专题23 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题-【十年高考】备战2027年高考生物真题分类解析与应试策略（Word版）

专题二十三　基因工程及生物技术的安全性与伦理问题 考点72　基因工程的基本工具及操作程序 1.BD　基因A突变为致病基因a是由碱基对T—A被G—C替换造成的,A项错误。用Hind Ⅲ限制酶酶切A基因后会形成黏性末端,用AluⅠ限制酶酶切A基因后,形成的是平末端,B项正确。用AluⅠ限制酶切割a基因有3个酶切位点,而Hind Ⅲ酶切位点只有2个,所以两种限制酶分别酶切a基因产生的片段大小不同,C项错误。用Hind Ⅲ限制酶对基因a进行酶切,产生的片段与对基因A的酶切结果不同,通过电泳显示可以进行鉴定诊断,D项正确。 2.C　本题主要考查DNA片段的扩增与电泳鉴定等知识,考查学生的信息获取和逻辑推理能力。因为DNA分子带负电,在凝胶中会向电源正极迁移,所以其迁移方向是从电源负极到正极,并非从电源正极到负极,A项错误。质粒P有两个EcoRⅠ限制酶的切割位点,单酶切后的产物最小,电泳时迁移速度较快,可推知泳道③条带可能是EcoRⅠ的单酶切产物(单酶切产生2个片段大小相同),泳道②条带和泳道④条带位置一致,无法区分泳道②条带是SacⅠ还是BamHⅠ的单酶切产物,B项错误。EcoRⅠ有2个酶切位点,单酶切会产生2个片段,SacⅠ有1个酶切位点,单酶切会产生1个线性片段。SacⅠ和EcoRⅠ双酶切,会产生3个片段,观察电泳图谱,泳道⑤有3个条带,可推测泳道⑤条带为SacⅠ和EcoRⅠ酶切产物,C项正确。酶切只是将质粒的环状结构切开,变成线性等结构,碱基总数不会改变,D项错误。 3.B　本题考查基因工程的相关知识,主要考查学生的判断和分析问题的能力。将T-DNA整合到水稻愈伤组织的染色体DNA后,若要使D基因表达并使水稻植株表现出抗病性状,那么D基因上游的U6启动子需被水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别,A项错误。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,并能够驱动基因转录出mRNA,最终表达出蛋白质。由题图得出,上述重组Ti质粒中的U6启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游,因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达,B项正确。愈伤组织多指将植物体的某一组织、器官置于特定培养基中培养,诱导产生的无定形的组织团块。当农杆菌侵染愈伤组织后,T-DNA整合到水稻细胞染色体的DNA中,通常情况下,若D基因能表达,那么T-DNA上的潮霉素抗性基因也能表达,从而使得导入T-DNA的水稻愈伤组织具有潮霉素抗性基因;卡那霉素抗性基因不位于T-DNA上,不会发生上述生理过程。因此,在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入潮霉素,C项错误。检测是否成功获得转基因品种一般需要经历两个阶段,首先是分子水平的检测,包括检测目的基因是否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的基因是否转录出mRNA或最终表达出蛋白质,其次,还需要进行个体生物学水平的鉴定。因此愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗不一定是抗病植株,D项错误。 4.C　氯化钙处理大肠杆菌可使其处于感受态,提高转化效率,更多质粒(含目的基因或不含)导入,会增加蓝色(未插入目的基因,β-半乳糖苷酶基因完整)和白色(插入目的基因,β-半乳糖苷酶基因被破坏)菌落数,A项正确。仅含卡那霉素时,导入普通质粒和含目的基因质粒的大肠杆菌均会形成白色菌落,无法判定菌株是否含目的基因,B项正确。白色菌落仅说明β-半乳糖苷酶基因被破坏(可能插入目的基因),但目的基因不一定表达,不能直接判定为表达目标蛋白的菌株,C项错误。质粒K酶切后自身环化,导入大肠杆菌后β-半乳糖苷酶基因完整,可分解X-gal产生蓝色菌落,会使蓝色菌落偏多,D项正确。 5.A　琼脂糖凝胶的密度对其中DNA分子的迁移和分辨率有影响。根据所需分离的DNA片段大小,通常会选择适当浓度的琼脂糖凝胶。对于大型DNA片段(如基因组DNA或质粒DNA),一般选择低浓度琼脂糖凝胶,以便实现高效迁移所需较大孔径;对于小型DNA片段(如PCR产物或酶切片段),则需要选择高浓度琼脂糖凝胶以提供更好的分辨率和分离效果,A项正确。凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是用于确定样品迁移的位置,B项错误。在琼脂糖凝胶电泳中,施加电场后,会使得DNA片段向正极方向迁移,同时,DNA片段的迁移速率与其长度呈负相关,即越长的DNA片段,迁移速率越慢,C项错误。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,D项错误。 6.C　酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌和真菌,A项错误。将含有酵母菌的培养基放置在28 ℃恒温培养箱中进行培养,B项错误。稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌的数目,当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌,由此可知,可用稀释涂布平板法对酵母菌计数,C项正确。酵母菌是真核细胞,具有高尔基体和内质网,可以对合成的蛋白质进行加工和修饰,D项错误。 7.B　限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A项正确。酶切条件不合适通常会使切割效果下降,此时应有部分DNA被酶切,B项错误。质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失,进而造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常质粒,C项正确。质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶,D项正确。 8. (1)化学合成法(人工合成法)　T4　未插入目的基因的空质粒(自身环化的pPK2质粒)　A　D(A、D顺序可互换)　染色体DNA(基因组DNA)　B (2)工程菌培养物对蚊子的引诱能力更强,蚊子的访问次数更多、停留时间更长,使更多分生孢子附着在蚊子体表,侵染效率提升,因此致死速度加快、死亡率更高 (3)安全性 解析 本题结合基因工程改造平沙绿僵菌研发灭蚊剂的实验流程,考查目的基因的获取、DNA连接酶的特性、重组质粒的鉴定、农杆菌转化法及基因工程的安全性评价等知识,以及科学思维、科学探究等学科素养。(1)重新设计的密码子序列在自然情况下不存在,可通过化学合成法人工合成该目的基因。EcoR Ⅴ切割产生平末端,T4 DNA连接酶既可连接黏性末端也可连接平末端,E.coli DNA连接酶主要连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端,但连接平末端的效率远远低于T4 DNA连接酶,因此使用T4 DNA连接酶可获得更高的平末端连接效率。经卡那霉素筛选的农杆菌中,除含目的基因的重组质粒外,还可能存在未插入目的基因、自身环化的空质粒。重组质粒总长度为质粒5.0 kb加上Tps基因1.8 kb,共6.8 kb;BamHⅠ与EcoRⅠ双酶切时,可切下0.7 kb的基因片段,剩余6.1 kb的载体片段,对应A组;Hind Ⅲ与EcoRⅠ双酶切时,可切下1.1 kb的基因片段,剩余5.7 kb的载体片段,对应D组。农杆菌转化后,T-DNA会转移并整合到平沙绿僵菌的染色体DNA上。PCR扩增时,引物需分别与两条模板链的3'端互补,正向引物序列与编码链5'端一致为5'-ATGTC…-3',反向引物与编码链3'端互补序列为5'-GGAGC…-3',故选B。(2)孢子附着量决定蚊子死亡速度,工程菌中表达长叶烯合酶基因,引诱能力显著增强,蚊子访问次数更多、停留时间更长,使更多分生孢子附着于蚊子体表,侵染效率提升,因此LT50显著缩短,第7天死亡率更高。(3)基因工程产品推广前必须经过严格的安全性评价,评估其对生态环境、非靶标生物的潜在影响,符合安全标准后方可推广应用。 基因工程操作易混点辨析 一是易混淆两种DNA连接酶的功能差异,E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于T4 DNA连接酶。二是重组质粒酶切鉴定易算错片段长度,需先计算重组质粒总长度,再结合酶切位点的位置拆分片段。三是PCR引物选择易出现方向错误,需明确引物与模板链反向互补,两个引物分别结合在两条链的3'端,延伸方向均为5'→3'。 9. (1)启动子　复制原点 (2)PstⅠ、XhoⅠ (3)DNA聚合酶和DNA连接酶　不需要　DNA聚合酶能从缺口处的3'端开始添加脱氧核苷酸 (4)抗原-抗体杂交 解析 本题结合末端脱氧核苷酸转移酶介导的同聚物加尾法构建重组载体的实验,考查基因工程的载体结构、限制酶选择、重组载体构建及目的基因表达检测等知识。(1)载体上的启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点,可驱动目的基因的转录。复制原点是载体在宿主细胞内进行自我复制的起点,保证载体随细胞分裂稳定遗传。(2)要保证重组载体中基因W可以被完整切下,需要选择两种限制酶,使得它们的识别序列在加尾后仍能被保留。由题图可知,基因W和载体上都有Sal Ⅰ的识别序列和切割位点,如果选用它会破坏基因W的结构,使基因W失活,因此不能选用Sal Ⅰ。若选用Pst Ⅰ和Kpn Ⅰ,酶切后产生的黏性末端为3'端突出,若要重新从重组载体上切下,Pst Ⅰ切割载体后要加同聚物G尾,Kpn Ⅰ切割载体后要加同聚物C尾,这样在重组载体中才能出现它们完整的识别序列而再次进行切割。若选用Xho Ⅰ,酶切后产生的黏性末端为5'端突出,可以先用DNA聚合酶补平,若要在重组载体中出现其完整的识别序列而再次进行切割,则要加同聚物G尾。载体在加尾时,只能加入一种脱氧核苷酸,否则会随机连接,这样载体两端只能加G尾。同理,目的基因的两端只能加互补的C尾。为了将质粒和基因W连接到一起,同聚物加尾间要能发生碱基互补配对,故应选择Pst Ⅰ、Xho Ⅰ。(3)同聚物尾互补配对后形成的重组载体存在单链缺口,DNA聚合酶可从单链缺口的3'端添加脱氧核苷酸,再由DNA连接酶连接磷酸二酯键,最终形成完整的环状重组载体。(4)在分子水平检测目的基因是否表达出相应蛋白质,采用抗原-抗体杂交技术,利用抗体与目标蛋白的特异性结合,判断目的蛋白是否成功合成。 10. (1)延伸 (2)防止目的基因自身环化、防止目的基因反向连接、防止质粒自身环化(任意2点) (3)防止外源基因扩散,减少基因污染,提升转基因生物的环境安全性 (4)庆大霉素　重组质粒携带该抗生素抗性标记基因,只有成功导入重组质粒的受体菌在含该抗生素培养基存活,未转化野生菌被杀死　蔗糖　②　进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 解析 (1)PCR每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。 (2)构建基因表达载体时,选用两种限制酶可防止目的基因自身环化、防止目的基因与质粒的反向连接、防止质粒自身环化。 (3)导入α-淀粉酶基因让花粉失活,转基因花粉不能飘散授粉,杜绝通过花粉向野生近缘植物发生基因漂移;质粒无法独立复制,只有整合到宿主基因组才能稳定留存,不会在细胞内大量扩增、也不易转移到其他微生物,阻断外源基因扩散,以上两种措施均可防止外源基因扩散,减少基因污染,提升转基因生物的环境安全性。 (4)由题图可知,第一次交换后UW4-1菌株中含有庆大霉素抗性基因,第一次筛选时,培养基添加庆大霉素,筛选原理是重组质粒携带该抗生素抗性标记基因,只有成功导入重组质粒的受体菌在含该抗生素培养基存活,未转化野生菌被杀死。第二次筛选在培养基中加入蔗糖,具有蔗糖致死基因的菌株不能有活,筛选后,培养基中仍同时存在两种菌株—UW4-2菌种和另一种菌株。由题图可知,UW4-2拟核DNA插入了外源基因片段,另一株丢失整合片段,拟核DNA为未插入外源序列的原始环状结构,图②。用特异性引物PCR扩增后,进行琼脂糖凝胶电泳,依据条带大小区分两种菌株扩增产物,鉴定纯化UW4-2菌株。 11. (1)BclⅠ和XbaⅠ (2)3+6　2 500 (3)X　4　3和5 解析 本题结合抗虫转基因高粱的培育与检测实验,考查基因工程的工具酶选择、PCR扩增产物分析、DNA化学测序及甲基化检测等知识,以及科学思维、科学探究等学科素养。(1)所选限制酶的作用位点需位于启动子与终止子之间,因此不可选用BstⅠ;为避免质粒自身环化以及目的基因反向连接,需选用两种产生不同黏性末端的限制酶进行双酶切,BclⅠ与XbaⅠ的酶切位点位于质粒上启动子与终止子之间的表达区域,二者切割后产生的黏性末端序列不同,可实现目的基因的定向插入,因此选择BclⅠ和XbaⅠ对质粒进行酶切。BamHⅠ与BstⅠ识别与切割的序列相同,因此不能选用BamHⅠ与BstⅠ。(2)DNA电泳时,片段长度越短迁移速率越快,引物组合3+6的扩增产物长度仅为250 bp,是所有引物组合中产物最短的,因此其扩增产物电泳迁移速率最快;结合引物位置与扩增长度,引物1+6扩增的全长片段为4 750 bp,其中包含2 000 bp的启动子序列、250 bp的下游序列以及中间的V基因,计算可得抗虫基因V的长度约为4 750-2 000-250=2 500 bp。(3)化学测序中,每条泳道的条带数等于试剂识别的有效碱基数加1条未切割的全长片段,泳道③共有5条条带,对应识别G、A两种碱基的X试剂;泳道②为识别胞嘧啶的试剂组,a、b分别对应两个不同位置的胞嘧啶切割产生的标记片段,二者长度相差4个核苷酸;结合亚硫酸氢盐可将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的作用原理推导可得,启动子的该序列从5'端到3'端第3位和第5位核苷酸发生了甲基化。 解答本题需紧扣三个核心逻辑:一是双酶切的核心是产生不同的黏性末端,需避开同尾酶;二是可通过不同引物扩增产物的长度差计算目的基因长度;三是化学测序条带数为有效切割位点数加全长条带,越靠下的条带片段越短,对应位点越靠近5'标记端。 12. (1)磷酸二酯　便于FP蛋白的分离纯化与检测鉴定 (2)单独使用FP蛋白和PD-1抗体均能抑制肿瘤生长,二者联合使用时抗肿瘤效果显著增强,优于单独处理 (3)ATP (4)E.coli-fp　肿瘤内部为缺氧环境,适合兼性厌氧大肠杆菌生存增殖,正常组织氧含量较高,不利于该菌大量存活　工程菌E.coli-fp可在肿瘤组织中特异性增殖并表达FP蛋白,FP蛋白通过水解ATP减少肿瘤细胞的能量供应,抑制肿瘤细胞增殖,从而发挥抗肿瘤作用 解析 本题结合工程菌抗肿瘤的研究情境,考查基因工程的工具酶、标签蛋白的功能、实验结果分析、酶的底物判断及工程菌作用机制,侧重考查科学思维与科学探究等学科素养。(1)DNA连接酶可催化目的基因与载体之间形成磷酸二酯键,完成重组质粒的构建;将His标签序列与fp基因融合表达,可利用His标签与对应抗体的特异性结合,实现对目标蛋白FP的分离纯化以及定性检测。(2)分析图2的肿瘤体积变化曲线,与对照组相比,FP蛋白处理组与PD-1抗体处理组的肿瘤体积均明显减小,说明二者单独使用均能有效抑制肿瘤生长,且单药抑制效果相近;二者联合处理组的肿瘤体积更小,说明联合使用时抗肿瘤效果显著提升,优于单独使用其中一种处理。(3)结合色谱出峰规律,分子越小出峰时间越早;对比标准品与反应后峰位,加入FP蛋白后,ATP发生水解反应生成对应的二磷酸产物,而GTP加入FP蛋白后无变化,说明FP蛋白可催化ATP分解,因此ATP为该蛋白的反应底物。(4)组1能与His标签抗体产生阳性杂交信号,说明其表达带His标签的融合蛋白,对应转入fp基因的工程菌E.coli-fp;肿瘤内部因快速增殖形成缺氧微环境,恰好适配兼性厌氧大肠杆菌的生存繁殖需求,而正常组织氧含量充足,不利于该菌生存增殖,因此大肠杆菌主要在肿瘤中存活聚集。综合来看,E.coli-fp经尾静脉注射后可特异性富集于肿瘤组织并持续表达FP蛋白,FP蛋白通过分解ATP耗竭肿瘤细胞的能量物质,抑制肿瘤细胞增殖,最终实现抗肿瘤效果。 色谱底物判定与工程菌作用机制梳理 解答酶底物判断类色谱题可遵循“两步法”:第一步依据标准品的出峰时间,确定各物质对应的特征峰位置;第二步对比加入酶前后的峰图,消失的特征峰对应反应底物,新增的特征峰对应反应产物,由此可快速推导酶的催化反应类型与底物种类。分析细菌靶向抗肿瘤机制时,可从“靶向富集-功能表达-效应通路”三个层级逐层梳理,结合题干给出的蛋白功能与细菌特性整合完整作用逻辑。 13. (1)①抗体 ②驱动CAR基因仅在星形胶质细胞中特异性表达　KpnⅠ、BamHⅠ (2)C (3)等量的不携带CAR基因的空病毒(空载病毒载体)　表达CAR的星形胶质细胞可吞噬并降解Aβ聚集体,减轻神经元损伤,对阿尔茨海默病具有一定的治疗效果 解析 本题结合嵌合抗原受体修饰星形胶质细胞治疗阿尔茨海默病的科研情境,综合考查基因工程的载体构建、限制酶选择、启动子功能、细胞吞噬实验设计和动物实验对照原则等知识,以及科学思维、科学探究与社会责任等学科素养。(1)①嵌合抗原受体的胞外识别区负责特异性结合靶抗原Aβ聚集体,该功能由抗体的抗原结合区实现,因此胞外识别区应选用Aβ聚集体的抗体特定片段编码序列,使表达出的CAR蛋白可精准识别Aβ聚集体。②特异性启动子具有细胞特异性,仅能在星形胶质细胞中招募RNA聚合酶启动转录,其作用是使CAR基因仅在星形胶质细胞中特异性表达,避免CAR在其他细胞中合成。为使CAR基因正确插入病毒载体,应使用双酶切,可避免自身环化,同时需要通过绿色荧光蛋白示踪CAR基因成功导入星形胶质细胞,故病毒载体需保留GFP基因,因此不能选择Hind Ⅲ切割病毒载体;为保证CAR基因在星形胶质细胞中特异性表达,需将特异性启动子和CAR基因编码序列同时插入病毒载体,并且破坏病毒载体上的非特异性启动子,则应选择限制酶Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ构建基因表达载体。(2)鉴定CAR-A细胞对Aβ聚集体的吞噬与降解能力,需先让细胞在含Aβ的培养基中完成吞噬,再更换至无Aβ的培养基排除细胞外Aβ的干扰。降解发生在细胞内,因此需分别检测0 h(刚更换培养基时,代表细胞吞噬的初始Aβ总量)和24 h的细胞内Aβ聚集体含量,若24 h含量显著下降,则证明细胞可降解Aβ,C项正确。仅检测24 h的含量无法判断是否发生降解,检测细胞外Aβ无法反映细胞内的降解过程,故A、B、D项错误。(3)该实验的自变量为病毒是否携带CAR基因,对照组需遵循单一变量原则,注射等量的不携带CAR基因的空病毒,以排除病毒载体本身对实验结果的干扰。实验结果显示,注射携带CAR基因的病毒后,模型小鼠大脑Aβ聚集体减少,神经元损伤标志蛋白的表达量下降,说明表达CAR的星形胶质细胞可通过吞噬降解Aβ聚集体减轻神经元损伤,对阿尔茨海默病具有一定的治疗作用。 基因工程限制酶选择类三步法 第一步明确目的基因必须保留的核心元件(如本题的特异性启动子、完整编码区),排除切割位点位于核心元件内部的酶;第二步明确载体必须保留的功能元件(如本题的GFP标记基因),排除破坏标记基因的酶;第三步结合实验目的(如本题需避免非特异性表达),进一步筛选可去除冗余元件、实现定向连接的酶组合,优先选择双酶切方案以避免自身环化与反向连接。分析细胞吞噬降解实验时,需紧扣“降解发生在细胞内、定量分析需前后对照”的核心逻辑,快速锁定检测对象与时间点。 14. (1)pH　不会　胰蛋白酶会分解细胞膜上的蛋白质,处理时间过长会导致细胞损伤或死亡 (2)③和④　将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细胞 (3)抑制　促进 解析 本题考查动物细胞工程和基因工程方面的知识,以及科学思维和社会责任的学科素养。(1)恒温培养箱内的CO2用于维持培养液的pH,若CO2不足,培养液pH会出现异常。乳腺癌细胞为癌细胞,细胞膜表面糖蛋白数量减少,细胞之间的黏着性下降,所以癌细胞不会出现接触抑制现象。胰蛋白酶可分解细胞间的蛋白质,使贴壁细胞分散,处理时间过长会分解细胞膜上的蛋白质,导致细胞损伤或死亡。(2)首先观察P基因,依据转录方向可知,基因的上面一条链是模板链,下面一条链是非模板链。与模板链结合的是上游引物,与非模板链结合的是下游引物。据题图可知上游引物的后面几个碱基应该是AGGCAT,符合要求的是引物①和③;下游引物的后面几个碱基应该是CCGTGT,符合要求的是引物④和⑥。再考虑限制酶的酶切位点,结合质粒图可知,不能选择Hind Ⅲ酶切,因为会破坏复制原点,也不能选择BamH Ⅰ酶切,因为可能会造成质粒片段的丢失。结合转录的方向,上游引物添加的限制酶序列与靠近启动子的酶切位点相同,则应补充的是Bgl Ⅱ的识别序列,最终选择的是引物③,下游引物添加的限制酶序列与靠近终止子的相同,则是Spe Ⅰ的识别序列,最终选择的是引物④。探究P基因的作用时,对照组应将不含P基因的空质粒导入乳腺癌细胞,排除质粒载体本身对实验的干扰。(3)S基因可抑制肿瘤增殖,P蛋白能诱导S基因的启动子甲基化,基因启动子甲基化会抑制基因的转录,因此P基因抑制S基因的转录,解除S基因对肿瘤增殖的抑制作用,进而促进肿瘤耐药。 15. (1)复制原点(复制起点)　终止子　终止目的基因的转录,使RNA聚合酶脱离模板,保证转录在合适位置结束 (2)XhoⅠ　NcoⅠ (3)b　目的基因片段长度小于载体片段,DNA分子越小电泳迁移速率越快,因此距离点样孔更远的条带b对应目的基因片段 (4)工程菌进入快速增殖阶段,菌体数量大量增加,同时目的基因高效表达,分泌到培养液中的4αGT快速积累(答出一点,合理即可) 解析 本题结合4αGT工程菌的构建流程,考查基因工程的载体元件、限制酶选择、电泳鉴定与工程菌培养的知识,以及科学思维与科学探究的学科素养。(1)复制原点是载体在宿主细胞中自主复制的起点,是克隆载体与表达载体均需具备的元件;与克隆载体相比,表达载体需额外配备启动子和终止子,终止子可终止转录过程,使RNA聚合酶停止转录并脱离模板,保证目的基因转录出完整的mRNA。(2)根据酶切位点与黏性末端匹配:XhoⅠ切割后产生5'突出的TCGA黏性末端,与目的基因的5'-TCGAG、3'-C末端完全匹配,对应限制酶1;NcoⅠ切割后产生5'突出的CATG黏性末端,与目的基因的末端序列互补匹配,对应限制酶2,双酶切可实现目的基因的定向连接。(3)DNA电泳中分子越小迁移速率越快,距离点样孔越远。重组表达载体总长度为5 129 bp,载体骨架为3 617 bp,因此目的基因片段更小,迁移更快,对应下方的条带b。(4)阶段2工程菌处于对数生长期,菌体快速增殖、数量大幅上升,同时目的基因持续高效表达,分泌到培养液中的4αGT快速积累,因此含量迅速升高。 16. (1)简并　③ (2)诱导　RNA聚合　引导融合蛋白分泌到细胞外(介导新生肽链进入内质网,最终分泌至细胞外) (3)KpnⅠ和EcoRⅠ　EcoRⅠ和SalⅠ　两种限制酶切割产生不同的黏性末端,可防止载体自身环化和目的基因反向连接,且插入后能保证J*基因与信号肽编码序列的阅读框一致,使融合蛋白正确表达 (4)增加培养液溶氧量,同时使菌体与营养物质充分接触,提高营养利用率,促进大肠杆菌繁殖　农杆菌转化　抑制 解析 本题结合新型抗虫棉的基因工程构建过程,考查密码子特性、基因工程的工具与操作、蛋白质工程及表观遗传等相关知识,以及科学思维、科学探究等学科素养。(1)密码子具有简并性,一种氨基酸可对应多种密码子,因此可设计出碱基序列不同但编码氨基酸序列相同的外源J基因。要确定获得的J*基因是否与设计相符,需先通过PCR扩增目的基因,再进行测序并与设计序列比对,但PCR只需要引物序列与目标DNA匹配即可扩增出目标基因,无法检测基因序列是否完全符合设计;琼脂糖凝胶电泳仅能检测片段大小,无法验证碱基序列,故选③。(2)该启动子仅在棉铃虫啃食后才驱动基因表达,属于诱导型启动子。启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点,可启动基因的转录过程。检测到J*蛋白在细胞外积累,说明信号肽S可引导融合蛋白通过分泌途径释放到细胞外。(3)选择EcoRⅠ与KpnⅠ、SalⅠ组合进行双酶切,两种酶切割产生不同的黏性末端,既可以防止载体自身环化和目的基因反向连接,又能保证J基因插入后与上游信号肽编码序列的阅读框保持一致,使S-J*融合蛋白正常表达。(4)振荡培养可增加培养液的溶氧量,保证大肠杆菌有氧呼吸,同时使菌体与营养物质充分接触,提高营养物质利用率,促进大肠杆菌快速繁殖以扩增重组质粒。将目的基因导入棉花茎尖细胞常用农杆菌转化法。组蛋白乙酰化水平升高,说明组蛋白去乙酰化酶的活性受到抑制,去乙酰化过程受阻,最终诱导肠细胞凋亡。 17. (1)线粒体 (2) 或 (3)PEG(或聚乙二醇)　细胞壁外层(或外层脂质双分子层膜)　维生素B1　ATP　葡萄糖可在酵母细胞质中分解产生ATP,未与大肠杆菌融合的酵母也可存活 解析 本题考查基因工程与PCR技术等知识,主要考查学生的理解能力和解决问题的能力。 (1)线粒体是有氧呼吸产生ATP的主要场所,要获得专性厌氧呼吸的酵母菌株,利用基因敲除技术破坏酵母菌线粒体的功能,就能导致该细胞器不能产生ATP。(2)要使质粒1线性化,且能与扩增后的基因X经酶切、连接重组为质粒2,引物P3和P4应分别位于质粒1的两端,且方向相反(因为PCR扩增时引物是从5'到3'方向延伸的,这样才能保证扩增出的线性化质粒两端分别带有EcoRⅠ和NotⅠ识别序列,与基因X两端的酶切位点匹配)。位置及方向见答案。 (3)促进膜融合的化学试剂通常选择PEG(或聚乙二醇)。大肠杆菌细胞壁外层为脂质双分子层膜结构,融合细胞中的大肠杆菌形态正常且具有活性,说明与酵母细胞膜融合的是菌株B的细胞壁外层(或外层脂质双分子层膜)。在以丙酮酸为唯一碳源的选择培养基上,酵母菌可进行代谢为大肠杆菌提供维生素B1,大肠杆菌能为酵母菌提供ATP,表明二者建立了互利共生关系。不能用葡萄糖为碳源筛选融合菌株,原因是葡萄糖可在酵母细胞质中分解产生ATP,未与大肠杆菌融合的酵母也可存活,二者都能在以葡萄糖为碳源的培养基上生长,无法区分出只有二者互利共生才能生长的融合菌株。 18. (1)复制原点　Xba Ⅰ　DNA聚合酶　Spe Ⅰ、Sma Ⅰ　550 (2)4　连接成环(或环化)　测序和序列比对 (3)不能 解析 (1)与复制有关的结构是复制原点。根据后面的信息“用限制酶切后补平”,即在DNA聚合酶的作用下游离的脱氧核苷酸连到脱氧核苷酸链的3'端,故需要用XbaⅠ对质粒进行切割,而不能用PstⅠ;提取质粒,切割后得到两条条带,需要两个切点,题干中给出长度的只有目的基因,故需要选择SpeⅠ和SmaⅠ两种限制酶进行切割,切割后会出现两种长度的片段,短的长度大约为550 bp,说明基因前端被补平,大肠杆菌中导入了正向重组质粒。 (2)限制酶识别序列越短,在识别序列出现的概率越高,切割得到的序列越短,根据题意选用识别序列为4个碱基对的限制酶。目的是通过PCR扩增出图乙中的未知序列,两种引物延伸方向相反,故需要把图乙中序列环化,或者首尾连接,再进行PCR。通过琼脂糖凝胶电泳仅能判断DNA片段长度,要判断是否为同一个基因需要进行测序或序列比对。 (3)野生型基因导入突变植株后无法确定其能否正常表达,故检测到野生型基因无法确定植株的表型。 19. (1)卡那霉素和四环素　白 (2)C　A (3)①B　②将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养,两者均不生长则为筛出的大肠杆菌 解析 本题主要考查基因工程的原理及技术、微生物的选择培养等知识,考查学生的信息获取和逻辑推理能力。 (1)质粒2中含有与LacZ基因对应的sgRNA基因,其转录出来的短链RNA与目的基因(LacZ基因)发生碱基互补配对,使其不能表达,因而不能使X-gal分解产生蓝色物质,将质粒1和质粒2导入大肠杆菌,因此在含四环素和卡那霉素且含X-gal的培养基中,筛选白色的菌落即为LacZ基因成功敲除的菌落。(2)Cas9基因的表达量过高对大肠杆菌产生毒性,使其数量减少,结合题图可知,启动子C对应的菌落数最多,因此启动子C对细胞毒性最小。结合菌落数和敲除率可知,启动子A的菌落数和敲除率均较高,因此综合考虑,应选择启动子A作用于该系统。(3)①质粒2为温度敏感型质粒,在37 ℃下不能进行复制,培养12小时后,试管1中大部分大肠杆菌为只有质粒1,B项正确,A、C、D项错误。②试管2中加入蔗糖,质粒1中的SacB基因表达的SacB蛋白能将蔗糖转化为有毒化合物,抑制大肠杆菌的生长繁殖,因此试管2含质粒2的大肠杆菌较少,为进一步筛选质粒1和质粒2均消除成功的大肠杆菌,实验设计思路和预测实验结果:将同一菌落的大肠杆菌分别用含卡那霉素和四环素培养基进行培养,在无抗生素平板上可以生长,在含抗生素平板上均不生长的则为筛出的大肠杆菌。 基因工程的基本操作步骤主要包括四步:①目的基因的获取;②基因表达载体的构建;③将目的基因导入受体细胞;④目的基因的检测与鉴定。其中,基因表达载体的构建是基因工程的核心。 