3.1 重组DNA技术的基本操作（第一课时）- 【精讲课堂】2024-2025学年高二生物同步教学实用课件（人教版2019选择必修3）

第1节：重组DNA技术的基本工具 （第一课时） 以信息技术为支撑；以现代教育教学理论为指导；强调新型教学模式的构建；教学内容具有更强的时代性和丰富性；教学更适合学生的学习需要和特点。信息化教学不仅仅是在传统教学的基础上对教学媒体 和手段的改变,而且是以现代信息技术为基础的整体的教学体系的一系列的改革和变化。 授课人：大道至简 微信：a533722113333 第三章 基因工程 1 核心素养 1.生命观念：运用结构与功能观说明基因工程的各种工具的特点。 2.科学思维：探究DNA的物理与化学性质， 进行DNA分子的提取与鉴定。 3．社会责任：关注基因工程的诞生和发展历程，参与讨论基础理论和技术发展如何催生基因工程。 2 基因工程的发展历程 1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。 1950年，埃德曼（P. V. Edman，1916-1977）发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格（F. Sanger，1918-2013）首次完成了胰岛素氨基酸序列的测定。 1958年，梅塞尔森（M. Meselson，1930-）和斯塔尔（F. W. Stahl。1929-）用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。 1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被成功破译。 1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。 20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、链接及功能基因的获得创造了条件。 1972年，伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功构建了第一个体外重组DNA分子。 1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流，基因正式问世。 1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。 1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。 1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能。 1982年，第一个基因工程药物——重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。 1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。 1984年，我国科学家朱作言（1941-）领导的团队培育出设计上第一条转基因鱼。 1985年，穆里斯（K. Mullis，1944-）等人发明了PCR，为获取目的基因提供了有效手段。 1990年，人类基因组计划启动。2003年该计划的测序任务顺利完成。 2013年，华人科学家张锋（1982-）及其团队首次报道了利用最新的基因编辑技术——CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。 基因工程的发展历程 基因工程 基因工程：指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。 1.基因工程的概念 苏云金杆菌 毒蛋白基因 毒蛋白 杀死害虫 棉花细胞 抗虫棉的培育 毒蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。毒蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，毒蛋白不会对人畜产生上述影响。 基因工程 基因工程：指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。 原理：基因重组。 操作水平：分子水平。 操作环境：生物体外。 操作对象：基因。 结果：赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。 基因工程 转基因木瓜（视频） 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。 转基因番木瓜 非转基因番木瓜 重组DNA技术的基本工具 “分子手术刀” 限制性内切核酸酶 准确切割DNA分子 “分子缝合针” DNA连接酶 “分子运输车” 基因进入受体细胞的载体 将DNA片段连接起来 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 2.主要来源： 主要是从原核生物中分离纯化出来的。 1.全称和简称 全称——限制性内切核酸酶 简称——限制酶 3.种类:数千种 限制酶不是一种酶，而是一类酶 限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。 现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内核酸切酶。 流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:____________________________ HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ 资料卡：限制酶的命名：用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌( Escherichia coli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRI。 练习：粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）中分离的第一种限制酶即_______ SmaⅠ 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 4.特点： （1）识别双链DNA分子特定核苷酸序列 （2）断开磷酸二酯键 专一性 T G C C G T A A 5' 3' 5' 3' 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 5.识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 EcoRⅠ 5’…G-A-A-T-T-C…3’ 3’…C-T-T-A-A-G…5’ SmaⅠ 5’…C-C-C-G-G-G…3’ 3’…G-G-G-C-C-C…5’ BamHⅠ 5’…G-G-A-T-C-C…3’ 3’…C-C-T-A-G-G…5’ TaqⅠ 5’……T-C-G-A……3’ 3’……A-G-C-T……5’ 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。 在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” EcoR Ⅰ (在G与A之间切割) 中轴线 黏性末端 平末端 Sam Ⅰ (在G与C之间切割) 6.切割结果:形成黏性末端或平末端 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 现学现用：写出下列限制酶切割形成的黏性末端 BamHⅠ________ EcoRⅠ________ HindⅢ________ BglⅡ ________ GATC AATT AGCT GATC *思考：你从中发现什么现象了？ 不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端 一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀” g1 g2 g3 1.现有一段DNA，含有g1、g2、g3，若要将g2提取出来，如何操作？ 需要有几个酶切位点？ 2 产生几个末端？共产生几个磷酸基团？ 4 4 使用EcoRⅠ酶剪切 识别序列GAATTC g1 g2 g3 CT TCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGAT T GGCATCTTAA AATTCCGTAG 5‘ 5‘ 3‘ 3‘ 拓展延伸 能切下目的基因且不破坏目的基因 2.下图中，选择哪种限制酶来获得抗病基因（目的基因）？ 选择限制酶切割目的基因的基本原则是： ____________________________________________________。 拓展延伸 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” 1.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）。 （1）E·coli DNA连接酶或T4DNA连接酶连接粘性末端 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” （2）T4 DNA连接酶可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，效率低 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 功能 只缝合____________ 缝合____________和____________ 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌 T4噬菌体 黏性末端 黏性末端 平末端 磷酸二酯键 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？ A A T T G C A A T T A A T T DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶的作用 相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶。 不同点：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板； DNA连接酶连接的是DNA片段。 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” DNA连接酶、DNA聚合酶、限制酶、解旋酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链， 形成两条长链 二、DNA连接酶 ——“分子缝合针” 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 1.作用：将外源基因送入受体细胞&在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 2.种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。 最常用的载体——质粒:一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 拟核DNA 质粒 氨苄青霉素抗性基因 目的基因插入位点 复制原点 大肠杆菌及质粒结构模式图 质粒是基因工程中最常用的载体 1.自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制 2.有一个至多个限制酶切割位点 3.对受体细胞无害、易分离 4.具有多种特殊的标记基因 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 3.作为载体需具备的条件 （1）有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。 （2）能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 （3）常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。 在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 氨苄青霉素抗性基因 目的基因插入位点 复制原点 对受体细胞无害 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” 标记基因的筛选原理：载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。 普通培养基 不含抗生素 选择培养基50µg/ml四环素 三、基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车” …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TCCTAG …AGGATCTTAA GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG AATTCCATAC… GGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 重组DNA分子 剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？ 剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。 限制酶 DNA连接酶 载体 ①对受体细胞无害； ②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因； ④能自我复制或能整合到宿主DNA上。 质粒、噬菌体 、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类： 磷酸二酯键 来源 ： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有专一性 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位：磷酸二酯键 种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶 作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 课堂小结 1.根据所学知识，完成以下填空： ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶 b a A.切断a处的酶为_______ B.连接a处的酶为_______ C.切断b处的酶为_______ ① ③④ ② a：磷酸二酯键；b：氢键 课堂练习 2.DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端 课堂练习 C 3.下列关于基因运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是( ) A.能够复制，以便目的基因插入其中 B.具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达 C.具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选 D.对受体细胞无害，便于重组DNA的筛选 C 课堂练习 4.图1为某种质粒结构简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述错误的是(   ) A.在基因工程中若只用一种限制酶 完成对质粒和外源DNA的切割，则可 选EcoRⅠ B.如果将一个外源DNA分子和一个 质粒分别用 EcoRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中 EcoRⅠ酶切点有1个 C.为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理 D.质粒是一种结构很小的、能自主复制的环状DNA，是基因工程中最常用的载体 课堂练习 B Lavf58.20.100 Tencent CAPD MTS FormatFactory : www.pcfreetime.com $$