备课素材：单克隆抗体制备学生高频问题解析-2024——2025学年度第二学期高中生物学选择性必修三

单克隆抗体制备学生高频问题解析 1.人教版（2019）选择性必修三第49页：“在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的，怎样解决这一问题呢？ 他们想到，如果把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合，所得到的融合细胞就可能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。”B淋巴细胞（浆细胞）：能产生抗体；但不能无限增殖。如果我们将B淋巴细胞与一种无限增殖的细胞融合，就可能使其既能产生抗体，又能无限增殖。癌细胞完美契合我们的需求，但为什么科学家们选择了“骨髓瘤细胞”，而没有选择其他种类的癌细胞呢呢？ 骨髓中出现恶性增殖的异常浆细胞，这样的细胞称为骨髓瘤细胞。也就是说，骨髓瘤细胞是起源于浆细胞的恶性肿瘤细胞，具有无限分裂的能力。因此，科学家们挑选骨髓瘤细胞是因为B淋巴细胞和骨髓瘤细胞“同宗同源”，两者更容易进行细胞融合。 2.人教版（2019）选择性必修三第48页：“用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。”这个“特定的选择培养基”是一种什么样的培养基？ 哺乳动物细胞中合成DNA的途径有两条，一条是从头合成途径(de novo synthesis pathway,简称D途径)，该途径是从最简单的起始物(如核苷酸)开始进行生化合成的。在D途径中,酸及其衍生物是必不可少的，它们参与嘌呤环和嘧啶甲基的合成。HAT培养基中加人的氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，因此它可以阻断细胞利用D途径合成DNA。另一条是补救途径(salvage pathway，简称S途径)，该途径需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，简称HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(thymidinekinase，简称TK)的参与，这两种酶可以催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷分别产生肌苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸，它们可以用来合成DNA。 骨髓瘤细胞是经过人工筛选的基因缺陷型细胞，缺乏HGPRT和TK。当它处于HAT培养基中时，它合成DNA的D途径被氨基蝶呤阻断；同时，它由于缺乏HGPRT和TK，所以不能利用S途径合成DNA，会很快死亡。而杂交瘤细胞从B淋巴细胞中获得了HGPRT和TK，可以利用补充在培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷经过S途径来合成DNA，这样在HAT培养基中它可以生存并增殖。 注：HAT培养基根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途径设计，通过在DMEM(或RPMI-1640)培养基中加入次黄嘌呤(hypoxanthine)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶核苷(thymidine)3种关键成分配制而成。 DMEM是Dulbecco's Modified Eagle Medium的缩写，该培养基应用广泛，常用于贴壁细胞的培养。RPMI-1640培养基是美国洛斯维·帕克纪念研究所(RoswellPark Memorial Institute )研发的，RPMI由该研究所名称的首字母组成，1640是培养基的编号，该培养基也是一种常用的培养基，主要用于一些悬浮细胞的培养。 3.人教版（2019）选择性必修三第49页：“对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。”抗体检测的方法和如何进行单克隆培养？ （1）抗体检测的方法 用选择培养基筛选出的杂交瘤细胞，大多数不能分泌抗体，仅有少数细胞能分泌所需的特异性抗体，因此需要将这些杂交瘤细胞挑选出来。如何挑选呢?可以根据抗原与抗体特异性结合的原理，运用免疫酶测定法(如常用的酶联免疫吸附试验)、免疫荧光技术、放射免疫测定法等检测各孔上清液中细胞分泌的抗体。 ①免疫酶测定法 酶免疫测定(enzyme immunoassay,EIA)，是将酶催化作用的高效性与抗原抗体反应的特异性相结合的一种微量分析技术。