20. (1)XhoⅠ　EcoR Ⅰ (2)液体　使贴壁细胞分散为单个细胞,37 ℃是胰蛋白酶的适应温度 (3)促进　增高 (4)①无靶向的siRNA　表达减少　②提取实验组和对照组的mRNA,使用PCR技术进行扩增,对比检测Z基因的mRNA的含量,若实验组含量减少,则说明siRNA起作用 提取实验组和对照组的蛋白质,使用抗原—抗体杂交技术,对比检测Z基因表达蛋白质的含量,若实验组含量减少,则说明siRNA起作用 解析 本题考查基因工程和动物细胞工程的相关知识,主要考查学生的信息获取和处理能力。 (1)需选择质粒甲和质粒乙共有的限制酶切割,保证目的基因和质粒产生相同的黏性末端。质粒甲的目的基因两端有EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位点(对应质粒乙的酶切位点),因此用EcoRⅠ和XhoⅠ限制酶。(2)动物细胞培养使用液体培养基;胰蛋白酶在37 ℃(人体/动物细胞适宜温度)下活性高,可分解细胞间的蛋白质,使贴壁细胞分散成单个细胞,便于传代培养。(3)与空质粒乙组(对照组)相比,重组质粒乙组(含基因Z)的细胞数量更多,说明基因Z的表达对细胞增殖有促进作用;随导入时间推移,两组细胞数量的差距增大,说明增殖速率加快。(4)①对照组应导入无靶向的siRNA(或空载体),排除siRNA本身的影响;该实验通过抑制基因Z的表达(siRNA切割其mRNA),目的是探究基因Z的表达减少对细胞增殖的影响。②在分子水平上检测基因的表达,可以从转录和翻译水平进行,可提取实验组和对照组的mRNA,使用PCR技术进行扩增,对比检测Z基因的mRNA的含量,若实验组含量减少,则说明siRNA起作用;也可提取实验组和对照组的蛋白质,使用抗原-抗体杂交技术,对比检测Z基因表达蛋白质的含量,若实验组含量减少,则说明siRNA起作用。 21. (1)标记基因、目的基因、终止子、复制原点　 (2)稀释涂布平板法　抑制工程菌IR3C增殖　15 h　在15 h时,IR3C数量开始下降,而MSC数量上升　 (3)高于　IR3C转入了ccdB基因,阻止细胞增殖,减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖,从而使更多山梨糖被用于合成维生素C 解析 本题考查基因工程和发酵工程。 (1)基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤,一个完整的基因表达载体除启动子外,还要有标记基因、目的基因、终止子、复制原点等。(2)统计活菌数目常用稀释涂布平板法,由图乙可知,在15 h时,IR3C数量开始下降,而MSC数量上升,所以推测转入的基因ccdB编码的蛋白质能抑制细菌增殖或诱导细菌凋亡,开始发挥作用的时间约为15 h。(3)由图丙可知,IR3C三菌混菌发酵产生的2-酮-L-古龙酸含量比MSC三菌混菌发酵产量高,因此可以推测,IR3C三菌混菌发酵维生素C的产量更高,可能的原因是IR3C转入了ccdB基因,阻止细胞增殖,减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖,从而使更多山梨糖被用于合成维生素C。 22. (1)①克隆树鼩和其他哺乳动物的TR1基因　②目的基因和载体　④氨基酸序列 (2)用基因编辑方法改变树鼩中TR1基因,使其编码的蛋白第579位氨基酸由M变为T,检测树鼩对辣椒素的敏感性是否提高 (3)树鼩群体出现可遗传的变异和含辣椒素类物质植物的定向选择 解析 本题考查基因工程的相关知识,主要考查学生理解和解决问题的能力。 (1)基因工程的基本操作程序是目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。据此分析①为克隆树鼩和其他哺乳动物的TR1基因。②为将树鼩、其他哺乳动物TR1基因和载体分别进行酶切并连接构建基因表达载体。由(2)中展示的蛋白之间的差异推测④为检测树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白的氨基酸序列。(2)树鼩TR1蛋白第579位氨基酸为M,人和小鼠TR1蛋白第579位氨基酸为T,利用基因编辑技术改变树鼩的TR1基因,使编码的TR1蛋白的第579位氨基酸由M变为T,若替换后树鼩对辣椒素的敏感性升高,则可以证实树鼩对辣椒素的敏感性降低是由TR1蛋白第579位氨基酸序列差异造成的。(3)适应形成的必要条件是树鼩群体出现可遗传的变异,含辣椒素类物质的植物可以拓宽树鼩的食物来源,环境对树鼩进行定向选择,使得树鼩种群中对辣椒素敏感度低的基因频率升高,让树鼩适应含辣椒素类物质的植物。 23. (1)F2、F4　保证载体在链霉菌中能正常复制 (2)2　验证重组质粒是否构建成功 (3)苯丙氨酸　翻译受阻 (4)目的基因发生突变(或目的基因表达受到抑制等)　发酵条件优化(拉索西丁的分离提纯方法、工程链霉菌的生产稳定性、链霉菌的生物安全性等) 解析 本题考查基因工程等相关知识。 (1)PCR子链的延伸方向为5'端→3'端。根据图中信息分析,通过PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA~lrcF目的基因时,应该包含lrcA的头部和lrcF尾部的序列,所选引物应与相应位置的DNA配对,因此应选用引物F2和F4。载体在细菌中的复制需要使用该菌对应的复制原点,确保载体在链霉菌中正常复制。 (2)lrcA~lrcF目的基因通过EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切后与载体连接,可获得重组质粒。为验证重组质粒是否构建成功,可使用相同的限制酶完全酶切,获得线性载体片段及lrcA~lrcF目的基因片段。琼脂糖凝胶电泳可将相对分子质量不同的核酸分子区分开,因此酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳检测会产生2条电泳条带。 (3)图中展示了拉索西丁抑制翻译过程的作用机制。翻译过程以mRNA为模板,由tRNA转运氨基酸,按照密码子与氨基酸之间的对应关系,在核糖体上合成具有一定氨基酸顺序的蛋白质。根据图中信息分析,AUG为起始密码子,因此甲硫氨酸在核糖体位点1,与AUG相邻的密码子是UUC,对应的氨基酸是苯丙氨酸。由于拉索西丁与细菌的核糖体结合,阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入核糖体位点2,致使翻译受阻,无法合成蛋白质,细菌无法正常生长,最终引起细菌死亡。 (4)基因突变是随机的,在自然界是普遍存在的。微生物在培养过程中大量增殖,数量庞大,有个别微生物的基因突变可能发生在目的基因上。通过多次培养,这些突变的微生物也会大量增殖,但部分突变菌产生的产物没有杀菌活性。基因工程制药包括制药菌种培育、鉴定和保藏,微生物发酵,产物提取精制和产品检验等技术流程。因此还需进一步研究发酵工艺的优化(如拉索西丁的分离提纯方法、工程链霉菌的生产稳定性、工程链霉菌的生物安全性等)、产物的提取和纯化等。 24. (1)①终止子(或复制原点)　P1和 P3　782 ②蛋白A在大肠杆菌细胞内合成,缺失分泌到细胞外的信号,不能分泌到细胞外;基因A未表达;基因A丢失 (2)PEG融合法(或电融合法,或灭活病毒诱导法)　抗体检测 解析 本题考查基因工程和动物细胞工程的相关知识,主要考查学生的理解能力。 (1)①基因表达载体的必备元件应包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子、终止子和复制原点等。选用图中的P1和P3,才能扩增出插入方向正确且完整的基因A,扩增产物的片段大小为582 bp+200 bp=782 bp。 ②上清液中无蛋白A的原因可能有:蛋白A在大肠杆菌细胞内合成,缺失分泌到细胞外的信号,因此不能分泌到细胞外;也可能是基因A 未表达或基因A丢失。 (2)将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,常用的诱导方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。单克隆抗体制备过程中,选择培养时,对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测,经多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 25. (1)在红藻原生环境中筛选到具有卡拉胶降解能力的微生物的可能性更大　稀释 (2)BamHⅠ　SmaⅠ和EeoRⅤ切割后均产生平末端,SpeⅠ和XbaⅠ切割后产生的黏性末端相同,两种情况均会导致部分cg反向连接,新的序列无法被原有酶识别 (3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(使细胞处于感受态)　四环素　卡拉胶 (4)44　该位点保守度低,且该位点在空间上与第119位的半胱氨酸接近 解析 本题考查微生物的培养技术、基因工程,主要考查学生的理解能力。 (1)在长期的进化过程中,各种生物会逐渐形成适应各自环境的特性。由题可知,卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖,可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖,因此在红藻原生环境中筛选到具有卡拉胶降解能力的微生物的可能性更大。将获得的菌液分成上千份后全部接种至含有培养的微孔板中培养,通过检测可以筛选得到目标菌株。因此,要获得最高CG活性的单一菌种,该“操作”的关键作用是将混合菌液分散成单个菌体,再接种至微孔板中进行培养和筛选,即接种前需要充分稀释。 (2)E.coli DNA连接酶只能连接具有黏性末端的片段,因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶,即不能选择EcoR V酶和SmaⅠ酶,而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同,若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割,会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接,因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个,而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶,又由于转录的方向是由启动子→终止子,且mRNA形成的方向是5'→3',且mRNA与DNA的模板链方向相反,因此基因模板链的3'应靠近启动子,故为保证连接准确性和效率,cg转录模板链的5'端最好含有BamH Ⅰ酶切位点。T4 DNA连接酶既可以连接平末端,也可连接黏性末端,不同的平末端均可由T4 DNA连接酶连接。由于限制酶的识别序列具有专一性,若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列,则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验,获得的部分重组质粒分子大小符合预期,但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割,其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。 (3)先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,可以使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。为筛选出成功导入表达载体的大肠杆菌,应在培养基中添加卡拉胶和四环素,培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈来判断。 (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键,从而提升蛋白质的耐热性。由图2可知,第44位赖氨酸空间上离半胱氨酸更近,容易形成二硫键,从而提升蛋白质的耐热性,而且保守度低,替换后对酶的功能影响较小。 26. (1)引物　脱氧核苷酸　复性　PCR 反应需要在高温条件下进行变性步骤(90~95 ℃使双链 DNA 解旋为单链) ,普通的 DNA 聚合酶在高温下会变性失活,而耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性,保证 PCR 反应的正常进行 (2)SmaⅠ和EcoRⅠ　磷酸二酯 (3)发黄色荧光且荧光定位于细胞壁　高 (4)转基因衣藻可通过细胞壁上的融合蛋白吸附培养液中的镉离子,减轻了镉离子对细胞的毒害　培养液中的镉离子浓度过高,超出融合蛋白的吸附能力,细胞内镉离子积累过多产生强毒害 (5)①　③ 解析 (1)PCR反应中,脱氧核苷酸(原料,随循环进行被消耗)和引物(与模板结合后被延伸,消耗减少)的分子数量逐渐降低。模板与引物在PCR反应的复性阶段结合(温度降低,引物与模板互补配对)。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,因为PCR反应要经高温变性(使DNA解旋),普通酶会失活,耐高温的DNA聚合酶才能在高温环境下催化子链合成。 (2)观察载体上的酶切位点,结合基因连接顺序(SP7→CADR→GP1→YFP),根据限制酶识别序列及切割位点可知,载体中前两个酶切位点经NheⅠ和XbaⅠ酶切后形成的黏性末端一致,如果第一个基因CADR添加这两个限制酶的识别序列,与切割后的载体连接时会形成倒位连接,因此CADR两端添加NheⅠ(或XbaⅠ)和SmaⅠ两种限制酶的识别序列,先与载体连接。第二个基因GP1两端添加SmaⅠ和EcoRⅠ两种限制酶的识别序列,连接到已重组了CADR基因的载体上。最后YFP基因两端添加EcoRⅠ和EcoRⅤ两种限制酶的识别序列,连接到已重组了CADR和GP1两个基因的载体上,从而完成基因表达载体的构建。DNA连接酶催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键。 (3)融合蛋白含黄色荧光蛋白YFP,若表达成功,转基因衣藻在荧光显微镜下会发出黄色荧光且荧光定位于细胞壁(GP1使融合蛋白定位于细胞壁)。若融合蛋白能结合镉离子,转基因衣藻细胞壁的镉离子含量会高于野生型(野生型无CADR高效吸附作用)。 (4)转基因衣藻的生长优于野生型,原因是细胞壁上的融合蛋白能吸附培养液中的镉离子,减轻了镉离子对细胞的毒害(转基因衣藻通过细胞壁上的CADR减少镉进入细胞)。240 μmol/L镉离子浓度下,转基因衣藻和野生型衣藻的生长均受到抑制,是因为镉离子浓度过高,超出融合蛋白的吸附能力,细胞内镉离子积累过多产生强毒害。 (5)与化学药物法相比,转基因衣藻的优势:①可自我繁殖,无需持续投放,能长期发挥作用;③吸收富营养化物质:治理镉污染的同时,改善水体富营养化(如吸收N、P)。衣藻生长受镉离子浓度影响,非优势,②不符合题意;镉沿食物链传递,有风险,非优势,④不符合题意,故填①和③。 27. (1)(4种)脱氧核苷酸　延伸 (2)5'端　AGATCT　BamHⅠ与EcoRⅠ (3)染色体DNA　2(2分)　再分化 解析 (1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用,将单个脱氧核苷酸加到引物的3'端进行子链的延伸。 (2)为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的5'端添加相应的限制酶识别序列。根据S基因的转录方向可知,使用双酶切法保证目的基因插入方向正确,载体中含有BamHⅠ、EcoRⅠ和XbaⅠ三个酶切位点,而S基因上含有XbaⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ的酶切位点,首先要保证S基因结构的完整性,不能在S基因两端添加XbaⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ的限制酶识别序列,由表格信息可选择能与载体中限制酶切出相同黏性末端的限制酶,BglⅡ和BamHⅠ切割产生的黏性末端相同,结合S基因的转录方向可知S基因的左端为上游启动子一端,应在S基因上游添加BglⅡ的识别序列,即5'-AGATCT-3',下游直接添加EcoRⅠ的识别序列。因此,切割载体应选用的两种限制酶为BamHⅠ和EcoRⅠ。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中的T-DNA会转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上。据图可知,载体的T-DNA片段中抗性基因2含有启动子和终止子,可正常表达,若T-DNA成功整合到被侵染细胞的染色体DNA上,则该细胞就可具有抗性基因2对应的抗性,因此,抗性基因2可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 28. (1)农杆菌转化法　Ti质粒上的T-DNA　潮霉素 (2)外植体　次氯酸钠　生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素 (3)PCR　病斑大小(或发病率) (4)对感病基因SWEET的启动子区进行定点“修改”后,白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻 解析 本题考查植物组织培养技术和基因工程的相关知识,主要考查学生的理解和综合运用能力。 (1)将重组Ti质粒转入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法,是将农杆菌中的含目的基因的Ti质粒上的T-DNA转移到受体细胞,并整合到该细胞的染色体DNA上。由题图可知,重组Ti质粒上含有潮霉素抗性基因HygR,所以为了筛选出转化成功的细胞,需在植物组织培养基中添加潮霉素。(2)在植物组织培养中,离体的植物器官、组织或细胞被称为外植体,对植物外植体消毒时需要依次使用酒精和次氯酸钠处理。在植物组织培养诱导形成再生植株的过程中,生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。不同浓度的生长素和细胞分裂素的配比可以调控细胞的分裂和分化方向,从而诱导形成根和芽等不同的器官,最终形成再生植株。(3)检测目标基因的启动子区是否被成功编辑,需要采用PCR技术。在个体水平上,将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌,通过比较病斑大小(或发病率)来验证抗病性。(4)在该研究中,基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因:对感病基因SWEET的启动子区进行定点“修改”后,白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻,从而使水稻获得了抗病性。 29. (1)基因突变、基因重组、表观遗传等 (2)①采用引物1和4进行PCR扩增(或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增),用Sac Ⅱ和EcoR Ⅰ对PCR产物进行酶切　②氯霉素(或氯霉素+头孢霉素)　③脱水四环素　头孢霉素　④D 解析 (1)Sa为原核生物,产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等。 (2)①由图1可知,质粒2上有Sac Ⅱ、EcoR Ⅰ酶切位点,而质粒1上只有Sac Ⅱ酶切位点,R基因的上、下游含有Sac Ⅱ、EcoR Ⅰ酶切位点,若要构建质粒2,采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因以及上下游片段,用Sac Ⅱ和EcoR Ⅰ对PCR产物进行酶切,然后回收上、下游片段,再与Sac Ⅱ酶切质粒1所得大片段连接,获得质粒2。②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa,因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因,所以可以将重组后的含质粒2的Sa涂布在含氯霉素(或氯霉素+头孢霉素)的平板上,能生存下来的菌落就是含质粒2的Sa单菌落。③已知质粒2上具有可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因,所以应使用含有脱水四环素的平板筛选不再含有质粒2的菌落。随后,需要获得不再具有头孢霉素抗性的R基因敲除菌株,以便进行分子鉴定。根据题意,要筛选的菌株无法在含头孢霉素的选择培养基上增殖,所以应在培养基中加入头孢霉素。④若R基因已被敲除,以含有引物2或引物3的引物组合(A、B、C组)进行PCR时,均无扩增产物,电泳结果应为空白,A、B、C三组不符合题意;以引物1与引物4进行PCR,若R基因已被敲除,产物长度应为上游片段+下游片段,约为1.9 kb,D组正确。 30. (1)低　44(256)　GTTT　CAAT (2)卡那霉素　SacⅠ　④　(3)1/4 解析 (1)引物越短,DNA上与之配对的序列越多,即特异性越低。用BsaⅠ酶切大豆基因组的DNA序列,从其识别序列与切割位点可知,切出的黏性末端有4个碱基(N),由于N代表任一碱基,则理论上可产生的黏性末端最多有44(256)种。载体有上、下游两个BsaⅠ酶切位点,酶切后,载体上留下的黏性末端,左侧为5'-CAAT-3',右侧为5'-GTTT-3'。 (2)重组载体的T-DNA有卡那霉素抗性基因,导入大豆细胞后,可使用卡那霉素筛选出具有该抗生素抗性的植株①~④。从目标基因L部分序列来看,目标序列与突变序列均有BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列,用这两种酶酶切后,目标序列与突变序列会产生等长的片段,无法区分是否含有突变序列。但突变序列中有SacⅠ识别位点,使用该酶进行酶切,目标序列不被酶切,突变序列则被切为长、短两段,根据电泳结果,可知①③为杂合子,②为野生型,④为纯合突变植株。 (3)基因L成功突变的纯合植株体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入,其抗生素抗性即来自T-DNA上的Kanr,就抗生素抗性而言,该突变株为杂合子,其自交子代中,突变位点纯合且对抗生素敏感的植株占1/4。 31. (1)EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ　(2)CaCl2　卡那霉素　S-F、P-R (3)启动子　C　(4)SOD-ELP50组沉淀蛋白含量比SOD组高　高温可使蛋白变性　纯化回收率高,杂蛋白少,常温下纯化有利于酶活性保持 解析 (1)目的基因应插入启动子和终止子之间,结合题意可知,ELP50应插入SOD基因之后,由题图可知,限制酶a和限制酶b分别是EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ。 (2)成功转入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌,需要使用PCR技术进行进一步验证筛选。正向引物选择S-F,而反向引物首先排除S-R,因为S-R和S-F只能PCR扩增到SOD基因片段,而不是SOD-ELP50片段。因为题干已经明确ELP50序列是(GTTCCTGGTGTTGGC)重复50次的序列,引物E-R与ELP50序列就存在着多个结合位点,导致PCR产物不能得到特异性目的条带,故不能选用引物E-R。所以,反向引物只能选引物P-R。 (3)RNA聚合酶与启动子结合后,驱动转录,翻译SOD-ELP50蛋白。由题图可知,决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1 212(bp),编码1 212÷3=404(个)氨基酸,已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa,融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11=44.44(kDa),电泳后应该为条带C。 (4)由图3观察得知20 ℃时,加入NaCl后SOD-ELP50组沉淀蛋白含量比SOD组高。高温可使蛋白变性,离心后沉淀。通过横向分析20 ℃和100 ℃的SOD-ELP50相对含量,20 ℃时的SOD-ELP50含量已经占到100 ℃时的SOD-ELP50的90%左右,可得出纯化回收率高的结论。此外 20 ℃时SOD-ELP50组的大肠杆菌自身蛋白含量非常低,而100 ℃时SOD-ELP50组的大肠杆菌自身蛋白含量很高,这表明纯化得到的SOD-ELP50中的杂蛋白很少。20 ℃情况下有利于酶活性的保持,不会使蛋白变性。 32. (1)5'端　两端包含Loxp序列的终止子　两端包含Loxp序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列　电泳 (2)清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压 (3)Cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM (4)添加四环素会竞争性结合A蛋白,无法激活T启动子,导致M基因不能表达,从而不能恢复被敲除的M基因的功能;不添加四环素,A蛋白基因表达激活T启动子,启动M基因表达,从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照,增加实验的准确性 解析 (1)引物的延伸方向为5'端→3'端,故应在引物的5'端添加限制酶的识别序列。在构建载体1时,想要阻断A基因的表达,可以在A基因之前添加终止序列。故从转录水平考虑,连接的片段可以是两端包含Loxp序列的终止子;从翻译水平考虑,连接的片段可以是两端包含Loxp序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列。鉴定重组载体是否构建成功,往往需要限制酶切割载体后,再进行电泳进行比对。 (2)进行动物细胞培养时需定期更换培养液,目的是清除细胞代谢产物、为细胞提供营养物质、调节培养液pH、维持细胞渗透压等。 (3)由于Cre、A、M-GFP、floxM 4对基因遵循自由组合定律,故通过转基因得到的2组模型鼠通过杂交获得的子代,再进行一代杂交后最终获得基因型为Cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM的同时具有Cre、A、M-GFP、floxM 4种基因的实验鼠。 (4)四环素可竞争性结合A蛋白,抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比,添加四环素会竞争性结合A蛋白,无法激活T启动子,导致M基因不能表达,从而不能恢复被敲除的M基因的功能;不添加四环素,A蛋白基因表达激活T启动子,启动M基因表达,从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照,增加实验的准确性。 33. (1)脱氧核糖核苷酸(或脱氧核苷酸) (2)EcoR Ⅰ　酶切后形成的片段黏性末端相同,易自我环化;不能保证目标片段与载体定向连接(反向连接) (3)酶切后的空载体片段,启动子D+基因S片段　PCR (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强,使得基因S表达量更高,种子更大 解析 (1)启动子是DNA非编码区上游的一段DNA序列,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,用于启动DNA的转录。 (2)由于“启动子D+基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列,若使用限制酶EcoR Ⅰ,会使“启动子D+基因S”的DNA序列被切断而导致目的基因被破坏。不宜同时选用酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ的原因是酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割DNA所产生的黏性末端相同,若用这两种限制酶切割,形成的DNA片段在构建基因表达载体时,容易出现自我环化,导致效率降低,且无法保证目的基因片段与载体片段单向连接,影响目的基因在受体细胞中的表达。 (3)DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段,用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段,还有酶切后的空载体片段。因此电泳时,对照样品除指示分子大小的标准参照物外,还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段。