疫 6．【2026·湖南卷7·高考真题】将物种A的启动子与物种B的生长激素基因编码序列重组，导入到鲤鱼受精卵，获得多条转基因鱼。与对照组相比，转基因鱼生长速率加快。下列叙述错误的是（　　） A. 来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合并表达 B. 不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平相同 C. 外源基因整合到染色体DNA上是其在受体细胞中稳定遗传的关键 D. 调控启动子活性可验证转基因鱼的生长速率与生长激素基因表达水平的关系 7．【2026·安徽卷12·高考真题】为研究某种鱼中新发现的R基因的功能，对该种鱼的受精卵进行基因敲除，使R基因的编码序列缺失4个连续的碱基成为R-，获得1条能正常生长的F0代个体（RR-），经杂交培育获得了纯合突变体。与野生型相比，纯合突变体的体型变小，体色变为浅红色。下列叙述错误的是（　　） A. 选用受精卵进行基因敲除，目的是确保突变的基因可以遗传给子代 B. 用F0个体进行杂交培育，最早可以在F1获得纯合突变体 C. R-编码的氨基酸序列发生改变，纯合突变体可用于R基因功能的研究 D. 突变体有多种表型变异，说明一个基因的功能可能影响多个性状 8．【2026·北京卷13·高考真题】MT是工业化生产海藻糖必需的酶，但天然MT热稳定性差。研究者将MT第216位的丙氨酸变为苏氨酸，获得热稳定性高的MT，提高了海藻糖生产效率。下列叙述错误的是（ ） A. 温度和pH会影响MT的催化活性 B. 第216位的丙氨酸对MT的专一性至关重要 C. 为筛选热稳定性高的MT，应在较高温度下测定酶活性 D. 对MT结构的改造属于蛋白质工程 9．【2025·6月浙江卷3·高考真题】下列关于生物技术安全和伦理问题的叙述，错误的是（　　） A. 反对设计完美婴儿 B. 反对人的生殖性克隆 C. 禁止生物武器的使用 D. 禁止转基因技术的应用 10．【2025·四川卷7·高考真题】为杀死蜜蜂寄生虫瓦螨，研究人员对蜜蜂肠道中的S菌进行改造，使其能释放特定的双链RNA（dsRNA）。进入瓦螨体内的dsRNA被加工成siRNA后，能与瓦螨目标基因的mRNA特异性结合使其降解，导致瓦螨死亡。下列叙述正确的是（　　） A. siRNA的嘌呤与嘧啶之比和dsRNA相同 B. dsRNA加工成siRNA会发生氢键的断裂 C. 瓦螨死亡的原因是目标基因的转录被抑制 D. 用改造后的S菌来杀死瓦螨属于化学防治 11．【2025·湖北卷14·高考真题】大数据时代，全球每天产生海量数据，预计2040年需一百万吨硅基芯片才能储存全球一年产生的数据。为解决这一难题，科学家尝试运用DNA来储存数据。我国科学家已经将汉代拓片、熊猫照片等文化数据写入DNA，实现数据长期保存。下列叙述中，DNA可以作为存储介质的优点不包括（　　） A. DNA具有可复制性，有利于数据的传播 B. 可通过DNA转录和翻译传递相应数据信息 C. DNA长链中碱基排列的多样化，为大量数据的存储提供可能 D. DNA作为存储介质体积小，为数据携带和保存节约了大量空间 12．【2023·1月浙江卷2·高考真题】以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是（　） A. 试管婴儿技术应全面禁止 B. 治疗性克隆不需要监控和审查 C. 生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险 D. 我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 13．【2023·海南卷2·高考真题】科学家将编码天然蜘蛛丝蛋白的基因导入家蚕，使其表达出一种特殊的复合纤维蛋白，该复合纤维蛋白的韧性优于天然蚕丝蛋白。下列有关该复合纤维蛋白的叙述，正确的是（　　） A. 该蛋白的基本组成单位与天然蜘蛛丝蛋白的不同 B. 该蛋白的肽链由氨基酸通过肽键连接而成 C. 该蛋白彻底水解的产物可与双缩脲试剂发生作用，产生紫色反应 D. 高温可改变该蛋白的化学组成，从而改变其韧性 14．【2022·江苏卷6·高考真题】采用基因工程技术调控植物激素代谢，可实现作物改良。下列相关叙述不合理的是（　　） A. 用特异启动子诱导表达iaaM（生长素合成基因）可获得无子果实 B. 大量表达ip（细胞分裂素合成关键基因）可抑制芽的分化 C. 提高ga2ox（氧化赤霉素的酶基因）的表达水平可获得矮化品种 D. 在果实中表达acs（乙烯合成关键酶基因）的反义基因可延迟果实成熟 15．【2022·重庆卷3·高考真题】将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸，B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列关于该胰岛素的叙述，错误的是（    ） A. 进入人体后需经高尔基体加工 B. 比人胰岛素多了2个肽键 C. 与人胰岛素有相同的靶细胞 D. 可通过基因工程方法生产 二、非选择题 考点01基因工程的工具（共7题） 1．【2026·河南卷21·高考真题】4-α糖基转移酶（4αGT）在工业生产中发挥重要作用。为实现产业化生产，研究人员利用双酶切法，从重组克隆载体（仅用于目的基因的复制和保存）中获取目的基因，连入表达载体，构建了高效表达4αGT的工程菌，流程如图1所示。回答下列问题： （1）为确保目的基因正常复制，重组克隆载体和重组表达载体均应含有的元件为          。为确保目的基因正常表达，相较于重组克隆载体，重组表达载体目的基因两端的元件除启动子外，还有          ，作用为          。 （2）根据限制酶识别序列和切割位点，以及目的基因片段的黏性末端（图1），判断所使用的限制酶1是          ，限制酶2是          。 （3）琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子大小与迁移速率成反比。为检验重组表达载体是否构建成功，用限制酶1和限制酶2切割后，进行电泳鉴定。构建成功的重组表达载体酶切产物的电泳结果如图2所示，条带          （填“a”或“b”）对应目的基因片段，理由是          。 （4）将重组表达载体导入受体细胞，获得的工程菌接入液体培养基中培养。定时检测培养液中4αGT的含量，结果如图3所示。阶段2中4αGT含量迅速升高的原因可能是          （答出一点即可）。 2．【2026·山东卷25·高考真题】小鼠基因W编码的蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母菌并使其稳定表达，实现了该蛋白的高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），该酶不需要模板，可在DNA的3´端随机添加4种脱氧核苷酸，若只提供1种脱氧核苷酸，则连续添加多个该种脱氧核苷酸，称为同聚物加尾。相关信息所示。 （1）载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是          ，载体上与其能自我复制相关的结构是          。 （2）研究人员选取2种限制酶切开载体，再用TdT分别对基因W和切开的载体进行同聚物加尾，然后将两者连接；若载体酶切后产生的黏性末端为5´端突出，则需先用DNA聚合酶补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下，据图分析，应选取的2种限制酶为          。 （3）基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组载体存在部分单链区，为构建完整重组载体需要的2种酶是          ，该过程中          （填“需要”或“不需要”）添加引物，原因是          。 （4）为检测基因W是否在酵母菌中表达出相应蛋白，在分子水平上的检测方法是          。 3．【2025·山东卷25·高考真题】种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 （1）Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 ______。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和 ______对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 ______。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 ______进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 ______bp,则一定为正向重组质粒。 （2）为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 ______（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ______，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 ______（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 （3）通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，______（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 4．【2025·湖南卷21·高考真题】非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： （1）制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和______等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物______对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为______bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是______（答出两点即可）。 （2）制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有______（答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和______，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 5．