3.1 重组DNA技术的基本工具1-【省心备课】2024-2025学年高二生物同步教学精优课件（人教版2019选择性必修3）

第1节 重组DNA技术的基本工具 贺老师 第3章 基因工程 1 1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。 1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被破译成功。 1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶） 1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。 1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。 1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。 1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。 20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。 1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。 2 3 问题探讨 【资料1】我国是棉花的生产和消费大国，以新疆棉最为著名。在棉花种植过程中，常常会受到棉铃虫的侵袭，这会使棉花大量减产。 苏云金杆菌 杂交育种？ 同种生物之间进行 诱变育种？ 不定向 思考：能否培育出自身就能抵抗虫害的棉花呢? 【资料2】苏云金杆菌有一种抗虫基因（Bt毒蛋白基因），它能通过编码产生抗虫蛋白来杀死棉铃虫。 大量施用农药不仅提高了生产成本，还可能造成农产品和环境的污染 基因工程 在原有基因上发生基因突变，产生新基因——等位基因 有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。 4 基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。（p67） 主要在生物体外 基因（具有遗传效应的DNA片段） DNA分子水平 创造出人类需要的新的生物类型和生物产品 基因重组 定向改造生物遗传特性；彻底打破种间界限 别名： 操作环境： 操作对象： 操作水平： 结果： 原理： 意义： 重组DNA技术 有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。 基因工程 5 重组DNA技术的基本工具 思考： DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。 苏云金杆菌 普通棉花(无抗虫特性) 抗虫基因 转入植物细胞 提取 怎么做？ “分子运输车” 抗虫棉： 如何获得抗虫棉? 需要什么工具? 含Bt抗虫蛋白 将体外重组DNA分子导入受体细胞 准确切割DNA分子 “分子缝合针” 将DNA片段连接起来 通过转基因来转性状 如何获得抗虫棉?需要什么工具?转基因抗虫棉如何培育？它为什么能抗虫？ 工欲善其事，必先利其器 剪下来的抗虫基因能否直接把它导入到棉花体内？不能。大多数生物会排斥外来的基因，若直接导入会被降解。利用转基因技术将抗虫基因导入到棉花细胞中，使棉花自身也能产生Bt抗虫蛋白，培育转基因抗虫棉。 外源 DNA 片段难以进入细胞内，即使进入也很难稳定存在、复制并表达。 在培育转基因植株时，既要在体外对含有所需基因的 DNA 分子“切割”、改造和“拼接”；又要将重组 DNA 分子导入植株体细胞内，并使其在细胞中表达。 6 【问题1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？（拼接的基础） ①DNA分子的基本组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸； ②空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。 ③都遵循碱基互补配对原则。 DNA立体结构 DNA平面结构 基因工程 CH2 H OH H H H H 碱基 磷酸 5’ 4’ 3’ 2’ 1’ 脱氧 核糖 7 【问题2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ （表达的基础） ①基因是控制生物性状的独立遗传单位。 相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质，同一蛋白质在不同细胞中的功能相同。 基因工程 ③生物界共用一套遗传密码。 DNA RNA 蛋白质 转录 翻译 复制 ②基因的表达过程相同：中心法则。 遗传信息的传递都遵循中心法则 8 重组DNA技术的基本工具 1 分子手术刀—— 限制性内切核酸酶 思考：去哪里寻找能够切割DNA的“分子手术刀”？ 1、病毒入侵真核生物会被免疫系统攻击，细菌面对噬菌体时如何自保？ 噬菌体侵染细菌的电子显微镜图片 细菌能产生限制性内切核酸酶，切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的（防御机制） 2、如何理解限制性内切核酸酶命名的由来？ 限制外源遗传物质的扩散 “内切”表明酶在DNA链内部切割（而非从末端开始） 作用于核酸，限制酶特指切割DNA的酶。 人的细胞中有吗？它存在的意义是什么？科学家发现限制酶精准切割的特性，将其改造为基因工程的‘手术刀’ 这种刀的本质是什么？① 甲基化酶：在细菌自身DNA的特定序列（如GAATTC）上添加甲基基团（标记为“自我”）。 ② 限制酶：巡逻扫描DNA，切割未甲基化的相同序列（识别并摧毁“非我”） 最初在细菌中发现，其作用是切割外源DNA（如病毒基因组），从而限制外源遗传物质的扩散。这种“区分自我与非我”的特性，体现了对入侵基因的“限制”功能。“内切”表明酶在DNA链内部切割（而非从末端开始） 作用于核酸（DNA或RNA），限制酶特指切割DNA的酶。部分限制酶也能切割RNA，但主流研究聚焦于DNA工具酶。 9 重组DNA技术的基本工具 3、为什么限制性内切核酸酶不剪切细菌本身的DNA？ 