经验证的重组表达载体需转入农杆菌,检测转入是否成功一般采用PCR技术,来检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。 (4)最后得到的大豆品种DN较TL种子大,但导入再生植株YZ-1和再生植株YZ-2的目的基因S序列无差异,故可推测可能是品种DN的基因S上游启动子D的效应强于品种TL的启动子T,启动子D使基因S表达量更高,因而种子更大。 34. (1)纤维素酶和果胶酶　生长素和细胞分裂素 (2)花药(或花粉)离体培养　用显微镜观察染色体数量 (3)①HindⅢ和BamHⅠ　交链格孢 ②PCR扩增基因L及其pL;插入Ti质粒中;利用农杆菌导入百合B体细胞,经培养获得转基因植株;筛选L表达量提高的转基因百合;用病原微生物侵染转基因百合,检测百合抗病能力。 解析 (1)因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶,而酶具有专一性,因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理,得到原生质体后使原生质体融合,形成杂种细胞,再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化,从而获得完整的杂种植株。 (2)获得单倍体植株常用花药(花粉)离体培养法。细胞有丝分裂中期,染色体形态稳定,数目清晰,便于观察,故鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目,如果染色体数目减少一半,则获得的植株为单倍体植株。 (3)①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。需要构建重组质粒,将Ti质粒中gus基因上游启动子序列替换为pL。因此,首先需要将启动子pL进行酶切,插入Ti质粒上获得重组质粒,根据启动子pL两端的酶切位点和Ti质粒的结构特点,用Hind Ⅲ和BamHⅠ对pL进行酶切后,再与Ti质粒进行连接。GUS酶活性反映启动子pL活性,GUS酶活性越高表明启动子活性越高,从图c实验结果可发现三种病原微生物都能促进pL的活性,其中交链格孢侵染后,GUS酶活性最高,所以其促进作用最强。 ②中现发现栽培种百合B中也有L,但抗病性弱。若要增强该百合中L的表达量以提高其抗病原微生物的能力,结合基因工程的基本操作程序及植物转基因工程技术等内容可知,实验思路为:利用PCR扩增L基因及其pL;将其插入至Ti质粒中;利用农杆菌导入百合B体细胞,经培养获得转基因植株;筛选L表达量提高的转基因百合;用病原微生物侵染转基因百合,检测百合抗病能力。 35. (1)细胞坏死　(2)分化　将抑制细胞分裂和分化的某基因也导入到棉花细胞中(或提高Bt毒蛋白基因的表达量,提高Bt毒蛋白的含量)　(3)数目　空间结构　 (4)避免棉铃虫的抗性基因频率增长过快 解析 (1)Bt毒蛋白被棉铃虫吞食后活化,导致细胞膜穿孔,细胞内含物流出而死亡,这属于细胞坏死。(2)肠干细胞是通过细胞分裂和分化产生新的肠道细胞的。可以将抑制细胞分裂和分化的某基因也导入到棉花细胞中,让棉铃虫的肠干细胞无法进行细胞的分裂和分化,从而提高转基因棉花杀虫效果。也可以提高Bt毒蛋白基因的表达量,提高Bt毒蛋白的含量,从而提高转基因棉花杀虫效果。(3)肠道细胞表面受体蛋白的数目或空间结构发生变化时,Bt毒蛋白结合较少或无法结合,导致棉铃虫对Bt毒蛋白产生抗性。(4)将Bt毒蛋白转基因棉花与非转基因棉花混种,可避免棉铃虫的抗性基因频率增长过快,从而延缓棉铃虫对转基因棉花产生抗性。 36. (1)蔗糖　参与蔗糖分解代谢,将液体培养基中的蔗糖分解生成葡萄糖　单位时间内培养液中葡萄糖的生成量(或单位时间内培养基中蔗糖的减少量等) (2)NV基因　>　T-DNA插入导致NV基因增加部分序列 (3)突变体　便于筛选出成功导入NV基因的重组DNA 解析 (1)据题表中野生型菌株的两组结果对比分析可知,野生型菌株加入蔗糖就会合成NV酶,不加就不会合成,推测蔗糖诱导了NV基因表达。题表中结果表明,当蔗糖和NV酶同时存在时,培养液中就会出现葡萄糖,由此说明NV酶的作用是催化蔗糖转化成葡萄糖。检测NV酶活性时,可以测定单位时间内培养液中葡萄糖的生成量或单位时间内培养基中蔗糖的减少量等。 (2)由题可知,突变体是通过T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得的。在进行PCR扩增时,使用的引物需要与特定的DNA序列配对结合,才能启动DNA的扩增。野生型菌株的基因组DNA中没有T-DNA的插入,所以用与NV基因配对的引物进行扩增时,可以扩增出完整的NV基因片段。而突变体由于T-DNA的随机插入,导致NV基因中增加部分序列。这样一来,使用同样的引物进行扩增时,突变体扩增片段的长度就会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度>野生型扩增片段长度,则表明突变体构建成功。从基因序列分析其原因是T-DNA插入导致NV基因增加部分序列。 (3)为进一步验证NV基因的功能,题表中的转基因菌株是将NV基因导入突变体细胞获得的。突变体由于NV基因发生突变,无法正常表达NV酶,导致相关生理功能缺失或异常。将正常的NV基因导入突变体细胞,如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能,就可以有力地证明NV基因确实具有特定的功能。在构建NV基因表达载体时,需要添加新的标记基因,原因是便于筛选出成功导入NV基因的重组DNA。 37. (1)只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖 菌落产生的纤维素酶的活性和量 (2)耐高温的DNA聚合酶 (3)基因表达载体的构建　限制酶、DNA连接酶 (4)繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等　能吸收周围环境中DNA分子 (5)降解时的温度不同、降解时的pH不同 解析 (1)选择培养基只允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中,只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物,使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解后,刚果红与纤维素的复合物就无法形成,培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈越大,说明纤维素分解菌分解纤维素的能力越强,即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。(2)扩增目的基因片段在PCR仪中进行,因此需要耐高温的DNA聚合酶。(3)根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒,推导出过程⑤为基因表达载体的构建,该过程需要限制酶和DNA连接酶。(4)大肠杆菌作为受体细胞的优点是繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等。先用Ca2+ 处理细胞,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。(5)不同酶的最适温度、最适pH不同,当温度和pH改变时,酶促反应速率也会受到影响。 受体细胞的选择 (1)转基因植物:受体细胞可以选择受精卵和体细胞,一般选择体细胞。 (2)转基因动物:受体细胞一般选择受精卵,目的基因整合到受精卵的染色体 DNA上,随着细胞分裂能稳定遗传给下一代。 (3)转基因微生物:常用酵母菌、大肠杆菌等。 38. (1)细胞外　(2)P1和P6 (3)(i)缺乏尿嘧啶　二　(ii)含有5-氟乳清酸　(4)3 解析 (1)由题可知,酵母菌不能吸收淀粉,因此应在细胞外将淀粉分解从而被酵母菌利用,所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。 (2)由题可知,酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点,为保证构建完成的目的基因是图中结构,引物应包含A.B序列和目的基因的部分序列,应选择P1和P6这对引物进行PCR。 (3)(i)选择了尿嘧啶合成基因(UGA)作为标记基因,则应该将导入目的基因的酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上进行筛选培养,如果导入成功,则能形成菌落。方式一,C和C'方向相反,如果切割,则末端在一条链上,不能连接,所以选择方式二,连接方向相同,切割后形成的末端便于连接。 (ii)由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质,所以切去UGA基因的酵母菌应在含有5-氟乳清酸的培养基上进行筛选培养。 (4)结合以上分析,C和C'的中间插入UGA,A和B之间插入目的基因,所以图3正确。 39. (1)RNA聚合酶 　复制原点、标记基因、限制酶切割位点 (2)F1和R2或F2和R1　a链 (3)J-V5融合蛋白 　不是 解析 (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位;质粒作为载体,必须具备启动子、终止子、标记基因、复制原点和限制酶切割位点等。 (2)为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,可对J基因和质粒中原部分序列进行PCR扩增,则可选择F1和R2或F2和R1作为引物;据“J基因转录的模板链位于b链”可判断左端为b链的3'-端,引物F1的左端为5'-端,可推知引物F1与b链间碱基互补配对,其与图甲中J基因的a链相应部分的序列相同。 (3)据图乙可知,条带1既可与抗J蛋白抗体结合,又可与抗V5抗体结合,可推测出现条带1证明该细胞内合成了J蛋白和V5蛋白,即表达了J-V5融合蛋白;条带2只用抗J蛋白抗体检测出现,而用抗V5抗体检测未出现,说明该细胞表达的是单一的J蛋白,而非J-V5融合蛋白,可推测该J蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 40. (1)模板(片段F1、片段F2)、引物　延伸时间 (2)CD (3)限制性内切核酸酶(限制酶)、DNA连接酶 (4)BCD　(5)P3、P4 (6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小,无法确定待检测DNA分子的碱基序列 解析 (1)PCR反应的进行需要提供引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。片段F1与片段F2大小不同,扩增程序中最主要的不同是延伸时间。 (2)由图1可知,引物F2-F用于扩增F2片段,引物F1-R用于扩增F1片段,C选项中5'-GACGAG-3'能与AnB1中左侧部分碱基进行互补配对,因此引物F2-F选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP中的右侧部分序列进行碱基互补配对,因此引物F1-R选用D。 (3)重组质粒构建需要先使用同种限制酶切割质粒和目的基因,将二者切出相同的黏性末端,然后再用DNA连接酶将二者连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶的作用下可形成环化质粒,不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶。 (4)用稀释涂布平板法培养计数时,为了使结果更准确,应选择有30~300个菌落的平板,A项正确。抗性平板上未长出菌落可能是因为培养基温度太高,也可能是其他原因,如转化失败等,B项错误。转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落,不会出现大量杂菌形成的菌落,C项错误。稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法,用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的菌落一般需要连续多次划线纯化,D项错误。 (5)EGFP为720 bp,AnB1为390 bp,二者的总大小为720 bp+390 bp=1 100 bp,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,其大小接近于P1、P2,根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有P3、P4。 (6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小,无法确定待检测DNA分子的碱基序列,因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认。 41. (1)野生型　(2)载体　启动子和终止子　(3)①DA1基因和卡那霉素抗性基因　②75　③自交　100 解析 (1)根据题干信息可知,突变后的基因为隐性基因,则野生型DA1基因为显性基因,因此采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确实由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DA1基因后,应该用同种限制性内切核酸酶对PCR产物和载体进行切割,再用DNA连接酶将两者连接起来。在基因表达载体中,启动子位于目的基因的首端,终止子位于目的基因的尾端,因此为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)①将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T-DNA上含有DA1基因和卡那霉素抗性基因)菌液中转化,再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上,在选择培养基上能够萌发并生长的阳性个体应该含有卡那霉素抗性基因,即表示其基因组中插入了DA1基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DA1基因,由于T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点,所以不确定是单一位点插入还是多个位点插入,若是单一位点插入,相当于一对等位基因的杂合子,其自交后代应该出现3∶1的性状分离比,即阳性率约75%的培养基中幼苗是单一位点插入的植株。③将单一位点插入的T2代阳性植株自交,再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上,若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株,即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析,野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp,野生型的基因上没有限制酶X的切割位点,而突变型的基因上有限制酶X的切割位点,结合图中的数据分析可知,电泳图中,野生型只有150 bp的条带,突变型有50 bp和100 bp的条带。 42.(1)1　4　5'　(2)XhoⅠ　(3)卡那霉素　(4)B　(5)PCR 解析 (1)由题图可知,若去除筛选效率较低的SacB,应选择引物1和4。进行PCR时,在引物作用下,DNA聚合酶从引物的3'端开始延伸DNA链,即DNA是从子链的5'端向3'端延伸的,因此在引物的5'端引入XhoⅠ酶识别序列。(2)图中载体4中RpsL的两侧具有XhoⅠ酶识别序列,载体3中不含XhoⅠ酶识别序列,如果将载体2和载体3连接形成高效筛选载体4,需要的引物应该含有XhoⅠ酶识别序列。(3)由题可知,载体5中含有RpsL(链霉素敏感基因)和KanR(卡那霉素抗性基因),将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌,为获得成功导入载体5的菌株,应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。(4)由题可知,载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)而卡那霉素敏感的受体菌,受体菌中P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA,且载体5上其他DNA片段全部丢失,因此该菌的表型为卡那霉素敏感、链霉素不敏感,B项正确。(5)通过PCR技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA中或目的基因是否转录出了mRNA,因此可采用PCR技术鉴定成功整合P1基因的菌株。 考点73　DNA的粗提取与鉴定及PCR技术 1.A　本题考查生物组织中化合物的鉴定、DNA的鉴定等相关知识。DNA的鉴定方法:在沸水浴条件下,DNA与二苯胺试剂反应呈蓝色,题干中缺少沸水浴这一条件,故混合后无法出现蓝色,A项错误。淀粉遇碘变蓝色,土豆匀浆中含有大量的淀粉,所以向土豆匀浆中加入一定量的碘液后,溶液会呈蓝色,B项正确。利用土豆匀浆制备的培养基,含有碳源、氮源、水、无机盐等营养物质,可用于酵母菌的培养,C项正确。土豆中含有过氧化氢酶,该酶可以催化过氧化氢的分解,且过氧化氢酶的活性与pH有关,所以土豆中的过氧化氢酶可用于探究pH对酶活性的影响,D项正确。 2.B　本题考查教材相关实验。藓类叶片薄,只有一层细胞,可直接用于观察叶绿体;菠菜叶由多层细胞组成,叶肉细胞中有叶绿体,可用菠菜叶稍带些叶肉的下表皮细胞作材料来观察叶绿体,所以能用“菠菜叶”替代“藓类叶片”进行用高倍显微镜观察叶绿体实验,A项不符合题意。猪是哺乳动物,猪成熟红细胞没有细胞核和众多细胞器,不含DNA,而猪肝细胞含有细胞核和线粒体等结构,含有DNA,所以不能用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞”进行DNA的粗提取与鉴定实验,B项符合题意。醋酸洋红液和甲紫溶液都属于碱性染料,都能使染色体着色,所以在观察根尖分生区组织细胞的有丝分裂实验中,能用“醋酸洋红液”替代“甲紫溶液”,C项不符合题意。肝脏研磨液中含有过氧化氢酶,所以在比较过氧化氢在不同条件下的分解实验中,能用“过氧化氢酶溶液”替代“肝脏研磨液”,D项不符合题意。 3.D　反应管中没有模板和引物,故要制备带有荧光标记的DNA探针,只能利用反应管中的DNA单链互为引物来实现,而且要保证产物中含有碱基被荧光标记的dATP,使之带有荧光标记。反应管①中的两条单链DNA可以错位互补形成如下双链: 但无法互为引物完成子链延伸。反应管②中的同种单链DNA可以错位互补形成如下双链: 虽可互为引物和模板,但却不需要碱基被荧光标记的dATP,不能使单链带上荧光标记。反应管③中的两条单链DNA可以错位互补形成如下双链: 可互为引物和模板,并利用碱基被荧光标记的dATP使每一条链都带上荧光标记。反应管④中的同种单链DNA可以错位互补形成如下双链: 可互为模板和引物,从链的3'端延伸,利用碱基被荧光标记的dATP使每一条链都带上荧光标记,D项正确。 本题是单选题中最难的题目,难在不易找到切入点。本题关键是信息的提取与处理。 (1)获取信息: ①制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、DNA聚合酶等。 ②在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种 脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别加入如表所示的适量单链DNA。 ③已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。 ④能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管。 (2)处理信息: 比较信息①②,可知反应管①~④中没有明确的模板与引物,只有表中所示的适量单链DNA,由此可知相关单链既是模板又是引物——联想重叠延伸PCR→相关单链要形成双链,并互为引物→子链延伸时利用碱基被荧光标记的dATP,使之标记。 4.A　组织研磨液中上清液的获取可以采用低温静置法或离心法,A项正确。研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,取上清液,其中含有DNA,不能再摇匀,B项错误。鉴定过程中需要沸水浴加热,会导致DNA变性,DNA的双螺旋结构发生改变,C项错误。仅设置一个只加2 mol/L的NaCl溶液的对照组即可排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰,D项错误。 5.B　细胞学说的提出先于电子显微镜的发明,光学显微镜的发明促进了细胞学说的提出,A项错误。差速离心法是通过不同的离心速率将细胞内大小不同的细胞器分离开来,其应用促进了对细胞器的认识,B项正确。花期主要受植物激素和环境等因素影响,光合作用的解析与花期控制技术的成熟没有直接关系,C项错误。PCR技术的发明关键在于耐高温的DNA聚合酶的应用,而不是RNA聚合酶的发现,D项错误。 6.B　PCR是在体外进行DNA扩增的技术,故配制PCR反应体系时,应加入等量的4种脱氧核糖核苷酸溶液作为扩增原料,A项错误。在凝胶中添加核酸染料,电泳后PCR产物可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,B项正确。酵母培养基应该用湿热灭菌的方法进行灭菌,而不是煮沸消毒,C项错误。为了避免高温杀死菌种,接种环烧红后需要先冷却,再蘸取酵母菌液在培养基上划线培养,获得单菌落,D项错误。 7.AC　利用双脱氧测序法时,PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引物,A项正确。电泳时产物的片段越大,迁移速率越慢,B项错误。对照个体测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3',患者个体测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3',对比可知,患者该段序列中某位点的碱基C突变为T,C项正确,D项错误。 电泳图像的辨析 DNA电泳是基因工程中最基本的技术之一,其原理是利用带电分子的带电性质以及DNA分子本身大小和形状不同,使带电分子在电场作用下产生不同的迁移速率,进而达到分离和鉴定的目的。 辨析电泳图像时,首先要明确电泳方向及条带对应的含义,根据电泳方向确定DNA片段的大小及相应序列或碱基,进而判断脱氧核苷酸链的方向。 该题中以对照个体电泳图像为例,按照电泳方向最短的DNA单链序列第一个碱基为C,第二个碱基为T,依次类推得到总序列为CTACCCGTGAT,因为DNA子链的延伸方向为5'端到3'端,所以该序列为5'-CTACCCGTGAT-3'。 8.D　研磨液有利于DNA的溶解,更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低,A项正确。DNA不溶于酒精,但细胞中的某些蛋白质溶于酒精,所以利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA,B项正确。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2 mol/L的NaCl溶液,可利用该原理对DNA进行粗提取,C项正确。在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,故二苯胺试剂可用于鉴定DNA,但不能检测溶液中是否含有蛋白质杂质,D项错误。 9.B　低温时DNA酶的活性较低,过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解,A项正确。离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀,B项错误。沸水浴条件下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色,C项正确。由于是粗提取,因此粗提取的DNA中很可能含有蛋白质,D项正确。 10.A　粗提取DNA时,向鸡血细胞溶液中加入一定量的蒸馏水,鸡血细胞吸水涨破,释放内容物,过滤后DNA存在于滤液中,但DNA主要与蛋白质结合,以染色体的形式存在,所以使用木瓜蛋白酶,可以分解蛋白质,DNA仍然存在于得到的滤液中,然后加入体积分数为95%的酒精,使其溶解度下降,DNA析出,呈白色丝状物,A项正确。37~40℃的水浴箱中保温10~15 min不能使蛋白质变性析出,也不能使DNA析出,B项错误。向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精,此时DNA析出,不会进入滤液中,C项错误。加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L,DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度小,DNA析出,不会进入滤液中,D项错误。 11. (1)174/174 (2)等位基因 (3)标记重捕　第一次捕获(鉴定)的个体数为24,第二次捕获(鉴定)的个体数为32,其中有10个与第一次相同,故貉的种群数量为:24×32÷10≈77 (4)根据雄性貉的Y染色体特有序列,设计相应引物,对现有每个个体的DNA样品进行PCR扩增电泳分析,鉴定其性别,计算出性别比例。 解析 (1)由图2可知,个体B扩增后的电泳条带只有长度为174的,故其“基因型”为174/174。 (2)根据题干信息可知,通过微卫星“基因”鉴别不同个体的原理是对微卫星“基因”扩增后进行电泳分析,以确定其“基因型”,所以微卫星“基因”数目和“等位基因”的数目越多,个体特异的“基因型组合”越多,能够区分的个体数就越多。 (3)第一次采集粪便进行DNA检测,相当于标记重捕法中的第一次捕获并标记,第二次检测相当于重捕,然后统计出其中被标记的个体数,即与第一次检测相同的个体数,进行进一步计算。第一次捕获(鉴定)的个体数为24,第二次捕获(鉴定)的个体数为32,其中有10个与第一次相同,故貉的种群数量为:24×32÷10≈77。 (4)Y染色体上具有其特有的碱基序列,例如微卫星DNA。根据雄性貉的Y染色体特有序列,设计相应引物,对现有每个个体的DNA样品进行PCR扩增电泳分析,鉴定其性别,计算出性别比例。 12. (1)捕食和种内竞争　物理信息、化学信息和行为信息　资源和空间 (2)互利共生 (3)①上清液　②溶解DNA　③Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶)和4种脱氧核苷酸 (4)互补配对　含有rbcL基因的DNA片段　丙、丁　甲、乙 (5)ab 解析 (1)川金丝猴警戒行为可监测捕食者,当有天敌入侵时会发出信号躲避敌害,这体现了生物之间的捕食关系;这种警戒行为还可监测同种个体,这体现了生物之间的种内竞争关系。信息类型有物理信息、化学信息和行为信息等。自然条件下资源和空间有限,川金丝猴根据获取的信息及时作出反应,可为争夺资源和空间获得更多机会。 (2)川金丝猴与消化道中参与高纤维食物消化的微生物共同生活,相互依存,彼此有利,属于互利共生关系。 (3)①样本中加入裂解液,使DNA释放出来,离心后细胞膜等结构在沉淀物中,上清液中含有DNA,向上清液中加入乙醇,因为DNA不溶于乙醇,会有丝状物析出,取沉淀即为粗提取的DNA。 ②上一步得到的沉淀物主要是DNA,加入纯水的目的是溶解DNA。 ③分析题表可知,PCR反应体系中还缺少Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶)和4种脱氧核苷酸。 (4)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。PCR扩增的产物可用琼脂糖凝胶电泳来鉴定,因此对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析,能检出的样本是含有rbcL基因的DNA片段。据题图可知,植物甲和植物乙测序部分的碱基序列完全一致,植物丙和植物丁的碱基序列均与植物甲有区别,对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序,得到的序列有图中的3种序列,可知川金丝猴摄食的植物至少有三种,其中一定含有的植物是丙和丁,但是无法确定摄食甲和乙其中的一种还是二者均被摄食。因此,若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物,还需选用甲和乙的保守序列再设计引物,对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。 (5)建立生态廊道可以帮助种群间建立联系,促进种群间基因交流,是保护川金丝猴的有效措施之一,a正确;保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物,可以提高其环境容纳量,是保护川金丝猴的有效措施之一,b正确;用标记重捕法对川金丝猴定期重捕,会干扰其正常生活,不能有效保护川金丝猴,c错误;就地保护是对川金丝猴最有效的保护,不能主要依赖迁地保护,d错误。 13. (1)稀释涂布平板法　探究内生放线菌最适的营养条件和温度 (2)指数级扩增　②　重组质粒通过(单交换)同源重组整合到了内生放线菌的基因组中 (3)设置两组培养实验:对照组在低(或常规)铁浓度的培养基上进行,实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后,观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况(如菌落大小或抑制圈大小)。 解析 本题考查微生物培养、基因敲除及实验设计等知识。 (1)从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落,并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件,目的是探究内生放线菌最适的营养条件和温度。 (2)PCR技术的核心原理是通过多次循环(变性、复性、延伸),使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加,实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。在野生型菌株中,引物1和引物2之间的DNA片段长度为R-U(500 bp)+R基因(2 000 bp)+R-D(500 bp)=3 000 bp。对应图2中的菌落①和③。在成功发生双交换的R基因敲除株中,R基因(2 000 bp)被替换,引物1和引物2之间的DNA片段长度为R-U(500 bp)+R-D(500 bp)=1 000 bp。对应图2中的菌落②。菌落④的PCR产物大小约为7 000 bp。这个大小可以通过以下方式解释:发生了单交换同源重组事件。整个重组质粒(大小为3 000 bp质粒骨架+500 bp R-U+500 bp R-D=4 000 bp)整合到了基因组中。整合后,引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3 000 bp)加上整个质粒的长度(4 000 bp),即3 000+4 000=7 000 bp。因此,这是单交换同源重组整合的结果。 (3)设置两组培养实验:一组为对照组,在常规(或低铁)浓度的培养基上进行;另一组为实验组,在添加了足量铁离子的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后,观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况(如菌落大小或抑制圈大小)。 14. (1)磷脂、蛋白质　发出星射线,形成纺锤体 (2)溶解DNA　耐高温的DNA聚合酶　3' (3)①a、b　②1 100　③Q4　④蛋白质X参与中心体的形成　(4)逆转录　32 解析 (1)纤毛膜由细胞膜延伸形成,其化学成分与细胞膜一致,主要由磷脂、蛋白质组成。中心体存在低等植物细胞与动物细胞中,在有丝分裂中的功能是在前期发出星射线,形成纺锤体。 (2)分离提取细胞样品中DNA时,利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,可通过交替调节NaCl溶液的浓度,将DNA分离出来。DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大,高于或低于这一浓度时,DNA的溶解度均会下降。因而在实验中可添加NaCl至2.0 mol/L,以溶解DNA。PCR扩增时,需在耐高温的DNA聚合酶的催化下,从引物的3'端开始进行DNA子链的延伸,从而获得扩增产物。 (3)①利用PCR技术扩增DNA片段时,由于DNA聚合酶只能从引物的3'端进行DNA子链的延伸,引物应分别与DNA分子的两条模板链互补,据题图可知,应选择图Ⅱ中的引物a和引物b。②根据图Ⅱ可知,PCR目的产物的长度约为300+800=1 100bp。③确保M及连接处序列正确,Y-M的连接处上游含有Hind Ⅲ+EcoR Ⅴ的识别序列,下游含有EcoR Ⅴ+BamH Ⅰ的识别序列,根据题干信息构建Y-M重组质粒(在EcoRⅤ位点插入片段),Y-M的连接处测序后部分序列应含有EcoR Ⅴ+BamH Ⅰ的识别序列,根据EcoR Ⅴ识别位点,应选择序列Q4。④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光,而实验组荧光集中在纤毛基部,说明蛋白质X参与中心体的组成。 (4)采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平,以研究另一纤毛病相关基因Z表达变化,首先要采集样本、提取总RNA,经逆转录形成cDNA,再以cDNA作为模板进行PCR扩增。PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20,说明病人基因Z表达较弱。设健康人Z基因相应的cDNA数为x,病人Z基因相应的cDNA数为y,则有x×215=y×220,从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的25=32倍。 考点74　基因工程的应用及蛋白质工程 1.C　本题考查蛋白质的结构与功能、基因工程的应用的相关知识,以及科学思维、科学探究等学科素养。由题干可知,导入相关基因后能形成功能正常的X+Y融合蛋白,不会因碱基序列相互影响导致蛋白功能异常,A项错误。由题图可知,内含肽序列并未嵌入X蛋白的功能结构内,而是位于X蛋白的结构外肽链部分,若嵌入功能结构内,切除后会破坏X蛋白的功能结构,B项错误。由题图可以看出,内含肽的IntAN与IntAC、IntBC与IntBN能通过匹配相互识别,进而发挥肽链连接和自我切除,由此可得,不同内含肽之间通过能互补匹配的结构域相互识别,进而发挥特异性的自我切除和肽链连接作用,C项正确。内含肽会自我切除并与两侧肽链分离,因此提供“内含肽+某蛋白”无法赋予X+Y融合蛋白新的结构,D项错误。 2.B　本题考查基因工程的原理与转基因技术的应用等知识,以及生命观念、科学思维等学科素养。基因表达的分子机制在生物界具有通用性,不同物种来源的启动子与基因编码序列可通过重组拼接,在受体细胞中正常启动转录并完成翻译,实现异源基因的表达,A项正确。外源基因整合到受体染色体的位置与拷贝数存在随机性,不同转基因鱼的整合位点存在差异,会导致重组生长激素基因的表达水平存在差异,B项错误。外源基因只有整合到受体细胞的染色体DNA上,才能随细胞分裂稳定复制并传递给子代细胞,这是其在受体中稳定遗传的关键,C项正确。通过调控启动子活性可以定向改变生长激素基因的表达水平,结合对应转基因鱼的生长速率变化,能够验证二者的关联,D项正确。 转基因性状类题的破题逻辑 解答此类题目需抓住三个核心要点:一是基因表达机制的通用性支撑异源重组基因在受体中表达;二是外源基因整合的随机性会导致不同个体的基因表达水平与性状强度存在差异;三是染色体整合是稳定遗传的前提,调控启动子活性可验证基因表达与性状的对应关系。 3.D　本题结合抗体的蛋白质工程改造情境,考查蛋白质工程、酶的特性与基因表达的知识,以及科学思维与生命观念等学科素养。蛋白质工程从预期蛋白质功能出发,通过改造对应的基因实现蛋白质改造,全程遵循遗传信息传递的一般规律,A项正确。胰蛋白酶只能识别并水解特定氨基酸序列间的肽键,改造后抗体失去对应识别位点,无法被水解,体现了酶的专一性,B项正确。改造后的甲仍保持抗体活性,第96位氨基酸未被替换,可能是该位点与抗体的功能密切相关,替换后可能导致抗体活性丧失,C项正确。改造后抗体的氨基酸序列发生改变,氨基酸种类不同对应的密码子必然不同,因此编码甲的基因序列发生改变,D项错误。 4.A　本题主要考查基因工程的基本操作程序、有丝分裂等知识,考查学生的逻辑推理能力。转化是指目的基因进入受体细胞内,并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。农杆菌转化前,需要将含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌中,此时应先使用Ca2+处理农杆菌细胞,使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,不需要使用Ca2+处理烟草细胞,A项错误。农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体的DNA中,因此紫杉醇合成的相关基因会随T-DNA整合到烟草染色体DNA上,B项正确。紫杉醇会干扰纺锤体的正常功能,通过抑制纺锤体的形成,阻碍肿瘤细胞的有丝分裂,从而发挥抗癌作用,C项正确。利用转基因技术生产紫杉醇前体,可减少对天然红豆杉的依赖,有利于保护其资源,D项正确。 5.B　生长素能促进子房发育果实,用特异启动子诱导表达iaaM(生长素合成基因)可获得无子果实,A项合理。大量表达ipt(细胞分裂素合成关键基因),细胞分裂素含量升高,细胞分裂素和生长素的比例较高时,有利于芽的分化,B项不合理。赤霉素能促进细胞伸长,从而引起茎秆伸长和植物增高,提高ga2ox(氧化赤霉素的酶基因)的表达水平可使赤霉素含量降低,从而能获得矮化品种,C项合理。乙烯能促进果实成熟,在果实中表达acs(乙烯合成关键酶基因)的反义基因,即抑制乙烯的合成,果实成熟会延迟,D项合理。 6. (1)基因重组　反密码子 (2)诱导型启动子　该启动子驱动MM-CP仅在雌蚊吸血后表达,多数转基因雌蚊可在死亡前完成繁殖,保证MM-CP基因能传递给子代,有利于该基因在按蚊种群中扩散　从预期抗菌肽的功能出发,设计其空间结构,推测对应的氨基酸序列,进而改造MM-CP基因的脱氧核苷酸序列,使改造后的抗菌肽保留抑制疟原虫的活性,同时降低对按蚊自身的毒性 (3)以携带MM-CP的同源染色体为模板进行同源重组修复,将MM-CP基因整合到被切割的野生型染色体上 (4)在抗菌肽的定向选择作用下,疟原虫种群的抗药性基因频率会逐代升高,最终进化出对抗菌肽的抗性,导致该防控手段逐渐失效(合理即可) 解析 本题结合转基因按蚊防控疟疾的研究,考查基因工程的原理、基因表达调控、蛋白质工程、基因驱动技术及生物进化等知识,考查科学思维、社会责任等学科素养。(1)培育转基因按蚊的核心技术为基因工程,通过转基因实现了外源基因与按蚊基因组合在一起,属于可遗传变异中的基因重组;翻译过程中,tRNA上的反密码子可与mRNA上的密码子互补配对,将对应的氨基酸转运至核糖体,参与多肽链的合成。(2)该启动子仅在雌蚊吸血这一特定条件下驱动MM-CP高表达,属于诱导型启动子;选用该类启动子的原因是抗菌肽会降低雌蚊存活率,若持续表达会导致按蚊繁殖能力下降、基因难以在种群中传递,而诱导表达模式可使多数雌蚊在死亡前完成繁殖,保证MM-CP基因稳定传递给子代,推动该基因在种群中扩散。运用蛋白质工程改造MM-CP时,需遵循蛋白质工程的基本路径:从预期的蛋白质功能出发,设计预期的蛋白质空间结构,推测应有的氨基酸序列,最终找到并改造对应的脱氧核苷酸序列,使产物保留抑制疟原虫的活性,同时降低对按蚊自身的毒性。(3)基因驱动打破孟德尔遗传比例的核心机制是:形成配子时,Cas9特异性切割野生型同源染色体,随后细胞以携带MM-CP的染色体为模板,通过同源重组修复断裂的DNA双链,将MM-CP基因精准整合到原本的野生型染色体上,使绝大多数配子都携带MM-CP基因,因此后代中携带该基因的个体比例显著高于50%。(4)从生物进化角度分析,大范围释放驱动型转基因按蚊后,抗菌肽会对疟原虫种群产生持续的定向选择压力,种群中原本低频存在的抗药性变异个体被保留并大量繁殖,疟原虫种群的抗药性基因频率逐代上升,最终进化出对抗菌肽的抗性,使该疟疾防控手段的效果逐渐下降;此外基因驱动会快速改变按蚊种群的基因频率,可能影响食物链中上级消费者的生存与进化,引发生态平衡风险。 基因驱动类题目的解题可分为三步:第一步明确核心原理,即核酸酶切割同源染色体+同源重组修复,实现目标基因的“纯合转换”,突破50%的遗传概率;第二步结合题干情境分析调控元件的作用,如诱导型启动子可平衡基因功能与生物繁殖能力,保障基因的种群扩散能力;第三步从定向选择、基因频率改变的角度推导进化与生态风险,紧扣自然选择决定生物进化方向的核心逻辑展开分析。 7. (1)固体 (2)碱基互补配对　5'　SacⅠ (3)标记　选择 (4)①抑制CreA基因的表达可显著提升黑曲霉的淀粉酶活力;②抑制CreA基因的表达不影响菌株正常生长 (5)①无需对淀粉进行高温糊化处理,节约能源,降低生产成本;②可直接将淀粉降解为葡萄糖,简化生产工艺,减少酶制剂的使用种类 解析 本题结合RNA干扰技术改造黑曲霉提升淀粉酶产量的研究,考查微生物培养、基因工程操作原理及酶制剂的工业应用等知识,以及科学思维、社会责任等学科素养。(1)分离纯化微生物菌种需使用固体培养基,固体培养基表面可形成单菌落,便于分离纯化和计数。(2)RNA自身折叠形成双链依赖碱基互补配对原则。PCR扩增时,限制酶识别序列需添加在引物的5'端,3'端需与模板互补以保证延伸正常进行。载体上A位点用KpnⅠ和SpeⅠ正向插入D片段,C位点需反向插入D片段才能使转录产物与A互补,因此D片段两端需各加两个酶切位点;左端外侧为SacⅠ、内侧为KpnⅠ,右端内侧为SpeⅠ、外侧为NcoⅠ,用SacⅠ和NcoⅠ双酶切后可反向插入C位点的NcoⅠ/SacⅠ之间,故限制酶①为SacⅠ。(3)基因表达载体的必备元件包括启动子、终止子、目的基因和标记基因等,标记基因可用于筛选成功导入重组载体的受体细胞;筛选过程需在选择培养基上进行,利用标记基因的抗性或营养缺陷互补特性筛选阳性菌株。(4)对比两组曲线可知,G1(CreA基因表达受抑制)的淀粉酶活力远高于野生型G,说明抑制CreA基因的表达可解除其对R基因的抑制作用,提升淀粉酶合成量;同时G1和G的生物量曲线几乎重合,说明抑制CreA基因表达不影响菌株正常生长。(5)传统工艺需高温糊化、多步酶解,而淀粉酶R可直接将未高温处理的淀粉降解为葡萄糖,因此无需高温处理可节约能耗;一步完成淀粉降解可简化工艺流程,缩短生产周期,降低工业生产成本。 RNA干扰载体构建解题思路 解答本题的核心是厘清RNA干扰载体的构建逻辑:转录出的单链RNA需形成双链发夹结构,因此目的片段需分正向、反向两次插入载体,中间以间隔序列隔开。解题时先明确载体上两个插入位点的酶切位置与顺序,再结合反向插入的黏性末端匹配要求,推导引物上额外添加的酶切位点种类,即可突破限制酶判断的难点。 8. (1)序列数据库　XhoⅠ　XbaⅠ　DNA连接酶 (2)外源基因N/外源DNA　1　重组质粒大小是9.5 kb,质粒pYL大小是7.2 kb,因此插入的基因N的大小约为2.3 kb,与DNA电泳图中1号样品大小接近,因此判断该组基因N导入成功 (3)GCC (4)香树脂醇 解析 (1)可从序列数据库中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,所以右端为启动子端,为保证基因N与质粒pYL正确连接,右端要与质粒pYL中用限制酶SpeⅠ切出的末端(5'-A 3'-TGATC)相连,而限制酶SpeⅠ会将基因N切断,所以引物2的5'端应引入限制酶XbaⅠ的识别序列,以便切出与SpeⅠ相同的末端进行连接;引物1的5'端则引入限制酶XhoⅠ的识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用DNA连接酶连接DNA片段。 (2)在进行PCR反应时,通常需要排除PCR反应污染的问题,主要是来自外源基因N的污染。从步骤(1)的条件可知,重组质粒的大小为9.5 kb,载体质粒的大小是7.2 kb,由于题干假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变,因此插入的基因N的分子大小约为9.5 kb-7.2 kb=2.3 kb,与电泳图中菌株1的PCR片段的条带大小相近。综上所述,可以初步判断实验组1的质粒成功导入了基因N。 (3)a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),据图可知,a的5'端显示的前三个碱基GCA即为第240位脯氨酸替换为丙氨酸后对应的密码子序列;又因为 b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同,据图可知,只有c的序列与a的序列(244位~250位)相同,故c链为诱变第243位苯丙氨酸的引物,5'端显示的前三个碱基为第243位苯丙氨酸替换为丙氨酸后对应的密码子序列GCC。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有GCC。 (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 9. (1)mKate2蛋白(或荧光) (2)细菌计数板计数法　作为mKate2蛋白的荧光对照　PGro停止转录,mKate2蛋白合成减少,且持续被降解 (3)快速生长期荧光值较低,生长稳定期快速增强 (4)先敲除野生型大肠杆菌中的酶B基因,再用酶A基因替换质粒2中的mKate2基因,酶B基因替换质粒1中的mKate2基因,并将上述质粒同时导入野生型大肠杆菌 解析 本题考查基因工程的相关知识,主要考查学生的理解能力和解决问题的能力。 (1)在基因工程中,筛选重组菌株时,常用的检测方法除了PCR,根据质粒中存在红色荧光蛋白基因,可利用荧光检测,筛选获得重组菌株W1。 (2)检测培养液中细胞密度常用的方法是细菌计数板计数法。接种前检测液体培养基的荧光强度,作用是作为mKate2蛋白的荧光对照。进入生长稳定期后,由于PGro在生长稳定期停止基因转录,所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2,同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解,导致荧光强度快速下降。 (3)在重组菌株W2中,启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在细胞快速生长阶段,阻遏蛋白X阻遏mKate2基因的表达;随着细胞进入生长稳定期,阻遏蛋白X停止表达并被降解,对PX启动子的阻遏作用降低,mKate2基因开始表达,荧光强度开始上升,由于原料的限制,最后保持稳定,所以培养期间荧光强度的变化趋势为快速生长期荧光值较低,生长稳定期快速增强。 (4)为了保证细胞正常生长,并在生长稳定期实现养草酸的大量积累,利用上述两种质粒的调控功能,结合野生型菌株遗传物质的改造,提出重组生产菌株构建思路是:首先对野生型大肠杆菌进行改造,敲除酶B基因;然后将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因,使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长,进入生长稳定期后该酶降解,减少对养草酸的转化;同时将质粒2中的mKate2基因替换为酶A基因,利用其调控机制在生长稳定期实现葬草酸合成相关基因的稳定表达,从而大量积累葬草酸,最后将两种质粒导入野生型大肠杆菌。 10. (1)EcoRⅠ、NotⅠ (2)便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落 (3)肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞(正常T细胞)与肿瘤细胞共同培养　肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等 (4)减少CAR-T细胞表面PD-1的表达　抑制PD-1基因表达的基因序列　终止子　溶解酶基因序列　多种酶基因序列 解析 本题考查基因工程和动物细胞工程等。 (1)构建含CAR基因的重组质粒,常采用双酶切法,目的是避免质粒和目的基因自连、目的基因反向插入;目的基因CAR需要插入质粒的启动子和终止子区域,而限制酶ClaⅠ和HindⅢ位于启动子和终止子区域之外,且CAR基因片段中间含有BamHⅠ识别序列,故应该选用EcoRⅠ和NotⅠ分别切割CAR基因和质粒。(2)质粒上含有氨苄青霉素抗性基因,将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌,使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养的目的是便于含有质粒的大肠杆菌形成单菌落,方便后续筛选出重组质粒。(3)研究目的是探究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果,自变量为是否含有CAR基因的T细胞,因变量为抗肿瘤效果,即肿瘤细胞凋亡率的检测指标为肿瘤细胞的体积、肿瘤细胞死亡数和存活数等;实验组为CAR-T与肿瘤细胞共同培养,对照组应为肿瘤细胞单独培养、不含CAR基因的T细胞(正常T细胞)与肿瘤细胞共同培养。(4)由题干可知,肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制,为了阻断免疫抑制,可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合,以及减少CAR-T细胞表面PD-1的表达;根据题干信息可知,与PD-1连接的生物开关,在该PD-1与PD-L1结合后会被打开,释放P因子激活P启动子,且需要减弱原有PD-1启动的抑制通路,可知新的重组质粒中①是抑制PD-1基因表达的基因序列;溶解酶可以降解细胞外基质,多种酶同时作用可提高降解效率,且由图可知,P启动子是双向启动子,因此②是终止子,③是溶解酶基因序列,④是多种酶基因序列。 11. (1)DNA序列　COXⅣ位于线粒体内膜,它的肽链序列X能引导GFP定位到线粒体,从而通过GFP来观察线粒体的形态变化 (2)B　B位于启动子下游与终止子上游,目的基因插入B点才可能转录 (3)外植体　染色体DNA　生长素和细胞分裂素 解析 本题考查基因工程、植物组织培养等相关知识,考查学生的信息获取、语言表达和逻辑推理能力。 (1)根据蛋白质工程原理,一般不会直接拼接肽链,而是将两段肽链对应的DNA序列拼接在一起完成“嫁接”(蛋白质工程是通过改造或合成基因来改造蛋白质)。COXⅣ的一段肽链序列X决定了COXⅣ在细胞内的分布,研究者选择将X与GFP拼接,理由是COXⅣ位于线粒体内膜,它的肽链序列X能引导GFP定位到线粒体,从而通过GFP的荧光来观察线粒体的形态变化(利用X的定位功能,使GFP标记线粒体)。(2)拼接好的序列应插入农杆菌T-DNA的B处。B位于启动子下游与终止子上游,目的基因插入B点才可能转录。(3)选择番茄幼嫩子叶进行离体培养,这些用于培养的器官、组织或细胞被称为外植体。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的染色体DNA中(农杆菌的T-DNA会整合到植物细胞的染色体DNA上)。番茄组织培养过程中,诱导期需在培养基中添加的植物激素是生长素和细胞分裂素(植物组织培养中,生长素和细胞分裂素的比例会影响细胞的脱分化和再分化过程,芽诱导期需要这两种激素来启动细胞的分裂和分化)。 12. (1)稳定性差异　选择性表达 (2)C (3)各组织器官中G和H的mRNA (4) 解析 (1)细胞分化是指在个体发育中,由一个或一种细胞增殖产生的后代,在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程,其实质是基因的选择性表达。 (2)根据题干信息“增强子位于基因上游或下游,与基本启动子共同组成基因表达的调控序列”可知,增强子是含有特定碱基序列的DNA片段,增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上,A、B项正确。根据图C分析可知,一个增强子可作用于多个基因的基本启动子,如图中的报告基因与内源基因,C项错误。根据题干信息“很多增强子具有组织特异的活性”可知,很多增强子在不同组织中的活性不同,D项正确。 (3)若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因,可以对其转录产物进行检测,即通过PCR等技术检测各器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的mRNA进行判断。 (4)由题干信息分析可知,增强子位于基因上游或下游,与基本启动子共同组成基因表达的调控序列,基因工程所用表达载体中的启动子,包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部,不会造成基因突变。只有当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部,才会造成该增强子所调控的基因发生突变。为研究某目的基因的功能,可将图B所示载体去掉基本启动子,则该载体插入基因内部后才会发挥作用,如下图。 13. (1)水解蛋白质,使蛋白质与DNA分离,便于后续操作中蛋白质的去除和DNA的提取　溶解蛋白质,析出DNA (2)PCR　人工合成 (3)RNA聚合酶识别和结合的部位　提高基因转录效率 (4)HygBR　(5)F3　R2　(6)D 解析 (1)从苏云金杆菌提取DNA时,加入蛋白酶的作用是溶解蛋白质,使蛋白质与DNA分离,便于后续操作中蛋白质的去除和DNA的提取,提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精可以溶解蛋白质,析出DNA。(2)由题图可知,获得目的基因的方法是PCR和人工合成。(3)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录。插入两个启动子可以转录出更多的mRNA分子,再进一步翻译出更多的蛋白质,提高了基因的表达量。(4)质粒上的基因在T-DNA上可以整合到宿主的核DNA上,从而在宿主细胞内表达,T-DNA外的基因不能在宿主细胞内表达。由题图可知,KanR在T-DNA外,不能在宿主细胞内表达;HygBR在T-DNA上,可以整合到宿主的核DNA上,从而在宿主细胞内表达。故用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。(5)由题图可知,目的基因左侧为人工合成序列,右侧为1 363—1 848序列,人工合成序列的上链左端有F3引物结合位点且向右延伸,1 363—1 848序列的下链右端有R2引物结合位点且向左延伸,故引物选择F3和R2。(6)蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过改造或合成基因,来改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质,以满足人类生产和生活的需求。而基因工程原则上只能生产自然界中已有的蛋白质。用1—1 362合成基因序列和1 363—1 848天然基因序列表达出新的抗虫蛋白,属于蛋白质工程。 14. (1)氮源、碳源　(2)PT7、PBAD和PBAD　基因2、3正常表达出无活性蛋白,被蓝光激活后再启动基因1表达　(3)抑制杂菌,去除丢失质粒的菌株　(4)该处细胞激活T7RNAP,酪氨酸酶基因表达并合成黑色素　(5)将酪氨酸酶替换成能催化合成其他色素的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白) 解析 (1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源和特殊营养物质等。培养工程菌需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件,并控制环境条件如CO2浓度。(2)由题图二a可知,蓝光照射下,T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C端-pMag结合,导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP。蓝光处理后,RNA聚合酶(T7RNAP)识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA,再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶,酪氨酸酶催化染色液中的酪氨酸形成黑色素,可见基因2、3正常表达出无活性蛋白,被蓝光激活后再启动基因1表达。综合上述分析可知,为实现蓝光控制染色,启动子①②及③依次为PT7、PBAD和PBAD。(3)大观霉素属于抗生素,抗生素具有抑制杂菌的作用。光控表达载体携带大观霉素抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素,可以抑制杂菌生长,还可以去除丢失质粒的菌株。(4)蓝光能够激活T7RNAP,表达出酪氨酸酶,酪氨酸酶催化酪氨酸形成黑色素。