酶标记抗原抗体后形成的酶标记物，既保留抗原或抗体的免疫活性，又保留酶的催化活性。当酶标记物与待测样品中相应的抗原或抗体相互作用时，可形成酶标记抗原抗体复合物。利用复合物上标记的酶催化底物显色，其颜色深浅与待测样品中抗原或抗体的量相关。该方法灵敏度可达到ng~pg/ml水平。常用的标记物有辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶AP等。 酶免疫测定分为酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和酶免疫组化技术(enzyme immunohistochemistry technique)，前者用于测定可溶性抗原或抗体，后者用于测定组织或细胞表面的抗原。 ②免疫荧光技术 免疫荧光实验是通过将已知的抗体标记上荧光素，再用荧光抗体检测组织或细胞内的抗原，荧光素受激发光的照射而发生明亮的荧光，可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原的性质、定位，以及利用定量技术测定其含量。与免疫组织化学实验相比，免疫荧光法在信号放大、靶向特异性、分辨率等方面具有明显的优势，可以通过各种显微镜技术直接观察。接下来，我们介绍不同类型免疫荧光染色和信号放大的检测方法。 根据实验目的或使用的特定抗体，免疫荧光检测方法可分为直接免疫荧光法（一级）和间接免疫荧光法（二级）。在直接免疫荧光法中，荧光标记与一抗结合，直接结合到靶标抗原上。而间接免疫荧光法涉及两步孵育过程：1）一抗结合靶表位，2）荧光标记的二抗识别并结合一抗。虽然直接免疫荧光法检测更快，但间接免疫荧光法因其高灵敏度、信号放大优势以及在同一样本中检测多个靶标的能力而被更广泛地采用。 图2. 免疫荧光检测法（左：直接IF法；右：间接IF法） 为了实现可视化和荧光信号的放大，可以通过多种方式修饰和偶联二抗。主要方法包含：① 使用多克隆二抗，多克隆二抗能够识别一抗的多个抗原的表位，以提高结合和信号水平（图3a）；② 多种荧光染料蛋白复合物可以与单一的生物素化二抗结合，以提高信号水平（图3b）；③ 结合多个荧光团-蛋白复合物的多克隆二抗组合可以用于荧光信号的进一步放大（图3c）。 图3.不同方式修饰和偶联二抗示例图 ③放射免疫测定法（Radioimmunoassay,RIA） 放射性标记的已知抗原和非标记的待检抗原同时与限量的特异性抗体进行竞争结合或竞争性抑制反应，通过测定结合的或游离的放射性标记抗原的量，根据标准曲线即可推算出被测物含量的一种超微量分析技术。 首先，抗原混合物用该浓度的已知量的抗体标记，它能够使抗体上的抗原结合位点饱和，通过它我们可以获得了使已知量的抗体饱和所需的放射性标记抗原。 将已知量的抗体（与之前使用的相同）添加到试管中，然后将已知量的放射性标记抗原与未标记测试样品一起加入，并逐渐增多测试样品的浓度。并允许标记抗原和未标记抗原之间对抗体上可用抗原结合位点的竞争，由于抗体不能区分标记抗原和未标记抗原，随着未标记抗原浓度的逐渐增加，这会导致标记抗原的置换，从而降低在测试样品存在期间抗体结合放射性标记抗原的量。经离心即可使含有结合态抗原(B)的沉淀物沉淀,与上清液中的游离标记抗原(F)分离。 它用于测量测试样品中存在的抗原量。在放射性降低和未标记抗原的已知浓度之间生成的标准曲线。每次测定均需作标准曲线图,以标准抗原的不同浓度为横坐标,以在测定中得到的相应放射性强度为纵坐标作图(下图)。放射性强度可任选B或F,亦可用计算值 B/(B+F)、B/F 和 B/B0。标本应做双份测定,取其平均值,在制作的标准曲线图上查出相应的受检抗原浓度。 （2）克隆化培养 一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时进行检测(对小鼠的杂交瘤细胞来说，一般在融合后的10~14d进行检测)。另外，新融合的杂交瘤细胞不稳定，容易失去分泌抗体的性质，所以一般需要进行几次检测以确保其稳定性。 当经过2~3次检测证实在培养孔中存在特异性抗体时，就可以对杂交瘤细胞进行连续克隆化培养了。克隆化是指由单个细胞分裂增殖获得细胞团的培养过程。常用的克隆化培养方法包括有限稀释法、软琼脂培养法等。下面以有限稀释法为例进行简要说明。 将处于对数生长期的杂交瘤细胞用培养液充分稀释，使分配到96孔细胞培养板每个孔中的细胞数不超过1，通过培养让它增殖为单克隆。一般培养4~5d后，如果在倒置显微镜下见到一簇紧密生长的细胞，可认为这是单一克隆。经过一次克隆化培养的细胞不能保证其来自单个细胞，一般经过3~4次培养才可以获得稳定的单克隆。这时候，如果再次检测抗体为阳性，就可以进行大规模生产了。 学科网（北京）股份有限公司 $$