备课素材：PCR技术的深度解析与考查应用-2024——2025学年度第二学期高中生物学选择性必修三

PCR技术的深度解析与考查应用 PCR 技术应用广泛。2024年 Nature 子刊的最新研究成果就包含使用 PCR 技术对增强子区域进行扩增和分析,得出软骨生成增强子在影响成人身高的非编码变异中具有潜在的作用。此外,PCR技术在临床诊断(如遗传疾病筛查、细菌、病毒等微生物检测)、食品安全检测、单克隆抗体制备、农业生物技术、环境微生物技术等方面的作用也很重要。可见,PCR 技术与人类的生活与生存息息相关。 然而人教版高中生物学选择性必修3介绍不深,使得学生难以应对众多试题中PCR 技术的各类考点和疑惑。 常见 PCR 技术的原理及适用范围 PCR 技术不仅包含标准PCR,还依据不同适用范围分为qPCR、RT-PCR、qRT-PCR、Blocker PCRMultiplex PCR、Tem-PCR 等一系列分支技术,每种技术都是基于标准 PCR 进行的改进和扩展,以 满足特定的实验需求(表1)。 PCR 技术中引物设计的最佳原则 引物是近年来高考试题中频繁出现的考点。它是 DNA 复制中 DNA 聚合酶结合位点,也为 DNA复制提供了起始点,只有借助引物,DNA 才能顺利启动复制。在生物体内,DNA 复制需要的引物是RNA 片段,而在体外 PCR 扩增中,引物是基于 DNA母链两端特定的碱基序列设计的一小段单链 DNA片段,其成对出现,能精准定位目的基因,并作为新合成 DNA 链的起始点,提供3'端的延伸基础,使得每条子链都从 5'端向3'端进行延伸。引物设计的重要性在于确保扩增的效率和特异性,避免非特异性扩增和假阳性结果,精准的引物设计能提高实验的可靠性和准确性。 PCR 技术中引物设计的最佳原则一般包括： (1)选择在模板cDNA的保守区(指在多个物种的同一基因中存在的相同或高度相似的 DNA 序列片段)进行设计,能确保 PCR 反应的特异性、通用性和扩增效率。 (2)引物长度在 15~30 个碱基之间选择,引物过短会导致特异性降低和误扩增风险变大,过长则会使延伸温度超过 74 ℃,不利于 Taq 醄发挥最佳活性。 (3)引物中碱基G和C的含量保持在 40%~60% 之间,含量过低影响引物与模板DNA 之间的稳定性,使 PCR 扩增效果不佳,以及增加引物与模板 DNA 非特异性结合的风险,导致非特异性扩增条带的产生,而含量过高可导致引物自身之间形成二聚体或多聚体,会降低扩增效率同时需要更高的退火温度,进而增加实验成本。 (4)弓物的3'端不选择对应密码子的第3位作为终止点，因为此位点的密码子容易出现简并性。 (5)引物的3'端不选择碱基A,常选用碱基T,因为当碱基为T时,容错率更低。 (6)引物中的4种碱基应随机分布,而不可与模板链具有高度相似性,这样能避免出现嘌呤或嘧啶聚集的现象,减少错误发生。 (7)引物本身不可含有互补序列,以减少产生折叠的发夹结构,降低引物自身负性,且一对引物之间也不能存在互补性,避免形成引物二聚体或交叉聚体。 (8)引物5'端和中间部分的吉布斯自由能变值应较高,确保5'端和中间部分形成的双链结构更加稳定,而3'端应较低,减少在错配位置形成双链结构,引发 DNA 聚合反应。 (9)引物的延伸是从3'端启动的,不可进行任何修饰,而5'端决定PCR产物的最终长度,对扩增特异性影响小,通常可添加酶切位点、启动子序列等修饰。 PCR 实验的常见问题及解决方案 1. 常见问题 PCR 作为一种高精密实验,任何操作上的失误都会导致实验失败。