【2024·黑吉辽卷25·高考真题】将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 ​ 注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 （1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是 ______ 。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是 ______ 。 （2）本操作中获取目的基因的方法是 ______ 和 ______ 。 （3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是 ______ ，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是 ______ 。 （4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用 ______ 基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 （5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是 ______ 和 ______ 。 （6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是 ______ （单选）。 A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C.将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D.用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 6．【2024·北京卷20·高考真题】学习以下材料，回答（1）～（4）题。  筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。   真核生物的基本启动子位于基因5′端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程中常用表达载体的基因表达调控序列，通常包含增强子和基本启动子。   很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。     获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。   研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。  （1）在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生           的过程称为细胞分化，分化是基因           的结果。  （2）对文中“增强子”的理解，错误的是           （单选）。  A.增强子是含有特定碱基序列的DNA片段  B.增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上  C.一个增强子只能作用于一个基本启动子  D.很多增强子在不同组织中的活性不同  （3）研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测           。  （4）真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称（略）。 7．【2023·山东卷25·高考真题】科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    （1）与图甲中启动子结合的酶是  ______ 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有  ______ （答出2个结构即可）。  （2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物  ______ 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的  ______ （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。  （3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了  ______ ，条带2所检出的蛋白  ______ （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 考点02基因工程的基本操作程序（共32题） 1．【2026·1月浙江卷25·高考真题】农杆菌能侵染真菌，介导真菌细胞的转基因。3-磷酸甘油脱氢酶是假丝酵母中甘油合成代谢途径的关键酶，将3-磷酸甘油脱氢酶基因（Gpd）构建到表达载体上，如图1所示。通过农杆菌介导法，转化假丝酵母野生型菌株，获得转Gpd的重组菌株。野生型菌株与某重组菌株分别进行发酵实验，生产甘油的结果如图2所示。 注：ZeoR是腐草霉素抗性基因，KanR是卡那霉素抗性基因 回答下列问题： (1)表达载体导入农杆菌细胞：用溶液处理农杆菌，制备          ，再用电击法将表达载体导入农杆菌细胞，经筛选获得阳性克隆。为验证阳性克隆是否为转化成功的农杆菌，从繁殖后的菌株细胞中提取质粒，经          限制酶酶切后电泳，若出现4条DNA条带，则表明转化成功。 (2)假丝酵母重组菌株的获得：在          中的酒精灯火焰旁，取野生型假丝酵母菌种，采用          方法接种在固体培养基上培养，适时挑选          再接种到液体培养基进行培养。取适量的假丝酵母与农杆菌进行共培养一段时间后，杀灭农杆菌，然后在含有          的选择培养基中筛选，最终获得重组菌株。 (3)重组菌株生产甘油能力的分析：根据图2可知，与野生型菌株相比，该重组菌株用于发酵生产甘油的2个优点是          。若某生长正常的重组菌株发酵液中甘油的含量显著低于野生型菌株，从引起变异的因素分析，可能的原因有：在培养过程中重组菌株发生了突变，或          ，导致甘油合成代谢受阻。 2．【2026·云南卷21·高考真题】UW4菌株可表达ACC脱氨酶减少植物乙烯合成，促进植物生长，但定殖植物根部能力较弱。现欲将增强定殖能力的五肽整合到UW4中ACC趋化受体（ACCR）的羧基端。 回答下列问题： 第一步：构建pEX质粒（图a），复制原点（ori）不能在UW4菌株中启动复制（质粒不复制策略）。 （1）PCR每次循环一般可以分为变性、复性和          三步。 （2）构建pEX质粒时，用2种限制酶的目的是          （答出2点）。 第二步：将pEX质粒导入UW4菌株中，利用DNA同源区段可发生交换的原理，改造得到工程菌UW4-2（图b）。 （3）我国科学家将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，使花粉失活，防止转基因花粉传播；在UW4-2菌株构建中使用了质粒不复制策略。此类设计的主要目的是          。 （4）要获得UW4-2菌株，需筛选三次。第一次在培养基中添加          ，即可筛选出UW4-1菌株，筛选的原理是          ；在第二次筛选培养基中添加          。筛选后，培养基中仍同时存在两种菌株，第一种菌株是UW4-2，另一种菌株的拟核DNA结构是          （填图c中序号）；可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并          。 3．【2026·四川卷19·高考真题】肿瘤的快速增殖使其内部缺氧，有人将普拉梭菌fp基因转入兼性厌氧大肠杆菌（E.coli），构建工程菌E.coli-fp并评估其抗肿瘤效果，部分操作如图1。回答下列问题。 （1）DNA连接酶可催化fp基因与载体之间生成______ 键，连接形成重组质粒。工程菌E.coli-fp表达的产物中His标签可被抗体识别。将His标签置于fp基因后并融合表达，目的是______ 。 （2）PD-1抗体是一种抗癌药物。为分析FP蛋白对肿瘤的疗效，有人开展了相关实验，结果如图2，请评价FP蛋白和PD-1抗体对肿瘤的治疗效果______ 。 （3）色谱分析可区分不同的小分子，同一分子会在固定时间出现峰值。向ATP或GTP溶液中加入FP蛋白，反应后的色谱分析结果如图3。FP蛋白的反应底物是______ 。 （4）有人将E.coli或含厌氧启动子的工程菌E.coli-fp注射到小鼠尾静脉，证明E.coli-fp具有抗肿瘤作用。据图4分析，用His标签抗体杂交，检测到的组1是______ （填“E.coli”或“E.coli-fp”）；兼性厌氧大肠杆菌主要在肿瘤中存活并增殖，原因可能是______ 。综合分析，E.coli-fp能有效治疗肿瘤的作用机制是______ 。 4．【2026·河北卷22·高考真题】曲霉中的淀粉酶R能直接将不经高温处理的淀粉降解为葡萄糖。R基因的表达受CreA蛋白抑制。研究者利用基因工程手段，抑制了黑曲霉CreA基因的表达，并进行了相关检测。 回答下列问题： （1）黑曲霉菌种的分离纯化应选用______ （填“固体”或“液体”）培养基。 （2）细胞中具有特定结构的双链RNA可被相关酶识别并降解为小片段。RNA小片段可识别与自身序列互补的mRNA，引导该mRNA发生降解。如图1所示，为使含片段A和C的转录产物能按照______ 原则自身折叠形成双链，扩增CreA基因D片段时，可在两个引物的______ 端分别添加两个限制酶识别序列。一部分PCR产物用限制酶KpnⅠ和SpeⅠ酶切连接到载体中A所在的位置，另一部分再用限制酶①和②构建到载体中C所在的位置。因此可判断，限制酶①应该是______ 。 （3）构建的基因表达载体除含有启动子、终止子和目的基因外，还需具有______ 基因，以使表达载体转入受体细胞后可利用______ 培养基筛选出转基因成功的菌株。 （4）构建的表达载体转入菌株G获得G1，将G和G1在相同且适宜的条件下培养，对其生长状况和菌液的淀粉酶活力进行检测，实验结果（图2）表明______ 。（答出两点） （5）传统工艺中需对淀粉进行高温糊化、淀粉酶液化和糖化酶糖化等处理，才可获得葡萄糖。相较于传统工艺，对淀粉酶R的研发利用所体现的优势是______ 。（答出两点） 5．【2026·湖南卷17·高考真题】阿尔茨海默病患者大脑中β-淀粉样蛋白（Aβ）异常聚集，损伤神经元。为了探索治疗该疾病的新方法，研究人员合成了一种嵌合抗原受体（CAR）基因，使其在星形胶质细胞中特异性表达，形成CAR-A细胞，并鉴定了这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力。回答下列问题： （1）CAR基因和病毒载体的部分结构（含限制酶切割位点）分别如图a、b所示。 ①胞外识别区应选用Aβ聚集体的______ （填“抗原”或“抗体”）特定片段编码序列。 ②采用特异性启动子的目的是______ 。