故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间,随后将其转至染色池处理,发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。(5)如果生产其他颜色图案的BC膜,需要将酪氨酸酶替换成能催化合成其他色素的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。 15. (1)胚乳特异表达基因的　终止转录　Hind Ⅲ　EcoRⅠ (2)农杆菌转化　r2HN基因是否转录　抗原—抗体杂交 (3)1/4　子代不发生性状分离　(4)体液　细胞　(5)生产成本低;转基因水稻易获得(或“安全性高”或“种子蛋白易纯化”或“水稻自花传粉不易发生基因污染”) 解析 (1)由题意可知,若使r2HN基因仅在水稻胚乳表达,GtP(启动子)应为水稻胚乳中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子,其作用为终止转录过程。GtP内部含有KpnⅠ的酶切位点,用KpnⅠ酶切会破坏启动子,Nos下游含有SacⅠ的酶切位点,用SacⅠ酶切会使目的基因无法插入启动子和终止子之间,进而无法表达,故构建基因表达载体时,可选择限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。(2)水稻是单子叶植物,可用农杆菌转化法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN基因表达情况,可通过PCR技术检测r2HN基因是否转录出了mRNA,通过抗原—抗体杂交技术检测r2HN基因是否翻译出r2HN蛋白。(3)选择单一位点插入目的基因的植株(用AO表示)进行自交一代,根据分离定律,r2HN纯合体植株(AA)占1/4,无r2HN基因的纯合体植株(OO)占1/4,杂合体植株(AO)占1/2。由于纯合体植株遗传性状稳定,故选择r2HN纯合体植株进行后续研究。(4)通过体液免疫,机体可产生较多抗体,通过细胞免疫,机体可产生较多细胞毒性T细胞。由题图可知,实验组的抗体和CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)的相对值明显高于对照组,因此获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗,具有生产成本低、生物安全性较高、提取和处理目标产物容易等优点。 16. (1)引物　(2)作为标记基因,筛选含有基因表达载体的受体细胞　终止转录(使转录在需要的地方停下来 )　(3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮,而不是用于重组梭菌的生长 (4)废物的资源化　不仅不排放二氧化碳,而且还可以利用工业废气中的二氧化碳 解析 (1)PCR技术的前提是需要根据目标基因两端的碱基序列设计一对引物,引物与模板链结合后,Taq酶才能从引物的3'端延伸子链。(2)在基因表达载体中,抗生素抗性基因属于标记基因,所以用含某种抗生素的培养基可筛选出导入目的基因的受体细胞。终止子是处于目的基因下游的一段序列,它是转录结束的信号,转录时遇到终止子就停止。(3)重组梭菌大量表达题述酶蛋白时,在这些酶蛋白的作用下,二氧化碳等气体大量用于合成丙酮,而不是用于重组梭菌的生长,所以会导致梭菌生长迟缓。(4)根据题意可知,这种生产高附加值化工产品的新技术,以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料,实现了废物的资源化,体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看,该技术在生产丙酮的过程中不仅不排放二氧化碳,而且还可以利用工业废气中的二氧化碳,有利于减缓温室效应,并实现较高的经济效益,所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 17. (1)多肽链　mRNA　密码子的简并性　(2)化学合成法　从基因文库中获取　DNA双链复制　(3)种类　提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同,导致水蛭蛋白的空间结构有不同程度破坏　(4)取三支试管,分别放入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素,再分别加入等量的同一动物的新鲜血液,静置一段时间后,观察三支试管中血液凝集情况 解析 (1)根据蛋白质工程的原理可知,物质a是多肽链,物质b是mRNA,由于密码子的简并性,密码子不同,合成的蛋白质空间构象也可能相同。(2)基因工程中获取目的基因的方法有PCR技术扩增、化学合成法、cDNA法以及从基因文库中获取等。PCR技术的原理是DNA双链复制。(3)根据图解可以看出,两种肽的含量差异不大,因此主要是种类的差异。导致两种酶解产物抗凝血活性不同的原因可能是提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同,导致水蛭蛋白的空间结构有不同程度破坏。(4)取三支试管,分别放入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素,再分别加入等量的同一动物的新鲜血液,静置一段时间后,观察三支试管中血液凝集情况。 考点75　生物技术的安全性与伦理问题 1.D　本题考查生物技术安全性的相关知识,主要考查学生的理解分析能力。设计完美婴儿涉及基因编辑技术,可能引发基因歧视、破坏基因多样性等伦理问题,因此反对是合理的,A项正确;生殖性克隆会冲击现有伦理体系,且克隆人存在技术风险,国际社会普遍反对,B项正确;生物武器具有大规模杀伤性,国际公约明确禁止其研发和使用,C项正确;转基因技术需在严格监管下合理应用(如转基因作物),并非完全禁止,D项错误。 2.B　在转基因抗虫棉种子中混入少量常规种子,则常规种子长成的普通植株能为敏感型(不抗虫)个体提供生存空间,增加与抗性个体的竞争,避免抗性基因频率升高过快,提高了抗虫棉的抗虫持久性,A项不符合题意。大面积种植转基因抗虫棉并使用杀虫剂会导致害虫大量死亡,能生存的大多数都具有抗性基因,抗性基因频率会越来越高,B项符合题意。转基因抗虫棉与小面积的常规棉间隔种植以及转基因抗虫棉大田周围设置常规棉隔离带的作用机理与A选项相似,都可以使敏感型个体存活,提高抗虫棉的抗虫持久性,C、D二项不符合题意。 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题二十三　基因工程及 生物技术的安全性与伦理问题 考点 2017~2021年 2022年 2023年 2024年 2025年 2026年 合计 72.基因工程的基本工具及操作程序 0 1 4 12 16 9 42 73.DNA的粗提取与鉴定及PCR技术 1 2 0 6 5 0 14 74.基因工程的应用及蛋白质工程 0 3 0 4 5 5 17 75.生物技术的安全性与伦理问题 0 0 1 0 1 0 2 命题热度 本专题命题热度非常高() 课程标准 备考策略 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具 　　从近几年高考来看,试题以非选择题为主,主要围绕基因工程的基本工具、操作步骤及DNA粗提取、电泳技术、蛋白质工程等知识点考查,生物技术的安全性和伦理问题基本不考查。试题情境和设问形式丰富多样,重点突出对信息获取、实验探究、语言表述等能力的考查。同时,试题的开放性进一步增加,对考生的思辨能力、创新能力提出了新的要求。 在高考备考中,考生复习时应在夯实必备知识的基础上,理解知识的应用,如根据重组DNA技术的具体情境选择合适的基本工具、在具体情境中获取目的基因、依据目的基因和载体选择限制性内切核酸酶、依据受体细胞的种类选择基因表达载体导入的方法等,同时还要扩大复习的广度,全面梳理教材及习题资源,扩充自己的储备材料(如各种PCR操作过程及应用),提升信息提取与加工、逻辑推理、语言表达等能力。 2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤 3.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质 4.概述人们根据基因工程原理,进行蛋白质设计和改造,可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质 5.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程 6.举例说出日常生活中的转基因产品,探讨转基因技术在应用过程中带来的影响 7.举例说出生殖性克隆人面临的伦理问题 考点72基因工程的基本工具及操作程序答案P479　 1.(2025·江苏,19,3分,难度★★★)(多选)图示人体正常基因A突变为致病基因a及Hind Ⅲ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为,下列相关叙述正确的有 (　　) A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B.用两种限制酶分别酶切A基因后,形成的末端类型不同 C.用两种限制酶分别酶切a基因后,产生的片段大小一致 D.产前诊断时,该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 2.(2025·福建,15,4分,难度★★★)质粒P含有2个EcoR Ⅰ、1个Sac Ⅰ和1个BamH Ⅰ的限制酶切割位点。已知BamHⅠ位点位于2个EcoRⅠ位点的正中间,用上述3种酶切割该质粒,酶切产物的凝胶电泳结果如图,其中泳道①条带是未酶切的质粒P,泳道②③④条带为3种单酶切产物,泳道⑤⑥⑦条带为双酶切产物。下列叙述正确的是 (　　) A.DNA分子在该凝胶的迁移方向是从电源正极到负极 B.可确认泳道②③条带分别是SacⅠ和EcoRⅠ的单酶切产物 C.泳道⑤条带是SacⅠ和EcoRⅠ的双酶切产物 D.泳道①②说明未酶切质粒的碱基数小于酶切后质粒的碱基数 3.(2025·江西 ,11,2分,难度★★★)为了获得抗白叶枯病的水稻品种,研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图),通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织,最终获得抗病植株。下列叙述正确的是 (　　) A.水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无需识别U6启动子 B.在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达 C.农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素 D.愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株 4.(2025·安徽,15,3分,难度★★★)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因,将该质粒导入大肠杆菌细胞后,其编码的酶可分解X-gal,产生蓝色物质,进而形成蓝色菌落,如图所示。科研小组以该质粒作为载体,采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是 (　　) A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率,可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B.如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C.因质粒K中含两个标记基因,筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D.若筛选平板中蓝色菌落偏多,原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 5.(2024·黑吉辽,7,2分,难度★★★)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是 (　　) A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 6.(2024·江苏,9,2分,难度★★)酵母菌是基因工程中常用的表达系统。下列相关叙述正确的是 (　　) A.酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌,但不能灭活真菌 B.酵母菌是真核细胞,需放置在CO2培养箱中进行培养 C.可用稀释涂布平板法对酵母菌计数 D.该表达系统不能对合成的蛋白质进行加工和修饰 7.(2024·湖南,5,2分,难度★★)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是 (　　) A.限制酶失活,更换新的限制酶 B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等 C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 8.(2026·黑吉辽内蒙古,25,11分,难度★★★★)平沙绿僵菌是一种昆虫病原真菌,通过分生孢子侵染蚊子,对蚊子致死率高,但引诱能力弱。利用松树长叶烯合酶基因(Tps)改造平沙绿僵菌,增强其引诱能力,据此研发“诱杀一体”的灭蚊剂。回答下列问题。 (1)为提高Tps基因在平沙绿僵菌中的表达效率,重新设计了长叶烯合酶编码序列,该序列与天然基因序列存在较大差异,但编码的氨基酸序列不变,获取该目的基因的方法是　。  注:质粒中限制酶切割位点间碱基对长度可忽略不计;kb:千碱基对。 实验如上图,用限制酶EcoR Ⅴ切割pPK2质粒,然后与Tps基因连接,用　　　　　(填“E.coli”或“T4”)DNA连接酶可获得更高的连接效率。  经卡那霉素筛选得到的农杆菌中,除含有目的基因的重组质粒外,还可能存在　。  为鉴定重组质粒是否正确连接,利用限制酶切割并电泳检测,下列限制酶组合和片段大小,属于正确连接的是　　　和　　　。  A.BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ、0.7 kb+6.1 kb B.BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ、1.1 kb+5.7 kb C.Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ、0.7 kb+6.1 kb D.Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ、1.1 kb+5.7 kb 农杆菌转化后,重组质粒上的T-DNA会转移并整合到平沙绿僵菌的　　　　　上。  为筛选工程化平沙绿僵菌,用PCR技术进行鉴定。Tps基因的转录模板链部分序列为5'-ATGTCGTTCC…AATTGGCTCC-3',下列引物对可用于扩增该片段的是　　　。  A.5'-ATGTC…-3'、5'-CCTCG…-3' B.5'-ATGTC…-3'、5'-GGAGC…-3' C.5'-TACAG…-3'、5'-CCTCG…-3' D.5'-TACAG…-3'、5'-GGAGC…-3' (2)研究人员比较了等量平沙绿僵菌和工程菌培养物对蚊子的诱杀效果,如下表。 培养物第7天 死亡率 (%) 访问次 数(次/ 小时) 停留时 间(分钟/ 小时) 2小时 感染率 (%) LT50 (天) 平沙绿僵菌62.4 0.9 1.1 100 5.84 工程菌84.3 2.4 5.9 100 4.04 注:感染率:感染孢子的蚊子比例;LT50(平均致死时间)为导致50%蚊子死亡所需的平均时间。 已知孢子附着量决定蚊子死亡速度,结合表中数据解释工程菌培养物使蚊子的LT50显著缩短且第7天死亡率更高的原因是  　。  (3)该工程菌制剂在推广前,需经过严格的　　　　　评价,符合标准后方可推广。  9.(2026·山东,25,12分,难度★★★★)小鼠基因W编码的蛋白质可调节脂肪代谢。研究人员将基因W转入酵母菌并使其稳定表达,实现了该蛋白的高效合成。该过程中用到末端脱氧核苷酸转移酶(TdT),该酶不需要模板,可在DNA的3'端随机添加4种脱氧核苷酸,若只提供1种脱氧核苷酸,则连续添加多个该种脱氧核苷酸,称为同聚物加尾。相关信息如图所示。 (1)载体上RNA聚合酶识别和结合的部位是　　　　,载体上与其能自我复制相关的结构是　　　　。  (2)研究人员选取2种限制酶切开载体,再用TdT分别对基因W和切开的载体进行同聚物加尾,然后将两者连接;若载体酶切后产生的黏性末端为5'端突出,则需先用DNA聚合酶补平后再进行同聚物加尾。因后续研究还需要用这2种限制酶将基因W从重组载体中切下,据图分析,应选取的2种限制酶为　。  (3)基因W和载体两者的同聚物尾配对后形成的重组载体存在部分单链区,为构建完整重组载体需要的2种酶是　　　　　　　　　　,该过程中　　　　(填“需要”或“不需要”)添加引物,原因是　    　。  (4)为检测基因W是否在酵母菌中表达出相应蛋白,在分子水平上的检测方法是　。  10.(2026·云南,21,12分,难度★★★★★)UW4菌株可表达ACC脱氨酶减少植物乙烯合成,促进植物生长,但定殖植物根部能力较弱。现欲将增强定殖能力的五肽整合到UW4中ACC趋化受体(ACCR)的羧基端。回答下列问题。 第一步:构建pEX质粒(图a),复制原点(ori)不能在UW4菌株中启动复制(质粒不复制策略)。 图a (1)PCR每次循环一般可以分为变性、复性和　　　　三步。　   (2)构建pEX质粒时,用2种限制酶的目的是  　(答出2点)。  第二步:将pEX质粒导入UW4菌株中,利用DNA同源区段可发生交换的原理,改造得到工程菌UW4-2(图b)。 图b (3)我国科学家将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中,使花粉失活,防止转基因花粉传播;在UW4-2菌株构建中使用了质粒不复制策略。此类设计的主要目的是   　。  (4)要获得UW4-2菌株,需筛选三次。第一次在培养基中添加　　　　　　　,即可筛选出UW4-1菌株,筛选的原理是　　　　　　　　　　　　　　　　　;在第二次筛选培养基中添加　　　　。筛选后,培养基中仍同时存在两种菌株,第一种菌株是UW4-2,另一种菌株的拟核DNA结构是　　　　(填图c中序号);可以通过设计特异性引物进行PCR扩增相应序列并　。  图c 11.(2026·贵州,21,10分,难度★★★★)高粱是酿酒的优质原料,虫害严重影响高粱产量和品质。将外源抗虫基因导入高粱植株,可培育具有抗虫性状的新品种。回答下列问题。 (1)科研人员拟将抗虫基因V连接到图甲中的质粒上,为避免错误连接,应选用图甲中的　　　　　　对质粒进行酶切。  甲 乙 (2)将重组质粒导入受体细胞并获得高粱植株,为检测目的基因是否正确导入,以叶片基因组DNA为模板,设计如图乙所示的引物进行PCR及电泳鉴定。其中引物组合为　　　　的扩增产物电泳迁移速率最快;抗虫基因V的长度约为　　　　 bp。  丙 (3)科研人员发现转基因高粱中V基因的表达量未达到预期,推测与启动子部分序列5'-ATCGCGAACG-3'的胞嘧啶甲基化有关。用亚硫酸氢盐(能使未甲基化的碱基C转变为U)处理高粱DNA,将处理后的样品进行PCR扩增等操作获得上述片段的互补链。将所得互补链的5'末端用32P标记,再分别用四种化学试剂处理,使识别的核苷酸的3'端磷酸二酯键断裂,并通过控制反应时间使断裂反应不充分进行,然后对四组反应产物进行电泳并检测放射性,化学试剂对碱基的识别情况及检测结果如图丙(只显示含有32P的条带)。③中加入的是　　　　试剂;a和b两片段长度相差　　　　个核苷酸;启动子的该序列从5'端到3'端第　　　　位核苷酸发生了甲基化。  12.(2026·四川,19,11分,难度★★★★)肿瘤的快速增殖使其内部缺氧,有人将普拉梭菌fp基因转入兼性厌氧大肠杆菌(E.coli),构建工程菌E.coli-fp并评估其抗肿瘤效果,部分操作如图1所示。回答下列问题。 图1 (1)DNA连接酶可催化fp基因与载体之间生成　　　　键,连接形成重组质粒。工程菌E.coli-fp表达的产物中His标签可被抗体识别。将His标签置于fp基因后并融合表达,目的是　  　。  (2)PD-1抗体是一种抗癌药物。为分析FP蛋白对肿瘤的疗效,有人开展了相关实验,结果如图2,请评价FP蛋白和PD-1抗体对肿瘤的治疗效果    　。  图2　图3 图4 (3)色谱分析可区分不同的小分子,同一分子会在固定时间出现峰值。向ATP或GTP溶液中加入FP蛋白,反应后的色谱分析结果如图3所示。FP蛋白的反应底物是　。  (4)有人将E.coli或含厌氧启动子的工程菌E.coli-fp注射到小鼠尾静脉,证明E.coli-fp具有抗肿瘤作用。据图4分析,用His标签抗体杂交,检测到的组1是　　　　(填“E.coli”或“E.coli-fp”);兼性厌氧大肠杆菌主要在肿瘤中存活并增殖,原因可能是　    　。  综合分析,E.coli-fp能有效治疗肿瘤的作用机制是    　。  13.(2026·湖南,21,12分,难度★★★★)阿尔茨海默病患者大脑中β-淀粉样蛋白(Aβ)异常聚集,损伤神经元。为了探索治疗该疾病的新方法,研究人员合成了一种嵌合抗原受体(CAR)基因,使其在星形胶质细胞中特异性表达,形成CAR-A细胞,并鉴定了这种细胞特异性识别、吞噬和降解Aβ聚集体的能力。回答下列问题。 (1)CAR基因和病毒载体的部分结构(含限制酶切割位点)分别如图a、b所示。 图a 图b ①胞外识别区应选用Aβ聚集体的　　　　　(填“抗原”或“抗体”)特定片段编码序列。  ②采用特异性启动子的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。同时,为使该CAR基因正确插入病毒载体,并能通过绿色荧光蛋白(GFP)示踪其成功导入星形胶质细胞,应选用的两种限制酶是　　　　　　　　。  (2)为鉴定CAR-A细胞能吞噬和降解Aβ聚集体,可用含Aβ聚集体的培养基培养CAR-A细胞,一段时间后更换不含Aβ聚集体的培养基继续培养,　　　(单选)的Aβ聚集体含量。  A.24 h检测细胞内 B.24 h检测细胞外 C.0 h和24 h检测细胞内 D.0 h和24 h检测细胞外 (3)给6月龄阿尔茨海默病模型小鼠注射携带CAR基因的病毒,3个月后,大脑Aβ聚集体减少,且神经元损伤标志蛋白的相对表达量下降。该实验对照组应注射　　　　　　　　　　　　　　;该实验结论是　  　。  14.(2026·安徽,20,11分,难度★★★★)肿瘤化疗通过诱导肿瘤细胞的DNA损伤,引发肿瘤细胞死亡。肿瘤细胞会激活DNA损伤修复途径,导致肿瘤对化疗药物耐药。为探究P基因在乳腺癌中的作用机制,科研人员进行了相关研究。回答下列问题。 (1)培养细胞时,若恒温培养箱内CO2不足,会导致培养液　　　　异常;乳腺癌细胞培养时　　　　(填“会”或“不会”)出现接触抑制现象;细胞传代培养时需要用胰蛋白酶处理,使贴壁细胞分散成单个细胞,操作时需要控制处理时间,原因是　  　。  (2)P基因及转录方向、质粒图谱及目的基因插入位点的相关信息如图1所示(实线方框内横线处表示限制酶的识别序列,箭头处表示酶切位点)。为构建重组质粒,扩增P基因时,应选择的一对引物为　　　　(填图2中序号)。为探究P基因对乳腺癌细胞增殖的影响,将重组质粒导入乳腺癌细胞的处理组作为实验组,对照组的处理是　  　　　　　　　　　　。  图1 ①5'-……GGATCCAGGCAT-3' ②5'-……AGATCTTCCGTA-3' ③5'-……AGATCTAGGCAT-3' ④5'-……ACTAGTCCGTGT-3' ⑤5'-……ACTAGTGGCACA-3' ⑥5'-……AAGCTTCCGTGT-3' 图2 (3)S基因主要通过抑制DNA损伤修复途径来抑制肿瘤增殖,引发肿瘤细胞死亡。研究发现,P蛋白能诱导S基因的启动子甲基化。这表明P基因　　　　S基因的转录,　　　　肿瘤耐药(均填“促进”或“抑制”)。  15.(2026·河南,21,10分,难度★★★★)4-α糖基转移酶(4αGT)在工业生产中发挥重要作用。为实现产业化生产,研究人员利用双酶切法,从重组克隆载体(仅用于目的基因的复制和保存)中获取目的基因,连入表达载体,构建了高效表达4αGT的工程菌,流程如图1所示。回答下列问题: 图1 (1)为确保目的基因正常复制,重组克隆载体和重组表达载体均应含有的元件为　　　　　。为确保目的基因正常表达,相较于重组克隆载体,重组表达载体目的基因两端的元件除启动子外,还有　　　　　,作用为　  　。  (2)根据限制酶识别序列和切割位点,以及目的基因片段的黏性末端(图1),判断所使用的限制酶1是　　　　　,限制酶2是　　　　　　　。  (3)琼脂糖凝胶电泳中,DNA分子大小与迁移速率成反比。为检验重组表达载体是否构建成功,用限制酶1和限制酶2切割后,进行电泳鉴定。构建成功的重组表达载体酶切产物的电泳结果如图2所示,条带　　　(填“a”或“b”)对应目的基因片段,理由是　  　。  图2 (4)将重组表达载体导入受体细胞,获得的工程菌接入液体培养基中培养。定时检测培养液中4αGT的含量,结果如图3所示。阶段2中4αGT含量迅速升高的原因可能是  　(答出一点即可)。  图3 16.(2026·陕晋宁青,21,11分,难度★★★★)研究人员筛选天然抗虫蛋白时发现,棉铃虫取食过表达J蛋白的棉花植株后会死亡,然而棉花细胞核中积累过量的J蛋白会导致棉花不育。我国科学家运用基因工程技术,构建了一种新型抗虫棉。回答下列问题。 (1)当转入的外源J基因与棉花内源J基因序列相同时,可能会抑制J基因在细胞内的表达。为避免该问题,基于密码子的　　　　　性,可设计与内源J基因序列不同但编码氨基酸序列相同的外源J基因(J*)。确定获得的J*基因是否与设计相符的方法是　　　(选填序号:①PCR;②琼脂糖凝胶电泳;③测序并序列比对)。  (2)为解决过表达J蛋白导致的棉花不育问题,按照蛋白质工程的设计思路,利用下图所示载体,构建仅在棉铃虫啃食后才表达J*蛋白的抗虫棉。在该载体中,启动子P属于　　　　　型启动子,棉铃虫啃食后,棉花细胞中的　　　　　酶与启动子P结合,启动融合基因S-J*表达,之后检测到J*蛋白在细胞外积累,则S-J*融合蛋白中信号肽S的作用是　。  (3)已合成的J*基因两端仅含有对应的限制酶识别序列,无额外碱基序列。为使J*基因插入载体并正确表达S-J*融合蛋白,需使用两种限制酶对载体进行酶切,限制酶识别序列如图,可选择的限制酶组合是　　　　　或　　　　　两种组合,原因是　  　。  (4)为获得足够的重组质粒,需对转化成功的大肠杆菌振荡培养,振荡培养的原因是  　。  可利用　　　　　法将融合基因导入棉花茎尖细胞,进而获得植株。棉铃虫在啃食抗虫棉后,J*蛋白会进入肠道细胞核中,　　　　　(填“促进”或“抑制”)组蛋白去乙酰化酶的活性,组蛋白乙酰化水平升高,诱导肠细胞凋亡,棉铃虫死亡。  17.(2025·天津,16,12分,难度★★★)内共生假说认为,线粒体起源于在厌氧真核细胞中共生的需氧细菌。研究人员将经过改造的大肠杆菌导入相应的专性厌氧酵母细胞质中构建共生体,为上述假说提供证据。 (1)获得专性厌氧呼吸的酵母菌株利用基因敲除技术破坏酵母菌　　　　的功能,导致该细胞器不能产生ATP。  (2)获得维生素B1营养缺陷且能分泌ATP的大肠杆菌菌株: ①利用基因敲除技术获得维生素B1营养缺陷型大肠杆菌菌株A; ②构建含有ATP转运蛋白基因X的质粒2。 已知在基因X和质粒1上均无EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点。研究者采用引物P1(含EcoRⅠ识别序列)和P2(含NotⅠ识别序列)对基因X进行扩增,并采用引物P3(含EcoRⅠ识别序列)和P4(含NotⅠ识别序列)对质粒1进行扩增,使质粒1线性化,再经酶切、连接,使基因X与质粒1重组为质粒2。请在下图质粒1处标出引物P3和P4的位置及方向。 ③将质粒2转入菌株A中,筛选获得菌株B。 (3)采用下图所示过程将菌株B导入步骤(1)获得的酵母菌中,筛选获得融合菌株 促进膜融合的化学试剂通常选择　　　　。大肠杆菌细胞壁为双层结构,内层为坚固的肽聚糖,外层为脂质双分子层膜结构。融合细胞中的大肠杆菌形态正常且具有活性,说明与酵母细胞膜融合的是菌株B的　　　　。在以丙酮酸为唯一碳源的选择培养基上筛选到能够增殖的融合菌株,其中酵母菌为大肠杆菌提供　　　　,大肠杆菌为酵母菌提供　　　　,表明二者建立了互利共生关系。在筛选融合菌株时,不能用葡萄糖为碳源,原因是:　  　。  18.(2025·山东,25,12分,难度★★★)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造,利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中,筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比,突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 注LB/RB为T-DNA的边界序列;Kanr为卡那霉素抗性基因;bp为碱基对。 