目前来看,PCR 实验中的常见问题包括: (1)无扩增条带；(2)PCR产量不足;(3)电泳带弥散;(4)产物出现杂带;(5)阴性对照出现条带;(6)条带大小不符。 2 .解决方案 (1)无扩增条带是由多种因素引起的,如 Taq酶缺失或失活、模板污染、变性温度不当、酶污染引物问题等。可分别采取重新添加 Taq 酶、更换模板、调整变性温度、预热去除污染、更换引物等措施解决上述问题。 (2)PCR产量不足时,需检查变性时间、退火温度、延伸时间、模板和引物浓度,以及PCR 循环次数。适当调整以上参数,可提升PCR产量。 (3)电泳条带弥散是由 Taq 酶、dNTP、MgCl,等浓度过高,或 PCR 循环次数过多、退火温度过低等因素引起的。适当降低浓度、减少循环次数、调整退火温度可改善条带质量。 (4)产物出现杂带与引物、DNA 模板、PCR 循环次数等因素有关。降低引物、模板用量,减少循环次数,调整 MgCl2和 Tag酶使用量,以及更换特异性更好的引物和PCR 试剂盒,可有效减少杂带的出现。 (5)阴性对照出现条带通常是由操作污染所致,需重新彻底清洗设备以避免交叉污染。 (6)条带大小不符是设备污染或模板、引物使用错误所致。重新清洗设备并检查模板和引物的使用是否正确,可解决此类问题。 PCR 技术的考查应用 1 .PCR 技术在高考生物学试题中的考查 PCR 技术在高考试题中频繁出现,2024年几乎各省市试卷均有考查(表2)。 PCR 是基因工程中的重要操作程序,常与电泳技术相结合考查学生的问题解决能力。2019年人教版生物学教材虽然对“DNA 片段的扩增及电泳鉴定”有两页的文字介绍,但考题中却常以电泳结果图的形式出现。因此,精准介绍PCR产物的电泳结果图对于学生深刻理解题意及正确解答此类题型至关重要。 2. PCR 扩增产物的电泳示意图分析与应用 电泳技术是一种利用电场作用,依据分子带电性质及大小形状差异,使带电分子以不同速度迁移,从而实现样品分离、鉴定或提纯的技术。在PCR 扩增 DNA 片段后,产物常通过琼脂糖凝胶电泳进行分析,通俗易懂的示意图对于学生理解题意至关重要,绘制图1。 基于高考考点分析,教师需着重强调:(1)标准琼脂糖浓度通常为 1.0%,其浓度影响 DNA 条带的分辨率,高浓度利于小条带分辨,而低浓度则对大分子量条带更为敏感。(2)DNA 在电场中因其磷酸残基带负电荷而向正极迁移,且分子越大,迁移速度越慢。(3)为了便于观察电泳结果,待测 DNA 常与荧光染料结合,如 EB、gel red 或 sybrgreen1,使其在紫外光下显现。(4)电泳时,需与 DNA 标准品( Marker)共跑,Marker 包含多种已知长度的 DNA,借此可推测 DNA样品长度。(5)由于 DNA 标准品中的 DNA 片段浓度已知,通过与 DNA 标准品的亮度进行比较也能初步判断 DNA 样品的浓度。 高考生物学相关题型常利用 PCR 扩增后的电泳图判断待测个体的基因型。判断依据如下:(1)根据条带数量判断基因型的纯合性或杂合性。由于纯合子通常表现为单一的、特定长度的条带,而杂合子则会显示两条或更多不同长度的条带,这些条带分别对应不同的等位基因或基因组合。(2)通过对比条带的位置,即在电泳凝胶上的迁移距离,确定 DNA 片段的精确长度。借助标准的 DNA 标记物作为参考,准确识别出各等位基因所在 DNA片段长度。(3)条带的亮度也是判断基因型的一个辅助指标。由于较亮的条带代表该等位基因在样本中的拷贝数较高,从而间接反映了其所占的比例。结合条带数量、位置和亮度的综合信息,最终精确确定待测个体的基因型,为后续的试题分析与解答提供重要依据。 学科网（北京）股份有限公司 $$