通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 通过长期的进化，细菌DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 10 1 分子手术刀——限制性内切核酸酶 （1） 来源： 主要是原核生物，可人工合成 （2）化学本质： 蛋白质 （3） 种类： 数千种 （限制酶不是一种酶，而是一类酶） （4） 命名： 流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:____________________________。 HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ 用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的（p72）。 例如，一种限制酶是从大肠杆菌( Escherichia coli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRI。 练习：粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）中分离的第一种限制酶即_______； SmaⅠ 11 1 分子手术刀——限制性内切核酸酶 （5）作用特点： 能够识别 的特定脱氧核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的 断开。 5' 3' 5' 3' T A G G T A T C C A 磷酸二酯键 双链DNA分子 磷酸二酯键 酶的专一性 限制酶通常不能切割单链DNA。其识别位点依赖双链DNA的特定序列（如EcoRI识别GAATTC↓），单链状态下无法形成稳定的酶-底物复合物。绝大多数限制酶不切割RNA。其进化功能是保护细菌免受噬菌体DNA入侵，RNA并非其天然底限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。 物。 12 1 分子手术刀——限制性内切核酸酶 （6） 限制酶的识别序列： 中轴线 四种限制酶识别的特定序列有何特点？ ①大多数限制酶的识别序列由 组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 6个核苷酸 ②都可以找到一条中心轴线； ③中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的，称为回文序列。 1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ） A．GAATTC B．GGGGCCCC CTTAAG CCCCGGGG C．CTGCAG D．CTAAATC GACGTC GATTTAG D 能被限制酶所识别的序列一般都有回文序列 13 【拓展】 一些常用的限制酶识别序列与切割产生的末端类型 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。例如，EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶的识别序列均为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 14 ①实例1——EcoRⅠ限制酶切割 *EcoRⅠ识别序列为GAATTC *EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键 黏性末端 黏性末端 ②实例2——SmaⅠ限制酶切割 *SmaⅠ识别序列为CCCGGG *SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键 平末端 DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。 切口处是平整的，这样的切口叫平末端。 （7） 切割结果： 1 分子手术刀——限制性内切核酸酶 15 1.写出下列限制酶切割形成的末端序列 BamHⅠ EcoRⅠ__________________________ Hind Ⅲ Bgl Ⅱ _________________________ -G -CCTAG -G -CTTAA -A -TTCGA -A -TCTAG or GATCC- G- or AATTC- G- or AGCTT- A- or GATCT- A- 1、同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？ 2、不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 相同。 可能相同 酶具有专一性，识别的序列相同 （比如BamHⅠ、BglⅡ） 同尾酶：识别的靶序列不同，但是酶切后形成的黏性末端相同 不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。 16 2. 请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。 3 可断开2个磷酸二酯键； 产生2个游离的磷酸基团； 产生2个黏性末端； 消耗2分子水。 3、请结合图示，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？ 产生多少个游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？ T T A A G C T T A A C G A A T T G C 限制酶的识别位点沿中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的，称为回文序列。 注意观察识别序列和切割位点 在黑板上补齐3种限制酶的识别序列 ①找到切割位点 ②补全序列 17 --ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA ……TCCCTAAGAATTC CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- Bt蛋白基因 3’ 5’ 5’ 3’ 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Bt蛋白基因 5’ 3’ 3’ 5’ EcoRⅠ识别 5'-GAATTC-3' 序列，并在G与A之间切割。 苏云金芽孢杆菌DNA片段中的部分基因 18 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.7.28 Lavf56.40.101 Tencent APD MTS $$