甲　Ti质粒与抗除草剂基因信息 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为　　　　　　。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切,再选择SmaⅠ和　　　　　对Ti质粒进行完全酶切,将产生的黏性末端补平,补平时使用的酶是　　　　　　　。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接,构建重组载体,转化大肠杆菌;经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶　　　　　进行完全酶切并电泳检测,若电泳结果呈现一长一短2条带,较短的条带长度近似为　　　　bp,则一定为正向重组质粒。  (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入小麦基因组中同一基因导致的,提取基因组DNA,经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中,限于后续PCR难以扩增大片段DNA,最好使用识别序列为　　　　(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶,且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段　　　　　　　,才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后,进行了一系列操作,其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为　　　　　　　　　　　　　　　(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。  注P1、P2表示引物。 乙　基因组DNA酶切后含T-DNA的片段 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株,如果检测到野生型基因,　　　　(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。  19.(2025·福建,20,12分,难度★★★★)为建立一种效率高、毒性小的基因敲除系统,将图1所示的质粒1和质粒2导入大肠杆菌,质粒2中的sgRNA基因依据目的基因设计,其转录的短链RNA通过与目的基因碱基互补配对,与Cas9蛋白共同作用,敲除大肠杆菌基因组中的目的基因。 图1 图2 回答下列问题: (1)大肠杆菌LacZ基因的表达产物可催化X-gal生成蓝色物质从而使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色。将质粒1与含LacZ基因相应sgRNA基因的质粒2同时转化到大肠杆菌中,涂布到含抗生素　　　　　　　　的平板(含有X-gal)上进行培养。若长出的是　　　　色菌落则为LacZ基因被敲除的大肠杆菌。  (2)Cas9基因的表达量会影响敲除效率,但其过量表达会对大肠杆菌有毒。为评估毒性和敲除效率,用5种启动子(A、B、C、D和E)启动Cas9的转录,相应检测结果如图2所示。结果表明,启动子　　　　对细胞毒性最小;综合考量毒性和敲除效率,应选用启动子　　用于该系统。  (3)含有质粒的大肠杆菌在无抗生素选择压力下培养,少数子代细胞会丢失质粒。结合质粒1和质粒2的特点,在成功敲除LacZ基因的大肠杆菌中消除质粒1和质粒2,实验流程如图3所示。 图3 ①培养12小时后,图3试管1中大部分的大肠杆菌　　　　(填选项)。  A.含质粒1和质粒2　B.只含质粒1 C.只含质粒2 D.无质粒1和质粒2 ②若要从图3平板上筛出质粒1和质粒2均被消除的大肠杆菌,简要写出实验思路和预期结果:  　。  20.(2025·海南,20,13分,难度★★★★)绵羊的羊毛长度与毛囊细胞的增殖有关,毛囊细胞中表达的基因Z可能是调控羊毛长度的关键基因。某团队利用基因工程技术,探究了基因Z对绵羊毛囊细胞X增殖的影响。回答下列问题。 (1)质粒甲保存有目的基因Z,如图1。质粒乙有4种限制酶的酶切位点,识别序列见表。现需将质粒甲中的基因Z插入质粒乙中,构建重组质粒乙用于研究,须用的限制酶是　　　　和　　　　。  图1 限制酶 识别序列(5'-3') EcoRⅠ GAATTC SalⅠ GTCGAC BglⅡ AGATCT XhoⅠ CTCGAG (2)细胞X是一种贴壁细胞,可用　　　　(填“固体”或“液体”)培养基培养。在进行传代培养时,需使用胰蛋白酶并置于37 ℃环境中处理,理由是　  　。  (3)将空质粒乙和重组质粒乙分别导入细胞X,导入后测定不同时间的细胞数量,结果如图2。根据实验结果说明基因Z的表达对细胞增殖有　　　　作用,且随导入时间推移,增殖速率　　　　。  图2 (4)siRNA是一种短的双链RNA,能引导内切核酸酶切割靶基因的mRNA。 ①人工合成靶向基因Z的siRNA,将其导入细胞X作为实验组,同时设置对照组,将　　　　　　　导入细胞X。一段时间后,发现实验组细胞数量少于对照组。该实验的目的是探究基因Z的　　　　对细胞X增殖的影响。  ②为检测靶向基因Z的siRNA导入细胞X后能否发挥作用,简要写出在分子水平上检测的2种实验思路是:      　。  21.(2025·云南,21,10分,难度★★★)我国研究人员发明了生产维生素C的两步发酵法,流程如图甲。为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖,需要进行灭菌以结束第一步发酵。 甲 　　在两步发酵法的基础上,我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌(原始菌MCS)中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB,得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时,活菌数变化曲线如图乙,MCS、IR3C分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时,产物含量变化曲线如图丙。 乙 丙 回答下列问题: (1)要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用,构建的基因表达载体除启动子外,还必须有　。  (2)绘制图乙需统计活菌数,常用方法是　　　　　　。当活菌达到一定数量时,基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用,推测该蛋白质的作用是　　　　　　　　　　,开始发挥作用的时间是　　　　　,判断理由是　　　　　　　　　　　　　　　。  (3)基于图丙,利用IR3C三菌混菌发酵的产量　　　　　(填“高于”或“低于”)MCS三菌混菌发酵的产量,其原因是　    　。  22.(2025·重庆,19,10分,难度★★★)绝大多数哺乳动物生来怕辣,而小型哺乳动物树鼩先天不怕辣,喜食含辣椒素类物质的植物。为探究其原因,我国研究人员进行了系列研究。 (1)研究发现,树鼩的受体蛋白TR1对辣椒素的敏感性低于其他哺乳动物。为研究树鼩和其他哺乳动物TR1蛋白的差异,可设计开展如下实验: ①　　　　　　　　　　　　　　　　　;  ②将　　　　　　　分别进行酶切并连接;  ③将重组DNA分子导入大肠杆菌; ④分离表达的TR1蛋白后,测定　　　　　　,明确蛋白之间的差异。  (2)树鼩及一些哺乳动物的TR1蛋白存在差异,如图所示。据分析,树鼩对辣椒素的敏感性降低,很可能是由TR1第579位氨基酸差异造成的,可证实该推测的实验思路是  　。  (3)树鼩与其喜食植物的地理分布基本一致,据此可推测树鼩对含辣椒素类物质植物的适应形成的必要条件是  　。  23.(2025·四川,19,11分,难度★★★)杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合,阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA~lrcF)导入链霉菌,基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。 注:①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物,“→”指引物5'—3'方向。②密码子对应的氨基酸:AAA—赖氨酸;AUG—甲硫氨酸(起始);UUC—苯丙氨酸;ACA—苏氨酸;UCG—丝氨酸。 (1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA~lrcF目的基因时,应选用　　　　　引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点,其目的是　。  (2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生　　　　　条电泳条带,电泳检测酶切产物的目的是　。  (3)由图可知,拉索西丁与核糖体结合后,会阻止携带　　　　　(填氨基酸名称)的tRNA进入结合位点,导致　  　,最终引起细菌死亡。  (4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性,但重组菌在实验室多次培养后,提取的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是　　　　　　　　　　。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一步研究的问题有　　　　　　　　　　(答出1点即可)。  24.(2025·湖南,21,13分,难度★★★★)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒,可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A,其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题: (1)制备特定抗原 ①获取基因A,构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和　　　　　等;为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,应选用图中的一对引物　　　　　对待测质粒进行PCR扩增,预期扩增产物的片段大小为　　　　　bp。  注:P1、P2、P3表示引物。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌,诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心,发现上清液中无蛋白A,可能的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点即可)。  (2)制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后,将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,诱导融合的常用方法有　　　　　(答出一种即可)。选择培养时,对杂交瘤细胞进行克隆化培养和　　　　　　,多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体,可用于非洲猪瘟的早期诊断。  25.(2025·河南,21,11分,难度★★★)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖,可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题: (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是　。  将培养后的菌液混匀并充分　　　　,再接种至微孔板中,经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。  (2)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1),对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切,随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率,cg转录模板链的5'端最好含有　　　　酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验,获得的部分重组质粒分子大小符合预期,但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割,其原因是　  　。  限制酶的识别序列和切割位点如下: 图1 (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌,需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,目的是　　　　　　　　　　　　　　　,随后在含　　　　和　　　　的培养基中培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。  (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键,从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性,研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键),如图2所示。根据分析结果,选择第　　　　位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适,原因是　  　。  注虚线长度代表氨基酸间的空间距离图2 26.(2025·河北,22,14分,难度★★★★)为治理水体中对生物有毒害的镉污染,研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体,转入单细胞衣藻,实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁,以吸附水体中的镉离子。回答下列问题。 (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中,随着PCR反应进行,分子数量逐渐减少的是　　　　和　　　　。模板与引物在PCR反应的　　　　阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,其原因为    　。  (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时,为避免错误连接,需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列,其中GP1两端应添加　　　　　　　　(填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时,可催化载体和目的基因之间形成　　　　　键。  图1 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为　　　　　　　　　　　　　　　　,初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后,若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量　　　　　,则表明融合蛋白能结合镉离子。  (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6 d后,检测细胞密度,结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是  　。  240 μmol/L镉离子浓度下,转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是    　。  注镉离子对渗透压的影响忽略不计。 图2 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理,与施加化学药物法相比,能体现出其环境治理优势的两个特性是　　　　　和　　　　　。(填标号)  ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖 ②衣藻生长速率受镉离子浓度影响 ③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质 ④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 27.(2025·陕晋宁青,21,10分,难度★★★)马铃薯作为重要农作物,提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现,野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关,将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 (1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、　　　　　　　　、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的　　　　　　步骤中起作用。  (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的　　　　　(填“5'端”或“3'端”)添加限制酶识别序列,结合上表分析,上游引物应添加的碱基序列是5'-　　　　　　　　-3',切割载体时应选用的两种限制酶是　　　　　　　　。PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后,经纯化和连接,获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。  (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到　　　　　上,抗性基因　　　　可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经　　　　　形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。  28.(2025·甘肃,21,11分,难度★★★)水稻白叶枯病(植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑)由白叶枯病菌引起,严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术,对水稻白叶枯病的感病基因SWEET(该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻)的启动子区进行了定点“修改”,编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株(如下图)。回答下列问题。 (1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后,可通过　　　　　　　　(方法)将该质粒转入植物细胞,并将　　　　　　　　　　整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞,需要在植物组织培养基中添加　　　　。　   (2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为　　　　　,对其消毒时需依次使用酒精和　　　　　处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素,原因是  　。  (3)为了检测基因编辑水稻是否成功,首先需采用　　　　　技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑;然后,在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌,通过比较　　　　　来验证抗病性。  (4)在该研究中,基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为  　。  29.(2024·天津,16,14分,难度★★★★)金黄色葡萄球菌(简称Sa)是人体重要致病细菌,不规范使用抗生素易出现多种抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有  　(至少答出2点)。  (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测,以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2,然后通过同源重组(质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对,并发生交换)敲除Sa的R基因。 Sa部分基因组 注1 kb=1 000碱基对;Y是可被脱水四环素(不作为 抗生素起作用)诱导表达的Sa致死基因。 图1 ①根据图1信息,简述质粒2的构建过程(需包含所选引物和限制酶):  　,  然后回收上、下游片段,再与Sac Ⅱ酶切质粒1所得大片段连接,获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa,然后涂布在含　　　　　　的平板上,经培养获得含质粒2的Sa单菌落。  ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的概率,随后稀释涂布在含　　　　的平板上,筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体,依次接种到含　　　　的平板上,若无法增殖,则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。  ④以③获得的菌株基因组为模板,采用不同引物组合进行PCR扩增,电泳检测结果如图2,表明R基因已被敲除的是　　　(单选)。  图2 30.(2024·山东,25,12分,难度★★★★★)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L,可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列,将载体导入大豆细胞后,其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 图甲:载体信息 LB/RB:T-DNA的边界序列;Kanr:卡那霉素抗性基因;Ampr:氨苄青霉素抗性基因 图乙:目标基因L部分序列 图丙:限制酶识别序列、切割位点及电泳结果 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时,所用的引物越短,引物特异性越　　　　(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时,形成的单链突出末端为黏性末端,若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有　　　　种。载体信息如图甲所示,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5'-　　　-3'和5'-　　　　-3'。  (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞,使用抗生素　　　　　筛选到具有该抗生素抗性的植株①~④。为了鉴定基因编辑是否成功,以上述抗性植株的DNA为模板,通过PCR扩增目标基因L,部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示,PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是　　　　　,其中纯合的突变植株是　　　　　(填序号)。  (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株,该植株具有抗生素抗性,检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代,其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为　　　　,筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。  31.(2024·江苏,23,12分,难度★★★★)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD),科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50,以融合表达SOD-ELP50蛋白,过程如图1。其中,ELP50是由人工合成的DNA片段,序列为:限制酶a识别序列-(GTTCCTGGTGTTGGC)50-限制酶b识别序列,50为重复次数。请回答下列问题。 图1 (1)步骤①双酶切时,需使用的限制酶a和限制酶b分别是　。　　　　　　　  (2)步骤②转化时,科研人员常用　　　　处理大肠杆菌,使细胞处于感受态;转化后的大肠杆菌采用含有　　　　　　的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌,应选用的一对引物是　　　　　　。  (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与　　　　结合,驱动转录,翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa,将表达的蛋白先进行凝胶电泳,然后用SOD抗体进行杂交,显示的条带应是　　　　(从图2的“A~D”中选填)。  图2 (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法,科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响,部分结果如图3。 图3 (ⅰ)20 ℃时,加入NaCl后实验结果是  　。  (ⅱ)100 ℃时,导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是　。  (ⅲ)据图分析,融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有  　。  32.(2024·广西,21,14分,难度★★★★)M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠,主要制备流程见下图。实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列,同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因(M-GFP)的表达,恢复小鼠自身被敲除的M基因功能,同时便于示踪。回答下列问题。 注基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条,即可表示为Aa;两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。 (1)在PCR扩增片段①和②时,通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列,该序列添加的位置位于引物　　　　(填“3'端”或“5'端”)。在构建载体1时,为了阻断A基因的表达,从转录水平考虑,连接的片段可以是　　　　　　　　　　;而从翻译水平考虑,连接的片段可以是　　　　　　　　　　。为了鉴定载体2是否构建成功,需要限制酶切割载体后,再进行　　　　　。  (2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液,其目的是  　(至少答2方面)。  (3)为了快速高效繁育出含有4对基因(遵循自由组合定律)的实验模型小鼠,应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交,杂交获得的子代,再进行一代杂交后最终获得基因型为　实验模型小鼠。  (4)为了实现M基因的表达可控,在实验模型小鼠喂食时,可添加竞争性结合A蛋白的四环素,抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比,目的是      　。  33.(2024·重庆,19,11分,难度★★★★)大豆是重要的粮油作物,提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现,基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小),然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列,并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是  　　　　。  (2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时,为保证目标序列的完整性,不宜使用的限制酶是　　　　　;此外,不宜同时选用酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ,原因是　  　。  (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上,可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时,对照样品除指示分子大小的标准参照物外,还应有  　。  经验证的重组表达载体需转入农杆菌,检测转入是否成功的技术是　　　　　　　。  (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ,所得再生植株YZ-2的种子也变大,但小于YZ-1。综合分析,大豆品种DN较TL种子大的原因是  　。  34.(2024·湖南,21,13分,难度★★★★★)百合具有观赏、食用和药用等多种价值,科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题。 图a 图b 图c (1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前,先用　　　　　　　　去除细胞壁获得原生质体,使原生质体融合,得到杂种细胞后,继续培养,常用　　　　　　　　(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化,获得完整的杂种植株。  (2)单倍体育种。常用　　　　　　的方法来获得单倍体植株,鉴定百合单倍体植株的方法是　。  (3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L,该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图,其中基因gus编码GUS酶,GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL,首先选用　　　　　　　酶切,将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接,再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫,结果如图c。由此可知,三种病原微生物都能诱导pL的活性增强,其中　　　　　　的诱导作用最强。  ②现发现栽培种百合B中也有L,但其上游的启动子与野生百合不同,且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种,简要写出实验思路:    　。  35.(2024·湖北,20,16分,难度★★★★)苏云金芽孢杆菌产生的Bt毒蛋白,被棉铃虫吞食后活化,再与肠道细胞表面受体结合,形成复合体插入细胞膜中,直接导致细胞膜穿孔,细胞内含物流出,直至细胞死亡。科学家将编码Bt毒蛋白的基因转入棉花植株,获得的转基因棉花能有效防控棉铃虫的危害。回答下列问题。 (1)Bt毒蛋白引起的细胞死亡属于　　　　(填“细胞坏死”或“细胞凋亡”)。  (2)如果转基因棉花植株中Bt毒蛋白含量偏低,取食后的棉铃虫可通过激活肠干细胞分裂和　　　　产生新的肠道细胞,修复损伤的肠道,由此导致杀虫效果下降。请据此提出一项可提高转基因棉花杀虫效果的改进思路:    　。  (3)在Bt毒蛋白的长期选择作用下,种群中具有抗性的棉铃虫存活的可能原因是:肠道细胞表面受体蛋白的　　　　或　　　　发生变化,导致棉铃虫对Bt毒蛋白产生抗性。  (4)将Bt毒蛋白转基因棉花与非转基因棉花混种,可以延缓棉铃虫对转基因棉花产生抗性,原因是  　。  36.(2024·贵州,21,12分,难度★★★★)研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基,培养真菌A的野生型(含NV基因)、突变体(NV基因突变)和转基因菌株(转入NV基因),检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量,结果如表所示(表中“+”表示有,“-”表示无)。回答下列问题。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中) 野生型 + + + 野生型 - - - 突变体 + - - 转基因菌株 + + + (1)据表可推测　　　　诱导了NV基因表达。NV酶的作用是　  　　　　　　　　。检测NV酶活性时,需测定的指标是　　　　　　　　　　　　(答出1点即可)。  (2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板,用与　　　　　　(填“T-DNA”或“NV基因”)配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度　　　　(填“>”“=”或“<”)野生型扩增片段长度,则表明突变体构建成功,从基因序列分析其原因是　  　。  (3)为进一步验证NV基因的功能,表中的转基因菌株是将NV基因导入　　　　细胞获得的。在构建NV基因表达载体时,需要添加新的标记基因,原因是　  　。  37.(2024·甘肃,21,11分,难度★★★★)源于细菌的纤维素酶是一种复合酶,能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率,某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株,克隆表达降解纤维素的三种酶(如下图),研究了三种酶混合的协同降解作用,以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。 (1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X,能起到筛选作用的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。高产纤维素酶菌株筛选时,刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了  　。  (2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是　　　　　　　　　　　　　　　　。  (3)过程⑤在基因工程中称为　　　　　　　　　　　　,该过程需要的主要酶有　  　。  (4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。该过程用Ca2+处理细胞,使其处于一种　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　的生理状态。  (5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理,结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是  　(答出两点)。  生物质 原料 降解率/% 协同系数 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2 小麦 秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64 玉米 秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02 玉米 芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34 注混1和混2表示三种酶的混合物。 38.(2023·天津,17,10分,难度★★★★★)基因工程:制备新型酵母菌 (1)已知酵母菌不能吸收淀粉,若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵,则应导入多步分解淀粉所需的多种酶,推测这些酶生效的场所应该是　　　　　　　(填“细胞内”或“细胞外”)。  (2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时,就可以发生同源切割,将目的基因直接插入。研究人员运用同源切割的方式,在目的基因两端加上一组同源序列A.B,已知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图,则应选择图中的引物　　　　　　对目的基因进行PCR。  (3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶,因此尿嘧啶合成基因(UGA)常用作标记基因,又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。 (i)导入目的基因的酵母菌应在　　　　的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因,需要多次筛选,因此在导入一种目的基因后,要切除UGA基因,再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C.C'序列,以便对UGA基因进行切除。C.C'的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式,进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连,如图,则应选择方式　　　　进行连接。  方式一 方式二 (ii)切去UGA基因的酵母菌应在　　　　　　的培养基上筛选培养。  (4)综上,目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图　　　　　。  图1 图2 图3 图4 39.(2023·山东,25,10分,难度★★★)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。 甲 乙 (1)与图甲中启动子结合的酶是　　 　　　　。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有　  (答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物　　　　　　　　　。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的　　　　(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。  (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了　　　　　　　　　,条带2所检出的蛋白　　　　(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。  40.(2023·江苏,22,12分,难度★★★★)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题。 图1 (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有　　　　　,扩增程序中最主要的不同是　　　　　　。  (2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用　。  EGFP基因序列:5'ATGGTGAGCAAGGGC………GACGAGCTGTACAAG3' AnB1基因序列:5'CATGTCCAGCTGCAG………CCAAAACCACAACCA3' 图2 A.ATGGTG………CAACCA B.TGGTTG………CACCAT C.GACGAG………CTGCAG D.CTGCAG………CTCGTC (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有  　　　　　　　　　　。  (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有　　　　。  A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有　　　　。  图3 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是    　。  41.(2023·广东,20,14分,难度★★★★)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。回答下列问题。 (1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确实由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与　　　　植株的种子大小相近。  (2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性内切核酸酶对PCR产物和　　　　　进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备　　　　　　　。  (3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图),用于后续验证突变基因与表型的关系。 ①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了　　　　　　　　　　　　　。  ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约　　　　　%的培养基中幼苗继续培养。  ③将②中选出的T2代阳性植株　　　　　　　　(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到　　　%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。  为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性内切核酸酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见下图,在答题卡电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。 42.(2022·天津,15,10分,难度★★★)研究者拟构建高效筛选系统,将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌,以提高苯丙氨酸产量。 (1)上图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和SacB两个标记基因,为去除筛选效率较低的SacB,应选择引物　　　　和　　　　,并在引物的　　　　(填“5'”或“3'”)端引入XhoⅠ酶识别序列,进行PCR扩增,产物经酶切、连接后环化成载体2。  (2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时,引物应包含　　　　　　　(填“EcoRⅠ”“HindⅢ”或“XhoⅠ”)酶识别序列,产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。  (3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株,应采用含有　　　　的平板进行初步筛选。  (4)用一定的方法筛选出如下菌株:P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA,且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为　　　　。  A.卡那霉素不敏感、链霉素敏感 B.卡那霉素敏感、链霉素不敏感 C.卡那霉素和链霉素都敏感 D.卡那霉素和链霉素都不敏感 (5)可采用　　　　技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。  考点73DNA的粗提取与鉴定及PCR技术　　答案P490　 1.(2025·四川,5,3分,难度★★)下列以土豆为材料的实验描述,错误的是 (　　) A.土豆DNA溶于酒精后,与二苯胺试剂混合呈蓝色 B.向土豆匀浆中加入一定量的碘液后,溶液会呈蓝色 C.利用土豆匀浆制备的培养基,可用于酵母菌的培养 D.土豆中的过氧化氢酶可用于探究pH对酶活性的影响 2.(2025·湖南,2,2分,难度★★)用替代的实验材料或者试剂开展下列实验,不能达成实验目的的是 (　　) 选项 实验内容 替代措施 A 用高倍显微镜观察叶绿体 用“菠菜叶”替代“藓类叶片” B DNA的粗提取与鉴定 用“猪成熟红细胞”替代“猪肝细胞” C 观察根尖分生区组织细胞的有丝分裂 用“醋酸洋红液”替代“甲紫溶液” D 比较过氧化氢在不同条件下的分解 用“过氧化氢酶溶液”替代“肝脏研磨液” 3.(2024·山东,5,2分,难度★★★★)制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有 (　　) 反应管 加入的单链DNA ① 5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A.①②　　B.②③　　C.①④　　D.③④ 4.(2024·山东,13,2分,难度★★)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是 (　　) A.整个提取过程中可以不使用离心机 B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中 C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 5.(2024·广东,4,2分,难度★★)关于技术进步与科学发现之间的促进关系,下列叙述正确的是(　　) A.电子显微镜的发明促进细胞学说的提出 B.差速离心法的应用促进对细胞器的认识 C.光合作用的解析促进花期控制技术的成熟 D.RNA聚合酶的发现促进PCR技术的发明 6.(2024·河北,13,2分,难度★★)下列相关实验操作正确的是 (　　) A.配制PCR反应体系时,加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 B.利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后,在紫外灯下观察结果 C.将配制的酵母培养基煮沸并冷却后,在酒精灯火焰旁倒平板 D.将接种环烧红,迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养,获得单菌落 7.(2024·湖南,15,4分,难度★★★)(多选)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则,以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列,结果如图所示。下列叙述正确的是 (　　) A.上述PCR反应体系中只加入一种引物 B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢 C.5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 8.(2024·安徽,14,3分,难度★★)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是 (　　) A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低 B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 9.(2022·山东,13,2分,难度★★)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是 (　　) A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质 10.(2021·山东,13,2分,难度★★)粗提取DNA时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是 (　　) A.加入适量的木瓜蛋白酶 B.37~40℃的水浴箱中保温10~15分钟 C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精 D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L 11.(2025·北京,21,11分,难度★★★★)学习以下材料,回答(1)~(4)题。 野生动物个体识别的新方法 　　识别野生动物个体有助于野外生态学的研究。近年,人们发现可以从动物粪便中提取该动物的DNA,PCR扩增特定的DNA片段,测定产物的长度或序列,据此可识别个体,在此基础上可以获得野生动物的多种生态学信息。 　　微卫星DNA是一种常用于个体识别的DNA片段,广泛分布于核基因组中。每个微卫星DNA是一段串联重复序列,每个重复单位长度为2~6 bp(碱基对),重复数可以达到几十个(图1)。基因组中有很多个微卫星DNA,分布在不同位置。每个位置的微卫星DNA可视为一个“基因”,由于重复单位的数目不同,同一位置的微卫星“基因”可以有多个“等位基因”,能组成多种“基因型”。分析多个微卫星“基因”,可得到个体特异的“基因型”组合,由此区分开不同的个体。 　　依据微卫星“基因”两侧的旁邻序列(图1),设计并合成特异性引物,PCR扩增后,检测扩增片段长度,即可得知所测个体的“等位基因”(以片段长度命名),进而获得该个体的“基因型”。例如,图2是对某种哺乳动物个体A和B的一个微卫星“基因”进行扩增后电泳分析的结果示意图,个体A的“基因型”为177/183。 图1 图2 　　有一个远离大陆的孤岛,陆生哺乳动物几乎无法到达,人类活动将食肉动物貉带到该岛上。科学家在岛上采集貉的新鲜粪便,提取DNA,扩增并分析了10个微卫星“基因”,结果在30份样品中成功鉴定出个体(表1)。几个月后再次采集貉的新鲜粪便,进行同样的分析,在40份样品中成功鉴定出个体(表1)。据此,科学家估算出该岛上貉的种群数量。 表1　两次采样所鉴定出的貉的个体编号 第一次采集的30份粪便样品所对应的个体编号 N01 N02 N03 N04 N05 N06 N07 N08 N08 N09 N10 N11 N12 N12 N13 N14 N14 N15 N16 N17 N18 N18 N19 N20 N21 N22 N22 N23 N24 N24 第二次采集的40份粪便样品所对应的个体编号 N03 N04 N05 N08 N09 N09 N12 N14 N18 N23 N24 N25 N26 N26 N26 N27 N28 N29 N30 N30 N31 N32 N32 N33 N33 N33 N34 N35 N36 N37 N38 N39 N40 N41 N42 N43 N44 N44 N45 N46 (1)图2中个体B的“基因型”为　　　　　　。  (2)使用微卫星DNA鉴定个体时,能区分的个体数是由微卫星“基因”的数目和　　　　　　的数目决定的。  (3)科学家根据表1信息,使用了　　　　　法的原理来估算这个岛上貉的种群数量,计算过程及结果为　      　。  (4)在上述研究基础上,利用现有DNA样品,设计一个实验方案,了解该岛貉种群的性别比例。 12.(2025·江苏,23,14分,难度★★★★)川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种,为了更好地保护这一物种,研究者开展了以下研究。请回答下列问题。 (1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能,这说明生物之间的关系有　　　　　　。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息,信息类型有　　　　　　　　　　　　　　　　　。川金丝猴根据这些信息及时作出反应,一方面可以降低被捕食风险,另一方面为争夺　　　　　获得更多机会。  (2)川金丝猴以植食为主,消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化,这些微生物与川金丝猴构成　　　　　　　　关系。  (3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性,采集其粪便样本,进行DNA提取、扩增,部分实验过程如下。请完成下表: 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取①　　　　　　　　,加入乙醇  ②　　　　  在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③　　　　　　　　　　　　　　、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入PCR管中,进行PCR  (4)为分析川金丝猴摄食的植物种类,研究者设计一对引物F和R,能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbcL基因片段,是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基　　　　　　　。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序,结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析,能检出的样本是　　　　　　　　　　。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序,得到的序列有图中的3种序列,据此可确定川金丝猴一定摄食的植物有　　　。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物,参照叶绿体基因库,还需选用　　　　的保守序列设计引物,对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。  注“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基;“……”表示省略200个碱基。 (5)依据上述研究,保护川金丝猴可采取的措施有　　　　(填字母)。  a.建立川金丝猴生态廊道,促进种群间基因交流 b.保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物 c.需用标记重捕法定期重捕,以精确监测种群数量 d.主要依赖迁地保护,扩大川金丝猴种群数量 13.(2025·安徽,20,11分,难度★★★★)稻瘟病是一种真菌病害,水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌,并开展了相关研究。回答下列问题。 (1)采集有病斑的水稻叶片,经表面消毒、研磨处理,制备研磨液。此后,采用　　　　　　　　　　　　　(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基,分别置于不同温度下培养,目的是　  　。  (2)经筛选获得一株内生放线菌,该菌株高效合成铁载体小分子,能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株,探究铁载体的功能。主要步骤如下:首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D;然后构建重组质粒;最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理,对目标基因进行敲除。如图1所示。 图1 图2 说明:用图1中的引物1和2进行PCR扩增。