同时，为使该CAR基因正确插入病毒载体，并能通过绿色荧光蛋白（GFP）示踪其成功导入星形胶质细胞，应选用的两种限制酶是______ 。 （2）为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解Aβ聚集体，可用含Aβ聚集体的培养基培养CAR-A细胞，一段时间后更换不含Aβ聚集体的培养基继续培养，______ （单选）的Aβ聚集体含量。 A.24h检测细胞内 B.24h检测细胞外 C.0h和24h检测细胞内 D.0h和24h检测细胞外 （3）给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒，3个月后，大脑Aβ聚集体减少，且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降。该实验对照组应注射______ ；该实验结论是______ 。 6．【2026·贵州卷21·高考真题】高粱是酿酒的优质原料，虫害严重影响高粱产量和品质。将外源抗虫基因导入高粱植株，可培育具有抗虫性状的新品种。回答下列问题： （1）科研人员拟将抗虫基因V连接到图甲中的质粒上，为避免错误连接，应选用图甲中的           对质粒进行酶切。 （2）将重组质粒导入受体细胞并获得高粱植株，为检测目的基因是否正确导入，以叶片基因组DNA为模板，设计如图乙所示的引物进行PCR及电泳鉴定。其中引物组合为           的扩增产物电泳迁移速率最快；抗虫基因V的长度约为           bp。 （3）科研人员发现转基因高粱中V基因的表达量未达到预期，推测与启动子部分序列5'-ATCGCGAACG-3'的胞嘧啶甲基化有关。用亚硫酸氢盐（能使未甲基化的碱基C转变为U）处理高粱DNA，将处理后的样品进行PCR扩增等操作获得上述片段的互补链。将所得互补链的5'末端用32P标记，再分别用四种化学试剂处理，使识别的核苷酸的3'端磷酸二酯键断裂，并通过控制反应时间使断裂反应不充分进行，然后对四组反应产物进行电泳并检测放射性，化学试剂对碱基的识别情况及检测结果如图丙（只显示含有32P的条带）。③中加入的是           试剂；a和b两片段长度相差           个核苷酸；启动子的该序列从5'端到3'端第           位核苷酸发生了甲基化。 7．【2026·黑吉辽蒙卷25·高考真题】平沙绿僵菌是一种昆虫病原真菌，通过分生孢子侵染蚊子，对蚊子致死率高，但引诱能力弱。利用松树长叶烯合酶基因（Tps）改造平沙绿僵菌，增强其引诱能力，据此研发“诱杀一体”的灭蚊剂。回答下列问题。 （1）为提高Tps基因在平沙绿僵菌中的表达效率，重新设计了长叶烯合酶编码序列，该序列与天然基因序列存在较大差异，但编码的氨基酸序列不变，获取该目的基因的方法是           。 注：质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽略不计；kb：千碱基对。 实验如上图，用限制酶EcoRⅤ切割pPK2质粒，然后与Tps基因连接，用           （填“E.coli”或“T4”）DNA连接酶可获得更高的连接效率。 经卡那霉素筛选得到的农杆菌中，除含有目的基因的重组质粒外，还可能存在           。为鉴定重组质粒是否正确连接，利用限制酶切割并电泳检测，下列限制酶组合和片段大小，属于正确连接的是           和           。 A.BamHⅠ/EcoRⅠ、0.7kb+6.1kb B.BamHⅠ/EcoRⅠ、1.1kb+5.7kb C.HindⅢ/EcoRⅠ、0.7kb+6.1kb D.HindⅢ/EcoRⅠ、1.1kb+5.7kb 农杆菌转化后，重组质粒上的T-DNA会转移并整合到平沙绿僵菌的           上。 为筛选工程化平沙绿僵菌，用PCR技术进行鉴定。Tps基因的转录模板链部分序列为：5′-ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC-3′，下列引物对可用于扩增该片段的是           。 A.5′-ATGTC…-3′、5′-CCTCG⋯-3′ B.5′-ATGTC⋯-3′、5′-GGAGC⋯-3′ C.5′-TACAG…-3′、5′-CCTCG…-3′ D.5′-TACAG⋯-3′、5′-GGAGC⋯-3′ （2）研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程菌培养物对蚊子的诱杀效果，如下表。 相关指标 培养物 访问次数（次/小0） 停留时间（分钟/小时） 2小时感染率（%） LT50（天） 第7天死亡率（%） 平沙绿僵菌 0.9 1.1 100 5.84 62.4 工程菌 2.4 5.9 100 4.04 84.3 注：感染率：感染孢子的蚊子比例；LT50（半数致死时间）：导致50%蚊子死亡所需的平均时间。 已知孢子附着量决定蚊子死亡速度，结合表中数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显著缩短且第7天死亡率更高的原因是           。 （3）该工程菌制剂在推广前，需经过严格的           评价，符合标准后方可推广。 8．【2025·1月浙江卷25·高考真题】3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示。回答下列问题： （1）分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的 ______ ，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用 ______ 凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 ______ 。 （2）若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是 ______ 。 A.DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B.每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C.在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D.在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 （3）为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚—氯仿抽提除去杂质，最后加入 ______ 沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 ______ （A.P1和P2 B.P3和P4 C.P1和P4 D.P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有 ______ 功能。 （4）为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 ______ 进行比对。将Gpd基因的编码区与 ______ 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 9．【2025·全国卷7·高考真题】为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因（目的基因）插入质粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1～4结合位置如图所示，→表示引物5'→3'方向）。回答下列问题： （1）PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是 ______，而PCR过程中解开双链的方法是 ______。 （2）PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有 ______。 （3）该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是：______；②无扩增产物，原因是 ______；③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是 ______。 管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 模板 无 P0 Px 无 P0 Px 引物对 引物1和引物2 引物3和引物4 （4）设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期结果 ______。 10．【2025·四川卷19·高考真题】杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合，阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因（lrcA-lrcF）导入链霉菌，基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如图。回答下列问题。 注：①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物，“→”指引物5′-3′方向。②密码子对应的氨基酸：AAA—赖氨酸；AUG—甲硫氨酸（起始）；UUC—苯丙氨酸；ACA—苏氨酸；UCG—丝氨酸。 （1）用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时，应选用 ______引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点，其目的是 ______。 （2）采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒，产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 ______条电泳条带，电泳检测酶切产物的目的是 ______。 （3）由图可知，拉索西丁与核糖体结合后，会阻止携带 ______（填氨基酸名称）的tRNA进入结合位点，导致 ______，最终引起细菌死亡。 （4）重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性，但重组菌在实验室多次培养后，提取的目的基因产物杀菌活性丧失，可能的原因是 ______。若运用发酵工程来生产拉素西丁工程药物，除产物活性外还需进一步研究的问题有 ______（答出1点即可）。 11．【2025·安徽卷20·高考真题】稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 （1）采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用 ______（填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是 ______。 （2）经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的 ______。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落 ______（填序号），出现菌落④的可能原因是 ______。 （3）内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路。 ______ 12．【2025·广西卷21·高考真题】CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原，在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见图，回答下列问题： （1）构建含CAR基因的重组质粒，选用的限制酶组合是______。 （2）将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌，使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是______。 （3）将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后，为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果，除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组，还需设置的对照组有______，肿瘤细胞凋亡率的检测指标有______（至少写出2点）。 （4）研究发现，肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制，可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及______。同时，肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞，也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质，多种酶同时作用可提高降解效率；与PD-1连接的生物开关，在该PD-1与PD-L1结合后会被打开，释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见图，其中①是______，②是______，③是______，④是______。 13．【2025·河北卷22·高考真题】为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题： （1）在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是 ______和 ______。模板与引物在PCR反应的 ______阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为 ______。 （2）载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GP1两端应添加 ______（填两种限制酶）的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成 ______键。 （3）若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为 ______，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量 ______，则表明融合蛋白能结合镉离子。 （4）将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是 ______。240μmol•L-1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是 ______。 （5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是 ______和 ______。（填标号） ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖 ②衣藻生长速率受镉离子浓度影响 ③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质 ④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 14．【2025·青海卷21·高考真题】马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 限制酶 识别序列及切割位点 BglⅡ 5′-A↓GATCT-3′ 3′-TCTAG↑A-5′ NdeⅠ 5′-CA↓TATG-3′ 3′-GTAT↑AC-5′ XhoⅠ 5′-C↓TCGAG-3′ 3′-GAGCT↑C-5′ EcoRⅠ 5′-G↓AATTC-3′ 3′-CTTAA↑G-5′ BamHⅠ 5′-G↓GATCC-3′ 3′-CCTAG↑G-5′ SalⅠ 5′-G↓TCGAC-3′ 3′-CAGCT↑G-5′ XbaⅠ 5′-T↓CTAGA-3′ 3′AGATC↑T-5′ （1）PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、______、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 ______步骤中起作用。 （2）图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体，PCR扩增S基因时需在引物的 ______（填“5′端”或“3′端”）添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是5′-______-3′，切割载体时应选用的两种限制酶是 ______。PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。 （3）用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时，基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞，将S基因整合到 ______，抗性基因 ______可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经 ______形成芽、根，继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 15．【2025·黑吉辽蒙卷25·高考真题】香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 （1）可从 ______中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入 ______和 ______限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 ______连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 （2）进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有 ______的污染。初步判断实验组 ______（从“1～4”中选填）的质粒中成功插入了基因N，理由是 ______。 （3）为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有 ______。 a：5′-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3′ b：5′-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3′ c：5′-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3′ d：5′-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3′ （4）进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 ______含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 16．【2024·山东卷25·高考真题】研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 ​ （1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越           （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有           种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′-           -3′和5′-           -3′。 （2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素           筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是           ，其中纯合的突变植株是           （填序号）。 （3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为           ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 17．【2024·广东卷21·高考真题】驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 ​ 回答下列问题： （1）研究者优化了培养基的           （答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和BC膜的复合物）。 （2）研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a,载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子PBAD（被工程菌RNA聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为           ，理由是           。 （3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为           （答两点）。 （4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是           。 （5）有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：           。 18．【2024·广西卷21·高考真题】M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题： 注：基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条，即可表示为Aa；两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。 （1）在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物 ______ （选填“3′端”或“5′端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是 ______ ；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是 ______ 。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行 ______ 。 （2）培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是 ______ （至少答2方面）。 （3）为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为 ______ 实验模型小鼠。 （4）为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是 ______ 。 19．【2024·江苏卷23·高考真题】为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：    （1）步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是  ______ 。  （2）步骤②转化时，科研人员常用  ______ 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有  ______ 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是  ______ 。  （3）步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与  ______ 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa,将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是  ______ （从图2的“A～D”中选填）。  （4）步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。  （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是  ______ 。  （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是  ______ 。  （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有  ______ 。 20．【2024·河北卷22·高考真题】新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。 回答下列问题： （1）实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为           启动子。Nos为终止子，其作用为           。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶           和           对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 （2）利用           方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测           ，通过           技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 （3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为           。选择纯合体进行后续研究的原因是           。 （4）制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8+T细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的           免疫和           免疫。 （5）利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是           。（答出两点即可） 21．【2024·甘肃卷21·高考真题】源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。 （1）过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是 ______ 。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了 ______ 。 （2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是 ______ 。 （3）过程⑤在基因工程中称为 ______ ，该过程需要的主要酶有 ______ 。 （4）过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 ______ 。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种 ______ 的生理状态。 （5）课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是 ______ （答出两点）。 生物质原料 降解率（%） 协同系数 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2 小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64 玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02 玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34 注：混1和混2表示三种酶的混合物 22．【2024·福建卷18·高考真题】病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： （1）利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是           。 （2）将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是           。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用           限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 （3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a,使其           。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是           。 （4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是           。 （5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是           。 23．【2023·广东卷20·高考真题】种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。 回答下列问题： （1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与 ______ 植株的种子大小相近。 （2）用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和 ______ 进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备 ______ 。 （3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（图1）。用于后续验证突变基因与表型的关系。​ ①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 ______ 。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 ______ %的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性植株 ______ （填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 ______ %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。 为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见图2，在图2电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。 24．【2023·江苏卷23·高考真题】为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：    （1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有  ______ ，扩增程序中最主要的不同是  ______ 。  （2）有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用  ______ 。    A.ATGGTG-----CAACCA  B.TGGTTG----CACCAT  C.GACGAG---CTGCAG  D.CTGCAG-----CTCGTC  （3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有  ______ 。  （4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有  ______ 。  A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落  B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高  C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落  D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化  （5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有  ______ 。    （6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是  ______ 。 25．【2023·河北卷23·高考真题】单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶（ME）基因构建到超表达载体，转入硅藻细胞，以期获得高产生物柴油的硅藻品系。 回答下列问题： （1）根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的            差异获得硅藻粗提DNA，PCR扩增得到目的基因。 （2）超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、            和            等。本研究中目的基因为            。 （3）PCR扩增时引物通过            原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物，对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测，扩增产物电泳结果见图2。其中，样品1为本实验的            组，样品2有特异性扩增产物，结果表明            。 （4）利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析，相对于品系A，品系B的胞内脂质含量平均水平明显            。同时，还需测定            以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。 （5）胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明，品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析，ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高，            ，最终促进胞内脂质合成。 （6）相对于大豆和油菜等油料作物，利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为            。（答出两点即可） 26．【2022·1月浙江卷31·高考真题】我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。回答下列问题： （1）新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用_________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的____________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。 （2）接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的__________基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是__________________________________________。 （3）单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的_______细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和____________。 27．【2022·北京卷19·高考真题】生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。 （1）将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是          。 （2）为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。 ​​​​​​​ 与方案1相比，方案2的主要优势是          ，因而被用于制备监测鱼（MO）。 （3）现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。 Ⅰ．启动子：          。 ①ERE    ②UAS    ③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生） ④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌） Ⅱ．基因：          。 A．GFP                B．Gal4                C．雌激素受体基因（ER） D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg） （4）SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后          造成不育。 （5）使拟用于实际监测的SM不育的目的是          。 28．【2022·山东卷25·高考真题】某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 （1）为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 ______。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 ______（填“3′端”或“5′端”）。 （2）PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 ______。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 ______。 （3）融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ______；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 ______。 （4）根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 ______。 29．【2022·广东卷22·高考真题】“绿水透迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 回答下列问题： （1）研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对 ______，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 （2）研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是 ______，终止子的作用是 ______。 （3）培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是 ______，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。 （4）这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了 ______，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于 ______，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 30．【2022·河北卷20·高考真题】蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。 回答下列问题： （1）蛋白酶抑制剂的抗虫机制是           。 （2）          是实施基因工程的核心。 （3）利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的           上，此方法的不足之处是           ​​​​​​​​​​​​​​。 （4）为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有           （写出两点即可）。 （5）确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的           以鉴定其抗性程度。图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析           （填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI+StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是           。 （6）基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生           。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。据此推测，被蛋白抑制剂基因作物长期选择后，某些昆虫具有了抗蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是          ​​​​​​​（写出两点即可）。 