备课素材：动物体细胞核移植技术和克隆动物问题解释-2024——2025学年度第二学期高中生物学选择性必修三

动物体细胞核移植技术和克隆动物问题解释 人教版选择性必修3《生物技术与工程》中绘制了体细胞核移植的流程图，图中指出，核移植得到的重构胚需要用电刺激、钙离子载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂等激活，使之完成细胞分裂和发育进程。 该技术中有些问题常常困扰一些师生。 如，体细胞核移植得到的重构胚为何需要激活：去核是否一定要选择减数分裂Ⅱ中期的卵母细胞：紫外线短时间照射在去核中的作用；离心法去核的机理；化学法去核的机理；电刺激如何激活重构胚：钙离子载体如何激活重构胚；蛋白酶合成抑制剂如何激活重构胚；乙醇如何激活重构胚等。 1.体细胞核移植得到的重构胚为何需要激活 去核时，清除减数分裂时期卵母细胞的染色质和中心体，而移入受体细胞的是供体细胞残缺的有丝分裂结构，这就使得大部分重构胚不能从母源控制过渡到胚胎控制阶段而停止分裂。体细胞核移植得到的重构胚由于在持续高活性的成熟促进因子(MPF)和细胞静止因子(CSF)作用下，卵母细胞不能完成减数第二次分裂，需要物理或化学方法降低其活性，才能使之完成分裂和发育进程。 2.去核是否一定要选择减数分裂Ⅱ中期的卵母细胞 人教版教材中指出，减数分裂Ⅱ中期(MⅡ期)卵母细胞中的“核”其实是纺锤体一染色体复合物，去核是去除该复合物。基于此，有人认为对卵母细胞去核一定要选择减数分裂Ⅱ中期的卵母细胞。实际上，对卵母细胞去核也可以选择减数分裂Ⅱ末期的卵母细胞。Bordignon在牛卵母细胞成熟30h后，用酒精处理，使其排出第二极体，然后除去第二极体及其附近很少部分的细胞质，该方法为末期去核法。比较末期去核法与MⅡ期去核法的去核率和胚胎发育率，发现前者的两个观测指标均高于后者。由此可见，对卵母细胞去核，可以选择减数分裂Ⅱ中期的卵母细胞，也可以选择减数第二次分裂末期的卵母细胞。     3.紫外线短时间照射在去核中的作用 人教版教材中指出，利用紫外线短时间照射可以去核，但没有说明该方法是如何去核的。由于紫外线能损伤DNA分子，因此早期两栖类核移植实验用紫外线短时间照射可以使卵母细胞核DNA变性而达到无核的效果。若紫外线使卵母细胞核DNA变性，则线粒体中的DNA也会变性，这样卵母细胞中损伤的线粒体就无法为后续的重构胚的分裂与发育提供能量。后来哺乳动物核移植就有了荧光指导法去核，紫外线短时间照射在荧光指导法去核中起辅助作用。Hochest33342可以特异地结合在DNA的碱基A和T上，用Hochest33342对卵母细胞进行染色，在紫外线照射下发出荧光，即可显示出卵母细胞中染色体的部位，从而指导去核操作，该方法去核率可达100%，为防止紫外线照射对卵母细胞的损害，紫外线照射时间一般不超过10秒。 4.离心法去核的机理 人教版教材中去核的方法有离心法。离心法是如何去除卵母细胞核的呢？化学试剂细胞松弛素B能抑制微丝聚合，破坏细胞质内微丝系统，从而提高卵母细胞的抗操作能力。用离心法对卵母细胞去核操作时，先将除去透明带的卵母细胞置于连续浓度梯度的含有l0mg/mL的细胞松弛素B的等压Peroll溶液中，离心(5000g,4s),卵母细胞被分散形成细胞质，该方法的缺点是会产生许多小的碎片，使得胞质必须检查去核效果。 由此可见，离心法是在提高卵母细胞抗操作能力的前提下，借助短时间高速离心使卵母细胞的细胞质与核分离。 5.化学法去核的机理     化学法是去除卵母细胞核的一种方法。化学法去核是用化学物质对染色体的分离或纺锤体的功能实施干扰，促使所有染色体与纺锤体紧密结合，再利用蛋白质合成抑制剂处理，抑制细胞周期蛋白B的合成，促成熟因子的浓度减小，极体借助惯性将染色体和纺锤体一同带出细胞，进而实现去核。 6.电刺激如何激活重构胚 细胞工程中，不论植物细胞，还是动物细胞，均可用电融合法，该方法可利用电脉冲使细胞发生凝聚，那么利用电刺激是如何激活重构胚的呢？实际上，哺乳动物排出的卵母细胞在持续较高水平的MPF和CSF的作用下不能继续分裂而停留在MⅡ中期。受精后，立即引起卵母细胞内Ca2+浓度正反馈性的升高，升高的Ca2+破坏CSF,导致MPF活性下降，从而激活卵子。核移植中常用的激活方法是电刺激，将卵母细胞置于短暂高压直流电脉冲下，细胞膜上产生许多可恢复的微孔，胞外的Ca2+通过微孔进入细胞内，细胞内Ca2+浓度升高导致CSF活性消失，进而引起MPF活性下降，卵母细胞被激活。 7.钙离子载体如何激活重构胚 钙离子载体是一种转运钙离子的载体蛋白，用该蛋白处理如何能使重构胚激活呢？与电刺激不同，钙离子载体A23187与另一种钙离子载体一离子霉素，不直接刺激Ca2+的释放，而是先借助细胞膜上Ca2+通道，由胞外涌入胞内，然后激活内质网释放Ca2+,引起细胞内的Ca2+浓度升高，降低了MPF活性，从而激活重构胚。 8.蛋白酶合成抑制剂如何激活重构胚 根据酶的命名法可知，蛋白酶是用来水解蛋白质的，根据酶的专一性，蛋白酶能水解几乎一切蛋白质，那么蛋白酶合成抑制剂是否通过抑制蛋白质的水解而激活重构胚的呢？MPF和CSF是细胞周期的调节蛋白，使卵母细胞停滞在MⅡ期。使用蛋白质合成抑制剂不能升高细胞内Ca2+浓度，而是抑制MPF和CSF的合成，使卵母细胞从MⅡ期休眠状态解脱出来，恢复第二次减数分裂。由此可见，使用蛋白酶合成抑制剂并不是抑制所有蛋白酶的合成，而是有选择地抑制MPF和CSF等蛋白质因子（酶蛋白）的合成，进而使重构胚恢复分裂状态。     9.乙醇如何激活重构胚 乙醇能使蛋白质变性，因此困惑乙醇是通过怎样的分子机制激活重构胚的。事实上，乙醇主要是引起卵母细胞膜1,4,5一三磷酸肌醇（ＩＰ３)的形成，ＩＰ３与其受体结合促使内源性Ca2+释放，从而引起卵母细胞激活的早期反应。 学科网（北京）股份有限公司 $$