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步,反复循环,可实现基因片段的　　　　　。R基因敲除过程中,可发生多种形式的同源区段交换,PCR检测结果如图2所示,其中R基因敲除株为菌落　　　　　　(填序号),出现菌落④的可能原因是　。  (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用,从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测,简要写出实验思路。 14.(2022·江苏,24,12分,难度★★★)纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引起多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。 (1)纤毛结构如图Ⅰ所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由　　　　　　组成。基体由中心体转变而来,中心体在有丝分裂中的功能是　  　。  图Ⅰ (2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是　。  PCR扩增时,需在　　　　　　　催化下,在引物　　　　　端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。  (3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcoRⅤ位点插入片段)。请完成下表。 图Ⅱ 图Ⅲ 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y-M(图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头,代表方向) ①选择图Ⅱ引物　　　　;  ②PCR目的产物约为　　　　bp。  确保M及连接处序列正确,Y-M的连接处上游含有Hind Ⅲ+EcoR Ⅴ的识别序列,下游含有EcoR Ⅴ+BamH Ⅰ的识别序列 ③质粒测序,图Ⅲ中正确的是　　　　(选填序列编号)  检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光,而实验组荧光集中在纤毛基部,说明  　。  (4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经　　　　形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的　　　　倍。  考点74基因工程的应用及蛋白质工程答案P492　 1.(2026·云南,16,3分,难度★★★)内含肽(Int)可通过自我催化实现自我切除并无痕连接两侧肽链。构建编码“内含肽+X蛋白”和“内含肽+Y蛋白”的基因,将其导入真核细胞表达后,内含肽自我切除生成X+Y融合蛋白,如图所示。 下列说法正确的是 (　　) A.构建X+Y融合蛋白基因导入细胞,会因碱基序列相互影响而使蛋白功能异常 B.内含肽序列需嵌入X蛋白的功能结构内,以保证获取的融合蛋白功能正常 C.不同内含肽之间通过能匹配的结构相互识别,发挥特异性切除和连接作用 D.为X+Y融合蛋白提供“内含肽+某蛋白”,可赋予X+Y融合蛋白新的结构 2.(2026·湖南,7,2分,难度★★)将物种A的启动子与物种B的生长激素基因编码序列重组,导入鲤鱼受精卵,获得多条转基因鱼。与对照组相比,转基因鱼生长速率加快。下列叙述错误的是 (　　) A.来源不同的启动子和基因编码序列可重新组合并表达 B.不同转基因鱼中重组生长激素基因的表达水平相同 C.外源基因整合到染色体DNA上是其在受体细胞中稳定遗传的关键 D.调控启动子活性可验证转基因鱼的生长速率与生长激素基因表达水平的关系 3.(2026·河南,13,3分,难度★★)胰蛋白酶可水解精氨酸与下一位氨基酸(脯氨酸除外)之间的肽键。抗体甲的第27、96位均为精氨酸。通过蛋白质工程将第27位替换为苯丙氨酸,第97位替换为脯氨酸。改造后的甲不被胰蛋白酶水解,并保持抗体活性。下列叙述错误的是 (　　) A.甲的设计改造需要遵循遗传信息传递的一般规律 B.胰蛋白酶不能水解改造后的甲,体现了酶的专一性 C.第96位氨基酸未被替换的原因可能是该位点与抗体功能相关 D.由于密码子的简并性,改造后编码甲的基因序列不一定改变 4.(2025·福建,10,2分,难度★★)紫杉醇是红豆杉的代谢产物,会干扰纺锤体的正常功能。科研人员利用农杆菌将紫杉醇合成的相关基因导入烟草中,实现了紫杉醇前体物质的合成。下列叙述错误的是 (　　) A.农杆菌转化前应先使用Ca2+处理烟草细胞 B.紫杉醇合成的相关基因会整合到烟草染色体DNA上 C.紫杉醇因干扰肿瘤细胞的有丝分裂而具有抗癌作用 D.该技术的突破有利于红豆杉天然资源的保护 5.(2022·江苏,6,2分,难度★★★)采用基因工程技术调控植物激素代谢,可实现作物改良。下列相关叙述不合理的是 (　　) A.用特异启动子诱导表达iaaM(生长素合成基因)可获得无子果实 B.大量表达ipt(细胞分裂素合成关键基因)可抑制芽的分化 C.提高ga2ox(氧化赤霉素的酶基因)的表达水平可获得矮化品种 D.在果实中表达acs(乙烯合成关键酶基因)的反义基因可延迟果实成熟 6.(2026·广东,20,12分,难度★★★★)疟疾是由疟原虫引起、经按蚊传播的传染病,对人类健康构成严重威胁。雌蚊成虫吸血后产卵,雄蚊不吸血。研究人员成功培育出一种转抗菌肽基因(MM-CP)按蚊。该抗菌肽仅在雌蚊吸血后高表达,可有效抑制按蚊肠道内疟原虫的发育,为疟疾防控提供了新思路。回答下列问题。 (1)构建该转基因按蚊涉及的可遗传变异类型属于　　　　。MM-CP转录形成的mRNA在翻译过程中,tRNA上的　　　　与mRNA上的密码子互补配对,将氨基酸转运至核糖体参与抗菌肽合成。  (2)研究发现,抗菌肽影响按蚊自身存活。转基因雌蚊吸血后存活率显著降低,但多数个体能在死亡前完成繁殖。推测转基因按蚊中调控MM-CP表达的启动子类型为　　　　　　。从基因传递的角度分析,选用该类启动子的原因是　  　。  为降低抗菌肽对按蚊的不利影响,运用蛋白质工程原理提出一种改造MM-CP的设计思路。   　。  (3)基于CRISPR/Cas9系统的基因驱动技术,可使特定基因从亲代到子代的遗传概率显著高于50%,从而在种群中快速扩散。研究人员培育了驱动型和非驱动型转基因按蚊(如图)。与非驱动型相比,驱动型后代中携带MM-CP的个体比例显著增加,其原因是:形成配子时,Cas9切割野生型染色体,然后  　,  使更多配子携带MM-CP。 (4)若将该驱动型转基因按蚊大范围释放,可能引发一些潜在风险。试从生物进化角度提出一种潜在风险。  　。  7.(2026·河北,22,13分,难度★★★★)黑曲霉中的淀粉酶R能直接将不经高温处理的淀粉降解为葡萄糖。R基因的表达受CreA蛋白抑制。研究者利用基因工程手段,抑制了黑曲霉CreA基因的表达,并进行了相关检测。回答下列问题。 (1)黑曲霉菌种的分离纯化应选用　　　　　(填“固体”或“液体”)培养基。  (2)细胞中具有特定结构的双链RNA可被相关酶识别并降解为小片段。RNA小片段可识别与自身序列互补的mRNA,引导该mRNA发生降解。如图1所示,为使含片段A和C的转录产物能按照　　　　　　　　原则自身折叠形成双链,扩增CreA基因D片段时,可在两个引物的　　　　　端分别添加两个限制酶识别序列。一部分PCR产物用限制酶KpnⅠ和SpeⅠ酶切连接到载体中A所在的位置,另一部分再用限制酶①和②构建到载体中C所在的位置。因此可判断,限制酶①应该是　　　　　。  载体的部分结构及其RNA产物: CreA片段D的引物及限制酶识别位点: 图1 (3)构建的基因表达载体除含有启动子、终止子和目的基因外,还需具有　　　　　基因,以使表达载体转入受体细胞后可利用　　　　　培养基筛选出转基因成功的菌株。  (4)构建的表达载体转入菌株G获得G1,将G和G1在相同且适宜的条件下培养,对其生长状况和菌液的淀粉酶活力进行检测,实验结果(图2)表明          　。(答出两点)  图2 (5)传统工艺中需对淀粉进行高温糊化、淀粉酶液化和糖化酶糖化等处理,才可获得葡萄糖。相较于传统工艺,对淀粉酶 R 的研发利用所体现的优势是      　。(答出两点)  8.(2025·黑吉辽内蒙古,25,11分,难度★★★)香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从　　　　　　中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5'端分别引入　　　　和　　　　限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用　　　　　　连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变。  图1 注M为指示分子大小的标准参照物,1~4为菌株号。 图2 (2)进一步筛选构建的质粒,以1~4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有　　　　的污染。初步判断实验组　　　　(从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是　  　。  (3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有　　　　。  a:5'…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…3' b:5'…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…3' c:5'…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…3' d:5'…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的　　　含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。   9.(2025·广东,21,11分,难度★★★★)大肠杆菌是重要工业菌株之一,其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量,使细胞适配不同阶段的生产需求,研究者设计了两种质粒,并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白,测试质粒功能。回答下列问题。 (1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2,将质粒导入感受态细胞后,在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况,结合PCR及　　　　　检测,筛选获得重组菌株W1。  注:PGro为大肠杆菌内源启动子,在细胞快速生长期开启基因转录,但进入生长稳定期后即停止基因转录;SsrA基因编码SsrA短肽;C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解。图a (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养,定时取样检测培养液中细胞密度,方法有　　　　　(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度,其作用是　　　　　　　　　　　　。培养结果(图b)表明,进入生长稳定期后荧光强度快速下降,原因是　  　。  图b (3)研究者选用启动子PX、X基因(编码阻遏蛋白X,阻遏PX开启转录),重新构建质粒②(图a),导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养,W2的生长趋势不变,培养期间荧光强度的变化趋势为  　。  (4)莽草酸是一种重要工业化学品,其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱,且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物,因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长,并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累,利用上述两种质粒的调控功能,结合野生型菌株遗传物质的改造,提出重组生产菌株构建思路:    　。  图c 10.(2025·广西,21,14分,难度★★★★)CAR-T是指通过基因工程技术表达CAR基因的T细胞。CAR-T能更好地识别肿瘤细胞表面特定抗原,在肿瘤治疗中疗效显著。构建CAR-T过程见下图,回答下列问题: (1)构建含CAR基因的重组质粒,选用的限制酶组合是　　　　　　　。  (2)将连接产物导入Ca2+处理后的大肠杆菌,使用添加氨苄青霉素的固体培养基培养。使用固体培养基的原因是  　。  (3)将获得的重组质粒导入T细胞并成功表达后,为了研究CAR-T识别肿瘤细胞的特异性及抗肿瘤效果,除了有CAR-T与肿瘤细胞共同培养的实验组,还需设置的对照组有  　,  肿瘤细胞凋亡率的检测指标有　　　　　　　　　　　　　　　(至少写出2点)。  (4)研究发现,肿瘤细胞高表达的PD-L1与CAR-T表达的PD-1结合会启动免疫抑制。为了阻断免疫抑制,可采取的策略有抑制PD-1与PD-L1的结合以及　　　　　　　　。同时,肿瘤周围组织过于致密会使CAR-T难以接触肿瘤细胞,也会影响疗效。可通过设计减弱原有PD-1启动的抑制通路和降解肿瘤胞外基质的途径解决上述两个问题。已知溶解酶可以降解细胞外基质,多种酶同时作用可提高降解效率;与PD-1连接的生物开关,在该PD-1与PD-L1结合后会被打开,释放P因子激活P启动子。依据上述特性构建新的重组质粒并使其在T细胞中表达。该新的重组质粒部分结构见下图,其中①是　　　　　　　　　　　　　,②是　　　　　　　　　　,③是　　　　　　　　　　,④是　　　　　　　　　　。  11.(2025·贵州,18,10分,难度★★★)番茄细胞中线粒体形态与其自身功能密切相关,并影响番茄果实的成熟过程。研究者将决定蛋白质在细胞内定位的特定肽链“嫁接”到绿色荧光蛋白(GFP)上,控制GFP在番茄细胞内的分布,从而在显微镜下观察线粒体的形态变化。回答下列问题: (1)根据蛋白质工程原理,一般不会直接拼接肽链,而是将两段肽链对应的　　　　拼接在一起完成“嫁接”,细胞色素c氧化酶Ⅳ(COXⅣ)参与有氧呼吸生成水的过程。COXⅣ的一段肽链序列X决定了COXⅣ在细胞内的分布,研究者选择将X与GFP拼接,理由是    　。  (2)拼接好的序列应插入下图中农杆菌T-DNA的　　　　(填下图字母)处。理由是　  　。  (3)选择番茄幼嫩子叶进行离体培养,这些培养的器官、组织或细胞被称为　　　　　　。农杆菌侵染后有一定几率将目的基因整合到番茄细胞的　　　　　　中,番茄组织培养过程中,芽诱导期需在培养基中添加的植物激素是　　　　　　　　　。  12.(2024·北京,20,10分,难度★★★★)学习以下材料,回答(1)~(4)题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因,对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近,没有组织特异性,本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游,与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子,实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性,它们与特定蛋白结合后激活基本启动子,驱动相应基因在特定组织中表达(图A)。基于上述调控机理,研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”(图B),并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中,如果插入位点附近存在有活性的增强子,则会激活报告基因的表达(图C)。　 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后,研究者提取每个个体的基因组DNA,通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后,与相应的基因组序列比对,即可确定载体的插入位点,进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段,对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达,检测个体表型的改变,研究其在细胞分化和个体发育中的作用,从而揭示组织和器官形成的机理。 (1)在个体发育中,来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生　　　　　　的过程称为细胞分化,分化是基因　　　　　　的结果。  (2)对文中“增强子”的理解,错误的是　　　　(单选)。  A.增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B.增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C.一个增强子只能作用于一个基本启动子 D.很多增强子在不同组织中的活性不同 (3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼,观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后,发现位点附近有两个基因G和H,为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因,应检测  　　　　　　　。  (4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分,因而在绝大多数表达报告基因的个体中,增强子捕获载体的插入位点位于基因外部,不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造,期望改造后的载体随机插入基因组后,在“捕获”增强子的同时,也造成该增强子所调控的基因发生突变,以研究基因功能。请画图表示改造后的载体,并标出各部分名称。 13.(2024·黑吉辽,25,12分,难度★★★★★)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T-DNA转移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒,共同转入农杆菌,可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同,为提高翻译效率,增强棉花抗病虫害能力,进行如下操作。回答下列问题。 注F1—F3,R1—R3表示引物;T-DNA-LB表示左边界;T-DNA-RB表示右边界;Ori表示复制原点;KanR表示卡那霉素抗性基因;HygBR表示潮霉素B抗性基因。 (1)从苏云金杆菌提取DNA时,需加入蛋白酶,其作用是  　。  提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精,其目的是　。  (2)本操作中获取目的基因的方法是　　　　　和　　　　　。  (3)穿梭质粒中p35s为启动子,其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,驱动目的基因转录;插入两个p35s启动子,其目的可能是　。  (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置,用　　　　　基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。  (5)为检测棉花植株是否导入目的基因,提取棉花植株染色体DNA作模板,进行PCR,应选用的引物是　　　　　和　　　　　。  (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程,理由是　　　　　。  A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C.将1—1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D.用1—1 362合成基因序列和1 363—1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 14.(2024·广东,21,13分,难度★★★★)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料,BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体,将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株,为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。 图一 回答下列问题。 (1)研究者优化了培养基的　　　　　　　(答两点)等营养条件,并控制环境条件,大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。  (2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签,构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a,载体的部分结构见图二b)。构建载体时,选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色,启动子①②及③依次为　　　　　　　　　,理由是　  　。  图二 (3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素,其作用为　　　　　　　　　　　　　(答两点)。  (4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间,随后将其转至染色池处理,发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色,其原因是  　。  (5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路。   　。  15.(2024·河北,22,14分,难度★★★★)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病,我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN,使其在水稻胚乳特异表达,制备获得r2HN疫苗,并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题。 (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子,若使r2HN仅在水稻胚乳表达,GtP应为　　　　　　　　　　启动子。Nos为终止子,其作用为　　　　　　。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此,可选择限制酶　　　　和　　　　　对r2HN基因与载体进行酶切,用于表达载体的构建。  图1 (2)利用　　　　　　方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况,可通过PCR技术检测　　　　　　　　　　　,通过　　　　　　　　　　技术检测是否翻译出r2HN蛋白。  (3)获得转基因植株后,通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后,r2HN纯合体植株的占比为　　　。选择纯合体进行后续研究的原因是　　　　　　　　　　　　　。  (4)制备r2HN疫苗后,为研究其免疫效果,对实验组鸡进行接种,对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)水平,结果如图2所示。据此分析,获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的　　　　免疫和　　　　免疫。  图2 (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。(答出两点即可)  16.(2022·广东,22,12分,难度★★)“绿水逶迤去,青山相向开”,大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力,有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体,多来自高污染排放企业)为原料,通过厌氧发酵生产丙酮,构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 回答下列问题。 (1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对　　　　　,利用PCR技术,在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。  (2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k,用于在梭菌中建立多基因组合表达库,经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等,其中抗生素抗性基因的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,终止子的作用是　　　　　　　　　　　　。  (3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时,出现了生长迟缓的现象,推测其原因可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,此外丙酮的积累会伤害细胞,需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。  (4)这种生产高附加值化工产品的新技术,实现了　　　　　　　　　,体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看,该技术的优势在于　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,具有广泛的应用前景和良好的社会效益。  17.(2022·湖南,22,15分,难度★★★)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题。 (1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是　　　　　,物质b是　　　　　。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是　。  (2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有　　　　　　、　　　　　　和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是　。  (3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的　　　　(填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是　  　。  (4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路:    　。  考点75生物技术的安全性与伦理问题答案P496　 1.(2025·浙江,3,2分,难度★)下列关于生物技术安全和伦理问题的叙述,错误的是 (　　) A.反对设计完美婴儿 B.反对人的生殖性克隆 C.禁止生物武器的使用 D.禁止转基因技术的应用 2.(2023·北京,6,2分,难度★★)抗虫作物对害虫的生存产生压力,会使害虫种群抗性基因频率迅速提高,导致作物的抗虫效果逐渐减弱。为使转基因抗虫棉保持抗虫效果,农业生产上会采取一系列措施。以下措施不能实现上述目标的是 (　　) A.在转基因抗虫棉种子中混入少量常规种子 B.大面积种植转基因抗虫棉,并施用杀虫剂 C.转基因抗虫棉与小面积的常规棉间隔种植 D.转基因抗虫棉大田周围设置常规棉隔离带 学科网（北京）股份有限公司 $