31．【2022·湖北卷22·高考真题】“端稳中国碗，装满中国粮”，为了育好中国种，科研人员在杂交育种与基因工程育种等领域开展了大量的研究。二倍体作物M的品系甲有抗虫、高产等多种优良性状，但甜度不高。为了改良品系甲，增加其甜度，育种工作者做了如下实验； 【实验一】遗传特性及杂交育种的研究 在种质资源库中选取乙、丙两个高甜度的品系，用三个纯合品系进行杂交实验，结果如下表。 杂交组合 F1表现型 F2表现型 甲×乙 不甜 1/4甜、3/4不甜 甲×丙 甜 3/4甜，1/4不甜 乙×丙 甜 13/16甜、3/16不甜 【实验二】甜度相关基因的筛选 通过对甲、乙、丙三个品系转录的mRNA分析，发现基因S与作物M的甜度相关。 【实验三】转S基因新品系的培育 提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培有出转S基因的新品系。 根据研究组的实验研究，回答下列问题： （1）假设不甜植株的基因型为AAbb和Aabb,则乙、丙杂交的F2中表现为甜的植株基因型有           种。品系乙基因型为           。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中甜：不甜比例为           。 （2）如图中，能解释（1）中杂交实验结果的代谢途径有           。 （3）如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用           酶切割S基因的cDNA和载体。 （4）用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，其目的是          ​​​​​​​。 （5）除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方法还有           （答出2点即可）。 32．【2022·重庆卷26·高考真题】改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui基因，并开展了相关探索。 （1）花药培养能缩短育种年限，原因是           。在步骤Ⅰ的花药培养过程中，可产生单倍体愈伤组织，将其培养于含           的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。Ⅰ中能用于制造人工种子的材料是           。 （2）步骤Ⅱ中，eui基因克隆于cDNA文库而不是基因组文库，原因是           ；在构建重组Ti质粒时使用的工具酶有           ​​​​​​​。为筛选含重组Ti质粒的菌株，需在培养基中添加           。获得的农杆菌菌株经鉴定后，应侵染Ⅰ中的           ，以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui基因的鉴定方法是           ，移栽后若发育为更高且丰产的稻株，则可望“禾下乘凉”。 考点03基因工程的应用与蛋白质工程（共13题） 1．【2026·山陕青宁卷21·高考真题】研究人员筛选天然抗虫蛋白时发现，棉铃虫取食过表达J蛋白的棉花植株后会死亡，然而棉花细胞核中积累过量的J蛋白会导致棉花不育。我国科学家运用基因工程技术，构建了一种新型抗虫棉。回答下列问题。 （1）当转入的外源J基因与棉花内源J基因序列相同时，可能会抑制J基因在细胞内的表达。为避免该问题，基于密码子的          性，可设计与内源J基因序列不同但编码氨基酸序列相同的外源J基因（J*）。确定获得的基因是否与设计相符的方法是          （选填序号：①PCR；②琼脂糖凝胶电泳；③测序并序列比对）。 （2）为解决过表达J蛋白导致的棉花不育问题，按照蛋白质工程的设计思路，利用下图所示载体，构建仅在棉铃虫啃食后才表达J*蛋白的抗虫棉。在该载体中，启动子P属于          型启动子。棉铃虫啃食后，棉花细胞中的          酶与启动子P结合，启动融合基因S-J*表达，之后检测到J*蛋白在细胞外积累，则S-J*融合蛋白中信号肽S的作用是          。 （3）已合成的J*基因两端仅含有对应的限制酶识别序列，无额外碱基序列。为使J*基因插入载体并正确表达S-J*融合蛋白，需使用两种限制酶对载体进行酶切，限制酶识别序列如图，可选择的限制酶组合是          或          两种组合，原因是          。 （4）为获得足够的重组质粒，需对转化成功的大肠杆菌振荡培养，振荡培养的原因是          。可利用          法将融合基因导入棉花茎尖细胞，进而获得植株。棉铃虫在啃食抗虫棉后，J*蛋白会进入肠道细胞核中，          （填“促进”或“抑制”）组蛋白去乙酰化酶的活性，组蛋白乙酰化水平升高，诱导肠细胞凋亡，棉铃虫死亡。 2．【2026·湖北卷21·高考真题】玉米是重要粮食作物之一，对低温极为敏感。低温不仅限制玉米的生长，还抑制其对磷的吸收。研究发现，一种泛素连接酶UbL是协调玉米低温响应与磷吸收的核心调控因子，UbL通过泛素化修饰靶蛋白促使其降解，UbL的靶蛋白包括低温信号通路关键蛋白J和磷转运蛋白T。为阐明UbL基因调控玉米低温响应与磷吸收的分子机制，科研人员对野生型玉米（WT）进行UbL基因敲除和定向改造，分别获得功能缺失突变体ubl与定向改造的突变体UbLΔ，并进行了相关实验研究，结果如图所示。 回答下列问题： （1）与野生型玉米相比，低温条件下突变体玉米植株中磷的含量            ，原因是            。 （2）推测蛋白J含量与玉米耐寒性之间呈            相关性，请设计实验证明上述推论            （写出实验思路）。 （3）UbL作为枢纽蛋白，体现了基因与性状之间的关系是            。 （4）培育耐低温玉米，对农业种植的积极意义是            （回答一点即可）。 3．【2026·湖北卷22·高考真题】蛋白激酶CaMKIIδ过度活化可导致某些心血管疾病。该酶过度活化与其第281和282位的甲硫氨酸（Met）有关。可通过向导RNA引导，将腺嘌呤碱基编辑器（ABE）精确定位至基因的待编辑位置，使基因相关位点①和②（如图1）的A转换成G，导致甲硫氨酸变为缬氨酸，从而抑制CaMKIIδ的过度活化。科研人员设计两种向导RNA-sgRNA1和sgRNA6，以此构建了两种ABE，两者在机体心肌细胞中编辑CaMKIIδ基因的效率如图2。 回答下列问题： （1）CaMKIIδ的化学本质是            。 （2）实验中使用心肌特异性启动子来驱动ABE发挥作用，目的是            。 （3）图1中sgRNA1序列为            （填标号）。 A.5′-GCTTCCATGATGCACAGAC-3′ B.5′-GTCTGTGCATCATGGAAGC-3′ C.5′-GUCUGUGCAUCAUGGAAGC-3′ D.5′-CGAAGGUACUACGUGUCUG-3′ （4）由图2可知，以            为向导RNA的ABE编辑效果更好，理由是            。 （5）镰状细胞贫血是一种遗传病，导致该病的根本原因是            ；理论上，若用上述技术，需将碱基编辑器导入            （填细胞名称），从而实现对患者血红蛋白分子的改造，达到治疗目的。 4．【2026·广东卷20·高考真题】疟疾是由疟原虫引起、经按蚊传播的传染病，对人类健康构成严重威胁。雌蚊成虫吸血后产卵，雄蚊不吸血。研究人员成功培育出一种转抗菌肽基因（MM-CP）按蚊。该抗菌肽仅在雌蚊吸血后高表达，可有效抑制按蚊肠道内疟原虫的发育，为疟疾防控提供了新思路。回答下列问题： （1）构建该转基因按蚊涉及的可遗传变异类型属于          。MM-CP转录形成的mRNA在翻译过程中，tRNA上的          与mRNA上的密码子互补配对，将氨基酸转运至核糖体参与抗菌肽合成。 （2）研究发现，抗菌肽影响按蚊自身存活。转基因雌蚊吸血后存活率显著降低，但多数个体能在死亡前完成繁殖。推测转基因按蚊中调控MM-CP表达的启动子类型为          。从基因传递的角度分析，选用该类启动子的原因是          。为降低抗菌肽对按蚊的不利影响，运用蛋白质工程原理提出一种改造MM-CP的设计思路。          。 （3）基于CRISPR/Cas9系统的基因驱动技术，可使特定基因从亲代到子代的遗传概率显著高于50%，从而在种群中快速扩散。研究人员培育了驱动型和非驱动型转基因按蚊（如图）。与非驱动型相比，驱动型后代中携带MM-CP的个体比例显著增加，其原因是：形成配子时，Cas9切割野生型染色体，然后          ，使更多配子携带MM-CP。 （4）若将该驱动型转基因按蚊大范围释放，可能引发一些潜在风险。试从生物进化角度提出一种潜在风险。          。 5．【2026·北京卷20·高考真题】学习以下材料，回答（1）~（4）题。 合成生物学助力尿酸代谢平衡 尿酸是细胞中嘌呤分解代谢的产物。大多数哺乳动物可以依靠细胞内的酶分解尿酸，但人类缺少酶，导致血液中的尿酸浓度比大多数哺乳动物高几十倍。尿酸有多种生物学功能，如可以作为还原剂减少细胞中的自由基。若尿酸代谢异常，浓度超过时，尿酸可能沉积于关节囊中，引发痛风。 为探索痛风的新疗法，研究者利用合成生物学的方法建立了一个尿酸响应体系。他们首先构建了两种表达载体（见下图），右侧是报告基因SEAP表达载体，启动子和SEAP之间插入了cH序列；左侧是表达载体，是来自细菌的一种蛋白，既能与尿酸可逆结合，也能与可逆结合。当尿酸浓度较低时，与结合的多，从而减少SEAP的转录；当尿酸浓度较高时，更多的与尿酸结合，导致结合于的减少，SEAP的转录增加（如下图）。将两种载体同时导入体外培养的细胞，发现SEAP的表达随培养液中尿酸浓度的变化而变化；在相同尿酸浓度下，SEAP的表达量随插入cH数目的增加而减少。 随后，研究者将酶基因改造为基因，用基因替换图中的SEAP，构建sU表达载体，其中串联的cH数目为8个。将R表达载体和sU表达载体导入细胞，再将细胞植入U酶缺失的小鼠体内，7天后小鼠血液中尿酸水平由降为，与饲喂痛风常用药的效果相似。可见上述研究为痛风的治疗提供了新思路。 （1）表达载体中__________的功能是驱动目的基因的转录。 （2）由文中信息可知尿酸与序列之间的关系：二者__________结合蛋白。 （3）为降解血液中而不是细胞内的尿酸，研究者将U酶基因改造为基因，基因应编码__________的U酶。 （4）对文中的表达载体稍加改造，可进一步降低U酶缺失小鼠的血液尿酸浓度。为此，利用文中现有的DNA序列，可以在sU表达载体中进行的改造是__________。 （5）利用合成生物学构建类似的稳态调控系统，也有希望用于其他代谢相关疾病的治疗。如果采用文中设计思路助力血糖稳态的维持，关键是寻找__________。 6．【2025·甘肃卷21·高考真题】水稻白叶枯病（植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑）由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET（该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻）的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株（如图）。回答下列问题。 （1）CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过______（方法）将该质粒转入植物细胞，并将______整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加______。 （2）实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为______，对其消毒时需依次使用酒精和______处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是______。 （3）为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用______技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较______来验证抗病性。 （4）在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为______。 7．【2025·贵州卷18·高考真题】番茄细胞中线粒体形态与其自身功能密切相关，并影响番茄果实的成熟过程。研究者将决定蛋白质在细胞内定位的特定肽链“嫁接”到绿色荧光蛋白（GFP）上，控制GFP在番茄细胞内的分布，从而在显微镜下观察线粒体的形态变化。回答下列问题： （1）根据蛋白质工程原理，一般不会直接拼接肽链，而是将两段肽链对应的______拼接在一起完成“嫁接”，细胞色素c氧化酶Ⅳ（COXⅣ）参与有氧呼吸生成水的过程。COXⅣ的一段肽链序列X决定了COXⅣ在细胞内的分布，研究者选择将X与GFP拼接，理由是______。 （2）拼接好的序列应插入图中农杆菌T-DNA的______（填图中字母）处。理由是______。 （3）选择番茄幼嫩子叶进行离体培养，这些培养的器官、组织或细胞被称为______。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的______中，番茄组织培养过程中，芽诱导期需在培养基中添加的植物激素是______。 8．【2024·湖北卷20·高考真题】苏云金芽孢杆菌产生的Bt毒蛋白，被棉铃虫吞食后活化，再与肠道细胞表面受体结合，形成复合体插入细胞膜中，直接导致细胞膜穿孔，细胞内含物流出，直至细胞死亡。科学家将编码Bt毒蛋白的基因转入棉花植株，获得的转基因棉花能有效防控棉铃虫的危害。 回答下列问题： （1）Bt毒蛋白引起的细胞死亡属于 ______ （填“细胞坏死”或“细胞凋亡”）。 （2）如果转基因棉花植株中Bt毒蛋白含量偏低，取食后的棉铃虫可通过激活肠干细胞分裂和 ______ 产生新的肠道细胞，修复损伤的肠道，由此导致杀虫效果下降。请据此提出一项可提高转基因棉花杀虫效果的改进思路： ______ 。 （3）在Bt毒蛋白的长期选择作用下，种群中具有抗性的棉铃虫存活的可能原因是：肠道细胞表面受体蛋白的 ______ 或 ______ 发生变化，导致棉铃虫对Bt毒蛋白产生抗性。 （4）将Bt毒蛋白转基因棉花与非转基因棉花混种，可以延缓棉铃虫对转基因棉花产生抗性，原因是 ______ 。 9．【2023·辽宁卷23·高考真题】天然β-淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题： (1)上述过程属于                    工程。 (2)PCR中使用的聚合酶属于          （填写编号）。 ①以DNA为模板的RNA聚合酶     ②以RNA为模板的RNA聚合酶 ③以DNA为模板的DNA聚合酶     ④以RNA为模板的DNA聚合酶 (3) 某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是                    （填写编号）。 (4) 为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因（即改造后的基因）和                              。 (5)目的基因（不含EcoRⅠ酶切位点）全长为1.5kb，将其插入BamHⅠ位点。用EcoRⅠ酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是                                                                      。正确连接的基因表达载体被EcoRⅠ酶切后长度为          kb。 (6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过                    ​​​​​​​反应获得PCR的模板。 10．【2022·北京卷18·高考真题】人体细胞因表面有可被巨噬细胞识别的“自体”标志蛋白C，从而免于被吞噬。某些癌细胞表面存在大量的蛋白C，更易逃脱吞噬作用。研究者以蛋白C为靶点，构建了可感应群体密度而裂解的细菌菌株，拟用于制备治疗癌症的“智能炸弹”。 （1）引起群体感应的信号分子A是一种脂质小分子，通常以          的方式进出细胞。细胞内外的A随细菌密度的增加而增加，A积累至一定浓度时才与胞内受体结合，调控特定基因表达，表现出细菌的群体响应。 （2）研究者将A分子合成酶基因、A受体基因及可使细菌裂解的L蛋白基因同时转入大肠杆菌，制成AL菌株。培养的AL菌密度变化如图1。其中，AL菌密度骤降的原因是：AL菌密度增加引起A积累至临界浓度并与受体结合，          。 （3）蛋白K能与蛋白C特异性结合并阻断其功能。研究者将K基因转入AL菌，制成ALK菌株，以期用于肿瘤治疗。为验证ALK菌能产生蛋白K，应以          菌株裂解的上清液为对照进行实验。请从下列选项中选取所需材料与试剂的序号，完善实验组的方案。 实验材料与试剂： ①ALK菌裂解的上清液                    ②带荧光标记的K的抗体 ③带荧光标记的C的抗体                 ④肿瘤细胞 实验步骤： 先加入          保温后漂洗，再加入          保温后漂洗，检测荧光强度。 （4） 研究者向图2所示小鼠左侧肿瘤内注射ALK菌后，发现ALK菌只存在于该侧瘤内，两周内即观察到双侧肿瘤生长均受到明显抑制。而向瘤内单独注射蛋白K或AL菌，对肿瘤无明显抑制作用。请应用免疫学原理解释“智能炸弹”ALK菌能有效抑制对侧肿瘤生长的原因。 11．【2022·江苏卷21·高考真题】科学家研发了多种RNA药物用于疾病治疗和预防，图中①～④示意4种RNA药物的作用机制。请回答下列问题。 （1）细胞核内RNA转录合成以 ______为模板，需要 ______的催化。前体mRNA需加工为成热的mRNA，才能转运到细胞质中发挥作用，说明 ______对大分子物质的转运具有选择性。 （2）机制①：有些杜兴氏肌营养不良症患者DMD蛋白基因的51外显子片段中发生 ______，提前产生终止密码子，从而不能合成DMD蛋白。为治疗该疾病，将反义RNA药物导入细胞核，使其与51外显子转录产物结合形成 ______，DMD前体mRNA剪接时，异常区段被剔除，从而合成有功能的小DMD蛋白，减轻症状。 （3）机制②：有些高胆固醇血症患者的PCSK9蛋白可促进低密度脂蛋白的内吞受体降解，血液中胆固醇含量偏高。转入与PCSK9mRNA特异性结合的siRNA，导致PCSK9mRNA被剪断，从而抑制细胞内的 ______合成，治疗高胆固醇血症。 （4）机制③：mRNA药物进入患者细胞内可表达正常的功能蛋白，替代变异蛋白发挥治疗作用。通常将mRNA药物包装成脂质体纳米颗粒，目的是 ______。 （5）机制④：编码新冠病毒S蛋白的mRNA疫苗，进入人体细胞，在内质网上的核糖体中合成S蛋白，经过 ______修饰加工后输送出细胞，可作为 ______诱导人体产生特异性免疫反应。 （6）接种了两次新型冠状病毒灭活疫苗后，若第三次加强接种改为重组新型冠状病毒疫苗，根据人体特异性免疫反应机制分析，进一步提高免疫力的原因有：______。 12．【2022·湖南卷22·高考真题】水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题： （1）蛋白质工程流程如图所示，物质a是 ______，物质b是 ______。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是 ______。 （2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有 ______、______和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 ______。 （3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 ______（填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是 ______。 （4）若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路 ______。 13．【2022·重庆卷23·高考真题】科学家用基因编辑技术由野生型番茄（HH）获得突变体番茄（hh），发现突变体中DML2基因的表达发生改变，进而影响乙烯合成相关基因ACS2等的表达及果实中乙烯含量（如图Ⅰ、Ⅱ），导致番茄果实成熟期改变。请回答以下问题： （1）图Ⅰ中，基因h是由基因H编码区第146位碱基后插入一个C（虚线框所示）后突变产生，致使h蛋白比H蛋白少93个氨基酸，其原因是          。基因h转录形成的mRNA上第49个密码子为           。另有研究发现，基因H发生另一突变后，其转录形成的mRNA上有一密码子发生改变，但翻译的多肽链氨基酸序列和数量不变，原因是           。 （2）图Ⅱ中，t1～t2时段，突变体番茄中DML2基因转录的mRNA相对量低于野生型，推测在该时间段，H蛋白对DML2基因的作用是          。突变体番茄果实成熟期改变的可能机制为：H突变为h后，由于DML2基因的作用，果实中ACS2基因           ，导致果实成熟期           （填“提前”或“延迟”）。 （3）番茄果肉红色（R）对黄色（r）为显性。现用基因型为RrHH和Rrhh的番茄杂交，获得果肉为红色、成熟期为突变体性状的纯合体番茄，请写出杂交选育过程（用基因型表示）。          。 试卷第1页，共3页 / 学科网（北京）股份有限公司 $